Associazione dei polimorfismi del gene del recettore della melanocortina 1 (mc1r) con riflettanza cutanea e lentiggini in giapponese | diario di genetica umana

Associazione dei polimorfismi del gene del recettore della melanocortina 1 (mc1r) con riflettanza cutanea e lentiggini in giapponese | diario di genetica umana

Anonim

Soggetti

  • Studio di associazione genetica
  • Variazione genetica

Astratto

La maggior parte degli studi sulle basi genetiche della pigmentazione della pelle umana si sono concentrati su persone di origine europea e solo pochi studi si sono concentrati sulle popolazioni asiatiche. Abbiamo studiato l'associazione di riflettanza cutanea e lentiggine con varianti genetiche del gene del recettore della melanocortina 1 ( MC1R ) in giapponese. Campioni di DNA sono stati ottenuti da un totale di 653 individui giapponesi (di età compresa tra 19 e 40 anni) residenti a Okinawa; la riflettanza cutanea è stata misurata usando uno spettrofotometro e lo stato lentigginoso è stato determinato per ciascun individuo. L'indice di leggerezza ( L * ) e lo stato lentigginoso non erano correlati con l'età, l'indice di massa corporea o gli antenati (Ryukyuan o Principali isole del Giappone). Tra le 10 varianti non sinonime identificate dal sequenziamento diretto della regione di codifica di MC1R , due varianti - R163Q e V92M - con le frequenze di allele derivate rispettivamente del 78, 6 e 5, 5%, erano le più comuni. L'analisi di regressione multipla ha mostrato che l'allele 163Q e la presenza di varianti rare non sinonime (frequenze alleliche <5%) erano significativamente associate ad un aumento della leggerezza cutanea standardizzata per sesso ( L * di CIELAB (CIE 1976 (L * a * b *) spazio colore)) della parte superiore del braccio interno. Rispetto all'allele 92V, l'allele 92M era significativamente associato con maggiori probabilità di lentiggine. Questo è il primo studio che mostra un'associazione tra l'allele 163Q e i valori di riflettanza cutanea; questa associazione ha indicato che la pelle di colore chiaro potrebbe essere stata sottoposta a selezione positiva nelle popolazioni dell'Asia orientale.

introduzione

Il corpo umano è avvolto dalla pelle, che funge da interfaccia per l'interazione tra il corpo e il suo ambiente. La pelle forma una barriera contro l'invasione microbica e protegge il corpo dai danni causati da sostanze chimiche, calore e radiazioni ultraviolette (UV). Un ruolo importante della pelle umana è controllare la temperatura corporea attraverso la sudorazione e la conseguente perdita di calore. 1 Un altro ruolo della pelle è mediare la sintesi di vitamina D quando l'esposizione al sole è adeguata. 2 Come interfaccia tra il corpo e l'ambiente, tutte queste funzioni della pelle possono essere probabilmente considerate adattamenti ai diversi tipi di ambienti che circondano i nostri antenati, modellando la variazione geografica delle caratteristiche della pelle, compresa la pigmentazione nell'uomo moderno. 3, 4 L'apparente variazione geografica nella pigmentazione della pelle ha attirato l'attenzione sia pubblica che accademica, ed è stata studiata in molte aree di ricerca come biologia evolutiva, medicina clinica, scienze della salute, fisiologia e genetica molecolare, 5, 6, 7, 8 come così come la sociologia e la psicologia. 9, 10, 11

Sono state proposte varie ipotesi per spiegare l'evoluzione della pigmentazione della pelle; riassumiamo queste ipotesi come segue. Si ritiene che la pelle scura sia favorita dalla selezione naturale vicino all'equatore dove le radiazioni UV sono elevate, perché la pelle scura protegge il corpo dal surriscaldamento e dalle scottature solari, 12 nonché dai danni indotti dai raggi UV al DNA e all'acido folico. 3 Alle alte latitudini, inclusa l'Europa, la pelle chiara può essere selezionata per la sua capacità di consentire la sintesi di vitamina D sufficiente anche in condizioni di bassa radiazione UV; al contrario, la pelle scura può portare ad una maggiore suscettibilità al rachitismo alle alte latitudini. 2, 13 Jablonski e Chaplin 4 hanno riportato una correlazione tra la quantità di melanina cutanea e i livelli di radiazione UV tra le popolazioni indigene; questa correlazione è stata spiegata dall'equilibrio tra i requisiti fisiologici per la sintesi di vitamina D e la protezione dai folati dai raggi UV. Un'altra spiegazione per la depigmentazione della pelle è l'evoluzione neutrale; in particolare, la riduzione dell'esposizione alle radiazioni UV per le popolazioni migrate lontano dall'equatore ha rimosso i vincoli che mantengono la pelle scura. 14 Tuttavia, recenti scoperte della genetica molecolare e teorica indicano che la deriva genetica casuale da sola non è sufficiente per spiegare il tasso di evoluzione della pelle chiara. Molto tempo prima di queste proposte, Darwin 15 aveva ipotizzato che la diversità del colore della pelle umana fosse sorta dalla selezione sessuale attraverso un processo di scelta del compagno, specialmente nelle aree ad alta latitudine. Pertanto, la selezione sessuale, così come la selezione naturale, deve essere considerata nello studio dell'evoluzione della pigmentazione della pelle umana. 16, 17

