Neurodegenerazione indotta dall'anestesia nel cervello di ratto fetale | ricerca pediatrica

Neurodegenerazione indotta dall'anestesia nel cervello di ratto fetale | ricerca pediatrica

Anonim

Astratto

Abbiamo studiato l'estensione della neurodegenerazione indotta da isoflurano sui feti di ratti gravidi esposti in utero . I ratti gravidi al 21 ° gestazionale erano divisi in tre gruppi sperimentali. I ratti nel gruppo di controllo hanno respirato spontaneamente il 100% di ossigeno per 1 ora. I ratti nei gruppi di trattamento hanno respirato isoflurano all'1, 3 o 3% in ossigeno al 100% attraverso un tubo endotracheale, con ventilazione meccanica per 1 ora. I cuccioli di ratto sono stati consegnati con taglio cesareo 6 ore dopo il trattamento e il sangue fetale è stato prelevato dal ventricolo sinistro di ciascun cuore fetale e valutato per S100β. I cervelli fetali sono stati quindi valutati per l'apoptosi, utilizzando l'immunoistochimica caspase-3 nella regione CA1 dell'ippocampo e della corteccia retrospleniale (RS). Il gruppo di trattamento con isoflurano al 3% ha mostrato livelli significativamente più alti di livelli di S100β e ha aumentato significativamente la densità media delle cellule totali caspasi-3 positive nell'ippocampo CA1 e nella corteccia RS rispetto al gruppo controllo e ai gruppi isoflurano 1, 3%. Non ci sono state differenze nei livelli di S100β o densità delle cellule positive alla caspasi-3 tra i gruppi di controllo e l'1, 3% di isoflurano. L'isoflurano ad una concentrazione del 3% per 1 ora ha aumentato la neurodegenerazione nell'area dell'ippocampo CA1 e la corteccia retrospleniale nel cervello in via di sviluppo dei ratti fetali.

Principale

Prove crescenti suggeriscono che gli anestetici per inalazione comunemente usati, in particolare l'isoflurano, inducono dose e tempo in modo inducente danni in vari tipi di tessuti e cellule, tra cui fette di ippocampo (1), linfociti (2, 3), neuroglioma (4), cellule epatiche ( 5), fibroblasti gengivali (6), cellule neurosecretorie PC12 (7, 8) e neuroni corticali e striatali primari (2, 7, 8). Negli studi sugli animali, l'isoflurano, da solo o in combinazione con midazolam o protossido di azoto, ha causato una neurodegenerazione diffusa nel cervello dei roditori di 7 anni ed è stato associato con conseguente deterioramento cognitivo (9, 10). Negli anziani roditori, l'esposizione all'isoflurano ha causato anche un persistente deterioramento della memoria (11). Recenti studi clinici suggeriscono una maggiore incidenza di difficoltà di apprendimento nei bambini esposti all'anestesia durante un intervento chirurgico prima dei 3 anni, in particolare nei bambini nel corso di più interventi chirurgici (12, 13).

Le donne in gravidanza a volte richiedono l'anestesia generale per vari interventi chirurgici, come i tagli cesari e gli interventi fetali. Poiché gli anestetici attraversano facilmente la placenta, questi interventi espongono lo sviluppo del cervello fetale anche agli anestetici per inalazione. Poiché i neuroni nei cervelli in via di sviluppo sono particolarmente vulnerabili alla neurodegenerazione mediata dall'anestesia (9), è possibile che gli anestetici per inalazione somministrati a donne in gravidanza possano danneggiare i cervelli fetali in via di sviluppo (14). Abbiamo precedentemente dimostrato che l'1, 3% di isoflurano somministrato durante la tarda gravidanza non ha prodotto lesioni rilevabili al cervello fetale di ratto (15). Tuttavia, nel caso della chirurgia fetale utilizzata per correggere varie malformazioni congenite durante la mezza gestazione (18–25 settimane) (16), il cervello fetale può essere esposto a 2-3 volte (2, 5–3 concentrazione alveolare minima [MAC]) le concentrazioni cliniche normalmente utilizzate degli anestetici per inalazione per rilassare la muscolatura liscia uterina e fornire un'adeguata anestesia (16). La chirurgia fetale è un'area in rapida crescita e in evoluzione e può diventare la terapia standard per la maggior parte delle malformazioni invalidanti che di solito vengono trattate nei bambini piccoli (16, 17). Considerando le caratteristiche dose-dipendenti della neurodegenerazione mediata dall'anestesia in entrambe le colture cellulari (2, 18) e nei modelli animali (9), è importante e urgente sapere se le alte concentrazioni di anestetici per inalazione normalmente utilizzate durante la chirurgia fetale causeranno neurodegenerazione in lo sviluppo del cervello fetale. In seguito all'uso di una bassa concentrazione di isoflurano nel nostro studio precedente (15), questo studio ha ulteriormente studiato se le alte concentrazioni di isoflurano inalate da madri in gravidanza durante la chirurgia fetale avrebbero causato neurodegenerazione nello sviluppo del cervello di ratto fetale.

