Le varianti del promotore dell'angiotensinogeno influenzano l'espressione genica nel rene umano e nel tessuto adiposo viscerale | diario dell'ipertensione umana

Le varianti del promotore dell'angiotensinogeno influenzano l'espressione genica nel rene umano e nel tessuto adiposo viscerale | diario dell'ipertensione umana

Anonim

Astratto

I polimorfismi del promotore del gene dell'angiotensinogeno umano (AGT) (G − 217A; A − 20C; G − 6A) influenzano la trascrizione dell'AGT in vitro e sono stati implicati nella genetica dell'ipertensione essenziale. Abbiamo analizzato l'associazione tra varianti di promotore AGT e livelli di mRNA di AGT nel rene umano e nel tessuto adiposo viscerale (IVA) in vivo . Campioni di rene e IVA sono stati ottenuti da 35 pazienti consecutivi sottoposti a chirurgia renale. Il promotore del gene AGT di ciascun paziente è stato sequenziato per identificare varianti. L'espressione del gene AGT è stata studiata mediante analisi TaqMan PCR in tempo reale. Nell'analisi statistica sono stati considerati anche i dati clinici ottenuti prima dell'intervento chirurgico. Sono stati identificati due nuovi polimorfismi a −175 e −163. Sebbene l'espressione dell'AGT fosse significativamente più alta nell'IVA rispetto al rene, quando entrambe le varianti erano presenti insieme, l'espressione dell'AGT nell'IVA era circa cinque volte inferiore ( P = 0, 033) rispetto all'aplotipo selvaggio. Questa espressione AGT inferiore nell'IVA suggerisce che la vicinanza e il collegamento delle varianti −175A e −163A potrebbero destabilizzare il legame di specifici fattori di trascrizione a un elemento sensibile alla fase acuta 3. Tra le varianti note del promotore AGT, solo −20C SNP ha un importante effetto sull'espressione differenziale AGT specifica del tessuto nei tessuti umani studiata, inducendo un aumento di 3, 8 volte dell'mRNA AGT localizzato solo nel midollo renale ( P = 0, 038). Gli altri polimorfismi noti (G − 6A; G − 217A) non erano associati a diversi livelli di espressione di AGT. I nostri risultati supportano l'ipotesi che alcune varianti del promotore AGT umano influenzano l'attività trascrizionale in un modo specifico del tessuto nell'uomo.

introduzione

Il sistema renina-angiotensina (RAS) svolge un ruolo critico nella manipolazione del sodio e nella regolazione della pressione sanguigna; pertanto i geni RAS sono stati accuratamente studiati come candidati per l'ipertensione essenziale. Il gene RAS più rilevante nella genetica dell'ipertensione sembra essere il gene dell'angiotensinogeno (AGT), il precursore dell'angiotensina II (AngII) e altri peptidi vasoattivi correlati. 1, 2, 3

I primi studi si sono concentrati sui polimorfismi di codifica e l'allele 235T AGT è stato associato ai livelli plasmatici di AGT e all'ipertensione. 1, 4 Varianti nella regione del promotore del gene AGT, che alterano il legame di specifici fattori di trascrizione, possono cambiare l'attività trascrizionale. La variante del promotore −6A è in collegamento con la variante 235T, suggerendo che l'aumento dei livelli plasmatici di AGT nei portatori 235T potrebbe essere dovuto a una maggiore attività trascrizionale. 5 Tuttavia, l'associazione SNP G − 6A alla pressione sanguigna è stata contestata 6 ed è stata anche messa in discussione in una recente meta-analisi. 7

Al contrario, i SNP promotori −20 e −217 hanno effetti meglio documentati sulla trascrizione AGT ed erano anche associati all'ipertensione nella maggior parte degli studi. 8, 9 In effetti, Dickson et al. 10 hanno mostrato che, in vitro , −20 e −217 SNPs hanno avuto la maggiore influenza, aumentando la trascrizione AGT nelle linee cellulari derivate da fegato umano, rene umano e adipocita di topo. Tuttavia, il significato di specifiche varianti del promotore sull'espressione del gene AGT in vivo nei tessuti umani, in particolare nei reni e nei tessuti adiposi, non è ancora chiaro.