La riflettanza cutanea umana è un tratto genetico quantitativo con un continuum dall'oscurità alla luce. Tradizionalmente, gli studi di misurazione del colore sull'uomo hanno utilizzato una serie di pannelli di colore o categorie di colore come la scala cromatica di von Luschan e il pannello di colore di Broca. 12, 18, 19 Successivamente, fu introdotta la scala Fitzpatrick per classificare la risposta abbronzante della pelle in sei categorie. 20 Con l'avanzare della tecnologia, i pannelli colorati sono stati sostituiti da spettrofotometri. 21, 22 La valutazione basata su questionari come le categorie autosufficienti (discrete / chiare, medie o verde oliva / scure) e la scala di Fitzpatrick sono ancora utilizzate anche negli studi di associazione su tutto il genoma incentrati su persone di origine europea. 23 Tuttavia, i metodi che dipendono da categorie arbitrarie per il colore della pelle o la scala di Fitzpatrick potrebbero non essere validi per gli asiatici orientali; ad esempio, tutti i partecipanti allo studio di Motokawa et al. 24 sono stati classificati nella categoria "media" e tipi di pelle II – IV. Pertanto, gli spettrofotometri, che forniscono misurazioni cromatiche obiettive e coerenti, sono più adatti per misurare la riflettanza cutanea degli asiatici orientali.

Il gene del recettore della melanocortina 1 ( MC1R , MIM 15555) è molto importante nella pigmentazione della pelle umana. MC1R si trova sul cromosoma umano 16q24.3 e codifica un singolo esone di 954 bp e una proteina di 317 amminoacidi. 25 La proteina MC1R è un recettore a sette transmembrane accoppiato a proteine ​​G per l'ormone della simulazione di α-melanociti. Quando l'ormone della simulazione dell'α-melanocita si lega alla sequenza aminoacidica His-Phe-Arg-Trp (TFRW) di MC1R, che si trova sulla superficie extracellulare di un melanocita, la successiva attivazione dell'adenilato ciclasi facilita l'accumulo di adenosina ciclofosfato all'interno del melanociti; questo accumulo in definitiva promuove la sintesi di eumelanina (pigmento scuro). 26, 27 Pertanto, l'attivazione dell'MC1R ha un ruolo chiave nella pigmentazione della pelle perché si traduce in un passaggio dalla sintesi di feomelanina (pigmento leggero e immaturo) alla sintesi di eumelanina. 28

Prove molecolari indicano che (1) gli alleli MC1R sono stati sottoposti a selezione purificante o negativa in Africa, dove le radiazioni UV sono elevate durante tutto l'anno; (2) il rilassamento del vincolo ha guidato l'evoluzione neutrale dell'MC1R in regioni ad alta latitudine come l'Europa; 29 e (3) alcuni alleli probabilmente sono stati sottoposti a selezione direzionale. 30 Pertanto, la regione di codifica dell'MC1R è altamente conservata negli africani, mentre sono state riportate oltre 30 varianti non sinonime e sinonime in popolazioni di origine europea. 31 Nelle popolazioni asiatiche sono state segnalate più di 10 varianti, di cui le varianti V92M e R163Q sono state osservate ad alte frequenze rispetto alle frequenze osservate in popolazioni non asiatiche. 32, 33, 34 Recenti scansioni del genoma per sweep selettivi hanno rivelato che una forte selezione positiva ha agito sui geni correlati alla pigmentazione. 35, 36, 37 Coop et al. 38 ha suggerito una firma di una "scansione dell'Asia orientale" su R163Q (rs885479) basata su F ST e XP-EHH nei dati sul polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) a livello del genoma da HapMap, CEPH-Human Genome Diversity Panel e dati Perlegen impostato.

Le funzioni delle due varianti, V92M e R163Q, sono state studiate principalmente per quanto riguarda lentiggini e lentiggini negli asiatici e capelli rossi, pelle pallida e fenotipi lentigginosi negli europei. Uno studio su una popolazione giapponese ha riferito che gli alleli 92M e 163R sono associati a lentiggini e lentiggini solari. 39 Nelle persone di origine europea, tre alleli - V60L, V92M e R163Q - sono, secondo quanto riferito, varianti di colore dei capelli rossi a bassa penetrazione indicate come ' r ' e quattro alleli: D84E, R151C, R160W e D294H - designati ' R ' sono ad alta penetrazione varianti di colore di capelli rossi. 40 L'effetto degli alleli R ha rappresentato l'associazione significativa a livello del genoma tra SNP in una regione intorno all'MC1R e il colore dei capelli o la capacità di abbronzatura della pelle. 23, 41 In uno studio di Duffy et al. , 42 alleli R erano associati ad un aumento dello 0, 9% della riflettanza cutanea nella parte superiore del braccio interno, ma l'aumento era inferiore a quello associato agli alleli R (1, 9%). Negli asiatici, le associazioni di V92M e R163Q con riflettanza cutanea sono state studiate raramente. Un'eccezione è uno studio su una popolazione tibetana; gli effetti principali di queste due varianti non erano significativi, ma un'interazione tra V92M e un SNP in OCA2 era associata ad un aumento della leggerezza ( L * ) della pelle nella parte superiore del braccio interno. 43

L'associazione delle varianti MC1R con la riflettanza cutanea rimane ancora poco chiara nella maggior parte delle popolazioni dell'Asia orientale, compresa l'intera popolazione giapponese; tuttavia, alcuni ricercatori hanno suggerito che la selezione positiva ha agito sugli alleli MC1R nelle popolazioni dell'Asia orientale. 38 Pertanto, abbiamo studiato l'effetto delle varianti MC1R sulla pigmentazione della pelle in un ampio campione di giapponesi analizzando l'associazione tra le varianti MC1R e la riflettanza cutanea oggettivamente quantificate con uno spettrofotometro, nonché la lentiggine.