METODI

Animali.

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Pennsylvania ha approvato tutte le procedure e i protocolli sperimentali utilizzati in questo studio. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza. Le femmine di ratto Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) erano alloggiate in gabbie di polipropilene e la temperatura della stanza veniva mantenuta a 22 ° C, con un ciclo luce-buio di 12 ore. Ratti in gravidanza a gestational d 21 (E21) sono stati usati per tutti gli esperimenti, come nel nostro studio precedente (15), perché questa volta corrisponde approssimativamente alla metà della gestazione negli esseri umani (9, 19) ed è un momento comune per la maggior parte degli interventi fetali (18–25 sett.) (16).

Protocollo sperimentale.

Il nostro precedente studio ha dimostrato che l'1, 3% di isoflurano per 6 ore è la massima esposizione che non causerebbe un effetto dannoso sui valori dei gas nel sangue arterioso, senza intubazione tracheale. Ai fini del disegno sperimentale, abbiamo prima eseguito uno studio pilota, utilizzando otto ratti gravidi, per determinare il tempo di esposizione massimo che MAC 2 MAC di isoflurano (3%) possono essere utilizzati senza ridurre la pressione arteriosa e peggiorare i gas nel sangue arterioso ( ABG) valori, anche con intubazione tracheale e ventilazione meccanica. I risultati del nostro studio pilota hanno indicato che una durata massima di esposizione dell'isoflurano al 3% era di 1 ora e che l'ossigeno al 100% era anche necessario per prevenire l'ipossia durante il trattamento. Pertanto, nel nostro progetto sperimentale formale, come dimostrato nella Figura 1, abbiamo diviso gli animali in tre gruppi: controllo, bassa concentrazione di isoflurano (1, 3%) e alta concentrazione di gruppi di trattamento isoflurano (3%). Le femmine di ratto nel gruppo di controllo hanno inalato solo umidificato al 100% O 2 per 1 ora in una camera, con monitoraggio e mantenimento della loro temperatura rettale a 37 ± 0, 5 ° C, utilizzando un tampone isotermico deltafase (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA ). Anche i livelli di ossigeno e anidride carbonica nella camera sono stati monitorati e mantenuti utilizzando un monitor per anestesia Datex-Ohmeda Capnomac Ultima ULT-1A-27–08 (Instrumentarium Corp., Helsinki, Finlandia) come descritto nel nostro studio precedente (15). I ratti gravidi nei gruppi di trattamento sono stati inizialmente anestetizzati con inalazione dell'1, 3% di isoflurano e la loro trachea è stata intubata con un tubo endotracheale (angiocatetere iv n. 14), seguito da ventilazione meccanica, utilizzando un ventilatore MR1–1 (CWE, Inc., Ardmore, PAPÀ). La temperatura rettale è stata monitorata continuamente durante l'esperimento da un termometro (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA) per entrambi i gruppi di trattamento ed è stata mantenuta a 37 ± 0, 5 ° C, utilizzando un pad di riscaldamento ospedaliero (The Davol Rubber Company, Providence, RI). Un catetere arterioso è stato posizionato nell'arteria femorale sinistra per il monitoraggio continuo della pressione arteriosa media (MAP) e la raccolta di campioni di sangue per i gas del sangue arterioso (ABG). Abbiamo ottenuto MAP e ABG al basale nei ratti in gravidanza dopo il posizionamento di un catetere arterioso nell'arteria femorale sinistra mentre gli animali venivano anestetizzati con isoflurano all'1, 3%. Successivamente, le femmine di ratto in gravidanza nei due gruppi di trattamento hanno inalato concentrazioni di isoflurano basse (1, 3%) o alte (3%) per 1 ora. Il MAP è stato costantemente monitorato durante gli esperimenti e il sangue arterioso dal catetere arterioso femorale sinistro veniva raccolto periodicamente per determinare i valori di ABG. Per i ratti in gravidanza sottoposti al trattamento con isoflurano al 3%, sono state utilizzate occasionali iniezioni di bolo iv di fenilefrina a 0, 3 mg / kg attraverso la vena femorale sinistra per mantenere i valori di MAP e ABG entro il normale intervallo fisiologico, senza differenze significative rispetto alla bassa concentrazione (1.3 %) trattamento con isoflurano (Tabella 1; Fig. 2). Queste iniezioni imitano uno scenario di pratica clinica durante la chirurgia fetale. Perché, in ostetricia, la fenilefrina è il vasopressore raccomandato per mantenere la pressione arteriosa entro limiti normali (20) ed è un fattore importante nel mantenimento del flusso sanguigno uterino. Per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha chiaramente dimostrato che la stessa fenilefrina può indurre la neurodegenerazione nello sviluppo del cervello fetale. La glicemia è stata misurata simultaneamente con un glucometro (ACCU-CHECK Advantage, Roche Diagnostics Corporations, Indianapolis, IN) per rilevare e trattare l'ipoglicemia. Il nostro precedente studio ha dimostrato che l'isoflurano somministrato a donne in gravidanza supera rapidamente la barriera emato-encefalica e che le concentrazioni di isoflurano misurate nel cervello fetale si equilibrano rapidamente con le concentrazioni di isoflurano inalato delle loro madri in gravidanza (15). Non abbiamo ulteriormente misurato le concentrazioni di isoflurano nel cervello fetale per questo studio.

