Lo spironolattone antagonista del recettore dell'aldosterone previene l'infiammazione e la fibrosi peritoneali | indagine di laboratorio

Lo spironolattone antagonista del recettore dell'aldosterone previene l'infiammazione e la fibrosi peritoneali | indagine di laboratorio

Anonim

Soggetti

  • chemioprevenzione
  • Infiammazione
  • Dialisi peritoneale
  • Fibrosi renale

Astratto

La fibrosi peritoneale è una complicazione di pazienti con dialisi peritoneale ambulatoriale continua a lungo termine (CAPD). I rapporti hanno indicato che l'angiotensina (Ang) II può essere correlata allo sviluppo della fibrosi peritoneale. Tuttavia, non è noto se l'aldosterone abbia anche un ruolo nello sviluppo dell'infiammazione peritoneale e della fibrosi. Lo scopo del presente studio era di chiarire il ruolo dell'aldosterone nell'infiammazione e nella fibrosi peritoneali. Un modello di ratto di infiammazione peritoneale e fibrosi è stato stabilito dall'iniezione intraperitoneale giornaliera di dializzati e lipopolisaccaride in un intervallo di 4 giorni per un periodo di 7 giorni. Gli animali sono stati assegnati in modo casuale a cinque gruppi come segue: controllo (C); dialisi peritoneale (PD); dialisi peritoneale-spironolattone (PD-S); dialisi peritoneale-cilazapril (PD-C); e dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril (PD-SC). Dopo 30 giorni, la concentrazione di TGF- β 1 nei dializzati di tutti i gruppi di trattamento è stata determinata da ELISA. L'istopatologia del peritoneo parietale è stata esaminata e l'espressione di MCP-1, c-Jun, fibronectina (FN) e TGF- β 1 nella membrana addominale è stata determinata mediante immunoistochimica. Recettore dei mineralcorticoidi (MR), 11 β- idrossisteroidide deidrogenasi di tipo 2 (11 β -HSD2) e CYP11B2 (aldosterone sintasi) sono stati analizzati mediante PCR in tempo reale. La deposizione di collagene era significativamente più alta nel PD rispetto agli altri gruppi. L'espressione di MR, 11 β -HSD2 e CYP11B2 era significativamente più alta nel PD rispetto agli altri gruppi. Il trattamento con spironolattone e / o cilazapril ha parzialmente annullato l'aumento della proteina chemoattractant dei monociti (MCP) -1, pc-Jun, trasformando il fattore di crescita (TGF) - β 1, FN, MR, 11 β -HSD2 e CYP11B2. Inoltre, il trattamento con spironolattone e / o cilazapril ha anche ridotto l'infiltrazione di cellule CD-4- e ED-1 positive nei tessuti peritoneali di ratto dopo fibrosi peritoneale. L'aldosterone esogeno può avere un ruolo chiave nello sviluppo dell'infiammazione peritoneale e della fibrosi. Lo spironolattone ha ridotto l'infiammazione e la fibrosi peritoneale, che è stata associata a ridotta secrezione da macrofagi peritoneali, inattivazione della via della chinasi N-terminale (JNK) c-Jun e successiva downregulation dell'espressione di TGF- β 1.

Principale

La dialisi peritoneale (PD) è un trattamento attraente per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Tuttavia, la PD a lungo termine è associata allo sviluppo di alterazioni funzionali e strutturali della membrana peritoneale. 1 Si ritiene che diversi fattori siano coinvolti nello sviluppo della fibrosi peritoneale nei pazienti con PD. Le citochine infiammatorie nella cavità peritoneale durante la peritonite possono anche scatenare infiammazione cronica e fibrosi.

Numerosi studi hanno ora dimostrato che i macrofagi hanno un ruolo importante in molti aspetti della lesione, dell'infiammazione e della riparazione dei tessuti. 2, 3 I macrofagi possono essere attivati ​​tramite una serie di vie di segnalazione intracellulari (ad es. C-Jun amino terminal chinase (JNK), protein chinase p38 mitogeno attivato (FcR / Syk), Janus chinase / trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (JAK /STATISTICA)).