Ad esempio, l'AGT sintetizzata dal tessuto adiposo non solo contribuisce ad aumentare la concentrazione locale di AngII, ma viene anche rilasciata nella circolazione, portando a disregolazione dell'attività sistemica di RAS, contribuendo così all'aumento della pressione sanguigna nei pazienti con obesità viscerale. 11, 12 Un modello di topo con un gene AGT umano transgenico ha aumentato l'espressione di AGT solo nel tessuto adiposo viscerale (IVA), incluso il deposito perirenale, dopo un'obesità indotta dalla dieta. 13

Nel rene, un aumento localizzato della trascrizione AGT può portare ad un aumento della produzione locale di AngII con effetti sistemici a causa dell'influenza quantitativa sul riassorbimento tubulare di sodio. Infatti, l'mRNA e la proteina AGT intrarenali sono stati localizzati principalmente nelle cellule tubulari prossimali, 14, 15 e gli alti livelli di AngII intratubulare e urinario derivano da AGT sintetizzato localmente. Inoltre, AngII svolge un ruolo importante anche nel midollo renale mediante la regolazione diretta, indipendente dall'aldosterone, del canale epiteliale del sodio nei condotti di raccolta, 14 un passaggio finale chiave nel controllo del sodio e della pressione sanguigna.

Pertanto, un aumento genetico dell'mRNA di AGT può avere conseguenze molto importanti anche se espresso solo in tessuti specifici. Pertanto, abbiamo studiato la relazione tra le varianti del promotore AGT e l'espressione di AGT nella corteccia renale umana, midollo renale e IVA per verificare se le varianti del promotore AGT possano essere associate a livelli di espressione AGT specifici del tessuto nell'uomo in vivo .

metodi

Pazienti e campioni di tessuto umano

Il protocollo di studio è stato rivisto e approvato dal nostro comitato etico locale e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti. Lo studio comprendeva 35 pazienti consecutivi sottoposti a nefrectomia radicale per carcinoma localizzato a cellule renali a cellule chiare (senza alcuna evidenza di diffusione del cancro locale o metastatico: T1 / T2, N0, M0) presso l'Ospedale Universitario "Ospedali Riuniti" di Ancona, Italia, tra febbraio 2006 e febbraio 2007. Tutti i pazienti erano bianchi caucasici con origini italiane. I dati clinici sono stati raccolti prima dell'intervento chirurgico e tutte le donne ( n = 9) erano in menopausa e prive di sostituti ormonali, contribuendo a ridurre le differenze cardiovascolari e ad aumentare l'omogeneità della popolazione studiata. Nessuno aveva un danno renale grave (creatinina plasmatica <1, 5 mg per 100 ml negli uomini e <1, 4 mg per 100 ml nelle donne). Solo un paziente aveva il diabete mellito di tipo 2 (trattamento con terapia dietetica). I farmaci orali sono stati sospesi almeno 12 ore prima dell'intervento.

Campioni di tessuto adiposo perirenale, corteccia renale e midollo renale (dalla porzione intatta del rene rimosso, ad almeno 3 cm di distanza dal carcinoma intracapsulare localizzato) sono stati raccolti da tutti i pazienti. I campioni di tessuto sono stati quindi congelati a scatto in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino all'estrazione dell'RNA.

genotipizzazione

Per valutare la presenza delle varianti del promotore AGT umano più rilevanti conosciute, abbiamo analizzato sequenze da -306 a +36 del gene AGT (numero di accesso GenBank NM_000029). Il DNA è stato estratto dalle cellule del sangue periferico usando il NucleoSpin Blood Kit (MACHEREY – NAGEL GmbH & Co, Duren, Germania) seguendo la procedura del kit.