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Nomogramma che illustra la distribuzione delle madri in gravidanza e dei loro feti tra i diversi gruppi sperimentali.

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Tabella a grandezza naturale

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Cambiamenti di MAP durante il trattamento dell'isoflurano a diverse concentrazioni. Cerchio solido , 3% isoflurano; piazza aperta , 1, 3% isoflurano. n = 6 per ogni punto temporale.

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Preparazione del sangue e dei tessuti cerebrali.

A 6 ore dopo l'interruzione di 1 ora di trattamento con isoflurano all'1 o 3% o inalazione di ossigeno al 100% nel caso del gruppo di controllo, i ratti in gravidanza sono stati anestetizzati con sodio pentobarbitale intraperitoneale (ip 100 mg / kg) e i cuccioli sono stati somministrati tramite taglio cesareo. Due cuccioli di ogni madre incinta sono stati scelti casualmente per ottenere sangue e tessuto cerebrale per studiare l'estensione della neurodegenerazione. Abbiamo scelto di eseguire la sezione cesareo per ottenere sangue e cervello fetali a 6 ore dopo l'interruzione del trattamento di anestesia di 1 ora perché i cervelli in via di sviluppo di roditori neonati hanno chiaramente dimostrato neurodegenerazione precoce indotta dall'anestesia circa 5-8 ore dopo l'inizio del trattamento di anestesia in precedente studi. Pertanto, 7 ore (1 ora di trattamento di anestesia più 6 ore di durata postanestesia) dopo l'inizio del trattamento di anestesia sono state considerate un momento sensibile nel tempo per rilevare la neurodegenerazione precoce e sono state utilizzate in questo studio (9, 15). Il pentobarbital è stato ampiamente utilizzato per il sacrificio di animali e non dovrebbe influenzare in modo significativo l'estensione della neurodegenerazione in questo studio perché i cervelli sono stati rimossi immediatamente dopo l'uso del pentobarbital. Il sangue (0, 1 mL) è stato raccolto dal ventricolo sinistro fetale per la determinazione di S100β, un biomarcatore utile raccomandato per il danno cerebrale fetale durante la gravidanza (21). Successivamente, i cervelli fetali sono stati perfusi per via transcardiale con soluzione salina normale ghiacciata seguita da paraformaldeide al 4% in PBS (pH 7, 4). I cervelli sono stati quindi rimossi e postfissati durante la notte nello stesso fissativo a 4 ° C e crioprotetti in saccarosio al 30% (peso / vol) a 4 ° C per 24 ore. I cervelli sono stati quindi congelati in isopentano a -20 ° C e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. Le sezioni coronali seriali (10 μm) sono state tagliate in un criostato (Dolbey-Jamison Optical Company, Inc., Pottstown, PA), quindi montate su vetrini rivestiti di gelatina e conservate a -80 ° C fino al momento dell'uso.