TGF- β 1 ha un ruolo fondamentale nella fibrosi peritoneale. 4 Durante la CAPD a lungo termine, le concentrazioni di TGF- β negli effluenti PD sono significativamente elevate, in particolare nei pazienti con peritonite. 5 TGF- β 1 guida il deterioramento peritoneale indotto dal liquido dialitico ed evidenzia il ruolo della transizione mesoteliale-mesenchimale mediata da TGF- β 1 nella patofisiologia della disfunzione della membrana peritoneale. 6

JNK è un membro di un gruppo più ampio di protein-chinasi Ser / Thr noto come la famiglia di mitogeni attivati ​​dalla proteina chinasi (MAPK), che può essere attivato da TGF- β attraverso TGF- β -attivato chinasi 1. 7, 8 Lavori recenti hanno identificato JNK1 come mediatore cruciale della transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) 9 indotta da TGF- β 1 e fibrosi polmonare. 10

Diverse linee di evidenza suggeriscono che il sistema renina-angiotensina-aldosterone può avere un ruolo chiave nello sviluppo della fibrosi tissutale. Ang II promuove l'espressione di MCP-1 e TGF- β 1, che alla fine porta alla deposizione nella matrice extracellulare. 11, 12, 13, 14 Sebbene l'aldosterone promuova la fibrosi tissutale in molti organi, il suo contributo alla fibrosi peritoneale e il meccanismo sottostante sono scarsamente compresi. L'espressione di TGF- β 1 indotta da aldosterone nelle cellule mesangiali è regolata dalle vie di segnalazione intracellulare ERK1 / 2, JNK e AP-1. 15

In questo studio, abbiamo studiato l'ipotesi che l'aldosterone potrebbe promuovere l'infiammazione e la fibrosi peritoneali stimolando la secrezione di macrofagi nel peritoneo, attivando la via JNK e sovraregolando l'espressione del TGF- β 1.

MATERIALI E METODI

Modello animale e gruppi di trattamento

Abbiamo stabilito un modello di ratto di infiammazione peritoneale e fibrosi come descritto da Nie et al. Cinquanta ratti maschi di Wistar, di età compresa tra 6 e 8 settimane e 180-200 g di peso, sono stati acquistati presso il Animal Laboratory Service (Harbin Medical University, Cina) e gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida per la cura degli animali.

I ratti sono stati assegnati in modo casuale a cinque gruppi di 10 ratti ciascuno: gruppo I, controllo (C); gruppo II, dialisi peritoneale (PD); gruppo III, dialisi peritoneale-spironolattone (PD-S); gruppo IV, dialisi peritoneale-cilazapril (PD-C); e gruppo V, dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril (PD-SC). L'infiammazione peritoneale è stata stabilita nei ratti nei gruppi II – V mediante iniezione intraperitoneale giornaliera di dializzati di glucosio al 4, 25% (Baxter Healthcare, Deerfield, Illinois, USA) a una dose di 100 ml / kg e lipopolisaccaride (Sigma, St Louis, Missouri, USA) ) alla dose di 0, 6 mg / kg in un intervallo di 4 giorni per un periodo di 7 giorni. Cibo e acqua venivano dati ad libitum a tutti i gruppi. I ratti nei gruppi III – V hanno ricevuto rispettivamente spironolattone (antagonista del recettore dell'aldosterone, 50 mg / kg / giorno), cilazapril (ACE-inibitore, 10 mg / kg / giorno) e spironolattone più cilazapril, rispettivamente. Questi farmaci sono stati sciolti nell'acqua potabile immediatamente prima della somministrazione mediante gavage gastrico una volta al giorno al mattino.

Test di equilibrio peritoneale (PET)

I ratti di tutti i gruppi di trattamento sono stati sottoposti a eutanasia il giorno 30 per la valutazione basale dell'ultrafiltrazione e del trasporto su membrana. A 4 ore dall'infusione intraperitoneale di 30 ml di Dianeal al 4, 25%, gli animali sono stati uccisi. È stato misurato un volume di ultrafiltrazione accurato e sono stati ottenuti campioni di sangue. L'analizzatore biochimico automatico è stato utilizzato per misurare la creatinina nel plasma (P cr ) e nell'effluente PD finale (D), nel glucosio nell'effluente iniziale (D 0 ) e nell'effluente PD finale (D 4 ). Sono stati calcolati i valori di D / P cr e D 4 / D 0 .

