Associazione del recettore del fattore di crescita degli epatociti costitutivamente attivato (incontrato) con resistenza a un doppio inibitore egfr / her2 in cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule | diario britannico del cancro

Associazione del recettore del fattore di crescita degli epatociti costitutivamente attivato (incontrato) con resistenza a un doppio inibitore egfr / her2 in cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule | diario britannico del cancro

Anonim

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Vi è un urgente bisogno di identificare nuovi bersagli farmacologici e nuovi approcci per il trattamento del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). I membri del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le famiglie di recettori Met sono stati identificati come importanti bersagli molecolari per NSCLC. Due inibitori della tirosina chinasi EGFR (TKI; erlotinib e gefitinib) sono attualmente in uso clinico, ma la maggior parte dei pazienti non risponde a queste terapie mirate. Abbiamo usato array di cattura del recettore TK (RTK) per identificare i recettori attivi nelle linee cellulari NSCLC. Poiché Met ed ErbB erano attivi, abbiamo esplorato il potenziale vantaggio terapeutico del targeting combinato di Met con inibitori della famiglia di recettori ErbB per il trattamento di NSCLC. Abbiamo scoperto che Met interagisce fisicamente sia con EGFR che con Her2 in una linea cellulare NSCLC con sovraespressione / iperattivazione di Met. L'uso combinato di un doppio inibitore EGFR / Her2 con un inibitore Met produce la massima inibizione della crescita rispetto all'uso di EGFR e / o inibitori Met. Ciò suggerisce che potrebbe essere necessaria un'inibizione simultanea di RTK multipli per abrogare efficacemente la crescita delle cellule tumorali. L'analisi fosfoproteomica mediante array di cattura RTK può essere uno strumento prezioso per identificare il sottoinsieme di tumori con attivazione del recettore funzionale, indipendentemente dal meccanismo.

Principale

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta la maggior parte di tutti i casi di carcinoma polmonare e, con scarsa prognosi e basso tasso di guarigione, è una delle principali cause di mortalità per cancro. Gli inibitori della tirosina chinasi (TKI) sono emersi come un'importante classe di farmaci per il trattamento dell'NSCLC. Gefitinib (Iressa) ed erlotinib (Tarceva) sono i due TKI specifici del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) approvati dalla FDA degli Stati Uniti che hanno mostrato benefici clinici nel trattamento di NSCLC. Sembrano funzionare, in parte, inibendo gli effetti delle mutazioni di guadagno di funzione nell'EGFR, ma anche i pazienti con tumori privi di mutazioni ne beneficiano (Sordella et al, 2004; Mukohara et al, 2005). Le mutazioni di guadagno di funzione sono raggruppate intorno al dominio catalitico di EGFR e sono sostituzioni di aminoacidi singoli o piccoli inserimenti / eliminazioni. Tuttavia, non tutti i pazienti portatori di EGFR mutante attivante beneficiano della terapia TKI e quasi tutti acquisiscono resistenza entro un anno dalla risposta iniziale (Haber et al, 2005; Riely et al, 2006; Sharma et al, 2007).

Un importante meccanismo di resistenza alla terapia basata su TKI è lo sviluppo di una mutazione del secondo sito (T790M) nell'EGFR che causa un cambiamento conformazionale che inibisce l'effettivo legame degli inibitori della chinasi alla tasca dell'ATP (Liu et al, 2006). Un'altra mutazione secondaria (D761Y) in EGFR è stata identificata in una metastasi cerebrale NSCLC originata da un tumore primario che inizialmente ha risposto alla terapia a base di gefitinib (Balak et al, 2006). Un'altra via di fuga dalla terapia TKI è l'amplificazione acquisita del recettore del fattore di crescita degli epatociti (HGF), MET , che è stato trovato in quattro dei diciotto (22%) NSCLC resistenti (Engelman et al, 2007). La maggior parte delle amplificazioni sono state riscontrate in lesioni metastatiche, suggerendo che Met potrebbe essere coinvolto nello sviluppo di metastasi e nella resistenza acquisita alla terapia TKI.

Met svolge un ruolo critico nel cancro, nella rigenerazione del fegato e dei reni e nello sviluppo delle ghiandole mammarie, compresa la proliferazione cellulare, motilità, invasione e tubulogenesi ramificata (Yang et al, 1995; Rosario e Birchmeier, 2003; Gao e Vande Woude, 2005; Gao et al, 2005; Desiderio, 2007; Sattler e Salgia, 2007). Met è presente in tutti i tipi di tessuto e l'attivazione di Met da parte del suo ligando, HGF, porta all'attivazione di diverse vie di segnalazione che si coordinano per raggiungere le funzioni cellulari dipendenti da Met. Nelle cellule normali, Met si localizza prevalentemente sulla membrana plasmatica; tuttavia, nello strato di tessuto germinale del colon normale, della cute e del testicolo e nel tessuto canceroso, sono state osservate sia la localizzazione citoplasmatica che quella nucleare (Pozner-Moulis et al, 2006). Sono state identificate mutazioni di guadagno di funzione, sovraespressione o amplificazione del MET e sono associate alla crescita e alla metastasi del tumore (Ma et al, 2003; Lengyel et al, 2005; Kong-Beltran et al, 2006).