Determinazione di S100ß nel sangue fetale.

I livelli di S100β nel sangue possono essere un utile indicatore del danno cerebrale fetale durante la gravidanza (21). Abbiamo misurato i livelli di S100β nel sangue fetale, usando i kit Sangtec 100 ELISA (DiaSorin, Inc., Stillwater, MN), seguendo il protocollo del produttore come precedentemente descritto (22). In breve, 50 μL di plasma sono stati collocati in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e miscelati, con 150 μL di tracciante dal kit e incubati per 2 ore. Questo è stato quindi seguito da substrato (3, 3 ′, 5, 5 ′ di tetrametilbenzidina, TMB) e soluzione di arresto. Il OD è stato letto a 450 nm. La sensibilità è stata determinata tracciando la curva standard e la concentrazione, usandola per determinare le concentrazioni dei campioni. Abbiamo usato solo due campioni di sangue fetale per ogni madre incinta a causa delle difficoltà nell'ottenere abbastanza sangue (0, 1 mL) da ogni feto per una misurazione adeguata del livello di S100β.

Immunohistochemistry for caspase-3.

Le cellule caspase-3-positive sono state misurate nella regione ippocampale CA1 e nella corteccia retrospleniale, usando metodi immunoistochimici che noi e altri abbiamo descritto in precedenza (15). Queste due regioni del cervello sono state scelte perché sono particolarmente vulnerabili alla neurodegenerazione mediata dall'anestesia (9, 15) e sono importanti per la memoria e l'apprendimento. In breve, le sezioni del cervello sono state incubate per la prima volta in acqua ossigenata al 3% in metanolo per 20 minuti per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Le sezioni sono state quindi incubate con una soluzione bloccante contenente il 10% di siero di capra normale in PBS contenente lo 0, 1% di Tween 20 (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente dopo il lavaggio con lo 0, 1% di PBST. L'anticorpo primario caspase-3 antiactivato (1/200, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) è stato quindi applicato in soluzione bloccante e incubato a 4 ° C durante la notte. Le sezioni di tessuto sono state biotinilate con anticorpo anti-coniglio di capra (1/200, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) in PBST dello 0, 1% per 40 minuti, seguita da incubazione con il complesso perossidasi avidin-biotinilato (Vectostain ABC-Kit, Vector Lab, Burlingame, CA) per 40 min. Le sezioni di tessuto sono state colorate con diamminobenzidina (DAB, Vector Laboratories, Burlingame, CA) per 8 minuti e controcolorate con ematossilina modificata. Le sezioni di controllo negativo sono state incubate in soluzione bloccante che non conteneva anticorpi primari. Le immagini sono state acquisite e valutate a 200 × utilizzando il software IP lab 7.0 collegato al microscopio Olympus IX70 (Olympus Corporation, Giappone) dotato di una fotocamera Cooke SensiCam (Cooke Corporation, Romulus, MI). Tre sezioni di tessuto cerebrale a 10 micron, corrispondenti all'Atlante del sistema nervoso in via di sviluppo del ratto, Figura 105 (23), sono state scelte da ciascun animale e analizzate per le cellule positive alla caspasi-3 nelle due regioni del cervello. Due individui non vedenti ai trattamenti hanno contato il numero totale di cellule caspase-3 positive nella regione ippocampale CA1 e nella corteccia retrospleniale. Le aree della regione dell'ippocampo CA1 e della corteccia retrospleniale sono state definite secondo l'Atlante del sistema nervoso in via di sviluppo del ratto, Figura 105 (23) e l'area misurata utilizzando il software di elaborazione e analisi delle immagini IPLab Suite v3.7 (Biovision Technologies, Exton, PA ; www.BioVis.com.). La densità delle cellule positive alla caspasi-3 in una particolare regione del cervello è stata calcolata dividendo il numero di cellule positive alla caspasi-3 per l'area di quella regione del cervello.