In tutto, 40 ng di DNA genomico sono stati amplificati dalla PCR (usando 5′-GTCACACACCTAGGGAGATGCT-3 ′ e 5′-CCTTCTGCTGTAGTACCCAGAAC-3 ′ rispettivamente come primer forward e reverse). I prodotti PCR (342 bp) sono stati purificati mediante elettroforesi su gel di agarosio ed eluiti utilizzando il kit di estrazione gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Germania). Il sequenziamento del ciclo (96 ° C per 10 s, 50 ° C per 5 s, 60 ° C per 4 minuti, per 25 cicli) è stato eseguito su entrambi i fili utilizzando il kit di sequenziamento del DNA, kit di reazione pronto per il ciclo di sequenziamento del ciclo Big Dye Terminator (applicato Biosystems, Warrington, Regno Unito). Le reazioni sono state purificate dal DyeExTM Spin Kit (Qiagen) e sottoposte a sequenziamento capillare automatizzato (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Le sequenze sono state analizzate su elettroferogrammi mediante il software Sequencing Analysis 5.2 (Applied Biosystems).

L'analisi del genotipo è stata condotta anche in 110 giovani pazienti sani del Caucaso (età media 32, 3 ± 2, 4 anni) reclutati durante il follow-up dell'Ancona Hearth Doctor Study (AHDS), il cui protocollo è stato descritto in precedenza. 16 Questa genotipizzazione di soggetti sani è stata eseguita al fine di escludere l'ipotesi che alcune varianti potrebbero essere presenti e / o più frequenti in particolare nei pazienti con carcinoma renale.

Espressione genica

L'RNA totale è stato estratto da campioni di tessuto dopo omogeneizzazione in tampone di tiocianato di guanidina e gradiente CsCl modificato come precedentemente riportato. 17 RNA (1, 5 μg) è stato trascritto inverso con kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità con RNase Inhibitor (Applied Biosystems).

L'analisi dell'espressione genica in tempo reale di AGT umana è stata condotta con TaqMan Gene Expression Assay (Hs00258938_m1; Applied Biosystems, Weiterstadt, Germania) utilizzando un ABI 7300 per PCR in tempo reale (Applied Biosystems, Darmstadt, Germania) con il metodo della curva standard. Le differenze nell'inizio dell'RNA totale e la diversa efficienza della sintesi di cDNA tra i campioni sono state normalizzate usando l'espressione GAPDH come gene di controllo delle pulizie. Come ulteriore controllo interno semiquantitativo, l'RRNA 18S è stato anche amplificato per normalizzare i risultati a causa di possibili differenze nell'espressione di GAPDH. Non ci sono state differenze nei risultati quando normalizzati con GAPDH o con rRNA 18S, e i dati nelle figure sono stati quindi riportati normalizzati per GAPDH. I livelli di espressione genica sono stati analizzati utilizzando GENEX (Gene Expression Macro Software fornito da BioRad, Hercules, CA, USA) e sono stati riportati come unità arbitrarie (AU).

analisi statistica

Le differenze nei livelli di espressione di AGT tra i tessuti sono state valutate usando il test di analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguito dal test post hoc di Bonferroni. L'analisi della regolazione della varianza per le covariate (età, sesso, indice di massa corporea (BMI)) è stata utilizzata per confrontare l'espressione del gene AGT tra i genotipi AGT. La prevalenza delle varianti del promotore di AGT tra ipertensivi e normotesi è stata valutata mediante χ 2- test. Poiché alcuni pazienti ( n = 12) sono stati trattati con inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACEI) o bloccanti del recettore dell'angiotensina (ARB), che, almeno in teoria, potrebbero influenzare i livelli di espressione di AGT, la presenza o l'assenza di questi farmaci è stata introdotta come un'ulteriore covariata. L'analisi statistica è stata effettuata con il software statistico SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) e un livello di P <0, 05 è stato considerato significativo. L'equilibrio di Hardy – Weinberg (HWE) è stato calcolato usando χ 2- test.

risultati

La tabella 1 mostra le caratteristiche cliniche di 35 pazienti studiati consecutivamente.

Tabella a grandezza naturale

La distribuzione delle varianti AGT tra i nostri pazienti è riportata nella Tabella 2.

Tabella a grandezza naturale

L'analisi della sequenza ha mostrato la presenza di due nuovi SNP G → A situati a −175 e −163 (Figure 1a e b). Abbiamo anche analizzato 110 soggetti caucasici sani (età media 32, 3 ± 2, 4 anni) perché questi SNP non erano stati segnalati in precedenza e anche al fine di escludere la presenza dei due nuovi SNP solo nei pazienti con carcinoma renale. In questa popolazione sana sono state trovate frequenze del 7, 3% per gli eterozigoti −163A e del 10, 9% per gli eterozigoti −175A. L'HWE è stato rispettato per entrambe le varianti (−175, P = 0, 55; −163, P = 0, 69).