Sebbene una piccola parte dei pazienti con NSCLC (∼ 10%) abbia maggiori risposte obiettive alla terapia a base di EGFR, la maggior parte dei pazienti con NSCLC non risponde a terapie mirate a EGFR. Pertanto, vi è un urgente bisogno clinico di identificare nuovi bersagli farmacologici e nuove strategie terapeutiche. È noto che la segnalazione di EGFR è modulata da altri recettori tirosina chinasi (RTK). Ad esempio, è noto che l'eterodimerizzazione con altri recettori della famiglia ErbB, Her2 e Her3, aumenta le attività oncogeniche di EGFR (Engelman et al, 2005, 2007; Arteaga, 2007). Inoltre, recenti evidenze implicano Met nelle interazioni funzionali con EGFR ed Her3 (Jo et al, 2000). Poiché sia ​​la famiglia di recettori ErbB che Met sono promettenti bersagli molecolari per la terapia dell'NSCLC, e con prove di interazioni funzionali di questi recettori, abbiamo esplorato la possibilità che il targeting combinato di Met e uno o più membri della famiglia ErbB possano avere promesse terapeutiche.

risultati

Attivazione / sovraespressione di Met e resistenza a GW2974

L'attivazione di più RTK contemporaneamente può contribuire al fenotipo maligno in NSCLC. Pertanto, abbiamo usato un array di anticorpi RTK che cattura 42 recettori e quindi è stato sondato con antifosfotirosina per rilevare l'attività degli RTK nelle linee NSCLC H441 e H1666. Queste linee hanno EGFR wild-type (WT). Il recettore del fattore di crescita epidermico e Her3 erano altamente attivati ​​nelle cellule H1666 e EGFR, Her2 e Her3 nelle cellule H441 (Figura 1A). Entrambe le linee cellulari hanno mostrato una debole attivazione di MSPR e DTK e alcune attività Her4 sono state rilevate nelle cellule H441 (Figura 1A). Inoltre, le cellule H441 hanno mostrato una forte attivazione del Met, in linea con i precedenti rapporti (Christensen et al, 2003), mentre il Met attivato non è stato rilevato nelle cellule H1666 (Figura 1A e C).

Con la potenziale importanza degli inibitori del recettore ErbB per il trattamento del cancro del polmone e con più recettori ErbB attivati ​​in queste linee cellulari, abbiamo studiato la loro sensibilità al doppio inibitore della chinasi EGFR / Her2 GW2974 nei test di proliferazione. GW2974 è un analogo di lapatinib con un'acidità enzimatica di 0, 007 μ M (rispetto a 0, 012 μ M per lapatinib) per EGFR e 0, 016 μ M (rispetto a 0, 010 μ M per lapatinib) per Her2 (Rusnak et al, 2001; Petrov et al, 2001; Petrov et al, 2006). La crescita cellulare è stata valutata dopo un'esposizione continua di 5 giorni al farmaco. Le cellule H1666 hanno mostrato un'elevata sensibilità a GW2974 con un GI 50 medio di 0, 1 μ M, rispetto a H441, dove il GI 50 era nel range micromolare (6–9 μ M; Figura 1B).

Abbiamo esaminato gli effetti di GW2974 sulle vie di segnalazione sia a livello del recettore sia per i componenti di segnalazione a valle (Figura 1C). GW2974 ha inibito la fosforilazione dell'EGFR nelle cellule H441 in modo dose-dipendente, sebbene a concentrazioni micromolari. Sorprendentemente, anche il fosfo-met è stato inibito da questo composto a concentrazioni simili. Tra i potenziali componenti di segnalazione a valle, il fosfo-Erk1 / 2 non è stato influenzato; tuttavia fosfo-Akt, fosfo-Stat3 e fosfo-Shc sono stati inibiti da GW2974 in modo dose-dipendente (Figura 1C). Questi dati suggeriscono che GW2974 influenza l'attività Met, direttamente o indirettamente, nelle cellule H441. Al contrario, nelle cellule H1666, GW2974 ha inibito la fosforilazione dell'EGFR a concentrazioni submicromolari, nonché molecole di segnalazione a valle tra cui Akt, Erk1 / 2 e Stat3, coerenti con la sua attività nel saggio di proliferazione. È interessante notare che c'era poca fosforilazione basale di EGFR a Y1068, o fosforilazione basale di Met a Y1234 / 1235 nelle cellule H1666, e la fosforilazione basale di questi recettori e le molecole di segnalazione a valle erano solo moderatamente inibite dal farmaco (Figura 1C).