Procedure sperimentali

Dopo 30 giorni di trattamento, il 10% di idrato di cloro (un anestetico, 3 ml / kg) è stato iniettato per via intraperitoneale usando un ago di calibro 22. A seguito di un leggero massaggio addominale, un tubo è stato inserito nella cavità peritoneale attraverso un'incisione sulla linea mediana. Il fluido peritoneale è stato aspirato attraverso una siringa senza perdite. Il fluido peritoneale aspirato è stato immediatamente centrifugato (4 ° C, 4000 rpm per 10 minuti) e i surnatanti sono stati conservati a -70 ° C per la misurazione in doppio cieco di TGF- β 1 in seguito. I ratti sono stati uccisi dall'ipovolemia e insieme al peritoneo sono stati ottenuti campioni di tessuto dalla parete addominale lontano dal sito di iniezione. I campioni di tessuto sono stati conservati a -70 ° C.

Analisi del tessuto istologico

I campioni di tessuto (5 × 2 × 2) sono stati quindi immersi in formalina al 10% per 24 ore e incorporati in paraffina. Le sezioni (2 μ m) sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE) e la colorazione tricromica di Masson. Per ogni sezione sono stati osservati 10 campi visivi (× 200 volte). La presenza di collagene è stata valutata quantitativamente dalle sezioni colorate di tricromo di Masson utilizzando il software analitico HPIAS-1000 (Champion Image Engineering Company della Tongji Medical University, Wuhan, Cina). Lo spessore del tessuto connettivo tra il mesotelio e la parete addominale è stato valutato utilizzando il software analitico HPIAS-1000. Sono state misurate tre aree casuali di ciascuna sezione di tessuto e sono state esaminate tre sezioni di tessuto per ratto.

Misure di TGF- β 1 nel liquido della cavità addominale mediante ELISA

I livelli di TGF- β 1 attivato nel liquido della cavità addominale in diverse condizioni sperimentali sono stati misurati con il kit ELISA per TGF- β 1 (R&D Systems, USA) secondo il protocollo del produttore. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata da un lettore di micropiastre. Le concentrazioni di TGF- β 1 attivato sono state determinate dalla curva standard.

L'immunoistochimica

La colorazione immunoistochimica è stata eseguita utilizzando la tecnica streptavidina – biotina – perossidasi. In breve, l'attività della perossidasi endogena è stata estinta in H 2 O 2 allo 0, 3%, quindi i siti di legame con le proteine ​​non specifici sono stati bloccati incubando con siero normale al 10%. MCP-1, pc-Jun, TGF- β 1, FN, macrofagi e linfociti sono stati colorati con anti-MCP-1, anti-pc-Jun, anti-TGF- β 1, anti-FN (Santa Cruz Biotechnology, California, USA), anticorpi anti-CD68 (Abcam, Cambridge, UK) e anti-CD4 (Abcam, Cambridge, UK), rispettivamente. La colorazione marrone e gialla è stata considerata positivamente macchiata. Un totale di 40 campi del peritoneo parietale sono stati osservati alla cieca sotto ingrandimento (× 200) come una valutazione semiquantitativa. La colorazione MCP-1, pc-Jun, TGF- β 1 e FN nel campo del peritoneo parietale è stata valutata dal software analitico HPIAS-1000. I segnali positivi sono stati quantificati come densità ottica (A) × area positiva. Il numero di macrofagi (cellule ED1 +) e linfociti (cellule CD4 +) è stato contato dal software analitico HPIAS-1000.