Materiali e metodi

Soggetti

I soggetti erano costituiti da 653 volontari sani (364 maschi e 289 femmine). L'età dei soggetti variava dai 19 ai 40 anni (media = 23, 62, sd = 4, 62). Il consenso informato è stato ottenuto da ciascun individuo. Questo studio è stato approvato dal comitato etico della ricerca dell'Università del Ryukyus. Ai partecipanti è stato chiesto di rivelare volontariamente il loro sesso, l'età e il luogo di nascita dei loro quattro nonni. In questo studio, "Isole Ryukyu" si riferisce alle isole più meridionali del Giappone, che includono le isole Okinawa, le isole Sakishima e le isole Amami. Il resto dell'arcipelago giapponese è stato definito come "Isole principali del Giappone" (Figura 1). L'indice Ryukyu è stato definito come il numero di nonni che provengono dalle Isole Ryukyu, compreso tra 0 (nessuno dei nonni proveniva dalle Isole Ryukyu) e 4 (tutti e quattro i nonni provenivano dalle Isole Ryukyu). L'indice di massa corporea (BMI) di ciascun soggetto è stato calcolato dall'altezza e dal peso corporei, misurati con un antropometro e una scala digitale portatile (media = 21, 58, sd = 3, 10 per le femmine; media = 23, 20, sd = 3, 61 per i maschi) .

Image

Mappa delle isole del Giappone divise in due gruppi, Isole Ryukyu e Isole Principali del Giappone. In questo studio, le isole Ryukyu comprendevano le isole Okinawa (compresa l'isola di Okinawa dove risiedevano i soggetti), le isole Sakishima e le isole Amami. Nonostante l'amministrazione della prefettura di Okinawa, le isole Daito furono escluse dalle isole Ryukyu a causa del background genetico dei residenti che discesero in gran parte da coloni relativamente recenti dell'isola di Hachijo, Tokyo.

Immagine a dimensione intera

Riflettanza della pelle

La riflettanza cutanea di ciascun soggetto è stata misurata usando uno spettrofotometro (Konica Minolta CM-600d; Konica Minolta Optics, Inc., Tokyo, Giappone) tra giugno 2009 e marzo 2011. Questo dispositivo misura la riflettanza di un oggetto con un componente che riceve la luce e converte i dati in vari sistemi di colore come CIELAB e curva spettrale. Abbiamo effettuato la misurazione sulla parte superiore del braccio interno di ciascun soggetto in condizioni di riposo. Ciascun partecipante ha esteso il braccio sinistro in modo tale da misurare la parte interna rivolta verso l'alto, per evitare errori dovuti al posizionamento del braccio, 44 e il punto medio tra l'ascella e il gomito.

Valutazione della lentiggine

Le lentiggini sono macule marrone chiaro (1-3 mm) su viso, braccia e schiena; le lentiggini si accentuano con l'esposizione al sole e si sbiadiscono durante l'inverno. 45, 46 Nei giapponesi, le lentiggini sono di colore marrone scuro e possono avere un diametro di 5 mm. 47 Abbiamo valutato le lentiggini su un colpo alla testa di ciascun partecipante e abbiamo considerato le lentiggini come "presenti" in soggetti con macule multiple sul dorso nasale e sulla guancia superiore e "assenti" in soggetti senza macule sul dorso nasale.

Genotipizzazione e aplotipizzazione

Il DNA genomico è stato estratto da un campione di sangue o saliva da ciascun partecipante utilizzando il kit per nucleo di sangue di Gentra Puregene o il mini kit di sangue per QIAamp (QIAGEN, Hilden, Germania), seguendo i protocolli del produttore. La genotipizzazione è stata eseguita utilizzando il metodo del sequenziamento diretto. Abbiamo progettato i primer (elencati nella tabella supplementare S1) utilizzando un programma online gratuito, Primer3, e facendo riferimento alla sequenza GenBank NG_012026. La PCR nidificata è stata eseguita per amplificare il frame di lettura aperta dell'MC1R in un volume totale di 20 μl contenente 0, 8 unità di FastStart Taq PCR Master (Roche Diagnosis, Basilea, Svizzera), 1 × PCR buffer + MgCl 2 e 200 μ M di ogni trifosfato desossiribonucleotidico. I parametri di ciclismo erano i seguenti: denatura iniziale di 95 ° C × 1 min, 40 cicli di 95 ° C × 30 s, 60 ° C × 30 se 72 ° C × 90 s, estensione finale di 72 ° C × 7 min e 20 ° C per la conservazione. Abbiamo usato un enzima diverso per la PCR nidificata di alcuni campioni; queste reazioni sono state eseguite in un volume totale di 20 μl contenente 0, 5 unità di TaKaRa ExTaq DNA polimerasi (Takara Biotechnology, Shiga, Giappone), 1 tampone PCR e 200 μ M di ciascun desossiribonucleotide trifosfato. I parametri di ciclismo in questo caso erano i seguenti: denatura iniziale di 94 ° C × 1 min, 40 cicli di 98 ° C × 10 s, 55 ° C × 30 se 72 ° C × 60 s, estensione finale di 72 ° C × 1 min e 4 ° C per la conservazione. I prodotti PCR sono stati sequenziati utilizzando il kit di sequenziamento del ciclo BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) su un analizzatore genetico ABI PRISM 310 o 3100 (Life Technologies); le sequenze sono state quindi analizzate con CodonCode Aligner (CodonCode Corporation, Dedham, MA, USA). Gli aplotipi MC1R sono stati stimati con PHASE versione 2.1, 48, 49, quindi è stata disegnata una rete di aplotipi utilizzando il metodo di giunzione mediana con il software NETWORK (fluxus-engineering.com). 50

La neutralità selettiva della regione di codifica MC1R è stata testata usando la D di Tajima con il software Arlequin ver. 3.5.1.3. 51, 52 Il significato della D di Tajima è stato testato dal valore P ottenuto come percentuale di D simulata minore o uguale all'osservazione in 1000 simulazioni usando un algoritmo di simulazione coalescente (test unilaterale).

analisi statistiche

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando IBM SPSS Statistics versione 19 (SPSS, Inc., una società IBM, Chicago, IL, USA). Abbiamo adottato un livello di significatività di 0, 05 se non diversamente indicato. Per test multipli, il tasso di scoperta falsa è stato controllato a un livello di 0, 05 secondo il metodo suggerito da Benjamini e Hochberg, 53, 54, che è stato trovato efficace per l'analisi quantitativa dei loci dei tratti.