L'attivazione costitutiva di Met, Her2 e Her3 nelle cellule H441 è inibita da GW2974

Poiché le cellule NSCLC esprimono molti RTK che potrebbero potenzialmente contribuire alla sensibilità di GW2974, abbiamo usato array di cattura di anticorpi RTK per valutare gli effetti del farmaco sull'attivazione di 42 diversi recettori in parallelo (Figura 2A). Le cellule erano affamate di siero e quindi incubate con EGF per 10 minuti in presenza o assenza di GW2974. È interessante notare che Met, EGFR, Her2, Her3 e Ret sono stati attivati ​​basicamente nelle cellule H441, anche in condizioni di deprivazione sierica. La stimolazione con EGF ha ulteriormente attivato EGFR e Ret, ma non Met, Her2 o Her3 (Figura 2A). L'attivazione di tutti questi recettori è stata inibita dal trattamento con GW2974 (Figura 2A). Un'esposizione più leggera dell'esperimento di array RTK è mostrata come Figura supplementare S1. Quindi, EGFR, Met, Her2 e Her3 sono tutti attivati ​​in questa linea cellulare senza EGF o HGF esogeni. Questi dati indicano l'attivazione costitutiva di Met, Her2 e Her3 in questa linea cellulare e dialoghi incrociati tra i recettori della famiglia ErbB e Met.

L'analisi dell'immunoblot di questi estratti ha confermato i dati dell'array RTK che mostrano l'attivazione costitutiva di EGFR e Met e l'inibizione da parte di GW2974 (Figura 2B e C). Il fattore di crescita epidermico è stato in grado di attivare ulteriormente la fosforilazione della tirosina dei recettori ErbB e questo effetto è stato abrogato dal trattamento di 2 ore con GW2974 (bande attorno a 175 kDa corrispondono ai recettori ErbB nella Figura 2B). Indagini dettagliate sull'effetto del trattamento con EGF hanno mostrato un'ulteriore fosforilazione di EGFR a Y845, ma non sono state osservate ulteriori attivazioni a Y1068 di EGFR e Met (Figura 2C). Allo stesso modo, nessuna ulteriore attivazione di Akt e Stat3 è stata osservata con il trattamento EGF, mentre Shc ed Erk1 / 2 sono stati ulteriormente attivati ​​dal trattamento EGF. Il trattamento delle cellule private del siero con GW2974 per sole 2 ore prima dell'attivazione dell'EGF era sufficiente per inibire la fosforilazione di EGFR e Met simile al trattamento continuo di 5 giorni con GW2974 nel siero al 10% (Figura 1C). GW2974 ha anche ridotto la fosforilazione a valle di Stat3, Shc e Akt, sebbene solo riducendo la fosforilazione EGK-dipendente di Erk1 / 2 ai livelli basali basali. Nel complesso, questi dati mostrano che GW2974 inibisce l'attivazione della segnalazione a valle indotta dal trattamento con EGF.

GW2974 non inibisce l'attivazione dipendente da HGF di Met in assenza di recettori della famiglia ErbB

La forte attivazione di membri delle famiglie Met ed ErbB nelle cellule H441 suggerisce due possibili meccanismi per l'attività inibitoria di GW2974 verso Met. Il composto potrebbe agire direttamente attraverso un'inibizione off-target di Met in queste cellule. In alternativa, i recettori ErbB presi di mira da GW2974 possono normalmente promuovere la fosforilazione del Met in queste cellule. Ciò sarebbe coerente con studi recenti che suggeriscono un dialogo a livello di recettori tra recettori ErbB e Met (Radaeva et al, 1999; Jo et al, 2000; Engelman et al, 2007).

Per determinare se GW2974 inibisce direttamente l'attivazione di Met, indipendentemente dalla sua attività su EGFR e Her2, abbiamo incubato cellule H441 affamate di siero con il ligando Met, HGF. GW2974 ha inibito la fosforilazione di Met in assenza o presenza di HGF esogeno in modo dose-dipendente simile alla sua attività in presenza di siero bovino fetale al 10% (FBS) o EGF (confronta la Figura 3A con le Figure 1 e 2). Inoltre, Met è costitutivamente attivo nelle cellule H441 (Figure 1 e 2) e non abbiamo osservato ulteriori fosforilazione in presenza di HGF (Figura 3A). Inoltre, l'attività di GW2974 sulla fosforilazione di Met non è stata influenzata dalla presenza di HGF in queste cellule. Un inibitore di piccole molecole di Met (PHA665752, di seguito denominato PHA) è stato usato come controllo positivo per l'inibizione di Met.

