Atorvastatina inibisce la proliferazione e l'apoptosi, ma induce senescenza nei miofibroblasti epatici e quindi attenua la fibrosi epatica nei ratti | indagine di laboratorio

Atorvastatina inibisce la proliferazione e l'apoptosi, ma induce senescenza nei miofibroblasti epatici e quindi attenua la fibrosi epatica nei ratti | indagine di laboratorio

Anonim

Soggetti

  • Fibrosi epatica
  • Meccanismo di azione
  • senescenza

Astratto

I miofibroblasti epatici (MFB) mostrano un aumento della proliferazione, migrazione e produzione di collagene, che sono cruciali per la fibrogenesi epatica. Il trattamento con atorvastatina inibisce la proliferazione, l'apoptosi e la produzione di citochine di MFB nei ratti legati da dotto biliare (BDL) in vivo . Qui, abbiamo ulteriormente studiato i meccanismi sottostanti. Le cellule stellate epatiche di ratto primario (HSC) sono state isolate e attivate per coltura in MFB epatico. Dopo 3 giorni di incubazione con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M), i livelli di trascrizione delle citochine profibrotiche (trasformazione del fattore di crescita-β1, fattore di crescita del tessuto connettivo e TIMP1) e procollagen Ia sono stati analizzati mediante PCR in tempo reale . La proliferazione è stata studiata mediante saggi 5'-bromo-2'-deossiuridina. L'espressione della proteina dell'actina del muscolo α-Smooth è stata esaminata mediante western blot. Per misurare l'apoptosi sono state utilizzate analisi di selezione cellulare attivate dalla fluorescenza di annessina V e ioduro di propidio. Inoltre, la colorazione occidentale p21 e la colorazione β-galattosidasi sono state studiate in MFB come marcatori di senescenza. Successivamente, l'espressione epatica dei marcatori di desmina e senescenza è stata analizzata nei fegati di ratti trattati con atorvastatina (15 mg / kg * d) per 1 settimana a partire da 3 e 5 settimane dopo BDL. L'atorvastatina ha inibito l'attivazione dell'HSC nell'MFB e ha ridotto la produzione di citochine e collagene nell'MFB in vitro . Inoltre, atorvastatina ha ridotto la proliferazione, la citochina e la produzione di collagene di MFB. L'atorvastatina ha iniziato l'apoptosi a 10 −4 M e l'ha attenuata a 10 −5 M. L'atorvastatina ha indotto l'espressione della proteina p21 e la colorazione β-galattosidasi dell'MFB in vitro e in vivo . L'atorvastatina provoca effetti simili sull'MFB precedentemente osservati in vivo : riduce il turnover e la fibrogenesi dell'MFB. Suggeriamo che un ulteriore meccanismo che spiega questi effetti è la senescenza delle cellule.

Principale

Durante la fibrosi epatica, le cellule stellate epatiche desmin-positive (HSC) e altre cellule miofibroblastiche (MFB) vengono attivate e mostrano attività profibrotica. 1, 2, 3 Questi MFB profibrotici producono elevate quantità di proteine ​​della matrice extracellulare (ad es. Collagene) e citochine profibrotiche (trasformando il fattore di crescita-β, TGF-β; fattore di crescita del tessuto connettivo, CTGF; fattore di crescita derivato dalle piastrine, PDGF), sostenere la progressione della fibrosi in modo autocrino e paracrino. 4, 5 MFB esprimono actina muscolare liscia α (α-SMA), che viene utilizzata come marker della loro attivazione. 2, 6, 7