Isolamento dell'RNA e analisi PCR in tempo reale dei livelli di espressione di MR, CYP11B2 e 11 β -HSD2

L'RNA totale è stato isolato dalla membrana addominale utilizzando il mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) secondo il protocollo del produttore. Il DNA complementare è stato generato utilizzando il sistema di sintesi di primo filamento Super-ScriptTM III (Invitrogen). La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio) e Light Cycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Per amplificare sono stati usati i seguenti set di primer: ratto MR, primer anteriore: 5′-TTGGAGCGTTCTTCACTTGGAC-3 ′, primer inverso: 5′-ATTGTCTTGCTGAATGTAAGGGAGT-3 ′; ratto CYP11B2, primer anteriore: 5′-ATACCACAATACTCCAGGAACAA-3 ′, primer inverso: 5′-AGGCAGCATCACAGACACAA-3 ′; ratto 11 β- idrossisteroide deidrogenasi tipo 2 (11 β -HSD2), primer anteriore: 5′-GAGAGGATGCTACAGACCACTTC-3 ′, primer inversa: 5′-TGCCAACAACCAGACAAATACA-3 ′; e β -attina di ratto, primer anteriore: 5′-TGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3 ′, primer inverso: 5′-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3 ′. Il contenuto di cDNA di ciascun campione è stato determinato usando un metodo di soglia del ciclo comparativo (CT) con 2 ΔΔCT . Per normalizzare i dati, i livelli di espressione della β -attina sono stati usati come controllo interno.

Analisi statistica

Tutti i dati numerici ottenuti sono espressi come media ± sd ANOVA è stata utilizzata per analizzare gruppi con più di due serie di dati e la D di Fisher è stata utilizzata per confrontare gruppi di dati. Tutti i calcoli statistici sono stati elaborati utilizzando il software SPSS 11.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Valori P <0, 05 sono stati considerati statisticamente significativi.

RISULTATI

Cambiamenti morfologici del peritoneo e della funzione peritoneale

I cambiamenti morfologici del peritoneo sono stati valutati dal tricromo di HE e Masson. Come mostrato nella Figura 1, il peritoneo di ratto normale era sottile, costituito da uno strato lineare di cellule mesoteliali e c'erano poche cellule infiammatorie nell'omento delle coliche. Nel gruppo PD, una perdita di cellule mesoteliali e un aumento del numero di cellule infiammatorie nella colica omentale erano evidenti a 4 settimane dopo l'inizio della malattia.

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Istologia del peritoneo in tutti i gruppi dopo dialisi peritoneale giornaliera per 30 giorni. Nel gruppo di controllo ( a e f ), poche cellule mesoteliali e cellule infiammatorie nel peritoneo e nella colica omenta; nel gruppo per dialisi peritoneale ( bec ), una perdita di cellule mesoteliali nel peritoneo e un aumento di cellule infiammatorie nell'omento delle coliche; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone (ceh), dialisi peritoneale-cilazapril ( d e i ) o dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril ( ee j ), lo spironolattone o il cilazapril previene la perdita di cellule mesoteliali e inibisce l'infiltrato infiammatorio. ( a - e ) colorazione ematossilina-eosina (HE) del peritonio (ingrandimento originale × 200); ( f - j ) colorazione ematossilina-eosina (HE) di colica omentum (ingrandimento originale × 200).

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Come mostrato nella Figura 2, rispetto ai ratti normali, nel gruppo PD è stata trovata una grave disfunzione peritoneale dimostrata da una significativa riduzione dell'ultrafiltrazione peritoneale e D 4 / D 0 . Il D / P cr nel gruppo PD era significativamente più alto di quelli dei ratti nel gruppo di controllo ( P <0, 01). Al contrario, lo spironolattone o il cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) hanno attenuato le variazioni ( P <0, 01).

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Il test di equilibrazione peritoneale è stato eseguito per 4 ore alla fine dei 30 giorni. Sono stati determinati il ​​livello D / P cr (1), i rapporti del livello glucosio D4 / D0 (2) e il volume dell'ultrafiltrazione (3). Il trattamento di ciascun gruppo è indicato sotto l'istogramma. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P <0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P <0, 01 vs gruppo di controllo normale, c P <0, 05 vs gruppo di controllo normale.