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Cross-talk tra i recettori della famiglia Met ed EGFR. GW2974 inibisce l'attivazione del Met in modo dose-dipendente nelle cellule H441 ( A ), ma non in assenza di recettori della famiglia EGFR nelle cellule 32D / Met ( B ). ( A ) GW2974 inibisce l'attivazione del Met in presenza o assenza di HGF. Le cellule erano affamate di siero per 24 ore, seguite da un trattamento con un veicolo (DMSO) o GW2974 o un inibitore Met (PHA) per 2 ore prima dell'attivazione con HGF (50 ng ml −1 ) per 30 min. Sono stati fatti estratti di cellule intere e sottoposti a western blot con anticorpi indicati. ( B ) GW2974 e gefitinib non inibiscono l'attivazione dipendente dal HGF di Met in cellule 32D trasfettate stabilmente con Met (32D / Met). Le cellule sono state trattate come nel pannello A. β -Tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.

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Per valutare direttamente i possibili effetti off-target di GW2974 su Met, abbiamo analizzato l'attività su cellule mieloidi 32D stabilmente trasfettate con Met (32D / Met) (Day et al, 1999). Queste cellule non esprimono i recettori della famiglia ErbB endogena (EGFR, Her2, Her3 e Her4). GW2974 non ha inibito fortemente l'attivazione dipendente dal metano di Met (Figura 3B, corsie 6-9), sebbene possa esserci una riduzione marginale nell'attivazione di Met alla maggiore concentrazione di GW2974. Inoltre, la combinazione dell'inibitore Met, PHA, con GW2974 ha prodotto un'attività simile al solo PHA e non è stata osservata un'ulteriore riduzione della fosforilazione di Met (Figura 3B, corsie 10-18). Un altro inibitore dell'EGFR di piccole molecole, il gefitinib, non ha inibito l'attivazione del Met nelle cellule 32D / Met (Figura 3B, corsia 19 e Figura supplementare S2). Questi dati suggeriscono che, nelle cellule H441, l'attività di GW2974 è dovuta all'inibizione di EGFR e / o Her2, che a sua volta influenza la fosforilazione di Met. Ciò suggerisce un dialogo incrociato attivo tra i recettori della famiglia ErbB e Met.

L'interazione fisica di Her2 e Met è inibita da GW2974

Poiché GW2974 ha avuto un impatto limitato sul Met nelle cellule prive dei recettori della famiglia ErbB, è possibile che, invece, il farmaco influisca sull'attivazione del Met nelle cellule H441 inibendo l'EGFR e / o Her2 e interferendo secondariamente con l'attivazione di Met dipendente dall'ErbB. Una possibilità è che Met formi un complesso fisico con uno o più recettori della famiglia ErbB. Infatti, Met coimmunoprecipitato con Her2, indica che si trovano in un complesso proteico (Figura 4A). Questa interazione è stata inibita da GW2974 in modo dose-dipendente (confrontare corsie 3-4 con corsia 2) parallelamente alla riduzione della fosforilazione Met (Figura 1C). Allo stesso modo, Met è stato coimmunoprecipitato con EGFR in cellule H441 (Figura 4B). Tuttavia, in questo caso, GW2974 si è ridotto, ma non ha completamente abrogato l'interazione (confrontare le corsie 7–8 con le corsie 3-4). Questi dati suggeriscono che il cross-talk di EGFR ed Her2, con Met, sia mediato dalle interazioni in un complesso proteico, sebbene la natura delle interazioni con EGFR ed Her2 possa essere diversa.

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Met interagisce sia con EGFR che con Her2 e l'interazione è inibita da GW2974. ( A e B ) Estratti di cellule intere sono stati ottenuti da cellule H441 trattate con GW2974 per 2 ore o controllo del veicolo DMSO. Gli estratti (1 mg) sono stati sottoposti a immunoprecipitazione con anticorpi anti-Her2 ( A ) o anti-EGFR ( B ) seguiti da immunoblotting con gli anticorpi indicati. L'immunoprecipitazione con IgG è stata usata come controllo negativo in ogni esperimento. I numeri sul lato dei pannelli indicano un marcatore di peso molecolare. I pannelli centrali di A e B provengono dalla regione del recettore ErbB della macchia. ( C ) Gli estratti di cellule intere sono stati immunoblottati con anticorpo anti-Met per indicare uguali quantità di Met in ciascun trattamento. La β- tubulina è stata usata come controllo del carico.

