Le isoforme akt1 e akt2 svolgono ruoli distinti durante la progressione del carcinoma mammario attraverso la regolazione di specifiche proteine ​​a valle | rapporti scientifici

Le isoforme akt1 e akt2 svolgono ruoli distinti durante la progressione del carcinoma mammario attraverso la regolazione di specifiche proteine ​​a valle | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Biologia molecolare
  • Oncologia

Astratto

Lo scopo di questo studio era di chiarire i meccanismi associati agli effetti specifici delle isoforme di AKT1 e AKT2 nella progressione del carcinoma mammario. Abbiamo modulato l'abbondanza di specifiche isoforme di AKT nelle linee cellulari di carcinoma mammario umano IBH-6 e T47D e abbiamo mostrato che l'AKT1 promuoveva la proliferazione cellulare, attraverso l'upregolazione di S6 e ciclina D1, ma inibiva la migrazione e l'invasione cellulare attraverso la β1-integrina e l'adesione focale chinasi ( FAK) downregulation. Al contrario, l'AKT2 ha promosso la migrazione e l'invasione cellulare attraverso l'induzione di F-actina e vimentina. Pertanto, mentre la sovraespressione di AKT1 promuoveva la crescita locale del tumore, la downregulation di AKT1 o la sovraespressione di AKT2 promuovevano l'invasione peritumorale e le metastasi polmonari. Inoltre, abbiamo valutato il set di dati del Cancer Genome Atlas (TCGA) per carcinomi mammari invasivi e abbiamo scoperto che un aumento dei livelli di mRNA di AKT2 ma non di AKT1 era correlato a un esito clinico peggiore. Concludiamo che le isoforme dell'AKT svolgono ruoli specifici nelle diverse fasi della progressione del carcinoma mammario, con l'AKT1 coinvolto nella crescita locale del tumore e l'AKT2 coinvolto nella diffusione del tumore distante, avendo l'AKT2 un valore prognostico più scarso e di conseguenza un obiettivo utile per la terapia.

introduzione

Il cancro al seno è il tumore più comune nelle donne e la seconda causa di morte in tutto il mondo 1 . Nonostante il miglioramento delle diagnosi e i progressi nella terapia del tumore, i decessi per cancro sono dovuti alla diffusione del tumore 2 . Le perturbazioni nelle normali interazioni cellula-cellula o cellula-cellula extracellulare portano a un'interruzione dell'integrità della membrana basale e dell'invasione dei tessuti circostanti, un passo precedente nella progressione metastatica 3 .

PI3K / AKT / mTOR è il percorso più comunemente deregolamentato nella maggior parte dei tumori solidi inclusi i carcinomi mammari 4, 5 . È stato dimostrato che l'iperattivazione della via contribuisce alla tumorigenesi e alla progressione del tumore nella ghiandola mammaria attraverso la proliferazione cellulare indipendente dal fattore di crescita 6, l'invasione cellulare 7, la deregolazione del recettore endocrino 8, 9 e la resistenza alla terapia 10 . È stato dimostrato che PIK3CA, AKT e PTEN presentano un aumento dei tassi di mutazione che porta alla deregolamentazione della via 11 . Tuttavia, il meccanismo e i segnali a valle mediante i quali PI3K e AKT regolano ogni fase dello sviluppo del tumore e della progressione del cancro non sono completamente compresi.

In modelli sperimentali, è stato dimostrato che le mutazioni di PI3KCA attivano l'AKT a valle della chinasi e inducono la trasformazione oncogenica 12, 13, quindi queste lesioni rendono i tumori altamente sensibili all'inibizione terapeutica diretta da PI3K / AKT / mTOR. Nonostante l'enorme quantità di studi clinici rivolti alla via del cancro, l'unico farmaco approvato è Everolimus, un inibitore mTOR, in combinazione con Exemestane per carcinoma mammario avanzato (H + +) / HER2-negativo (HER2-) avanzato del recettore ormonale che è progredito su endocrino terapia 14, 15 . Tuttavia, la relazione tra attivazione della via o mutazione PIK3CA ed esito clinico nel carcinoma mammario è ancora controversa 16, 17, 18, 19 .

Esistono tre isoforme AKT; AKT1, AKT2 e AKT3, che condividono sequenze elevate e omologia strutturale ma presentano funzioni specifiche e non ridondanti in vari tipi di tumore 6, 20, 21, 22 . Nel seno, il ruolo di AKT3 è stato finora meno studiato, ma sembra avere un ruolo più preponderante nei tumori tripli negativi 23 . Per quanto riguarda gli studi AKT1 e AKT2, sono stati sviluppati diversi modelli murini transgenici con carcinomi mammari, che hanno mostrato risultati diversi. In un modello indotto da ErbB2, Hutchinson et al . 24 hanno mostrato che l'attivazione di AKT1 accelera la tumorigenesi ma sopprime l'invasione del tumore, mentre Ju et al . 25 hanno riportato un ruolo proliferativo e pro-migratorio per AKT1. Nei modelli MMTV-ErbB2 / neu e MMTV-PyMTV, Maroulakou et al . 26 hanno riferito che l'ablazione dell'AKT1 ritarda la formazione del tumore, ma non ha alcun effetto sulla metastasi, mentre l'ablazione dell'AKT2 migliora la crescita del tumore mammario. Al contrario, nel modello MTB-IGF-IR Watson et al . 27 hanno riferito che l'ablazione di AKT1 o AKT2 ritarda l'insorgenza del tumore mammario e sopprime la crescita del tumore.