Le statine hanno mostrato effetti benefici sulla fibrosi epatica e ipertensione portale nella cirrosi, molto probabilmente perché l'inibizione dell'HMG-CoA-reduttasi impedisce piccole GTPasi (RhoA e Ras). 8, 9, 10, 11, 12, 13 L'effetto di abbassamento della pressione portale è stato attribuito all'inibizione della traslocazione di RhoA sulla membrana dell'HSC miofibroblastica e quindi all'interruzione della segnalazione di RhoA / Rho-chinasi, con conseguente riduzione della contrazione di queste cellule e ridotta resistenza intraepatica. 9 In un modello di fibrosi biliare progressiva utilizzando la legatura del dotto biliare (BDL) nei ratti, 14 trattamenti profilattici e di atorvastatina precoce hanno attenuato l'attivazione dell'MFB e la successiva deposizione di collagene. 8 Nella fibrosi biliare completamente consolidata, il trattamento con atorvastatina ha ridotto il turnover dell'MF riducendo l'apoptosi e la proliferazione dell'MFB. 8 Questi effetti, senza una riduzione simultanea del numero di cellule, possono essere spiegati dall'arresto della crescita e dalla ridotta attività fibrotica. Tali fenomeni sono stati precedentemente osservati nell'HSC miofibroblastico senescente. 15, 16, 17 Le statine possono indurre senescenza, come mostrato per le cellule tumorali della prostata. 18 Dopo lo stress cellulare molte cellule mostrano una maggiore espressione della β-galattosidasi principalmente nei lisosomi, riflettendo la senescenza. 19, 20, 21 Ulteriori marcatori di senescenza sono la maggiore espressione di p21, 22, 23 e l'attivazione della via Wnt. 24 WNT1-inducible-signaling pathway protein 2 (WISP-2) (CCN5), un componente del pathway Wnt, media l'arresto della crescita e attenua gli effetti indotti dal TGF-β. 25, 26

Il presente studio affronta gli effetti cellulari dell'atorvastatina sull'MFB epatico in vitro e in vivo con particolare enfasi su proliferazione, apoptosi e senescenza.

MATERIALI E METODI

Isolamento e cultura del ratto primario HSC

Le HSC sono state isolate come precedentemente descritto. 9 In breve, dopo perfusione sequenziale in situ del fegato con collagenasi di tipo IV (Sigma, St. Louis, USA) e pronasi E (Merck, Darmstadt, Germania), le cellule disperse sono state frazionate mediante centrifugazione con gradiente di densità usando Optiprep (Nycomed, Svezia ). Le cellule sono state raccolte a densità <1, 053 (9% Optiprep). La vitalità e la purezza erano sistematicamente superiori al 95%, come determinato dall'esclusione del tripan-blu e dalla caratterizzazione morfologica (autofluorescenza della vitamina A). Le cellule sono state seminate su piatti di coltura di plastica non rivestiti e coltivate in terreno DMEM integrato con siero di vitello fetale al 10%, insulina 0, 6 UI / ml, glutammina 2 mM e soluzione antibiotica-antimicotica all'1% (Invitrogen, Karlsruhe, Germania). Il contatto con la plastica comporta l'attivazione e la successiva transdifferenziazione di HSC. 27 Il supporto è stato rinnovato ogni 48-72 ore.

Incubazione di ratto primario HSC con atorvastatina

L'atorvastatina è stata aggiunta al terreno di coltura dell'HSC a diverse concentrazioni (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) a partire dal giorno 1 o dal giorno 3 dopo l'isolamento. Il terreno ricevente HSC attivato per coltura senza atorvastatina è servito da controllo. Le caratteristiche citologiche (goccioline lipidiche, forma cellulare e diffusione) sono state valutate mediante microscopia ottica. Le cellule sono state utilizzate per esperimenti 7 giorni dopo l'isolamento. Dopo il primo passaggio, le HSC miofibroblastiche sono state completamente attivate. Per questi esperimenti, l'atorvastatina è stata aggiunta al terreno di coltura di queste cellule a diverse concentrazioni (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) per 3 giorni, oppure le cellule sono rimaste non trattate. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando almeno tre isolamenti indipendenti.

Saggio di proliferazione 5'-Bromo-2'-desossiuridina (BrdU) di HSC

L'effetto dell'atorvastatina sui tassi di proliferazione degli HSCs di ratto è stato determinato tramite un kit colorimetrico ELISA BrdU (Roche Diagnostic GmbH, Penzberg, Germania). In breve, le cellule sono state placcate ad una densità di 6 × 10 5 cellule / ml in piastre a 96 pozzetti con fondo piatto. Durante le ultime 24 ore dell'esperimento, le cellule sono state etichettate con 10 μM di BrdU e la loro incorporazione è stata misurata secondo le linee guida dei produttori (Roche Diagnostic GmbH).