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La downregulation di Met influenza l'attivazione dei recettori della famiglia ErbB

In precedenza è stato dimostrato che la downregulation di Met, in una linea cellulare sovraespressa di Met con mutazione attiva in EGFR, non ha ridotto l'attivazione di EGFR o Her3, ma ha ripristinato la sensibilità di gefitinib (Engelman et al, 2007). Abbiamo esaminato l'effetto della downregulation Met utilizzando shRNA specifico per Met nelle cellule H441, che ha fortemente ridotto l'espressione di Met, ma non EGFR, Her2 o Her3 (Figura 5B). Nell'analisi dell'array di cattura RTK, sono state ridotte non solo la fosforilazione del Met ma anche la fosforilazione dei recettori della famiglia ErbB (EGFR, Her2 e Her3) e Ret (Figura 5A). La fosforilazione totale della tirosina di Her2 e Her3 immunoprecipitati è stata ridotta con l'espressione di Met shRNA (Figura 5C), in linea con i dati dell'array di acquisizione RTK (Figura 5A). Un'ulteriore analisi degli effetti del met shRNA sui recettori della famiglia ErbB ha rivelato che i siti di fosforilazione della tirosina nei recettori ErbB sono influenzati in modo diverso. Sia il dominio TK (Y847) che i siti di autofosforilazione (Y992, Y1068) di EGFR sono maggiormente interessati, con inibizione concomitante di Erk1 / 2 e fosforilazione di Akt. In confronto, i siti di autofosforilazione del sito Her2 (Y1289, Y1112) e del dominio della chinasi (Y877) sono stati influenzati solo modestamente con solo un effetto marginale su Shc e nessun effetto apparente sullo stato di fosforilazione di Stat3. Allo stesso modo, Her3 a Y1289 è stato meno influenzato dalla downregulation di Met (Figura 5B). Questi dati forniscono ulteriori prove del cross-talk di EGFR, Her2 e Her3 con Met.

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Met shRNA downregula l'attivazione del recettore della famiglia ErbB. Gli estratti di cellule intere sono stati ottenuti da cellule di controllo (H441-pLKO.1) e Met shRNA (H441-Met shRNA). ( A ) Gli estratti di cellule intere (200 μ g) sono stati analizzati su ciascuna membrana dell'array RTK e lo stato di attivazione dei recettori è stato valutato utilizzando l'anticorpo antifosfotirosina e numerato come in Figura 1A. 1: EGFR; 2: Her2; 3: Her3; 6: incontrato; 7: MSRP; e 9: Ret. ( B ) Gli estratti cellulari analizzati nel pannello A sono stati analizzati mediante immunoblotting con gli anticorpi indicati. La β- tubulina è stata usata come controllo del carico. ( C ) Gli estratti cellulari (500 μ g) usati nel pannello A sono stati sottoposti a immunoprecipitazione usando anticorpi anti-Her2 o anti-Her3 seguiti da immunoblotting con gli anticorpi indicati. Le IgG sono state usate come controllo negativo.

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GW2974 inibisce la guarigione delle ferite nelle cellule H441

Poiché Met interagisce sia con EGFR che con Her2 e la segnalazione Met-dipendente è inibita da GW2974, abbiamo studiato gli effetti di GW2974 su un processo associato all'attività biologica di Met, la guarigione delle ferite. Studi precedenti hanno dimostrato che la guarigione delle ferite nelle cellule H441 è inibita dal trattamento con l'inibitore Met PHA (Christensen et al, 2003). GW2974 ha inibito la guarigione della ferita da graffio delle cellule H441 a una concentrazione che inibisce altri processi di segnalazione metadipendenti (Figura supplementare S3). La ferita da graffio nelle cellule trattate con GW2974 (25 μ M) non è stata curata da 54 h (Figura complementare S3H), mentre la ferita da graffio nelle cellule non trattate è stata guarita da 24 h in presenza di FBS al 10% (Figura supplementare S3C). Allo stesso modo, la ferita da graffio delle cellule che esprimono met shRNA non è guarita di 24 ore in presenza di FBS al 10%, mentre le cellule di controllo ferite da graffio sono state guarite di 24 ore (Figura complementare S4B e D).

Combinazione di inibitori di Met con inibitori della famiglia ErbB

Per esplorare le implicazioni terapeutiche dell'attivazione del Met nel trattamento dell'NSCLC, abbiamo combinato l'inibitore del Met con gefitinib (Figura 6A) o GW2974 (Figura 6B) e monitorato la crescita cellulare nelle cellule H441, H441-pLKO.1 e shRNA H441-Met le cellule. È stato utilizzato un rapporto fisso di 1 sia per PHA che per GW2974 con concentrazioni comprese tra 0, 125 e 3 μ M. Ogni set di dati viene tracciato come una curva di regressione dose-risposta. Ogni singolo farmaco non è stato in grado di inibire efficacemente la proliferazione alle concentrazioni utilizzate in questo studio, ma la combinazione di due farmaci ha provocato un'inibizione sinergica della proliferazione. È importante sottolineare che la downregulation di Met ha ripristinato le attività di gefitinib e GW2974 (Figura 6Aiii e Biii). L'analisi Western blot indica che GW2974 è più efficace nell'inibire la fosforilazione di Her2, Her3, Stat3 e Shc nelle cellule shRNA H441-Met rispetto alle cellule H441-pLKO.1 infette da controllo (Figura 6C) suggerendo che Met è responsabile dell'attivazione di Segnalazione dipendente dal recettore della famiglia EGF e resistenza a GW2974 nelle cellule H441.