Nelle cellule di tumore al topo e al seno umano il nostro gruppo ha descritto che l'iperattivazione dell'AKT1 porta alla crescita tumorale 9 simile a duttale e all'attivazione indipendente dall'ormone dei recettori endocrini 8, 28 . Altri studi hanno dimostrato che mentre l'AKT1 inibisce la migrazione cellulare mediante la regolamentazione ERK 29 o la degradazione di NFAT 30, l'AKT2 promuove l'invasione cellulare attraverso la β1-integrina 31 e l'upregolazione della palladina 32 . Questi e altri studi 33, 34 hanno ipotizzato che l'inibizione dell'AKT1 possa portare a una maggiore invasività delle cellule tumorali e malattia metastatica. Tuttavia, nessuno dei modelli di tumore al seno umano sopra menzionati ha completamente discriminato il ruolo specifico di AKT1 e AKT2 sul fenotipo aggressivo e sulla progressione della malattia in vivo . Il presente studio è stato progettato per analizzare il ruolo specifico e la segnalazione di AKT1 e AKT2 nella regolazione dei diversi stadi della progressione del carcinoma mammario in due linee cellulari di carcinoma mammario umano duttale che crescono in coltura e negli xenotrapianti.

risultati

L'AKT1, ma non l'AKT2, favorisce la proliferazione cellulare

È stato dimostrato che l'iperattivazione di AKT1 porta ad un aumento della crescita tumorale mammaria 9, 20, 25, 28 . In questo studio, le cellule tumorali IBH-6 e T47D positive al recettore degli estrogeni e progesterone (ER + / PR +) sono state modificate stabilmente per sovraregolare o downregolare in modo specifico le isoforme AKT1 o AKT2 e cercare i loro effetti specifici sulla proliferazione, adesione e invasione cellulare.

L'iperattivazione di AKT1 (myrAKT1) o AKT2 (myrAKT2) è stata generata con una sequenza di miristoilazione, che mantiene la proteina costitutivamente attiva sulla membrana cellulare. La downregulation di AKT1 (shAKT1) o AKT2 (shAKT2) è stata generata con costruzioni shRNA. La rispettiva modulazione di isoforme specifiche è stata confermata dalla valutazione dell'espressione proteica (Fig. 1a e b e Fig. S1a, b e c supplementari) e della fosforilazione (Fig. 1c ed d e Fig. 1d supplementare). Non siamo riusciti a distinguere la regolazione specifica dell'isoforma nella fosforilazione di pSer473AKT (Fig. 1c ed d) e pThr308AKT (Fig. 1d supplementare) ciò che indicherebbe attivazione differenziale, poiché questi anticorpi non discriminano tra le isoforme AKT.

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( aeb ) WB che mostra l'upregolazione AKT1 o AKT2 (a sinistra) e la downregulation (a destra) nelle celle mAKAKT e shAKT, rispettivamente. ( c, a sinistra ) WB e ( d ) IF in verde che mostrano una riduzione dei livelli di pSer473AKT nelle cellule IBH-6 carenti di AKT1 e AKT2. ( c, a destra) Il bilanciamento del bianco mostra livelli di pSer473AKT ridotti nelle cellule T47D carenti di AKT1 e AKT2. L'anticorpo per pSer473AKT riconosce tutte le isoforme AKT fosforilate in Ser473. ( e e f ) Proliferazione cellulare in cellule con insufficienza di sovrapressione (sinistra) o carenti (a destra). ( g ) WB (a sinistra) e quantificazione (a destra) per la ciclina D1 in cellule carenti di AKH IBH-6. (H) IF in verde per pSer240S6 (pS6, pannello superiore) e S6 totale (pannello inferiore) in cellule carenti di AKH IBH-6. Nuclei sono stati controcolorati in rosso con PI. ERK1 / 2 o α-Tubulina sono stati usati come controlli di caricamento. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001 rispetto alle celle di controllo o shco. n = 3 (ANOVA, post-test di Dunnet). Le macchie in a, b, c e g sono state ritagliate. Le macchie a lunghezza intera sono presentate nella Figura S6 supplementare.

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Abbiamo quindi analizzato l'effetto della modulazione AKT sulla proliferazione cellulare. Come previsto, in entrambe le linee cellulari, la sovraespressione di AKT1 è aumentata, mentre la sua downregulation ha ridotto la proliferazione cellulare. Tuttavia, l'effetto di AKT2 sulla crescita cellulare è stato meno chiaro (Fig. 1e e f). Una downregulation statisticamente significativa sulla proliferazione cellulare è stata osservata solo nelle cellule shAKT2 IBH-6 (Fig. 1e, a destra). Inoltre, l'inibizione della proliferazione cellulare nelle cellule shHHT IBH-6 è stata accompagnata dalla downregulation della ciclina D1 (Fig. 1g) e da una diminuzione dell'espressione S6 e della fosforilazione (Fig. 1h). Tuttavia, AKT2 non ha avuto alcun effetto sulla regolazione della ciclina D1 o S6. Risultati simili sono stati osservati nelle cellule T47D (Fig. 1e e f supplementari). Questi risultati indicano che nelle cellule IBH-6 e T47D, l'AKT1, ma non l'AKT2, controlla la proliferazione cellulare attraverso la regolazione di S6 e ciclina D1.

AKT1 e AKT2 svolgono ruoli diversi nella migrazione e nell'invasione cellulare

Abbiamo analizzato l'effetto della downregulation specifica dell'AKT sull'aggressività cellulare. Le cellule epiteliali IBH-6 mostrano una morfologia a forma di fuso 35 . Nella coltura monostrato (bidimensionale, 2D), le cellule shAKT1 IBH-6 e shAKT2 IBH-6 hanno conservato dimensioni e morfologia rispetto alle cellule shco IBH-6 (Figura complementare S2a). T47D shAKT1 e T47D shAKT2 hanno anche conservato dimensioni e morfologia in 2D (non mostrato).