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( a ) Sequenza nucleotidica (340 bp) del promotore prossimale del gene AGT umano. La sottolineatura rappresenta i siti di legame per i fattori di trascrizione; gli asterischi rappresentano SNP. ( b ) Elettroferogramma di una regione di sequenze di promotori AGT eterozigoti a −175 e −163.

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I livelli di espressione comparativa del gene AGT nella corteccia renale umana, nel midollo renale e nell'IVA hanno suggerito che l'IVA è una fonte importante di AGT. L'espressione di AGT era significativamente più alta (circa cinque volte) nell'IVA rispetto alla corteccia e al midollo renale ( P = 0, 006 e P = 0, 003, rispettivamente), mentre la corteccia e il midollo avevano espresso livelli simili di AGT (Figura 2).

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Espressione comparativa del gene AGT nella corteccia renale umana (K-Cortex), midollo renale (K-Medulla) e tessuto adiposo viscerale (perirenale) (IVA) ( n = 35 campioni accoppiati). I dati sono presentati come mediana, intervalli di confidenza al 95%. ** P <0, 001 IVA vs K-Cortex e IVA vs K-Medulla.

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I soggetti con la variante nota −20C avevano un'espressione AGT 3, 8 volte maggiore localizzata solo nel midollo renale ( P = 0, 038) rispetto agli omozigoti −20A (Figura 3a). Non sono stati identificati effetti significativi sui livelli di mRNA di AGT nella corteccia renale e nel tessuto adiposo (Figura 3a).

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Influenza delle varianti del promotore AGT sui livelli di espressione di AGT nella corteccia renale (K-Cortex), midollo (K-Medulla) e tessuto adiposo viscerale (IVA). ( a ) I pazienti con la variante −20C avevano un'espressione AGT 3, 8 volte maggiore solo in K-Medulla ( P = 0, 038). ( b, c ) Effetti non significativi delle varianti −6 e −217 sull'espressione di AGT nel tessuto renale e adiposo umano. I dati sono presentati come media ± se * P <0, 05.

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Gli altri SNP noti (−6AG; −217GA) non sono stati associati con un'espressione AGT significativamente diversa nei tessuti studiati (figure 3b e c).

Quando le nuove varianti −175A e −163A erano presenti insieme in un aplotipo comune ( n = 16), erano associate a un'espressione AGT in IVA che era circa cinque volte inferiore a quella trovata nell'IVA dei pazienti con aplotipo selvaggio ( P = 0, 033; Figura 4a). Al contrario, quando l'analisi è stata effettuata separatamente per ogni singola nuova variante, non sono stati riscontrati cambiamenti significativi nell'espressione di AGT nei reni e nei grassi (Figure 4b e c), sebbene una minore espressione di AGT nell'IVA sia stata trovata in −175A o −163A SNP vettori.

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Influenza delle varianti del promotore AGT sui livelli di espressione di AGT nella corteccia renale (K-Cortex), midollo (K-Medulla) e tessuto adiposo viscerale (IVA). ( a ) Aumento dell'espressione di AGT (circa cinque volte) solo nell'IVA dei pazienti con aplotipo −163A / −175A ( P = 0, 033). ( b, c ) Effetti non significativi delle varianti −163 e −175 sull'espressione di AGT nel tessuto renale e adiposo umano. I dati sono presentati come media ± se * P <0, 05.

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La terapia antiipertensiva con ACEI / ARB non ha influenzato significativamente l'espressione di AGT in nessun tessuto rispetto ai pazienti che non assumevano farmaci (Tabella 3).

Tabella a grandezza naturale

Non c'erano differenze significative nelle distribuzioni di allele e genotipi tra pazienti ipertesi e normotesi, sebbene la variante −20C sembrasse avere una tendenza verso una maggiore prevalenza nei pazienti ipertesi ( P = 0, 071, Tabella 3). A causa della grande variabilità nota della BP, la mancanza di associazioni significative è probabilmente dovuta al numero relativamente basso di pazienti per ciascun genotipo.