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Espressione dell'mRNA MR, CYP11B2 e 11 β -HSD2 nei tessuti peritoneali

CYP11B2 è un fattore chiave nella sintesi dell'aldosterone. RT-PCR ha mostrato che l'espressione di mRNA di CYP11B2 e MR nei tessuti peritoneali normali era minima (Figura 3) ma era sostanzialmente sovraregolata nel gruppo PD ( P <0, 01). Al contrario, gli animali che hanno ricevuto il trattamento con spironolattone o cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) hanno mostrato una marcata riduzione del mRNA peritoneale e del CYP11B2 ( P <0, 01).

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Espressione di mRNA MR, CYP11B2 e 11 β -HSD2 nella membrana addominale. Ciascuno dei cinque gruppi di 10 ratti è stato dializzato come descritto in Metodi per 30 giorni. Alla fine di questo periodo, il peritoneo è stato isolato e i livelli di mRNA per MR, CYP11B2 e 11 β -HSD2 sono stati determinati mediante PCR in tempo reale e normalizzati a β -attina. I valori di controllo sono indicati come 1.0. Tutti i valori sono presentati come media ± sem a P < 0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P < 0, 01 vs gruppo di controllo normale.

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Poiché l'attivazione non selettiva della MR da parte dei glucocorticoidi può avere un ruolo anche nella fibrosi peritoneale, abbiamo esaminato l'espressione dell'mRNA di 11 β -HSD2, un enzima che protegge l'attivazione della MR indotta dai glucocorticoidi convertendo l'11-idrossisteride (cortisolo) biologicamente attivo in inattivo Forma di 11-chetosteroidi (cortisone). L'enzima β -HSD2 era assente nel peritoneo del gruppo di controllo ma era sovraregolato nel gruppo PD ( P <0, 01). Rispetto al gruppo PD, lo spironolattone o il cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) hanno attenuato le variazioni ( P <0, 01; Figura 3).

L'antagonismo del recettore dell'aldosterone ha ridotto l'infiammazione e la fibrosi nel peritoneo

Spessore peritoneale e fibre di collagene

Il peritoneo di ratto normale era sottile e consisteva in una deposizione di collagene ridotta, come mostrato dalla colorazione tricromica di Masson (Figura 4). Nel gruppo PD, c'è stato un aumento dello spessore peritoneale con ricchezza di deposizione di matrice di collagene nella zona submesothelial ( P <0, 01). Lo spessore della deposizione di matrice di peritoneo e collagene nei gruppi spironolattone o cilazapril (PD-S, PD-C e PD-SC) era significativamente diverso da quello del gruppo PD ( P <0, 01).

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L'antagonismo del recettore dell'aldosterone ha ridotto la fibrosi peritoneale dopo dialisi peritoneale cronica. Tronrome di Masson colorato per spessore peritoneale medio e collagene (ingrandimento originale × 200) ( a - e ). Nel gruppo di controllo ( a ), il peritoneo era sottile; nel gruppo dialisi peritoneale ( b ), è stato osservato un aumento dello spessore peritoneale con una ricchezza di deposizione di matrice di collagene; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone ( c ), dialisi peritoneale-cilazapril ( d ) o dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril ( e ), spironolattone o cilazapril recuperano il cambiamento. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P < 0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P < 0, 01 vs gruppo di controllo normale.

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Livelli di espressione FN e MCP-1

La deposizione di FN e MCP-1 è stata aumentata nel gruppo PD ( P <0, 01; Figure 5 e 6). Il trattamento con spironolattone o cilazapril ha attenuato la deposizione di FN e MCP-1 con colorazione debole delle cellule mesoteliali. L'analisi semiquantitativa ha mostrato che i livelli di espressione di MCP-1 e FN nei ratti trattati con spironolattone / cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) erano significativamente inferiori rispetto a quelli nei ratti PD ( P <0, 01).

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L'antagonismo del recettore dell'aldosterone ha ridotto l'FN nel peritoneo. Colorazione immunoistochimica per FN (marrone, ingrandimento originale × 200) ( a - e ). Nel gruppo di controllo ( a ), la deposizione di FN era bassa; nel gruppo dialisi peritoneale ( b ), la FN era aumentata; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone ( c ), dialisi peritoneale-cilazapril ( d ) o dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril ( e ), spironolattone o cilazapril recuperano il cambiamento. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P < 0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P < 0, 01 vs gruppo di controllo normale.