Su una membrana tridimensionale (3D) del seminterrato Matrigel, le cellule shco IBH-6 aggregate in alto, con alcune cellule che invadono il Matrigel (Figura complementare S2b). La downregulation di AKT1 ha aumentato il fenotipo invasivo, mentre la downregulation di AKT2 ha soppresso questo fenotipo e le cellule sono rimaste come aggregati (Figura complementare S2b). Coerentemente, in un saggio di guarigione delle ferite le cellule shAKT1 avevano una capacità di migrazione simile alle cellule shco IBH-6, mentre le cellule shAKT2 la diminuivano (Fig. 2a). Inoltre, shAKT1 è aumentato e shAKT2 ha ridotto la capacità di invadere Matrigel (Fig. 2b). L'effetto differenziale di AKT1 e AKT2 sul fenotipo invasivo era meno evidente nelle cellule T47D (non mostrato).

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( a ) Test di guarigione delle ferite. Immagini rappresentative a T0 e Tf (21 ore dopo) di un esperimento (a sinistra). I grafici a barre rappresentano la quantificazione dell'area di migrazione (a destra). ( b ) Saggio di invasione del transwell (a sinistra). I grafici a barre indicano la media delle cellule che hanno invaso il Matrigel e si sono attaccate sull'altro lato dell'inserto dopo 26 ore (a destra). ( c ed e ) IF per β1-integrina e pTyr861FAK (pFAK). ( d e f ) WB rappresentativo (a sinistra) e quantificazione (a destra) di β1-integrina e pFAK. ( g ) Se la falloidina si colora con fibre rosse di F-actina (a sinistra) e quantificazione dell'intensità di F-actina (a destra). ( h ) IF per vimentina (a sinistra) e quantificazione della colorazione della vimentina (a destra). I nuclei sono stati controcolorati in rosso con PI (tranne in g ). Le frecce bianche mostrano la localizzazione punteggiata ( c ed e ) e le fibre di actina ( g ). * P <0, 05; ** p <0, 01. n = 3. Le macchie in d e f sono state ritagliate. Le macchie a lunghezza intera sono presentate nella figura supplementare S7.

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Abbiamo quindi analizzato l'effetto del doppio silenziamento delle isoforme (shAKT1 / 2). Per questo, le cellule IBH-6 sono state co-infette per downregolare contemporaneamente AKT1 e AKT2 (Figura complementare S3a). Le cellule ShAKT1 / 2 hanno ridotto la proliferazione (Figura supplementare S3b), simile alle cellule shAKT1. Inoltre, l'effetto di shAKT1 ha prevalso sull'effetto di shAKT2 e il fenotipo risultante è stato un aumento delle capacità di migrazione (Fig. S3c supplementare) e invasiva (Fig. S3d supplementare) delle cellule IBH-6 shAKT1 / 2. Questi risultati dimostrano che AKT1 inibisce la migrazione cellulare e l'invasione di per sé , e il suo effetto è prevalente su AKT2.

AKT1 e AKT2 regolazione opposta di adesione cellulare e proteine ​​di invasione

Le integrine appartengono a una famiglia di recettori delle membrane cellulari coinvolte nelle interazioni della matrice cellulare-extracellulare attraverso gli effettori delle protein-chinasi e nel regolare l'attività e la localizzazione delle proteine ​​intracellulari ed extracellulari per favorire la diffusione cellulare 36, 37 .

In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che l'iperattivazione dell'espressione dell'AKT1 chinasi focale downregolata (FAK), portando a una riduzione dell'adesione cellulare IBH-6 9 . In questo studio, abbiamo analizzato i livelli di β1-integrina e FAK dopo downregulation di AKT1 o AKT2. β1-integrina aumentata nelle cellule shAKT1 (Fig. 2c ed d). Coerentemente, la fosforilazione di FAK (pFAK) è aumentata nelle cellule shAKT1 e non è cambiata nelle cellule shAKT2 (Fig. 2e e f). MMP9 è stato anche aumentato nelle cellule shAKT1 (non mostrato). Inoltre, nelle cellule shAKT1, la β1-integrina e la pFAK erano particolarmente aumentate vicino ai bordi della membrana in una localizzazione punteggiata (Fig. 2c ed e).

Abbiamo anche analizzato i componenti del citoscheletro F-actina e vimentina, comunemente liberalizzati durante la migrazione cellulare. Mentre le cellule shHHT IBH-6 esprimono livelli simili di F-actina come cellule shco, con fibre di actina chiaramente definite, le cellule shAKT2 IBH-6 hanno mostrato un modello di espressione più debole, con filamenti non definiti (Fig. 2g). Inoltre, mentre le cellule shco IBH-6 esprimevano alti livelli di vimentina, shAKT1 diminuiva i livelli di questa proteina con un modello polarizzato (Fig. 2h). Le cellule ShAKT2 hanno anche diminuito i livelli di vimentina, sebbene con uno schema non polarizzato, in linea con la loro ridotta capacità di invadere il Matrigel (Fig. 2h). Anche se, né la sovraespressione di AKT1 né AKT2 hanno cambiato la morfologia cellulare in 2D (Supplementary Fig. S4a), le cellule myrAKT1 hanno ridotto i livelli e la polarizzazione di pFAK (Supplementary Fig. S4b), mentre le cellule myrAKT2 hanno aumentato la polimerizzazione dell'F-actina (Supplementary Fig. S4c) Le cellule di tipo selvaggio (WT) presentavano un comportamento simile alle cellule trasfettate da controllo ACL-4.1 o pCDNA3 (non mostrate). Complessivamente, questi risultati suggeriscono che l'invasione cellulare è regolata diversamente da AKT1 e AKT2 attraverso i loro effettori a valle. Cioè, mentre le proteine ​​di adesione cellulare β1-integrina e FAK sono preferibilmente inibite da AKT1, i componenti del citoscheletro F-actina e vimentina sono indotti preferibilmente da AKT2.