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Inibizione sinergica della proliferazione cellulare mediante combinazione di un inibitore Met (PHA) con gefitinib o GW2974 nelle cellule H441. Le cellule sono state trattate con le concentrazioni indicate di gefitinib e PHA ( Ai - iii ) o GW2974 e PHA ( Bi - iii ) da sole o in combinazione a un intervallo di concentrazione di 0, 125–3 μ M per 5 giorni. Per la combinazione di farmaci, è stato utilizzato un rapporto fisso di 1. La proliferazione cellulare è stata valutata come nella Figura 1B. I dati sono stati tracciati come curve di regressione dose-risposta usando il programma Xlfit. Ogni barra di errore rappresenta l'sd di tre set di dati. Ai - Bi : cellule H441; Aii - Bii : cellule H441-pLKO.1; e Aiii - Biii : cellule shRNA H441-Met. ( C ) Gli estratti di cellule intere sono stati ottenuti da cellule trattate con farmaci per 5 giorni, come indicato, e sono stati sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi indicati. La β- tubulina è stata usata come controllo del carico.

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La combinazione di GW2974 con PHA ha prodotto una maggiore inibizione sinergica a una concentrazione inferiore di entrambi i farmaci rispetto a gefitinib con PHA per la crescita cellulare nelle cellule shRNA H441-Met (confronta la Figura 6Aiii con la Figura 6Biii), suggerendo che Met influenza direttamente l'attivazione dell'EGFR nelle cellule H441 . Questi dati, se combinati con altri dati presentati in questo studio, suggeriscono che potrebbe essere necessaria un'inibizione simultanea di RTK multipli per abrogare efficacemente la crescita cellulare.

Discussione

Nel tentativo di comprendere meglio i potenziali bersagli drogabili in NSCLC, abbiamo analizzato diverse linee cellulari con array di acquisizione RTK. Questi esperimenti hanno rivelato che, nelle cellule H441, l'attività RTK dominante era per i recettori EGFR, Her2, Her3 e Met. La linea cellulare H441 è stata precedentemente dimostrata resistente a gefitinib e cetuximab (Tracy et al, 2004; Mukohara et al, 2005). Abbiamo scoperto che l'attività dell'EGFR in queste cellule può essere inibita dal doppio EGFR e dall'inibitore della chinasi HerW GW2974 ad alte concentrazioni micromolari, che influenza anche la fosforilazione di Stat3, Akt e Shc, ma non Erk1 / 2. Inaspettatamente, questo inibitore ha anche ridotto l'alto livello di fosforilazione Met basale. L'inibizione di Met da parte di GW2974 sembra avvenire principalmente attraverso un meccanismo indiretto, poiché questo composto non ha alcun effetto sulla fosforilazione di Met in cellule 32D che esprimono Met (32D / Met) che mancano di recettori EGFR ed Her2. Poiché Met è coimmunoprecipitato con Her2 ed EGFR e questa interazione è inibita da GW2974, si suggerisce che l'interruzione di complessi fisici tra RTK sia un possibile meccanismo. GW974 ha forti attività biologiche che probabilmente funzionano attraverso Met, inclusa l'inibizione della guarigione della ferita dopo la lesione da graffio di un monostrato cellulare. Inoltre, combinazioni di farmaci anti-Met e anti-ErbB hanno prodotto effetti sinergici sulla proliferazione cellulare e sulla segnalazione a valle di questi recettori.

EGFR attivato, Her2, Her3 e Her4 formano eterodimeri che portano a risultati cooperativi e sinergici. La stretta collaborazione di EGFR con Her2 ha portato allo sviluppo di altri farmaci inibitori della famiglia dei recettori ErbB tra cui il doppio lapatinib EGFR / HER2 TKI e l'anticorpo terapeutico, pertuzumab, che blocca le interazioni Her2 con EGFR ed Her3. Questi farmaci sono attualmente in fase di sperimentazione clinica (pertuzumab) o approvati (lapatinib), dimostrando la loro promettente attività nel cancro. Questi recettori sono anche modulati dall'associazione diretta con altri recettori (incluso gp130) e dall'impatto di altri recettori sull'attivazione funzionale dei propeptidi del fattore di crescita mediante elaborazione proteolitica (ad esempio, l'attivazione di Hb-EGF da parte di recettori accoppiati a proteine ​​G).