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L'antagonismo del recettore dell'aldosterone ha ridotto l'espressione di MCP-1 nel peritoneo. Colorazione immunoistochimica per MCP-1 (marrone, ingrandimento originale × 200) ( a - e ). Nel gruppo controllo ( a ), la deposizione di MCP-1 era debole; nel gruppo per dialisi peritoneale ( b ), sono stati aumentati gli MCP-1; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone ( c ), dialisi peritoneale-cilazapril ( d ) o dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril ( e ), spironolattone o cilazapril recuperano il cambiamento. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P < 0, 01 vs gruppo dialisi peritoneale, b P < 0, 01 vs gruppo controllo normale.

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Numero di cellule positive per ED-1- e CD-4

Immunohistochemistry ha mostrato che sia le cellule positive per ED-1- che CD-4 nel gruppo di controllo erano minime (Figura 7). Un aumento significativo del numero di cellule positive per ED-1- e CD-4 è stato osservato nel gruppo PD ( P <0, 01); questo aumento è stato significativamente inibito dal trattamento con spironolattone o cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC). L'analisi quantitativa ha mostrato che sia le cellule ED-1- sia le CD-4 positive nei tessuti peritoneali dei ratti trattati con spironolattone / cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) erano significativamente inferiori rispetto a quelle nel gruppo PD ( P <0, 01).

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L'antagonismo del recettore dell'aldosterone ha ridotto l'infiammazione dopo dialisi peritoneale cronica. Colorazione immunoistochimica per infiltrazioni di linfociti e macrofagi. ( a - e ) Linfociti identificati mediante colorazione immunoistochimica di CD4 (marrone, ingrandimento originale × 200); ( f - j ) ED1 + macrofagi identificati mediante colorazione immunoistochimica di CD68 (marrone, ingrandimento originale × 200). Nel gruppo di controllo ( a e f ), le cellule CD-4- e ED-1 positive erano minime; nel gruppo per dialisi peritoneale ( be g ), il numero di cellule CD-4- e ED-1 positive è aumentato; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone (ceh), dialisi peritoneale-cilazapril ( d e i ) o dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril ( ee j ), spironolattone o cilazapril recuperano il cambiamento. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P < 0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P < 0, 01 vs gruppo di controllo normale.

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Inattivazione del c-Jun Pathway da parte dell'antagonismo del recettore dell'aldosterone

L'espressione di pc-Jun era debole nei ratti normali (Figura 8). Il gruppo PD ha mostrato una maggiore espressione pc-Jun nella membrana addominale ( P <0, 01), mentre il trattamento con spironolattone o cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) ha mostrato un'espressione pc-Jun ridotta ( P <0, 01) .

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Effetto dell'antagonismo del recettore dell'aldosterone sull'espressione del pc-Jun nel peritoneo dopo dialisi peritoneale giornaliera per 30 giorni. Colorazione immunoistochimica per pc-Jun (marrone, ingrandimento originale × 200) ( a - e ). Nel gruppo controllo ( a ), l'espressione di pc-Jun era debole; nel gruppo dialisi peritoneale ( b ), l'espressione di pc-Jun era maggiore; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone ( c ), dialisi peritoneale-cilazapril ( d ) o dialisi peritoneale-spironolattone-cilazapril ( e ), spironolattone o cilazapril recuperano il cambiamento. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P < 0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P < 0, 01 vs gruppo di controllo normale.

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L'antagonismo del recettore dell'aldosterone sottoregola l'espressione di TGF- β 1

È noto che il TGF- β 1 ha un ruolo critico nell'alterazione strutturale peritoneale nel PD. Come mostrato nella Figura 9 (1), TGF- β 1 rilasciato nel liquido della cavità addominale è stato notevolmente aumentato nel gruppo PD ( P <0, 01) ma è stato significativamente inibito dallo spironolattone o cilazapril ( P <0, 01).