AKT1 e AKT2 generano diversi fenotipi del cancro al seno negli xenotrapianti

In un precedente lavoro, abbiamo dimostrato che le cellule IBH-6 myrAKT1 iniettate in animali immunodepressi hanno generato tumori che crescono più velocemente delle cellule IBH6 ACL-4.1 9 . Qui, mostriamo che le cellule shHHT IBH-6 hanno originato tumori più piccoli con un tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule shco IBH-6 (Fig. 3a). Al contrario, le cellule shHH2 IBH-6 non hanno modificato la latenza del tumore o il tasso di crescita. Vale la pena ricordare che le cellule shco IBH-6 hanno generato tumori che crescono in modo simile alle cellule WT IBH-6 38 e che tutte le linee cellulari derivate da IBH-6 crescono in assenza di apporto di ormoni esogeni. Poiché i tumori IBH-6 shco e shAKT2 sono cresciuti così rapidamente, quando hanno raggiunto la dimensione massima consentita secondo le linee guida NIH e 39, gli animali sono stati sacrificati e tumori, polmoni e fegato sono stati rimossi per analizzare l'istologia e la presenza di metastasi.

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( a ) Curve di crescita di IBH-6 shco e cellule carenti di AKT nei topi NSG. ( b ) HE nei campioni di tumore, le frecce indicano l'invasione del tumore del tessuto adiposo adiacente. I tumori shco IBH-6 erano scarsamente differenziati, simili ai carcinomi IBH-6 WT, con due popolazioni cellulari chiaramente definite: una epiteliale e l'altra a forma di fuso (inserto). ( c ) colorazione Ki67 e ( d ) β1-integrina. ( e ) HE nei polmoni di IBH-6 shAKT1 animali portatori di tumore, che mostrano infiltrazione di cellule polimorfonucleate (a sinistra, indicata dalle frecce) e due focolai di metastasi (a destra) in 6 animali su 12. *** p <0, 001. n = 4 in ciascun gruppo sperimentale per le curve di crescita del tumore. Gli esperimenti sono stati eseguiti da duplicati.

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L'istologia tumorale ha mostrato differenze rilevanti a seconda dell'isoforma AKT specifica downregolata (Fig. 3b). I tumori IBH-6 shAKT1 sono stati arricchiti nella popolazione simil-fibroblastica del fuso, quasi senza cellule epiteliali (Fig. 3b, inserto). Inoltre, nonostante il ridotto tasso di crescita, i tumori shAKT1 presentavano evidenti segni di invasione del tessuto adiposo adiacente (Fig. 3b, frecce). Al contrario, i tumori IBH-6 shAKT2 presentavano una morfologia meno a forma di fuso, senza segni di invasione (Fig. 3b). Abbiamo analizzato da IHC l'espressione di AKT1 e AKT2 nei tumori shco e carenti di AKT (Figura complementare S5a e b) per confermare la specifica dowregulation di AKT. I tumori ShAKT1 mostravano meno cellule positive al Ki67 (Fig. 3c) costituite da un ridotto tasso di proliferazione (Fig. 3a). Infine, il livello di β1-integrina nei tumori ha riprodotto i risultati ottenuti nelle colture cellulari; cioè, aumento dei livelli di shAKT1 e riduzione dei livelli di tumori shAKT2, rispetto ai tumori shco (Fig. 3d).

Alla fine dell'esperimento, 40 giorni dopo l'inoculazione cellulare, non sono stati trovati focolai di metastasi in nessuno dei gruppi sperimentali (non mostrato). Tuttavia, i polmoni di animali portatori di tumore shAKT1 hanno mostrato segni di infiammazione, come l'infiltrazione di cellule polimorfonucleate (Fig. 3e, a sinistra), suggerendo una nicchia pre-metastatica favorevole per le cellule circolanti. Esperimenti a lungo termine (60 giorni dopo l'inoculo cellulare) con cellule shHHT IBH-6 hanno generato metastasi polmonari (Fig. 3e, a destra). Non sono stati condotti esperimenti a lungo termine su animali portatori di tumori shco o shAKT2 a causa di problemi di benessere degli animali.

Analogamente, negli xenotrapianti T47D, il silenziamento dell'AKT1 ha ridotto la crescita tumorale, mentre il silenziamento dell'AKT2 non ha modificato il tasso di crescita rispetto ai tumori di controllo (Fig. 4a). Sebbene i tumori T47D shAKT1 fossero di dimensioni più piccole, erano gli unici con evidenti segni di invasione, con gruppi di cellule che invadevano il tessuto adiposo adiacente (Fig. 4b, frecce). La downregulation specifica dell'isoforma AKT è stata confermata da IHC (Figura complementare S5c e d). I tumori T47D shAKT1 esprimevano bassi livelli di E-caderina e alti livelli di vimentina, che potevano essere un preludio di un fenotipo di staminalità, mentre i tumori shAKT2 mostravano il modello opposto, alta E-caderina e bassa vimentina (Fig. 4c). Non sono stati osservati focolai di metastasi al momento del sacrificio in nessun animale con isoforme silenziate (non mostrate).