Analisi statistica.

Abbiamo calcolato la media dei dati di due feti scelti casualmente dalla stessa madre e abbiamo usato questa media come un singolo campione per tutte le analisi dei dati derivate dai feti per ridurre la varianza da cucciolate di dimensioni diverse, come è stato fatto anche per il nostro studio precedente (15). Sei madri in gravidanza sono state utilizzate per ciascun gruppo di trattamenti di anestesia, quindi il valore n utilizzato per l'analisi statistica dei valori MAP e ABG per ciascun gruppo sperimentale era 6. Poiché i dati fetali sono stati mediati da due feti della stessa madre per formare un dato punto per i livelli ematici di S100β e densità della caspasi-3 nelle diverse regioni del cervello, il valore n era anche 6. I risultati delle misurazioni ABG e MAP nei ratti in gravidanza sono stati analizzati utilizzando misurazioni ripetute ANOVA a due vie a causa di diversi punti temporali. I dati per i livelli di S100β e la densità di caspasi-3 nelle diverse regioni del cervello fetale sono stati analizzati utilizzando ANOVA a una via, seguito da test di confronto multiplo post hoc Tukey. In tutti gli esperimenti, le differenze sono state considerate statisticamente significative con p <0, 05.

RISULTATI

Confronto delle variabili fisiologiche di base di ABG e MAP.

Come mostrato nella Tabella 1 e nella Figura 2, abbiamo mantenuto i valori ABG e MAP all'interno del normale intervallo fisiologico nei gruppi di trattamento che ricevevano isoflurano all'1, 3 o al 3%. Ciò è stato fatto con iniezioni endovenose di fenileferina per il gruppo che riceveva isoflurano al 3% e l'uso di ossigeno al 100% come vettore di gas, imitando lo scenario clinico della chirurgia fetale. Non ci sono state differenze significative tra le concentrazioni basse e alte dei gruppi di trattamento con isoflurano su qualsiasi variabile misurata per ABG e MAP ( n = 6 per entrambi). L'adozione di queste misure riduce la possibilità che la neurodegenerazione indotta dall'isoflurano nel cervello fetale sia stata causata da effetti collaterali fisiologici ( ad es. Ipotensione, ipossia e ipercapnia).

La maggiore concentrazione di isoflurano ha aumentato i livelli di S100β nel sangue fetale.

Sebbene non statisticamente significativo, il livello medio di S100β nel ratto fetale le cui madri hanno ricevuto il trattamento con isoflurano all'1, 3% per 1 ora era leggermente superiore rispetto al gruppo di controllo (Fig. 3). Tuttavia, il livello medio di S100β nel feto le cui madri sono state trattate con isoflurano al 3% per 1 ora è stato significativamente aumentato rispetto al livello di S100β nel gruppo di controllo (aumento del 121% rispetto al livello di controllo, p <0, 05, n = 6 ).

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L'isoflurano ad alta concentrazione (3%) ha aumentato S100β nel sangue fetale di ratto. I livelli di S100β nel sangue ottenuti dalla puntura del ventricolo sinistro sono stati determinati usando un kit ELISA Sangtic 100. ISO, isoflurano. I dati rappresentano la media ± SE di 12 feti di ratto. * p <0, 05 rispetto sia al controllo che all'1, 3% ISO.