Ad oggi, non esistono terapie mirate adatte alla maggior parte dei pazienti con NSCLC che non rispondono a erlotinib o gefitinib. Presumibilmente, questi tumori sono guidati dall'attivazione di altre molecole di segnalazione oltre l'EGFR. Alcuni avranno mutazioni in altri RTK che sarebbero segni distintivi della sensibilità agli inibitori di RTK con lo spettro d'azione appropriato, mentre altri potrebbero essere guidati da meccanismi non correlati agli RTK. La definizione di tumori con array di cattura RTK può essere molto utile nell'analisi di primo passaggio dei tumori per identificare RTK attivi che possono essere sensibili al trattamento con gli inibitori della chinasi. Ad esempio, la nostra scoperta che le cellule H441 sono sensibili al Met e che gli inibitori ErbB potrebbero essere previsti in base all'attività di questi recettori determinata dall'array di acquisizione RTK (Figura 1).

Oltre a porre sfide al trattamento, l'interattività incrociata di RTK offre potenzialmente nuove opportunità di trattamento. Questo studio è focalizzato sulle interazioni tra due famiglie RTK, ErbBs e Met, che hanno funzioni sovrapposte nell'iniziazione e nella progressione del cancro. Gli ErbB sono coinvolti nella promozione della proliferazione e della sopravvivenza e Met ha ruoli importanti nella motilità cellulare e nella transizione epiteliale / mesenchimale. La nostra identificazione della segnalazione di ErbB e Met in una singola linea cellulare di carcinoma polmonare e il coinvolgimento nella risposta agli inibitori di ErbB e Met è coerente con altri studi recenti che hanno evidenziato la cooperazione funzionale tra queste due famiglie di recettori (Bean et al, 2007; Guo et al, 2008; Mueller et al, 2008; Shattuck et al, 2008; Yano et al, 2008). L'interazione di queste famiglie di recettori è stata suggerita per anni, in base alla constatazione che il Met è spesso sovraespresso con ErbB nel carcinoma della prostata e del seno. Il fattore di crescita degli epatociti promuove la motilità e il comportamento invasivo delle cellule epiteliali mammarie trasformate da Her2 (Neu) (Khoury et al, 2005). Un recente schermo fosfoproteomico per bersagli EGFR nel glioblastoma ha identificato Met (Stommel et al, 2007).

Le matrici di anticorpi della tirosina chinasi dei recettori utilizzate in questo studio hanno indicato chiaramente differenze nei livelli di attivazione dei recettori in due linee cellulari con WFR EGFR, che ci ha spinto a studiare gli inibitori dei recettori della famiglia ErbB nel NSCLC. In questo studio, riportiamo l'attività di un analogo del lapatinib, GW2974, che è una piccola molecola TKI doppia di EGFR / Her2. Lapatinib ha mostrato benefici preferenziali per i pazienti con carcinoma mammario amplificato Her2 rispetto ai pazienti con livello normale di Her2 (Konecny ​​et al, 2006). Sebbene HER2 non sia comunemente amplificato in NSCLC, in circa il 2% dei pazienti con NSCLC, in Her2 è stata riportata una mutazione attivante simile a quella osservata in EGFR. Il tasso di risposta per lapatinib da solo in uno studio clinico randomizzato per NSCLC è stato molto basso (Smylie et al, 2007). Abbiamo dimostrato che GW2974 mostra un'elevata attività micromolare in cellule H441 che portano WT EGFR e attivazione costitutiva ed espressione di Met. Questa attività è simile all'Her2 non amplificato nel carcinoma mammario (Konecny ​​et al, 2006). Tuttavia, segnaliamo una linea cellulare cancerosa del polmone sensibile al GW2974 (H1666) che ha un livello normale sia di Her2 che di Met e non ha una mutazione attiva in EGFR. GW2974 è stato in grado di downregolare l'attivazione dipendente da EGFR di Akt, Erk1 / 2, e ha avuto un effetto marginale su Stat3 in modo dose-dipendente (Figura 1C). Questa linea cellulare ha dimostrato di essere resistente a gefitinib. La sensibilità di questa linea cellulare a GW2974 è simile alla sua attività nei tumori mammari amplificati Her2. Sono necessarie ulteriori indagini per comprendere il meccanismo molecolare per la sua risposta a questo farmaco.