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Curve di crescita di ( a ) cellule con deficit di T47D shco e AKT o ( d ) cellule di sovraespressione di T47D WT e AKT nei topi NSG. ( b ed e ) HE nei campioni di tumore, le frecce indicano l'invasione del tumore del tessuto adiposo o muscolare adiacente. ( c ) colorazione con E-caderina e vimentina nei tumori con T47D shco e con deficit di AKT. ( f ) HE nei polmoni di T47D myrAKT2 animali portatori di tumore che mostrano focolai di metastasi in 8 animali su 12. ( g ) IHQ per le cellule metastatiche epiteliali nei polmoni delle macchie di citocheratina. ** p <0, 01; *** p <0, 001. n = 3 in ciascun gruppo sperimentale per le curve di crescita del tumore. Gli esperimenti sono stati eseguiti da duplicati.

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Per confermare i risultati della funzione invasiva differenziale delle isoforme AKT, abbiamo sovraespresso le isoforme specifiche. Gli xenotrapianti T47D myrAKT1 hanno mostrato una minore latenza tumorale e un aumento della crescita (Fig. 4d), come precedentemente osservato negli xenotrapianti IBH-6 myrAKT1 9 . Tuttavia, dopo 15 giorni, il tasso di crescita dei tumori T47D myrAKT1 era paragonabile a quello dei tumori T47D WT (Fig. 4d). Questo rallentamento del tasso di crescita delle cellule T47D myrAKT1 potrebbe essere dovuto al fatto che queste cellule sono ancora dipendenti dalla fornitura di estradiolo per la crescita. Gli xenotrapianti T47D myrAKT2 hanno mostrato un tasso di crescita simile agli xenotrapianti WT (Fig. 4d), ma in realtà hanno mostrato un'istologia simile ai tumori lobulari con invasione del tessuto muscolare adiacente (Fig. 4e, frecce). Inoltre, esperimenti a lungo termine (60 giorni dopo l'inoculazione cellulare) hanno mostrato focolai di metastasi nei polmoni di animali portatori di tumore T47D myrAKT2 (Fig. 4f) positivi per il marcatore epiteliale citocitatina (Fig. 4g). Vale la pena ricordare che T47D WT non è una linea cellulare metastatica.

I livelli di tumore AKT1 e AKT2 sono correlati in modo differenziale con la sopravvivenza nei carcinomi mammari invasivi

Infine, per valutare se i livelli di tumore AKT1 e AKT2 sono correlati alla progressione del carcinoma mammario nei pazienti, abbiamo valutato 1105 campioni di carcinoma mammario invasivo disponibili dal sito Web The Cancer Genome Atlas (TCGA) 40, 41 costituito da set di dati con amplificazioni del DNA, mutazioni, delezioni e mRNA up e downregulation (Fig. 5a). Considerando solo i profili di dati di espressione di mRNA per AKT1 e AKT2, abbiamo scoperto che AKT2 ma non AKT1 era associato a una sopravvivenza globale inferiore (Fig. 5b).

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a ) alterazioni genetiche dell'AKT1 (tasso di alterazione dell'11%) o dell'AKT2 (tasso di alterazione del 10%) in 1105 campioni di carcinoma mammario invasivo prelevati dal TCGA. Per AKT1 e per AKT2 l'alterazione predominante nei campioni dei pazienti era la sovraregolazione dell'mRNA. ( b ) Curve di Kaplan-Meier nella popolazione di riferimento che mostrano che l'upregolazione di mRNA di AKT2 era associata a una sopravvivenza globale peggiore (p = 0, 0535) rispetto all'upregolazione di mRNA di AKT1 (p = 0, 935).

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Complessivamente, le nostre scoperte da modelli sperimentali e la meta-analisi TCGA supportano l'idea che la progressione del tumore nel carcinoma mammario coinvolge in modo differenziato le isoforme AKT1 e AKT2. In conclusione, i livelli di AKT1 e AKT2 potrebbero essere utilizzati come biomarcatori della progressione del carcinoma mammario nelle prime fasi del processo di diagnosi per discriminare quale sottogruppo di pazienti potrebbe progredire prima e conseguentemente avere esiti clinici potenzialmente peggiori. Forniamo prove sperimentali e cliniche che è principalmente la sovraespressione di AKT2 che è correlata alla progressione della malattia e ha un peggior valore prognostico nel carcinoma mammario.

Discussione

I nostri risultati mostrano che le isoforme AKT1 e AKT2 regolano le cellule del cancro al seno in modo diverso. Qui descriviamo i meccanismi con cui AKT1 e AKT2 svolgono ruoli specifici nella crescita e nella diffusione del tumore nelle linee cellulari umane IBH-6 e T47D. Abbiamo scoperto che AKT1 è rilevante per la proliferazione cellulare e la sopravvivenza attraverso l'upregolazione di S6 e ciclina D1. Sia l'AKT1 che l'AKT2 sono coinvolti nella migrazione e nell'invasione cellulare, sebbene ciascuna isoforma regola in modo differenziale l'espressione di β1-integrina, FAK, E-caderina, F-actina e vimentina (Fig. 6a) e di conseguenza abbiano effetti opposti sul fenotipo aggressivo (Fig. 6b). Le funzioni cellulari specifiche dell'AKT1 e dell'AKT2 potrebbero essere apprezzate anche nel trapianto in vivo e descriviamo l'invasione dei tessuti adiposi e muscolari adiacenti e le metastasi polmonari derivate dagli xenotrapianti shAKT1 e myrAKT2.

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( a ) Segnalazione specifica di AKT1 e AKT2 e particolare regolazione delle proteine ​​a valle. ( b ) Schema rappresentativo per le funzioni specifiche di AKT1 e AKT2 sulla crescita e l'invasione del tumore.