Rilevazione dell'apoptosi mediante analisi della selezione delle cellule (FACS) attivata dalla fluorescenza in allegato

L'analisi dell'HSC miofibroblastica epatica di ratto apoptotico (MFB) è stata eseguita utilizzando un kit di rilevazione dell'apoptosi dell'allegato V disponibile in commercio (BD Biosciences, Heidelberg, Germania). In breve, 10 5 ratti MFB sono stati lavati due volte con tampone V allegato. Le cellule sono state risospese in 100 microlitri di tampone di legame con l'annessina V e incubate con 5 μl di allegato di V coniugato con FITC e 5 μl di soluzione di colorazione con ioduro di propidio (PI) per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo aver aggiunto 400 μl di tampone legante V in allegato, la sospensione cellulare è stata analizzata mediante citometria a flusso entro 30 minuti. Le cellule apoptotiche sono state definite come PI-negative e annessina V-positiva.

Rilevazione di apoptosi / necrosi mediante identificazione di cellule subG1 mediante analisi del ciclo

10 5 MFB sono stati lavati con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) e risospesi delicatamente in 500 μl di tampone di lisi ipotonica PI (0, 1% (p / v) citrato di sodio, 0, 1% (p / v) Triton X-100, 100 μg / ml RNAse e 50 μg / ml PI in H 2 O deionizzato). Dopo un tempo di incubazione di almeno 20 minuti, i nuclei liberi sono stati analizzati in modo citometrico a flusso entro 2 ore dal trattamento ipotonico. L'analisi citometrica del flusso è stata eseguita utilizzando lo strumento del ciclo cellulare del software FlowJo (Tristar, Ashland, USA) che include l'identificazione automatica delle fasi del ciclo cellulare. 28

Western Blotting

Le cellule surgelate e i campioni di fegato sono stati omogeneizzati in un tampone contenente 25 mM di Tris / HCl, acido tetraacetico etilendiammina 5 mM, fenilmetansolfonil fluoruro 10 μM, 1 mM benzamidina e 10 μg / ml di leupeptina. I campioni sono stati diluiti con tampone come precedentemente descritto. 9 La concentrazione proteica degli omogenati è stata determinata utilizzando il kit del test DC (Biorad, Monaco, Germania). I campioni (20 μg di proteine ​​per corsia) sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (gel al 10%) e le proteine ​​sono state cancellate su membrane di nitrocellulosa. La colorazione di Ponceau-S è stata eseguita per assicurare un uguale carico di proteine ​​e GAPDH è servito da controllo endogeno. Le membrane sono state bloccate, incubate con anticorpi primari per α-SMA (Abcam plc, Cambridge, UK), GAPDH, p21 (sc-25778, sc-397, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) o desmin (GeneTex, Irvine, CA, USA), rispettivamente. Successivamente, le membrane sono state incubate con corrispondente anticorpo accoppiato alla perossidasi secondaria (Calbiochem, San Diego, USA). Le macchie sono state sviluppate con una migliore chemiluminescenza (Amersham, Regno Unito). Le intensità delle bande rilevate digitalmente sono state valutate densitometricamente usando Chemi-Smart (PeqLab Biotechnologies, Erlangen, Germania).

PCR quantitativa in tempo reale (RT-PCR)

L'isolamento dell'RNA, la trascrizione inversa con 0, 5 μg di RNA totale e il rilevamento mediante RT-PCR sono stati eseguiti come descritto in precedenza. 9 Primer e sonde per RT-PCR sono stati ottenuti come miscela pronta all'uso (TGF-β-1, TIMP1, CTGF, procollagen Ia e recettore PDGF-β (PDGFβ-R)) da Applied Biosystems (Foster City, USA ). 18 S rRNA ha funzionato come controllo endogeno (primer e sonde mix pronto all'uso di Applied Biosystems). RT-PCR (rivelatore di sequenza ABI 7300) e reazione PCR (2 × TaqMan-PCR-mastermix, Applied Biosystems) sono stati eseguiti come precedentemente descritto. 9 Per ciascuno dei geni, è stato eseguito un esperimento di validazione. Le efficienze di RT-PCR per il gene bersaglio e il controllo endogeno erano approssimativamente uguali. −Δ C T esprime la differenza tra il numero di cicli ( C T ) dei geni bersaglio e il controllo endogeno. Per una migliore comprensione, abbiamo normalizzato tutti i valori −Δ C T con quelli dei controlli. I risultati dei campioni di fegato sono stati espressi come 2 ΔΔCt, ed esprimono il triplo aumento dell'espressione genica rispetto al gruppo di controllo. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando almeno tre isolamenti indipendenti.