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La maggiore concentrazione di isoflurano ha aumentato l'apoptosi nei cervelli fetali in via di sviluppo.

L'isoflurano all'1, 3% per 1 ora non ha influenzato in modo significativo la densità delle cellule positive alla caspasi-3 nella regione CA1 dell'ippocampo (Fig. 4) o della corteccia retrospleniale (Fig. 5) rispetto al controllo. Tuttavia, l'isoflurano al 3% per 1 ora ha aumentato significativamente la densità della caspasi-3 sia nella regione dell'ippocampo CA1 (Fig. 4, aumento del 115% rispetto al controllo, p <0, 05) sia nella corteccia retrospleniale (Fig. 5, aumento del 154% rispetto controllo, p <0, 001, n = 6).

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Nell'utero isoflurano ad alta concentrazione (3%) aumenta l'apoptosi nella regione CA1 dell'ippocampo del cervello in via di sviluppo fetale. ( A ) Le frecce indicano le cellule positive alla caspasi-3 nella regione CA1 dell'ippocampo situata all'interno dei rettangoli rossi illustrati a sinistra, a dimostrazione dell'intero ippocampo dello sviluppo di cervelli fetali a basso ingrandimento. Barra di scala = 50 micron per l'ingrandimento basso a sinistra e 10 micron per l'ingrandimento alto a destra (barra rossa nell'angolo inferiore destro per ogni immagine). ( B ) I dati rappresentano la media ± SE di 12 cervelli di ratto fetale di sei madri in gravidanza ( n = 6) nel gruppo di controllo o nei gruppi di trattamento con isoflurano 1, 3 o 3% (ISO). * p <0, 05 rispetto sia al controllo che all'1, 3% ISO, n = 6.

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Nell'utero isoflurano ad alta concentrazione (3%) aumenta l'apoptosi nella corteccia retrospleniale del cervello in via di sviluppo fetale. ( A ) Le frecce indicano le cellule positive alla caspasi-3 nella corteccia retrospleniale in diversi gruppi di esperimenti. ( B ) I dati rappresentano la media ± SE di 12 cervelli di ratto fetale di sei madri in gravidanza ( n = 6) nel gruppo di controllo o nei gruppi di trattamento con isoflurano 1, 3 o 3% (ISO). Barra di scala = 10 μm (barra rossa nell'angolo in basso a destra per ogni immagine). ** p <0, 001 rispetto sia al controllo che all'1, 3% ISO, n = 6.

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DISCUSSIONE

Il nostro studio ha dimostrato che l'esposizione all'isoflurano ad alta concentrazione (3%) nei ratti in gravidanza ha aumentato i livelli ematici di S100β nei loro feti, nonché aumentato il grado di apoptosi nella regione CA1 dell'ippocampo fetale e la corteccia retrospleniale del cervello fetale. Queste due regioni del cervello sono strettamente correlate alla memoria e all'apprendimento e sono particolarmente vulnerabili alla neurodegenerazione mediata dall'anestesia (9, 15). Analogamente agli studi incentrati sul cervello fetale di cavie (14) e sullo sviluppo del cervello neonatale di roditori (9, 10), questi risultati indicano che l'isoflurano a una concentrazione più elevata è in grado di causare neurodegenerazione nei cervelli di ratto fetale.