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Nonostante la crescente quantità di studi sul ruolo delle isoforme dell'AKT nel cancro, i loro ruoli specifici non sono ancora chiaramente chiariti, essendo il tipo di cellula dei risultati e il contesto dipendente. Ciò evidenzia l'importanza di comprendere la specificità di ciascuna isoforma AKT durante la progressione del cancro per definire meglio il loro valore prognostico. La maggior parte degli studi sperimentali fino ad oggi hanno fatto uso di varianti iperattive di AKT come mutanti targetizzati da membrana o strategie di knockdown come lo shRNA in vitro . Con questo approccio, i ruoli distinti di AKT1 come induttore di crescita e AKT2 come repressore di crescita e invasione sono stati ben definiti nelle cellule tumorali ovariche, sia all'interno del tumore che del microambiente 22 . Nella mammella, la maggior parte dei dati nei modelli di topo transgenico concordano sul fatto che l'AKT1 è fondamentale per l'induzione del cancro al seno, mentre l'AKT2 è maggiormente coinvolto nella diffusione metastatica 20, 26 .

Nelle cellule di carcinoma mammario e ovarico, la migrazione e l'invasione indotte da AKT2 sono legate alla sovraregolazione di β1-integrina 31, tuttavia, nelle cellule di carcinoma prostatico, sia AKT1 che AKT2 hanno ridotto la migrazione e l'invasione cellulare attraverso la downregulation di β1-integrina 42 . Qui mostriamo nelle cellule IBH-6 che la downregulation specifica di AKT1, ma non AKT2, ha aumentato l'espressione di β1-integrina e la fosforilazione di FAK in aree di membrana punteggiate compatibili con i siti di adesione focale. La FAK può essere considerata a monte e a valle dell'AKT nella regolazione del fattore di crescita e della motilità cellulare stimolata dall'integrina. Abbiamo precedentemente dimostrato nelle cellule IBH-6 che l'iperattivazione di AKT1 è diminuita, mentre la sovraespressione di PTEN ha aumentato i livelli di FAK 9 . Al contrario, nelle cellule tumorali umane del colon, Wang et al . 43 hanno riferito che AKT1, ma non AKT2, si lega direttamente e fosforilati FAK. Inoltre, qui abbiamo mostrato il coinvolgimento di AKT2, ma non di AKT1, nel rimodellamento del citoscheletro di actina, che è anche rilevante per la migrazione delle cellule tumorali. Complessivamente, i nostri risultati confermano che l'AKT2 ha un ruolo promigratorio nelle cellule del cancro al seno.

Diversi studi hanno considerato la caderina E come un gene soppressore del tumore, suggerendo che la sua ridotta espressione è un requisito per la progressione del tumore. La sovraespressione di AKT1 nelle cellule MCF10A cresciute in 3D Matrigel e iniettate nel dotto mammario del topo, assomigliano al carcinoma duttale in lesioni situiche 44 . Allo stesso modo, abbiamo precedentemente riferito che l'AKT1 è coinvolto nella differenziazione duttale nelle culture 3D e in vivo 9 e che le cellule del carcinoma mammario myrAKT1 formano strutture organizzate e di tipo polare con alta espressione di E-caderina. Qui mostriamo che i tumori T47D con deficit specifico di AKT mostrano la regolazione inversa di E-caderina e vimentina. Nonostante la perdita di E-caderina, i tumori deplemente AKT1 mantengono cellule invasive coesive con livelli più alti di vimentina. Ipotizziamo che è molto probabilmente l'equilibrio tra le proteine ​​invasive piuttosto che il livello di proteine ​​nelle singole cellule, che determina il grado invasivo di un tumore. Nel complesso, ipotizziamo che l'AKT1 funzioni come un soppressore dell'invasione durante le prime fasi della malattia, per cui l'AKT2 migliora l'invasione cellulare e l'aggressività nelle fasi avanzate della malattia (Fig. 6b).

Infine, abbiamo scoperto, in un'analisi univariata di 1105 campioni di carcinoma mammario invasivo da TCGA, che i pazienti portatori di mutazioni che aumentano l'abbondanza del livello di mRNA di AKT1 hanno un esito migliore rispetto ai pazienti con mutazioni a livello di AKT2, che hanno una sopravvivenza globale più breve . Di conseguenza, il nostro studio propone che l'AKT2 costituisca un marker prognostico di scarsi risultati clinici nel carcinoma mammario. Questa conclusione è ulteriormente supportata dai meccanismi cellulari descritti qui in due linee cellulari di carcinoma mammario umano.

Studi recenti che hanno associato l'espressione di AKT alla prognosi del cancro hanno mostrato alcuni risultati contraddittori a seconda delle caratteristiche della popolazione valutata e dell'approccio tecnico 45, 46, 47 . Pereira et al . 47 ha sottolineato che l'AKT2 è coinvolto nell'acquisizione di proprietà simili alle cellule staminali, responsabili dell'invasività e della chemioresistenza e del peggior risultato del carcinoma mammario. Tuttavia, Fohlin et al . 46 hanno dimostrato che i livelli di AKT2 e pAKT (pSer473AKT) erano associati a un tasso di recidiva distante inferiore. Nella stessa linea, Grell et al . 45 hanno mostrato che l'espressione di AKT2 e la presenza concomitante di pAKT (pThr308AKT e / o pSer473AKT) erano collegate a risultati migliori nei pazienti metastatici HER2 + trattati con Trastuzumab. Inoltre, Badve et al . 48 hanno scoperto che la localizzazione nucleare di pAKT (pSer473AKT) era associata a una migliore sopravvivenza a lungo termine nei pazienti con carcinoma mammario ER + / PR +. Altri studi hanno suggerito che AKT1 guida la progressione nel carcinoma mammario in fase iniziale, mentre AKT2 inverte questo effetto 49, 50, 51 . Inoltre, Plant et al . 52 descrivono uno shuffle in AKT1 dal nucleo al citoplasma durante la progressione del tumore al seno. Questo evento potrebbe anche essere correlato all'attivazione proteica differenziale nel tessuto tumorale, come riportato qui; cioè proteine ​​di proliferazione nelle fasi iniziali e proteine ​​di rimodellamento dell'ECM, come β1-integrina, nelle fasi avanzate. Tutte queste evidenze diverse suggeriscono che una solida valutazione di AKT1 e AKT2 nelle fasi precoci e tardive della malattia è suggerita come nuovi marcatori prognostici. Nei pazienti con carcinoma prostatico, l'espressione di AKT e la fosforilazione erano significativamente associate a risultati sfavorevoli, con espressione di AKT1 citosolica correlata con un rischio più elevato di recidiva postoperatoria 53 e livelli di pAKT predittivi di scarso esito clinico 4 .