Nell'analisi stratificata per sesso, le associazioni tra valori L * e genotipi sono state testate separatamente per femmine e maschi. Quindi, i risultati per femmine e maschi sono stati combinati da meta-analisi utilizzando due metodi: il metodo di trasformazione r- to- z di Fisher che combina coefficienti di regressione standardizzati specifici del sesso e il metodo normale inverso che raggruppa più valori P indipendentemente dall'effetto dimensioni. 55

Inoltre, i valori di L * sono stati adeguati al sesso standardizzandoli in punteggi z separatamente per maschi e femmine. Sono state condotte analisi di regressione multipla per esaminare le associazioni tra le varianti MC1R e i punteggi z dei valori di L * sui bracci interni (ZL *), e in queste analisi sono state controllate le covariate.

Per le varianti con frequenze alleliche non inferiori a 0, 05, i genotipi sono stati codificati come il numero di alleli derivati ​​(AA = 0, AD = 1, DD = 2; A = allele ancestrale, D = allele derivato) assumendo l'additivo (co-dominante ), in cui avere DD piuttosto che AA ha due volte più probabilità di influenzare L * rispetto ad avere AD piuttosto che AA. Le varianti non sinonime con frequenze inferiori a 0, 05 sono state combinate come "varianti rare" e una variabile, designata RARE, è stata definita come il numero di varianti rare portate dall'individuo, poiché la dimensione del campione di ciascuna variante rara era troppo piccola per essere testata separatamente . Abbiamo esaminato ulteriormente il modello dominante in cui avere il genotipo AD o DD piuttosto che AA ha la stessa probabilità di influenzare L * (codifica genotipo: AA = 0, AD = 1, DD = 1) e il modello recessivo in cui solo DD influenza il L * (AA = 0, AD = 0, DD = 1).

Le covariate includevano età (ETÀ), origini (indice Ryukyu) e indice di massa corporea, nonché il mese in cui ha avuto luogo ciascuna misurazione. Duecentododici femmine e 219 maschi erano dell'indice Ryukyu = 4 e 43 femmine e 95 maschi erano dell'indice Ryukyu = 0. Le altre categorie per l'indice Ryukyu avevano campioni di piccole dimensioni (2, 47, 19 per l'indice Ryukyu = rispettivamente 1, 2 e 3; 16 partecipanti avevano almeno un nonno con un luogo di nascita sconosciuto). Per il mese, una variabile fittizia JAN è stata impostata uguale a 1 se la misurazione è stata effettuata a gennaio ( n = 19) e uguale a 0 altrimenti. Allo stesso modo, 5 variabili fittizie aggiuntive JUN, JUL, AUG, OCT e NOV ( n = 60, 110, 58, 28 e 108, rispettivamente) sono state definite in modo identico alla variabile JAN, impostando le misurazioni effettuate a dicembre come base, perché la dimensione del campione era la più grande ( n = 269). Nessuna misura è stata presa a febbraio, aprile, maggio e settembre. Solo un individuo è stato misurato a marzo, quindi abbiamo incluso il campione in JAN.

La relazione tra queste variabili e ZL * è stata esaminata con la correlazione di rango di Spearman, t -test, test U -test di Mann – Whitney, test di Kruskal-Wallis e regressione multipla. Nell'analisi di regressione multipla, abbiamo adattato i dati a un modello

Image

dove X 1, X 2,

.

, X k sono variabili indipendenti. La multicollinearità è stata valutata in base al fattore di inflazione della varianza. Il modello migliore è stato determinato usando una procedura di regressione graduale con la probabilità di F di inserire 0, 05 e la probabilità di F di rimuovere 0, 10. Abbiamo anche testato il coinvolgimento dell'interazione che è descritta come un termine di prodotto di due variabili indipendenti, come X 1 X 2, nel modello. Le analisi che includevano valori erratici di L * sostanzialmente davano gli stessi risultati delle analisi che escludevano questi valori anomali; pertanto, abbiamo incluso gli outlier per rilevare l'effetto delle varianti agli estremi dei dati.

Prima dell'analisi di associazione dell'MC1R con la lentiggine, è stato calcolato un coefficiente di correlazione del rango di Spearman (ρ) tra lentiggine e covariate di due variabili continue, età e BMI. Per le variabili categoriche, tra cui sesso, indice Ryukyu e mese, è stato condotto un test di Pearson χ 2 per le variabili categoriali. È stato calcolato il odds ratio (OR) per la lentiggine dell'allele minore in ciascun SNP rispetto all'allele di consenso del campione. Un intervallo di confidenza al 95% (CI) per ciascun OR è stato ottenuto da OR ± 1, 96 se, per verificare se l'OR è significativamente diverso da 1. I valori OR che non sono significativamente diversi da 1 indicano che non vi era alcuna associazione tra l'allele e la lentiggine . Per la regressione logistica, abbiamo adattato i dati a un modello

Image

dove X 1, X 2,

.