Discussione

In questo studio, abbiamo valutato l'associazione di varianti di promotori AGT note e nuove con l'espressione di AGT nel rene umano e nel tessuto adiposo, che sono di fondamentale importanza come fonte AGT sistemica e / o per gli effetti locali di AngII derivata da AGT. I nostri risultati supportano l'ipotesi che le varianti del promotore AGT umano influenzano l'attività trascrizionale in vivo , probabilmente alterando il legame dei fattori di trascrizione. Inoltre, gli effetti degli SNP studiati sono specifici del tessuto, supportando un effetto trascrizionale specifico del tipo di cellula di diverse varianti di promotore. In effetti, la variante −20C è associata a un'espressione AGT più di tre volte superiore rispetto alla variante −20A nel midollo renale ma non nella corteccia renale o nell'IVA. Questo risultato è in accordo con uno studio precedente che ha mostrato una maggiore attività del promotore quando era presente la variante −20C nel costrutto usato per verificare l'effetto dei polimorfismi del promotore in una linea di cellule renali umane. 10 L' aumentata espressione genica di AGT nel midollo renale umano può portare a AGT e AngII locali più elevati che, agendo direttamente anche sul tubulo distale, 15 aumentano il riassorbimento di sodio e la pressione sanguigna. È risaputo che l'AngII prodotta localmente in specifici compartimenti renali ha un'importante influenza regolatoria sull'emodinamica renale e sul riassorbimento del sodio. 19, 20 Studi recenti che descrivono una maggiore concentrazione di AngII in regioni specifiche all'interno del rene indicano l'esistenza di una regolazione locale selettiva di AngII intrarenale indipendentemente dalle concentrazioni di AngII circolanti. 18

Abbiamo anche identificato due nuove varianti del promotore AGT (−175A e −163A) che sembrano ridimensionare selettivamente l'espressione AGT nell'IVA umana. Queste varianti non sono state descritte nel vasto lavoro di Nakajima et al. 21 forse perché hanno sequenziato l'intero gene AGT di africani, eurasiatici ed asiatici orientali ma non caucasici. Nell'opera originale di Jeunemaitre et al. , usando il test del polimorfismo conformazionale a singolo filamento (SSCP) per identificare la variante del promotore AGT, il promotore AGT che coinvolge le regioni −175 e −163 non è stato analizzato a causa della progettazione dei primer consecutivi che si sovrapponevano in questa regione. 22 La vicinanza e il legame di questi due nuovi SNP suggeriscono che probabilmente agiscono destabilizzando il legame di specifici fattori nucleari. È interessante notare che le varianti −175 e −163 corrispondono a un sito di legame del fattore di trascrizione noto (localizzato da −173 a −164), classificato come elemento sensibile alla fase acuta (APRE). Sherman e Brasier 23 hanno dimostrato che IL-6 aumenta l'espressione del gene AGT umano nelle cellule del fegato attraverso la famiglia di fattori di trascrizione Signal Transducer e Activator of Transcription (STAT) e hanno identificato tre potenziali siti di legame STAT-3 (hAPRE1 (278– 269), hAPRE2 (246–237) e hAPRE3 (171–162)) basato sull'omologia della sequenza con il sito di legame del consenso STAT nel promotore del gene AGT umano. Jain et al. 24 hanno dimostrato che la regione che contiene il sito APRE-3 è transattivata dal trattamento con IL-6 e hanno suggerito che APRE-3 può essere un importante contributo dell'attività del promotore. È anche importante notare che il sito APRE-3 è conservato tra il gene AGT umano e quello dei ratti, suggerendo un ruolo importante di questo sito nella regolazione trascrizionale durante l'evoluzione. L'infiammazione sistemica di basso grado che era probabilmente presente nei nostri pazienti con carcinoma intracapsulare renale potrebbe aver migliorato la trascrizione dell'AGT poiché l'AGT è una proteina di risposta in fase acuta. Questo fattore probabilmente ha aiutato a trovare una differenza così grande nell'espressione AGT in presenza di varianti −175A e −163A.