Infine, gli sforzi per dissezionare i meccanismi molecolari della segnalazione specifica isoforme dell'AKT forniranno nuove intuizioni per la progettazione di terapie più efficaci e selettive per il trattamento del cancro 23, 54, 55, 56, 57 . A questo proposito, siRNA, microRNA, inibitori e anticorpi specifici per isoforme costituiscono strumenti per chiarire i contributi relativi di ciascun segnale isoforme AKT e la localizzazione alla diffusione del cancro. I nostri risultati nelle linee cellulari di carcinoma mammario mostrano che anche se il doppio silenziamento di AKT1 / AKT2 riduce la proliferazione cellulare, migliora sorprendentemente la migrazione e l'invasione cellulare. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che il targeting a livello di PI3K o AKT1 / 2 non sarebbe efficace nel prevenire la progressione del tumore, sebbene il targeting specifico dei segnali guidati da AKT2 potrebbe essere più efficace nel prevenire l'aggressività del cancro. La sfida ora è provare nuove terapie target dirette alla segnalazione a valle attivata da AKT2 in combinazione con farmaci che prendono di mira PI3K e / o mTOR per ottenere un'efficacia ottimale nella riduzione della progressione del carcinoma mammario. Gli inibitori di PanAKT tra cui MK2206, AZD5363 sono attualmente in fase di sperimentazione clinica per tumori solidi avanzati come tumori del pancreas, del colon-retto, della mammella e della prostata. Gli inibitori selettivi per le isoforme di AKT sono stati sviluppati e testati preclinicamente ma non hanno ancora raggiunto studi clinici (ad es. CCT128930 con una maggiore selettività per AKT2 e attività antitumorale) 58 . L'effetto di questi o altri inibitori dell'AKT sull'aggressività cellulare merita ulteriori ricerche sperimentali alla luce dei dati attuali che suggeriscono che le isoforme dell'AKT abbiano ruoli particolari. Il nostro studio suggerisce che l'interruzione specifica di AKT2 potrebbe essere preferibile all'inibizione di panAKT per il trattamento del carcinoma mammario avanzato.

Conclusione

I nostri risultati forniscono una logica per guidare l'uso di AKT1 e AKT2 come biomarcatori della progressione della malattia e potenziali bersagli per nuove terapie. Il loro uso come indicatori prognostici evidenzia l'importanza di valutare con precisione l'espressione dei componenti PI3K / AKT / mTOR se questa segnalazione oncogenica è mirata in ambito clinico. Inoltre, l'identificazione dei componenti a valle della segnalazione di AKT1 e AKT2 coinvolti in ogni fase della malattia faciliterà l'implementazione di nuove terapie basate sui biomarcatori per ritardare o bloccare la progressione.

Sulla base dei risultati mostrati qui, la nostra previsione è che il PI3K, il panAKT o l'inibizione specifica dell'AKT1 potrebbero non essere raccomandati e potrebbero persino essere controindicati nel carcinoma mammario, poiché potrebbero favorire l'invasività del tumore e la diffusione del cancro. Al contrario, il knockout di AKT2 o delle sue molecole a valle potrebbe essere un'opzione migliore per migliorare i risultati del trattamento del cancro al seno, almeno per le malattie metastatiche.

Materiali e metodi

Linee cellulari e cultura

La linea cellulare IBH-6 è derivata da una donna in pre-menopausa di 34 anni 35, esprime ER e PR e cresce in animali NSG senza apporto di ormoni 38 . La linea cellulare umana T47D richiede una precedente iniezione di 0, 25 mg di 17β-estradiolo per crescere nei topi NSG 28 .

Entrambe le linee cellulari sono state mantenute in DMEM F12 (Sigma Aldrich St. Louis, MO) siero bovino fetale al 10% (FBS, Natocor Córdoba Argentina). Per le colture 3D le cellule sono state seminate su Matrigel (BD Biosciences San Jose, CA).

Studi in vitro

Trasfezioni e infezioni

Le linee cellulari IBH-6 e T47D sono state trasfettate stabilmente per sovraesprimere AKT1 (pACL4.1-myrAKT1 9 ) o AKT2 (pCDNA3-myrAKT2, Addgene # 9016). Le trasfezioni sono state eseguite con il reagente alla lipofectamina (Invitrogen) seguendo le istruzioni del produttore. La delezione stabile di AKT1 o AKT2 è stata eseguita utilizzando shRNA lentivirale specifico (TRCN0000022937 per AKT1 o TRCN0000055260 per AKT2, Sigma). Shc-002 shRNA non target è stato usato come vettore di controllo. Per la preparazione lentivirale shRNA specifico è stato cotrasfettato con pCMV-dR 8.74 plasmide di imballaggio e pMD2.G plasmide nelle cellule HEK239T. Dopo due giorni sono state raccolte particelle lentivirali e le cellule sono state trasdotte in presenza di Polybrene (Sigma). Cells stably transfected were selected with 400 μg/ml Geneticin (G418, Invitrogen) or 5 μg/ml Puromicin (Calbiochem) according to selection gene in each case.