, X k sono variabili indipendenti. Gli stessi criteri graduali utilizzati per l'analisi della regressione multipla lineare sopra descritta sono stati utilizzati per selezionare il modello migliore. È stato assunto il modello additivo (co-dominante) e i genotipi sono stati trattati come variabili continue. L'OR per X k è stato dato dalla funzione esponenziale, exp ( β k ).

Abbiamo anche condotto analisi di associazione degli alleli 92M e 163Q con riflettanza cutanea e lentiggini, seguendo la procedura utilizzata in Duffy et al. 42 Abbiamo definito una variabile, designata r , come il numero totale degli alleli 92M e 163Q. La riflettanza percentuale alla lunghezza d'onda 650 nm è stata utilizzata come variabile dipendente anziché ZL *.

risultati

I valori medi di L * erano 67, 07 e 64, 58 rispettivamente per donne e uomini. L'uguaglianza delle varianze è stata respinta (sd = 2.47 per la femmina, 3.30 per il maschio; F = 15.27, P = 1.03E – 04) e un test t per l'uguaglianza dei mezzi ha mostrato una differenza significativa tra i sessi nei valori L * medi ( varianza uguale non assunta, P = 4.71E-26). Pertanto, i valori di L * sono stati standardizzati per ciascun sesso e raggruppati per le seguenti analisi.

Abbiamo quindi esaminato l'effetto delle covariate su ZL *, prima della regressione multipla. Età e BMI non erano correlati con ZL * (età: Spearman's ρ = 0, 09, P = 0, 818; BMI: ρ = 0, 038, P = 0, 334), e quindi esclusi dalla regressione. Abbiamo confrontato Ryukyuans (Ryukyu Index = 4) e Main Island Japanese (Ryukyu Index = 0) e non abbiamo riscontrato differenze significative in ZL * tra i due gruppi ( t- test, ipotesi di variazione uguale, P = 0, 855). Pertanto, anche l'indice Ryukyu è stato escluso dal modello di regressione multipla. Quando ZL * è stato regredito sulle variabili fittizie relative al mese, due di queste variabili, JUN e JUL, sono state incluse nel modello migliore, come definito usando il metodo graduale; pertanto, queste due variabili fittizie sono state combinate come JUN_JUL per essere incluse nella successiva analisi di regressione come covariata.

Come risultato del sequenziamento della regione di codifica di MC1R , abbiamo trovato 20 varianti, 10 delle quali erano mutazioni non sinonime; il resto erano mutazioni sinonime. Sono state osservate una singola sinonimo e due varianti non sinonime a frequenze di allele derivate superiori al 5% (5, 5% per V92M, 78, 6% per R163Q e 8, 2% per 942A> G). Non vi è stata alcuna deviazione significativa dall'equilibrio di Hardy-Weinberg. Le restanti varianti non sinonime sono state osservate solo nello stato eterozigote e sommate nella variabile fittizia RARE, che ha assunto uno dei due valori 0 o 1 (Tabella 1). Non abbiamo trovato le varianti fortemente associate ai tratti pigmentari negli studi rivolti a persone di discendenza europea. 42, 56, 57 La Figura 2 mostra la rete di aplotipi basata sugli aplotipi stimati del campione. Come mostrato nel cerchio più grande con molti rami, la maggior parte degli aplotipi stimati aveva l'allele 163Q. Per il test di neutralità selettiva, la D di Tajima è stata calcolata come −1, 66 con un valore P di 0, 015, il che ha suggerito una deviazione dalla neutralità e la possibilità di purificazione o selezione positiva su MC1R .

Tabella a grandezza naturale

Image

Rete di aplotipi MC1R basata sugli aplotipi stimati di 1306 cromosomi valutati in questo studio. Ogni cerchio rappresenta un aplotipo con i suoi cambiamenti di aminoacidi annotati da o nel cerchio. La dimensione di ciascun cerchio riflette la frequenza dell'aplotipo. Il cerchio più piccolo equivale a 1 su 1306 cromosomi, mentre il cerchio più grande contiene 931 cromosomi. Le modifiche di base sono annotate lungo le linee che collegano i cerchi, che sono generiche per non sinonimi. I tre aplotipi stimati con la probabilità di 0, 5 con R163Q sono indicati con le linee tratteggiate.

Immagine a dimensione intera

L'analisi di regressione multipla graduale con fattori genetici ha determinato il modello migliore

Image

dove l'effetto dell'allele 163Q e delle varianti rare erano significativi ( P = 0, 016 e P = 0, 018, rispettivamente; Figura 3), ma V92M e 942A> G non erano significativi ( P = 0, 093 e 0, 067, rispettivamente). Il termine di interazione tra R163 e RARE (R163Q × RARE) era insignificante ( P = 0, 67) nel modello. R163Q e RARE sono rimasti significativi anche dopo aver controllato il tasso di falsa scoperta con il metodo Benjamini e Hochberg, con il secondo valore P più basso inferiore a 0, 025 (= 0, 05 × 2/4), sebbene non fossero significativi dopo la correzione di Bonferroni (livello di significatività = 0.05 / 4 = 0, 0125). L' R 2 aggiustato era 0, 012; pertanto, il modello ha spiegato solo l'1, 2% della variabilità totale in L * del braccio interno superiore per valori di L * che erano stati standardizzati dal sesso. 55