Gli effetti dell'anestesia sull'apoptosi nel cervello fetale in via di sviluppo sono stati controversi, con inibizione (15), nessun effetto (24) e effetti di promozione (14) tutti riportati. Allo stesso modo, gli effetti dell'anestesia utilizzati durante lo sviluppo del cervello fetale o neonatale sulla memoria e l'apprendimento a lungo termine sono anche mescolati con l'anestesia che provoca sia un miglioramento transitorio (15) che una compromissione permanente (9). I dati controversi hanno anche dimostrato il miglioramento (25) e la compromissione (11) della funzione cognitiva dopo che i roditori adulti hanno ricevuto l'anestesia generale. Insieme al nostro studio precedente (15), questi risultati suggeriscono che l'isoflurano induca la neurodegenerazione nel cervello del ratto fetale solo quando è stato utilizzato in concentrazioni più elevate (3% o circa 2 MAC). Questi risultati sono coerenti con gli effetti tossici dose-dipendenti dell'isoflurano nelle colture di tessuti (2, 7) e nei ratti neonati (9). Va notato che l'isoflurano ha indotto un grado molto più grande di neurodegenerazione nei ratti di 7 anni (9) rispetto ai cervelli di ratto fetali in via di sviluppo, dimostrato nel presente studio. Si ipotizza che la sinaptogenesi nei ratti raggiunga il picco intorno al d 7 postnatale, il che può contribuire all'aumentata vulnerabilità del cervello in via di sviluppo dei ratti di 7 anni alla neurodegenerazione mediata da isoflurano (9, 19). È stato proposto che i neuroni durante i periodi di rapida crescita o sinaptogenesi nel cervello in via di sviluppo siano vulnerabili alla neurodegenerazione mediata dall'anestesia (9). Il fatto che una combinazione di isoflurano con protossido di azoto e midazolam sia stata utilizzata in uno studio precedente (9) potrebbe anche aver contribuito all'aumento della neurodegenerazione mediata dall'anestesia generale rispetto a quella osservata dall'isoflurano come singolo agente in questo studio. Il nostro recente studio che ha esaminato le colture di tessuti ha indicato che l'isoflurano può assumere le proprietà di una "spada a doppio taglio" in quanto può essere sia neuroprotettivo che neurotossico (18). L'isoflurano a bassa concentrazione e di breve durata sembrava precondizionare i neuroni e fornire neuroprotezione, mentre l'isoflurano ad alta concentrazione per lunga durata ha indotto direttamente la neurotossicità (18). Pertanto, l'1, 3% di isoflurano inalato da topi gravidi ha temporaneamente inibito l'apoptosi spontanea nel cervello fetale, possibilmente mediante precondizionamento come visto nel nostro studio precedente (15), mentre l'isoflurano al 3% inalato da madri in gravidanza in questo studio ha indotto l'apoptosi nel cervello del ratto fetale. Dato che l'apoptosi spontanea nel cervello fetale in via di sviluppo è un normale processo che modella il cervello man mano che matura, il significato dell'aumentata apoptosi indotta dall'anestesia nello sviluppo del cervello non è chiaro, ma, come dimostrato in precedenza, è probabile che sia dannoso per il successivo cognitivo abilità (9).

I cervelli in via di sviluppo di diverse specie animali dimostrano diverse vulnerabilità all'apoptosi mediata dall'anestesia. L'isoflurano a una concentrazione relativamente bassa (0, 55%) ha indotto un'apoptosi significativa in più regioni cerebrali nelle cavie fetali (14), mentre era necessaria una concentrazione significativamente più elevata (3%) dell'isoflurano per indurre l'apoptosi nel cervello del ratto fetale in questo studio. I periodi di sinaptogenesi sono prolungati per una parte più lunga della gravidanza nelle cavie rispetto ai ratti (19), rendendo potenzialmente i cervelli di ratto in via di sviluppo relativamente meno vulnerabili alla tossicità dell'isoflurano rispetto alle cavie. Tuttavia, l'isoflurano alle concentrazioni relativamente elevate comunemente utilizzate durante la chirurgia fetale potrebbe ancora indurre un'apoptosi significativa anche nel cervello del ratto fetale, che sono teoricamente meno vulnerabili alla neurodegenerazione indotta dall'isoflurano. Insieme alle relazioni di altri studi sugli animali (9, 10), questa indagine suggerisce che la somministrazione di alte concentrazioni di anestetici per inalazione nelle madri in gravidanza potrebbe non essere prudente, se questi risultati nei roditori possono essere tradotti nell'uomo (9, 10).