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L'antagonismo del recettore dell'aldosterone ha ridotto i livelli di TGF- β 1 sia nel dializzato che nel peritoneo. Saggio immunosorbente enzimatico di TGF- β 1 nel liquido della cavità addominale (1). Colorazione immunoistochimica per TGF- β 1 nella membrana addominale dei ratti (2) (marrone, ingrandimento originale × 200) ( a - e ). Nel gruppo di controllo ( a ), TGF- β 1 era debole; nel gruppo dialisi peritoneale ( b ), l'espressione di TGF- β 1 è aumentata; e nei gruppi dialisi peritoneale-spironolattone ( c ), dialisi peritoneale-cilazapril ( d ) o dialisi peritoneale-spironolattone - cilazapril ( e ), spironolattone o cilazapril recuperano il cambiamento. Ogni istogramma rappresenta la media ± sem di 10 animali. a P < 0, 01 vs gruppo per dialisi peritoneale (PD), b P < 0, 01 vs gruppo di controllo normale.

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Il peritoneo dei ratti normali presentava un'espressione debole di TGF- β 1 (Figura 9 (2)). Nessuna colorazione delle cellule mesoteliali peritoneali era evidente nel gruppo di controllo. I ratti del gruppo PD hanno mostrato una maggiore immunocolorazione TGF- β 1 nella membrana addominale ( P <0, 01), mentre il trattamento con spironolattone o cilazapril (gruppi PD-S, PD-C e PD-SC) è stato caratterizzato da una riduzione TGF- β 1 immunocolorazione nella membrana addominale ( P <0, 01).

DISCUSSIONE

L'infiammazione peritoneale è un passo iniziale ed essenziale nello sviluppo di complicanze peritoneali associate a PD a lungo termine. Il peritoneo è infiltrato di globuli bianchi e macrofagi, che possono rilasciare alti livelli di radicali liberi dell'ossigeno, proteinasi, prostaglandine, leucotrieni e citochine, tra cui TNF-α, IL-1 β , MCP-1 e RANTES. È noto che queste sostanze danneggiano l'integrità strutturale del peritoneo colpendo le cellule mesoteliali peritoneali, causando infine fibrosi e perdita della funzione peritoneale. 17, 18, 19, 20, 21

Un ruolo chiave per i macrofagi nella fibrosi è stato osservato in diversi contesti di organi. Nei pazienti PD, rispetto ai pazienti non infetti, i macrofagi mostrano una upregulation ex vivo . 22 Alcuni studi hanno dimostrato che i macrofagi possono partecipare alla fibrosi peritoneale umana attraverso la stimolazione della crescita cellulare dei fibroblasti e la produzione di CCL18. 23 Altre ricerche hanno indicato che i macrofagi possono anche avere un ruolo cruciale nella fibrosi peritoneale indotta da glucosio elevato e che la funzione dei macrofagi M2 nella fibrosi peritoneale può essere correlata alle vie di segnalazione TGF- β / Smad. 24 Nel nostro studio, abbiamo scoperto che la quantità di macrofagi ED1 è aumentata nei ratti PD.

La funzione della segnalazione JNK dipende dalla fosforilazione dei domini di attivazione (tramite MKK4 o MKK7 a monte) che consente a JNK di fosforilare una gamma di proteine ​​target che includono fattori di trascrizione (ad esempio, c-Jun, JunD, Smad3) e altri elementi della via di segnalazione che indurre risposte pro-infiammatorie, pro-fibrotiche e / o pro-apoptotiche. 25 L' attivazione di JNK può essere rilevata nell'infiltrarsi di macrofagi nella malattia sperimentale della membrana basale anti-glomerulare di ratto e nel danno renale acuto indotto da cisplatino. 26, 27 Un altro studio sulla malattia renale umana ha utilizzato l'immunodetection della fosforilazione di c-Jun per identificare la segnalazione JNK in molte cellule glomerulari e tubolari, nella misura in cui l'attivazione JNK tubulointerstiziale è stata negativamente correlata con la velocità di filtrazione glomerulare stimata. 28 Nel nostro studio, pc-Jun ha mostrato livelli di espressione più elevati nel gruppo PD rispetto ai livelli ridotti di ex-pressione negli altri gruppi trattati con spironolattone e / o cilazapril, indicando che JNK è attivato nel gruppo PD.