Image

Boxplot di L * (leggerezza) classificato in base al genotipo R163Q e raggruppato in rari aplotipi. Il punteggio Z di L * nella parte superiore del braccio interno è stato classificato in base ai genotipi R163Q e raggruppato in base agli aplotipi di rare varianti dell'MC1R. L'aplotipo '163R + rare' significa che la variante rara si trova sullo stesso aplotipo dell'allele 163R; '163Q + rare' significa che l'aplotipo contiene l'allele 163Q; e '0' significa che la variante rara è assente. Gli aplotipi stimati con la probabilità di 0, 5 sono stati considerati "163 Q + rari". La parte inferiore della scatola è il 25 ° percentile, la linea centrale è la mediana e la parte superiore della scatola è il 75 ° percentile. Le barre della casella rappresentano l'intervallo di dati, ad eccezione di quelli con punti neri, in cui le barre si estendono fino a 1, 5 volte più a lungo della casella e i dati oltre la fine della barra sono valori anomali contrassegnati come punti aperti. Il test di Kruskal-Wallis ha respinto l'ipotesi nulla di mediana di uguale popolazione per genotipi R163Q quando aplotipo raro = 0 ( P = 0, 012), nonché per aplotipi rari quando R163Q = RQ ( P = 0, 010). Sono stati eseguiti test a coppie per mediane uguali con il test U di Mann-Whitney e i valori P sono mostrati nella figura.

Immagine a dimensione intera

Un'analisi stratificata per sesso ha mostrato che i coefficienti di regressione per R163Q e RARE erano 0, 127 ( P = 0, 036) e 0, 085 ( P = 0, 158) nelle femmine, mentre 0, 095 ( P = 0, 081) e 0, 101 ( P = 0, 064) nei maschi (Tabella Supplementare S2). Sebbene i coefficienti di regressione fossero insignificanti nell'analisi stratificata per sesso, ad eccezione di R163Q nelle femmine ( P = 0, 036), la meta-analisi ha mostrato che i coefficienti standardizzati raggruppati erano significativi per R163Q ( P = 0, 0059), anche dopo la correzione di Bonferroni e per RARE ( P = 0, 018), anche dopo aver controllato il tasso di falsa scoperta con il metodo Benjamini e Hochberg (Tabella supplementare S3). 53, 55 I valori P raggruppati utilizzando il metodo normale inverso hanno supportato anche la significatività (R163Q: P = 0, 0033; RARO: P = 0, 011) anche dopo la correzione di Bonferroni, nonché dopo aver controllato il tasso di scoperta falsa (Tabella supplementare S3). 55

Quando sono state aggiunte le variabili del mese, l'analisi della regressione multipla ha determinato il modello migliore

Image

La variabile fittizia per mese (JUL_JUN), il numero di alleli 163Q (R163Q) e la presenza di varianti rare (RARE) sono rimasti con coefficienti significativi ( P = 3, 14E – 10, 0, 016 e 0, 026, rispettivamente; Tabella 2). L' R 2 aggiustato era 0, 072, indicando che il modello migliore spiegava il 7, 2% della variabilità totale in ZL *. I termini di interazione tra ciascuna variabile (JUN_JUL × R163Q, JUN_JUL × RARE e R163Q × RARE) non erano significativi se aggiunti al modello migliore ( P = 0, 804, 0, 832 e 0, 418, rispettivamente). Sebbene V92M fosse escluso dal modello migliore, il coefficiente di regressione era 0, 056 ( P = 0, 196) quando aggiunto nel modello.

Tabella a grandezza naturale

Il modello sopra è stato sviluppato in base al presupposto del modello additivo (co-dominante) per la variante R163Q. Successivamente abbiamo esaminato i modelli dominanti e recessivi. Per il modello dominante, l'analisi di regressione graduale ha determinato il modello migliore con solo JUN_JUL come variabili descrittive significative. Per il modello recessivo, era il modello migliore determinato dall'analisi della regressione multipla graduale

Image

con l' R 2 regolato di 0, 073, indicando un adattamento buono come il modello additivo (Tabella 2).

Sulla base degli aplotipi stimati, abbiamo diviso le varianti rare in due gruppi, 163R + raro e 163Q + raro, a seconda dell'allele di R163Q situato sullo stesso aplotipo delle varianti rare non sinonime. Solo un aplotipo, quello con 120T, era contenuto in 163R + raro; al contrario, sette diversi aplotipi erano contenuti in 163Q + rare. Quando abbiamo condotto un'analisi di regressione multipla graduale con 163R + raro e 163Q + raro anziché RARA, nessuno dei due è rimasto nel modello migliore ( P = 0, 141 per 163R + raro e P = 0, 067 per 163Q + raro). Il confronto a coppie di U- test di Mann – Whitney ha mostrato una differenza significativa solo tra 'nessuna variante rara' e '163Q + raro' al genotipo 163R / Q (Figura 3).

Nell'analisi di regressione multipla con r , il numero totale degli alleli 92M e 163Q, abbiamo ottenuto il seguente modello migliore

Image

dove 650NM era una riflettanza percentuale a una lunghezza d'onda di 650 nm, SEX era codificato come 0 per le femmine e 1 per i maschi (valori P per il test t su ogni variabile nel modello: 7.28E – 09, 1.29E – 07, 3.76E –03 e 3.74E – 02, rispettivamente). L'analisi di regressione lineare con r come unica variabile indipendente ha mostrato il coefficiente di regressione di 0, 65 ( P = 1, 18 E – 02, IC al 95% = 0, 15–1, 15).