Una scoperta interessante in questo studio è che i livelli di S100β nel sangue fetale sono aumentati significativamente dopo che le madri in gravidanza hanno inalato il 3% ma non l'1, 3% di isoflurano. A differenza della diagnosi di infarto del miocardio che utilizza i livelli di troponina nel sangue, la diagnosi di neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale è di solito difficile perché nessun biomarcatore selettivo e sensibile per la neurodegenerazione è stato ben sviluppato. L'S100β sembra essere più abbondante nelle cellule gliali del sistema nervoso ed è stato ampiamente utilizzato come uno dei biomarcatori per la neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale. L'S100β può essere un utile biomarcatore per il danno cerebrale fetale durante la gravidanza poiché è stato dimostrato che la sua concentrazione è aumentata nel liquido amniotico e nel sangue cordonale in quei feti che hanno subito un insulto cerebrale durante la gravidanza (21). I risultati di questo studio supportano l'ipotesi che i livelli di S100β nel sangue fetale possano essere un utile biomarcatore per il danno cerebrale fetale, sebbene la sua utilità nel rilevare la neurodegenerazione nel danno cerebrale mediato dall'anestesia nei cervelli neonati e adulti necessiti di ulteriori ricerche.

I meccanismi per la neurodegenerazione mediata dall'anestetico inalato nel cervello in via di sviluppo non sono ancora chiari. Alcuni studi suggeriscono che l'attivazione dei recettori del GABA A e l'inibizione dei recettori NMDA da parte di anestetici, come l'isoflurano, possono svolgere un ruolo importante nell'induzione della neurotossicità nel cervello in via di sviluppo (9). I nostri recenti studi, sia nella coltura dei tessuti che negli animali, suggeriscono che gli anestetici per inalazione inducono l'apoptosi attraverso un'interruzione dell'omeostasi del calcio intracellulare, in particolare attraverso l'iperattivazione dei recettori IP 3 e il rilascio anormale di calcio dal reticolo endoplasmatico (2, 3, 8). Inoltre, sembra che le cellule con elevata attività del recettore IP 3, come le cellule neurosecretive (PC12) del feocromocitoma di ratto trasfettate con mutazione presenilin-1 (L286V) dell'Alzheimer o neuroni striatali del ratto Q-111 (un modello cellulare della malattia di Huntington), più vulnerabile all'apoptosi mediata dall'isoflurano e al rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (2, 8). Una migliore comprensione dei meccanismi di tossicità dell'anestesia ci aiuterà a sviluppare strategie che minimizzeranno i possibili effetti dannosi dell'anestesia generale sui pazienti.

Questo studio ha diversi limiti. Innanzitutto, non abbiamo valutato gli effetti di un'alta concentrazione di isoflurano utilizzato durante la gravidanza sulla funzione cognitiva postnatale. Inoltre, in questo studio non abbiamo eseguito alcun tipo di chirurgia fetale, che può avere effetti sull'infiammazione del cervello e influire sulla funzione cognitiva postoperatoria (26). Abbiamo trovato difficile mantenere Pao 2 invariato per più di 1 ora, anche a FiO 2 del 100% e ventilazione meccanica, in condizioni di anestesia profonda e infusione di fenilefrina endovenosa. Sebbene le iniezioni di fenilefrina siano spesso utilizzate nei pazienti clinici per mantenere la MAP entro il range fisiologico durante la chirurgia fetale e nessuno studio finora suggerisce che la fenilefrina possa influenzare significativamente la neurodegenerazione, questo rimane un limite. Inoltre, non abbiamo esaminato gli effetti dell'esposizione all'isoflurano sull'apoptosi nel cervello in via di sviluppo in altri momenti durante il periodo di gestazione. Inoltre, il valore n per ciascun gruppo è relativamente basso ma ha dimostrato significatività statistica a causa del notevole aumento dei livelli di S100β nel sangue fetale e dell'apoptosi significativamente aumentata nell'ippocampo fetale e nella corteccia retrospleniale dopo il trattamento con un'alta concentrazione di isoflurano in gravidanza madri.

In conclusione, l'esposizione prenatale dell'isoflurano ad alta concentrazione (3%), ma non bassa (1, 3%), ha indotto la neurodegenerazione nel ratto fetale che sviluppa cervelli.

Glossario

ABG

gas nel sangue arterioso

MAC

minima concentrazione alveolare

CARTA GEOGRAFICA

pressione arteriosa media