Studi recenti hanno dimostrato la presenza di crosstalk tra la via di segnalazione JNK e TGF- β 1. Ad esempio TGF- β 1 può mediare l'attivazione di JNK1. 29, 30 Inoltre, è stato dimostrato che la fosforilazione JNK-dipendente di c-Jun e JunB media gli effetti antagonistici delle citochine infiammatorie sulla segnalazione TGF- β 1 / Smad. 30 Nella fibrosi polmonare, gli studi hanno dimostrato l'importanza fondamentale della via di segnalazione JNK1 nell'aumentare l'espressione dei mediatori pro-fibrotici e hanno identificato JNK1 come un amplificatore cruciale di EMT indotto da TGF- β 1. 9, 10

L'aldosterone è un ormone steroideo che agisce attraverso il recettore dei mineralcorticoidi (MR). La MR si differenzia dagli altri recettori steroidei in quanto risponde a due ligandi fisiologici, l'aldosterone e il cortisolo. La MR lega l'aldosterone e il cortisolo con uguale affinità, ma la presenza dell'enzima inattivante il cortisolo 11 β -HSD2 conferisce specificità all'aldosterone per la MR nei tessuti in cui sono coespressi. 31 Il finanziatore 32 ha recentemente suggerito che l'11- β HSD2 può essere importante nella selettività dell'aldosterone inibendo la capacità del cortisolo di agire come agonista della MR piuttosto che escludere il cortisolo dal legame con la MR. Nel nostro studio, la MR è appena rilevabile e 11 β -HSD2 è assente nel peritoneo normale. Tuttavia, MR e 11 β -HSD2 sono sovraregolati nel peritoneo dopo infiammazione e fibrosi. La upregulation parallela di 11 β -HSD2 e MR suggerisce il potenziale per la segnalazione specifica dell'aldosterone all'interno del peritoneo fibrotico.

La MR è presente in varie cellule non epiteliali, dove l'aldosterone provoca infiammazione e fibrosi attraverso azioni genomiche e non genomiche. 33 Abbiamo scoperto che l'espressione di MR e CYP11B2 era migliorata nel peritoneo. CYP11B2 è un fattore chiave nella sintesi dell'aldosterone. I MR dei macrofagi sono necessari per la traduzione dell'infiammazione e dello stress ossidativo in fibrosi interstiziale e perivascolare dopo carenza di NO, anche quando l'aldosterone plasmatico non è elevato. 34 Lo spironolattone ha impedito questi cambiamenti, che potrebbero essere una ragione per la riduzione della fibrosi.

È stato riportato che l'aldosterone induce la sintesi del collagene nella fibrosi cardiaca in coltura, 35 cellule muscolari lisce vascolari 36 e cellule mesangiali glomerulari. 37 Numerosi studi hanno dimostrato che lo spironolattone agisce per prevenire la fibrosi cardiaca e renale inibendo la sintesi di inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1, TGF- β 1, MCP-1 e specie reattive dell'ossigeno. 38, 39 L' irbesartan e lo spironolattone sembrano ridurre l'entità del danno peritoneale causato dalla peritonite batterica. 40 L' aldosterone stimola la via MAPK e la progressione del ciclo cellulare nelle cellule mesangiali principalmente tramite MR. 41 Un altro studio ha dimostrato che l'aldosterone ha indotto rapidamente la fosforilazione di JNK e lo spironolattone ha abolito la fosforilazione di JNK indotta da aldosterone, 42 che è in accordo con i nostri risultati. Lo spironolattone ha mostrato di downregolare ED1, MCP-1, pc-Jun, TGF- β 1 e FN nel peritoneo viscerale.

Nel nostro studio, l'aldosterone può avere un ruolo nella fibrosi peritoneale combinandosi con MR, stimolando l'infiltrazione di monociti / macrofagi e inducendo la via di segnalazione JNK e TGF- β 1. Lo spironolattone può avere un ruolo protettivo nella prevenzione e nel trattamento della fibrosi peritoneale.