Nessuna delle covariate ha mostrato una correlazione significativa con la lentiggine. Il test χ 2 ha indicato che le lentiggini si sono verificate indipendentemente dal SESSO ( χ 2 = 1.45, df = 1, P = 0.228) e dall'indice Ryukyu (solo 0 e 4, χ 2 = 3.41, df = 1, P = 0.065). Il test t ha mostrato la stessa media di età e BMI nei due gruppi di lentiggini, "presente" e "assente". Gli OR per lentiggine per gli alleli minori relativi agli alleli di consenso del campione sono mostrati nella Tabella 3. Solo V92M ha mostrato un cambiamento significativo nelle probabilità di lentiggine; gli individui con l'allele 92M avevano un OR di 3, 11 rispetto agli individui che sono omozigoti 92V (IC 95% = 1, 18–8, 17). Allo stesso modo, solo V92M ha mostrato un coefficiente significativo ( P = 0, 030) nel modello di regressione logistica

Tabella a grandezza naturale

Image

con né R163Q e 942A> G, né RARE che contribuiscono in modo significativo quando vengono aggiunti. L'OR per la lentiggine dell'allele 92M è stato ottenuto come valore esponenziale del coefficiente di regressione (1, 00), che era 2, 72 (IC al 95% = 1, 10–6, 71). Nel modello di regressione logistica con r come variabile descrittiva, il coefficiente di regressione per r era 0, 95 ( P = 0, 100), che è equivalente a OR di 2, 58 (IC al 95% = 0, 83–7, 96) e non significativo.

Discussione

Si dice che Ryukyuan abbia la pelle scura rispetto al giapponese dell'isola principale. In uno studio antropologico sulle persone di Okinawa, Suda 58 ha concluso che le persone dell'isola di Okinawa avevano una pelle più scura sulla fronte rispetto alle persone di Kagoshima (Figura 1) quando valutate con la tavolozza dei colori di Broca. D'altra parte, Torii 59 non ha trovato alcuna differenza nel colore della pelle nella parte superiore del braccio, come definito dalla tavolozza dei colori di Broca tra 77 studentesse di Okinawa e 30 delle isole principali del Giappone, tutte residenti nell'isola di Okinawa. La ragione per cui affermava la somiglianza del colore della pelle era che la loro pelle era protetta dalla luce solare, coperta da abiti con le maniche, che all'epoca era un privilegio per le persone di classe media e alta. Allo stesso modo, il nostro studio non ha trovato una differenza statisticamente significativa nella leggerezza della pelle nella parte superiore del braccio interna tra le persone di origine Ryukyuan e le persone di origine giapponese dell'Isola Principale per coloro che vivono nello stesso ambiente, l'isola di Okinawa. Nel loro insieme, questi studi indicano che l'apparente differenza nel tono della pelle tra Okinawa e il giapponese dell'isola principale potrebbe non essere di origine congenita, ma più probabilmente a causa della differenza nei livelli di radiazione UV tra Okinawa e le isole principali del Giappone. Questa conclusione è corroborata dai dati dell'agenzia meteorologica giapponese secondo cui Naha nell'isola di Okinawa è esposta a livelli di radiazione UV più elevati durante tutto l'anno rispetto a Kagoshima nell'isola di Kyushu, una delle isole principali; la media della dose giornaliera cumulativa di eritema standard (DCSED) tra il 1994 e il 2008 era di 2, 84 kJ m −2 in Naha e la DCSED media dal 1997 al 2004 era di 2, 41 kJ m −2 in Kagoshima.

Un dimorfismo sessuale nella riflettanza della pelle è stato chiaramente osservato nei nostri dati; la media per le femmine era superiore a quella per i maschi. Questo modello era coerente con il modello ampiamente riportato in studi precedenti. 4, 17, 60 Il fatto che le femmine mostrino una varianza inferiore in L * rispetto ai maschi indicherebbe anche l'uso della protezione solare o l'evitamento dell'esposizione ai raggi UV tra le femmine. Questa scoperta potrebbe riflettere la tendenza delle donne giapponesi che vivono ad Okinawa a desiderare un leggero tono della pelle, come documentato in altre città dell'Asia orientale. 61 We found no significant association between skin reflectance and age, which may be explained by the majority of the participants being in early adulthood.

As a result of the regression analysis with the month variables, we found that JUN and JUL were associated with a lighter skin tone. This could be explained by a time lag between the UV exposure and tanning response, and between tanning and depigmentation. According to the data of the Japan Meteorological Agency, a monthly average of DCSED in Naha is the highest in July (Supplementary Figure S1). It is possible melanin accumulates in the skin of inner upper arms towards the end of high UV months and the skin remains pigmented until it slowly loses a tan.

Association analysis between MC1R variants and skin reflectance showed that the 163Q allele had the effect of increasing the lightness of skin at the inner upper arm in an additive or recessive mode. Duffy et al. 42 suggested an additive mode for the effect of r on skin reflectance of Europeans at wavelength 650 nm, and the regression coefficient for r (0.9 with 95% CI=0.2–1.6) was similar to that found in the present study (0.7 with 95% CI=0.20–1.20). In the multiple regression model with only MC1R variants, R163Q and RARE, the adjusted R 2 was 0.012, indicating that the model explained 1.2% of the total variability in L* of inner upper arm for L* values that were standardized by sex. This finding is consistent with our expectation that each variant contributes a small amount to a quantitative trait such as skin pigmentation. Examination of the contribution of genes other than MC1R to skin pigmentation in Asian populations is awaited.

We also found a significant association between V92M and freckling in a logistic regression (OR=2.72, 95% CI=1.10–6.71); this finding was consistent with findings from a study by Motokawa et al. 39 (OR=3.08, 95% CI=1.35−6.56). However, the association between freckling and R163Q was not significant in our study (OR=1.12, 95% CI=0.54–2.4); this finding was not consistent with their results (OR=2.08, 95% CI=1.01–4.12). In addition, when V92M and R163Q were combined as r , our logistic regression analysis did not show a significant effect of r on freckling although Motokawa et al. 39 and Duffy et al. 42 found it significant. Further examination is required to conclusively determine the effect of R163Q on freckling.