Test di proliferazione

4 × 10 4 cells were seeded and maintained during 4 days in DMEM F12 5% SFB medium (for IBH-6) or 5 days in DMEM F12 2% charcoal stripped FBS (chFBS) + 20 nM insulin (for T47D). Il mezzo è stato cambiato a giorni alterni. At the end of the incubation cells were tripsinized and counted in Neubauer chamber.

Test di guarigione delle ferite

5 × 10 5 cells were seeded 24 hours prior to the experiment. Wound was made with a tip and incubated for 21 hours in DMEM F12 5% FBS medium. Photographs were taken all along the wound at the beginning (T0) and at the end of the experiment (Tf). Wound healing areas were quantified as T0-Tf using the ImageJ software.

Transwell assay

5 × 10 4 cells were seeded on top of 8 μm transwell inserts (BD Biosciences) previously coated with 1:6 Matrigel: DMEM F12 medium and incubated for 26 hours. Cells were fixed with cold methanol, stained with Cristal Violet 0, 1% and the cells that passed through the insert were quantified.

Western blots (WB)

Total protein extracts were obtained using RIPA buffer (Sigma). 100 μg of protein from each sample was separated in 10% polyacrylamide electrophoresis gels. Phosphorylated protein's bands were normalized using total proteins, with the density of bands from the control group set arbitrarily to 1.0 using the ImageJ software.

Immunofluorescence (IF)

Cells were fixed with PFA 4%, blocked with PBS 10% FBS and incubated with primary antibodies overnight. After washing with PBS, cells were incubated with FITC or Dylight secondary antibodies (Vector Laboratories Burlingame, CA) and nuclei were counterstained with propidium iodide (PI) or 4′, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Stained cells were analyzed under a Nikon Eclipse E800 Laser Confocal Microscope.

PathScan Intracellular Signaling Array Kit

PathScan Intracellular Signaling Array Kit (Chemiluminescent Readout) #7323 (Cell Signaling Technology) was performed following manufacturer´s instructions for IBH-6 and T47D cell lines modified to overexpress or dowregulate AKT isoforms.

Studi in vivo

Animali

NOD/LtSz-scid/IL-2Rgamma null mice (NSG) from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) were bred at IByME Animal Facility and two-month-old virgin females were used for the experiments. Animal care and manipulation were performed in agreement with the International Guidelines and Regulations from the National Institute of Health. IByME's Ethical Committee approved the experiments and the use of animals for this work CE 023-June 2014.

Xenografts and immunohistochemistry (IHQ)

For IBH-6 xenografts, mice were injected subcutaneously with 5 × 10 6 cells. For T47D xenografts, mice were implanted subcutaneously with silastic pellets containing 17β-estradiol (0.25 mg) and injected subcutaneously with 8 × 10 6 cells mixed with Matrigel. When tumors were palpable, sizes were measured with caliper Vernier and growth curves were performed plotting tumor size (mm 2 ) vs. time.

Tumors, lungs, liver, uterus and ovaries were fixed in 10% formalin, paraffin embedded (FFPE) and sectioned into 5 μm for histochemical analysis. Tumor and tissue histology were evaluated in hematoxylin/eosin (H&E)-stained slides. For IHQ, FFPE tissues were stained for primary antibodies. Primary antiserum was detected after incubation with a biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories Inc.) using the Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories Inc.) and the diaminobenzidine (DAB) Chromogen and Substrate Buffer (Dako, Agilent Technologies). After IHC, the specimens were counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted.

TCGA analysis

Open data from 1105 breast invasive carcinoma samples from The Cancer Genome Atlas dataset (TCGA) 40, 41 and cbioportal platform (//www.cbioportal.org) were used to link AKT alterations to clinical outcomes. For the survival analysis we considered mRNA expression data profiles by RNA Seq for AKT1 and AKT2 and an arbitrary overexpression level greater than three standard deviations from the mean in the reference population.

anticorpi

Total AKT1/2/3 (8312), phosphorylated Ser473AKT1/2/3 (7985), ERK1/2 (94), β1-integrin (8978), cyclin D1 (753) and actin (1616) were purchased from Santa Cruz Biotechnology; total AKT1 (2938), total AKT2 (3063), phosphorylated Ser240/244S6 (2215) and E-cadherin (3195) from Cell Signaling Technology, phosphorylated Tyr861FAK (4804) from Abcam, vimentin (V6630) from Sigma, alpha-tubulin (MS-719) from Neomarkers and cytokeratin Clones AE1/AE3 (M3515) from Dako.

analisi statistiche

Statistical analyses were performed with the GraphPad Prism™ software 6.0 (GraphPad, Inc. CA). One way ANOVA followed by Tukey or Dunnet´s post-tests was used to compare means of multiple experimental groups. When comparing the means of two different groups, two-sided Student's t -test was applied. Tumor growth curves were studied using regression analysis, and the slopes compared using analysis of variance. In all graphs, the mean ± SEM are shown.

Informazioni aggiuntive

How to cite this article : Riggio, M. et al . AKT1 and AKT2 isoforms play distinct roles during breast cancer progression through the regulation of specific downstream proteins. Sci. Rep. 7, 44244; doi: 10.1038/srep44244 (2017).

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