Al contrario, GW2974 ha sottoregolato la segnalazione Met-dipendente in H441 e non ha mostrato alcun effetto sul livello di fosforilazione di Erk1 / 2. L'attivazione costitutiva di Met, Her2 e Her3 anche nelle cellule affamate di siero suggerisce un'attivazione indipendente dal ligando di questi recettori. Una possibilità potrebbe essere l'attivazione autocrina di questi recettori a causa dell'espressione di un ligando, come EGF o HGF ecc. L'espressione del ligando da parte delle cellule tumorali è stata osservata in molti casi che spesso portano alla resistenza ai farmaci aggirando la necessità di sovraespressione o attivazione della mutazione negli oncogeni per la progressione del cancro. Una seconda possibilità è la transattivazione da parte di un altro recettore, ad esempio Met nelle cellule H441 che aggira la necessità di attivazione ligando-dipendente di EGFR, Her2 e Her3 (Figure 1, 2, 5 e 6). GW2974 ha inibito la proliferazione, l'attivazione Met-dipendente della segnalazione a valle e la fosforilazione di Met in modo dose-dipendente nelle cellule H441, ma non ha downregolato l'attivazione HGF-dipendente di Met nelle cellule 32D / Met, suggerendo che in H441 c'è un cross-talk attivo tra i recettori Met ed ErbB. Tuttavia, l'attività inibitoria di GW2974 è osservata a una concentrazione (micromolare) più elevata di quella normalmente richiesta per l'inibizione della segnalazione dipendente da EGFR / Her2. Nelle cellule H441, GW2974 ha inibito l'attivazione di EGFR, Her2 e Her3 a concentrazioni più basse, quando Met è stato regolato verso il basso (Figura 6, confrontare la corsia 2 con la corsia 6). Infatti, sia Her2 che EGFR sono in grado di coimmunoprecipitare Met nelle cellule H441. L'interazione di Met con Her2 è inibita da GW2974 in modo dose-dipendente simile alla sua attività verso la segnalazione Met-dipendente. Tuttavia, l'interazione di Met con EGFR è di natura diversa, poiché questa interazione è inibita da GW2974 senza mostrare alcuna dipendenza dalla dose. Per la prima volta, abbiamo dimostrato che la downregulation di shRNA Met-specifico-specifico porta a un effetto differenziale sui siti di fosforilazione della tirosina di EGFR, Her2 e Her3 (Figura 5) suggerendo che Met svolge un ruolo cruciale nell'attivazione dei recettori della famiglia ErbB, in particolare EGFR, poiché l'attivazione di EGFR è drasticamente influenzata dall'inibizione concomitante di Erk1 / 2 e l'attivazione di Akt. Tuttavia, l'attivazione di Stat3 non è stata influenzata e Shc è influenzato solo marginalmente dalla downregulation Met che suggerisce che è regolata da un meccanismo diverso. Uno di questi meccanismi potrebbe essere l'attivazione ligando-dipendente di Her2 e Her3 in queste cellule, in quanto l'attivazione di entrambi è sotto-regolata da GW2974 in modo dose-dipendente.

Per esplorare le implicazioni terapeutiche della coattivazione delle RTK, abbiamo valutato la combinazione di inibitori per i recettori della famiglia Met ed ErbB nelle cellule H441. Come mostrato nella Figura 6, entrambi i farmaci da soli non erano molto efficaci nell'inibire la proliferazione. Tuttavia, la combinazione di farmaci è stata sinergica nell'inibire la proliferazione delle cellule in modo molto efficace. È interessante notare che dalle curve di regressione è molto chiaro che qualsiasi piccola inibizione da parte del solo PHA era sufficiente per inibire efficacemente la crescita cellulare quando combinato con GW2974 alla concentrazione più bassa di 0, 125 μ M nelle cellule shRNA Met (Figura 6Biii), mentre questo non era il caso con PHA e gefitinib nelle stesse cellule (Figura 6Aiii). Ciò suggerisce che la coattivazione di più RTK nelle cellule tumorali conferisce resistenza alla terapia con un singolo agente, ma questa resistenza può essere facilmente superata inibendo contemporaneamente diversi RTK con combinazioni di farmaci scelte razionalmente. Osservazioni simili sono state fatte recentemente nel caso di glioblastomi che trasportano recettori EGFR e Met attivati ​​in cui l'inibizione simultanea di EGFR (erlotinib) e Met (SU11274) porta alla downregulation della via PI3K e riduce la dimensione della formazione di colonie nell'agar molle (Stommel et al, 2007). La singola inibizione da parte del singolo farmaco è stata meno efficace. Thus, our study combined with other similar observations provides a compelling evidence to effectively treat cancers by rationally designed drug combinations.

The rapid pace of development of molecularly targeted anticancer drugs creates a concomitant need for the development of the best tools for matching the drugs to appropriate patients. Phosphoproteomic analysis by RTK capture arrays may be a valuable tool for identifying the subset of tumours with functional receptor activation, regardless of mechanism. Similar arrays that monitor the activity of intermediary signalling molecules through their phosphorylation status provide one relatively inexpensive tool for this purpose. The best analysis of tumour samples may require a combination of proteomic, genetic, epigenetic and functional characterisation.

The functional studies here led to the hypothesis that dual targeting of ErbBs and Met may be very important in the treatment of some human cancers. Ectopic signalling by members of each receptor family are common in human cancer, and the receptor systems have complementary functions in promoting growth, survival and qualities associated with invasion and metastasis. This study when combined with other studies provides compelling support for the combination of these drugs in future clinical trials.

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  4. 4.

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    Informazioni supplementari accompagnano l'articolo sul sito Web del British Journal of Cancer (//www.nature.com/bjc)