The haplotype network we constructed had a star-like composition of haplotypes surrounding the R163Q variant. 62 The negative value (−1.66) obtained for Tajima's D , showing an excess of observed rare variants relative to the expectation, indicated a possibility of recent demographic expansion or positive selection. Voight et al. 63 obtained an average Tajima's D of 0.18 for Han Chinese ( n =15) based on the resequencing data of 50 unlinked autosomal noncoding regions. Their result suggests that demographic history in East Asia has shifted the D from 0 toward the positive direction, which is the opposite direction of our D ; therefore, the value we obtained for MC1R cannot be explained by demography. In addition, the star-like composition was observed only at R163Q; therefore, this pattern may support that the frequency of 163Q alleles has increased recently. Thus, our result indicated the involvement of selection on the 163Q allele; this conclusion is consistent with a finding from a study by Coop et al. , 38 which showed a selective sweep on the same allele. The present study showed an association between the 163Q allele and light skin tone in East Asia; this association indicated positive selection on light-toned skin among East Asians.

Although our findings indicated that positive selection on MC1R had occurred, it is difficult to identify the force of selection. When considering sexual selection on the light-toned skin, whether the change in skin reflectance is discernible or not is important. The amount of change in L* predicted by our multiple regression model is 0.82 (2 × ZL* × 2.47) for females and 1.08 (2 × ZL* × 3.30) for males, comparing 163Q homozygotes (163Q/Q) to 163R homozygotes (163R/R). A similar amount of change is predicted for the nonsynonymous rare variants (0.97 for females and 1.30 for males). These differences are distinguishable by the eye if the two shades are placed close to each other, according to the definition adopted by CIELAB, the color space we used. 64 Psychological studies on perception of skin color would help in understanding the relationship between the statistically significant change in L* of skin and discernible change in lightness.

Population structures in the Japanese archipelago have been observed, especially between Ryukyuan and Main Island Japanese. 65 As we found no significant difference in neither skin reflectance nor freckling between Ryukyuans (Ryukyu Index=4) and Main Island Japanese (Ryukyu Index=0), genetic factors that strongly affect pigmentation are unlikely to be highly differentiated between these subpopulations. To further investigate the effects of population stratification on our association study, we examined other SNPs (rs3827760, rs853975, rs350886, rs1048610), which are differentiated among populations across the world in a similar manner to MC1R R163Q (Supplementary Figures S2–S6), and found no association of these SNPs with pigmentary traits (Supplementary Table S4). Therefore, population stratification, if any, had only a small effect on our association study.

Our results suggested that two major nonsynonymous variants, V92M (rs2228479) and R163Q (rs885479), had different influence on skin phenotype; V92M was associated with freckling, whereas R163Q was associated with the lightness of skin. These two variants are located in different domains of the protein MC1R; V92M is in the second of seven transmembrane domains, whereas R163Q is in a cytoplasmic loop. SIFT, a software to predict the effect of amino acid substitutions on protein function based on the conservativeness of amino acid in the closely related sequences, predicted that V92M and R163Q would not damage the function of MC1R with scores of 0.68 and 0.21, respectively. 66 According to PolyPhen-2, another tool that predicts impact of amino acid substitutions on the structure of proteins and the subsequent functional change, both of the 163Q and 92M mutations were predicted to be benign with scores of 0.015 and 0.004, respectively, whereas the rare variants were predicted to be 'possibly damaging' or 'probably damaging' (scores ranged from 0.656 to 0.999), except for V140M (score=0.390; Supplementary Table S5). 67 This is consistent with the finding that the effect of RARE on skin reflectance was twice as much as R163Q in our multiple regression analyses. However, an in vitro study showed that the 92M allele caused impaired MC1R function; in contrast, the 163Q allele had almost the same response to α-melanocyte simulation hormone as the human consensus allele. 32 These results may explain the difference in the effect of the V92M and R163Q alleles on skin pigmentation.

As discussed above, the 163Q allele does not cause any change in the MC1R ligand-binding amino acid sequence; hence, the allele may retain a normal ability to promote eumelanin (dark pigment) synthesis through activation of adenylate cyclase and the subsequent accumulation of cyclic adenosine monophosphate in a melanocyte cell. An in vitro study on the function of MC1R variants also indicates that 163Q functions normally when compared with the consensus. 32 Motokawa et al. 68 investigated polymorphisms in the promoter region of MC1R linked to R163Q among 247 Japanese. They found that the promoter haplotypes with a combination of −490T, −445A and −226T, 98.5% of which bore the 163Q allele in the coding region, showed lower OR for initiating freckles and solar lentigines than did the human consensus haplotype (−490C, −445G, −226A). They suggested that the −490C>T variant might be responsible for the decreased promoter activity, based on the finding by Moro et al. 69 that a deletion from −517 to −447 damages the promoter activity. Therefore, impaired function in the promoter region, caused by the variant(s) in linkage disequilibrium with R163Q, may explain the association between the 163Q allele and the lightness of skin, which we found in this study. Further functional studies are needed to reveal the mechanism.

In summary, we found that the 163Q allele contributed to the lightness of skin in Japanese people. The effect of 92M in increasing the odds of freckling was also confirmed. These results explain a part of the difference in constitutive skin pigmentation between Asian and non-Asian populations, as well as the north-to-south gradient in pigmentation across Asia. Association studies on admixed populations or comparative studies in allele frequencies among different populations are required to further elucidate the evolution of skin pigmentation among the people of Asia.

Informazione supplementare

Documenti Word

  1. 1.

    Informazione supplementare

    Informazioni supplementari accompagna il documento sul sito Web Journal of Human Genetics (//www.nature.com/jhg)