Nel nostro studio, le altre varianti ben note del promotore non sono state associate ai livelli renali o ai livelli di mRNA di AGT IVA in vivo . Studi in vitro hanno dimostrato che non solo −20 ma anche −217 SNP hanno una grande influenza sulla trascrizione AGT in una linea cellulare adiposa (3T3-L1). 10 Tuttavia, sono necessari studi di trasfezione utilizzando adipociti umani per confermare sia i risultati precedenti sia il potenziale ruolo delle nuove varianti umane che abbiamo identificato. La mancanza di associazione tra la variante G − 6A e la pressione sanguigna o il fenotipo cardiovascolare che abbiamo riportato in precedenza 6 ha ora una nuova spiegazione probabile sulla base dei risultati di questo lavoro. Inoltre, una meta-analisi molto recente che comprende 26.818 pazienti ha confermato la mancanza di associazione tra la variante G − 6A e ipertensione. 7 Ciononostante, non possiamo escludere la possibilità che sia SNP -217 che –6 possano avere un effetto trascrizionale sull'espressione di AGT in altri tipi di cellule come cellule epatiche o neuroni.

In sintesi, i nostri risultati, per la prima volta, supportano fortemente l'ipotesi che alcune varianti del promotore di AGT umane possano predisporre o proteggere dall'ipertensione mediante un'alterazione distinta e specifica dei livelli di espressione di AGT nel rene e nel tessuto adiposo. Inoltre, sia AGT che Ang II sono aumentati nell'obesità centrale. L'evidenza che gli adipociti possono produrre quantità sostanziali di AGT ha supportato il concetto secondo cui un aumento degli adiposità può contribuire in modo significativo a un'attività di renina plasmatica in modo inappropriato normale o persino elevata. 25, 26 Ang II stesso, attraverso i recettori di tipo 1 (AT1), è stato proposto come fattore trofico nella crescita e nello sviluppo del tessuto adiposo; 27 in effetti, Ang II stimola la lipogenesi 28 e la differenziazione pre-adipocitaria. 29

Alcune limitazioni di questo studio dovrebbero essere prese in considerazione. In primo luogo, sebbene questo studio fosse focalizzato solo sulle relazioni tra le diverse varianti di promotore AGT (comprese quelle nuove) e i livelli di mRNA AGT in diverse porzioni del rene umano e del tessuto adiposo, la quantificazione del livello di proteina AGT in questi tessuti avrebbe potuto migliorare i risultati e la mancanza di dati occidentali è una limitazione. Tuttavia, sebbene l'aumento dell'mRNA di AGT non sia ovviamente uguale all'aumento della produzione di proteine ​​AGT e AngII, la serie di prove pubblicate indica che la produzione di proteine ​​AGT e AngII è consensuale ai livelli di mRNA nei tessuti sia nei reni che nel tessuto adiposo. 12, 13, 14 In secondo luogo, le nuove varianti erano più rare nella popolazione generale rispetto ai nostri pazienti, probabilmente a causa del caso, a seconda del numero relativamente piccolo di pazienti con carcinoma renale che siamo stati in grado di reclutare. In terzo luogo, queste nuove varianti dovrebbero essere testate in un appropriato sistema di cellule umane per studiare il tasso di trascrizione AGT e anche per escludere l'eventualità che altre varianti collegate fossero responsabili dell'effetto.

In conclusione, il gene AGT è ampiamente espresso in IVA umana e, a livelli più bassi, nei reni umani. I nostri risultati suggeriscono che alcune varianti del promotore AGT possono influenzare l'attività trascrizionale AGT in vivo . La variante −20C può comportare un aumento del riassorbimento del sodio, mentre i pazienti obesi con le varianti −175A e −163A potrebbero essere protetti dall'aumento di AGT derivato dall'adiposio, contribuendo a spiegare perché non tutti i pazienti obesi hanno un aumento della pressione sanguigna. È anche possibile che la "protezione" genetica (−175A e -163A-dipendente) dall'eccessiva AGT derivata dall'adiposio possa aiutare a prevenire l'ipertensione correlata all'obesità. Sono necessari ulteriori studi per valutare le frequenze dei nuovi SNP AGT in diverse popolazioni e la loro associazione con la pressione arteriosa, nonché le complicanze metaboliche post-angolate dipendenti e adipocitarie del sovrappeso.

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Conflitto d'interesse

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

adesioni

GenBank / EMBL / DDBJ

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