β -galattosidasi colorazione delle cellule

Gli MFB sono stati fissati in formaldeide al 2% e glutaraldeide allo 0, 2%. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate durante la notte a 37 ° C con 0, 1% (p / v) X-Gal (Peqlab) in 5 mM di esacianoferrato di potassio (III), 5 mM di esacianidoferrato di potassio (II), 2 mM di cloruro di magnesio, 0, 01% (p / v) desossicolato di sodio e 0, 02% (v / v) Nonidet P-40 in PBS. La visualizzazione è stata eseguita utilizzando un microscopio Nikon Eclipse TS100 dotato del software NIS-Elements D3.2 (Nikon, Düsseldorf, Germania).

Animali

Abbiamo usato ratti maschi Sprague-Dawley con un peso corporeo iniziale compreso tra 180 e 200 g. Sedici ratti sono stati sottoposti a BDL come precedentemente descritto. 9 Otto animali sono stati uccisi 4 settimane dopo BDL (4 W) e otto animali sono stati uccisi 6 settimane dopo BDL (6 W). A 3 e 5 settimane dopo BDL, la metà dei ratti da 4 W BDL e 6 W BDL, rispettivamente, ha ricevuto per via orale 15 mg di atorvastatina per kg di peso corporeo al giorno per 1 settimana prima di uccidere, come precedentemente descritto. 8, 9 fegati dissecati sono stati tagliati in frammenti e congelati a scatto in azoto liquido (conservato a -80 ° C) o immagazzinati in formaldeide come precedentemente descritto. 9 Lo studio è stato approvato dal comitato locale per gli studi sugli animali (Bezirksregierung Köln, 50.203.2-BN22, 46 / 05).

Doppia colorazione per β -Galattosidasi, α -SMA e Desmin

Le criosezioni da tessuto epatico (20 e 7 μm) sono state fissate in formaldeide al 2% e glutaraldeide allo 0, 2%. Dopo il lavaggio con PBS, le sezioni sono state incubate durante la notte a 37 ° C con soluzione di x-Gal (Peqlab). Per la colorazione immunoistochimica di α-SMA, vetrini da 20 μm con sezioni sono stati incubati con un anticorpo topo anti-SMA (clone 1A4; Sigma-Aldrich) diluito 1: 600 in soluzione salina tamponata con Tris per 60 min. È stato applicato un anticorpo secondario di coniglio anti-topo biotinilato assorbito con siero di ratto (Dako, Glostrup, Danimarca) (1: 200, 45 min) e complessato con fosfatasi alcalina coniugata con strepdavidina (1: 200, 45 min; Dako). La colorazione è stata sviluppata in una soluzione AS-BI di fucsina-naftolo fresca (Sigma-Aldrich). Per l'analisi morfometrica di campioni colorati almeno 10 mm 2 di tessuto epatico sono stati analizzati mediante analisi computazionale (Histoquant, 3DHistech, Budapest, Ungheria) come descritto. 29, 30 Sono stati esclusi i grandi dotti biliari e le navi.

Sono stati analizzati sette crioscopi micometrici mediante microscopia confocale utilizzando un microscopio confocale LSM710 (Zeiss, Jena, Germania). Al fine di combinare la colorazione X-Gal con immunoistochimica anti-α-SMA o anti-desmin e DAPI, le diapositive sono state ulteriormente incubate con anticorpo anti-SMA (1: 100; A2547, Sigma-Aldrich) o anticorpo anti-desmin (1: 100; GTX 28592, GeneTex) e con il rispettivo anticorpo secondario marcato cy5 o anticorpo Dylight 649 (Dianova, Amburgo, Germania). Le sezioni sono state contrastate con DAPI (Sigma-Aldrich) dopo la colorazione X-Gal. I campioni sono stati monitorati mediante microscopia a fluorescenza e valutati utilizzando AxioVision 4.8 (Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland).

Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± sem Il test t di Student è stato utilizzato per il confronto, ove appropriato; U- test di Mann – Whitney è stato usato per il confronto tra i gruppi. Valori P <0, 05 sono stati considerati statisticamente significativi.

RISULTATI

L'atorvastatina inibisce l'attivazione e la proliferazione del ratto primario HSC in vitro

Recentemente, abbiamo dimostrato che il trattamento con atorvastatina attenua la fibrosi epatica nei ratti BDL. 8 Per analizzare l'effetto dell'atorvastatina sull'attivazione dell'HSC, l'HSC di ratto quiescente primario è stato trattato con atorvastatina dal primo (d1) o dal terzo giorno (d3) dopo l'isolamento, oppure sono rimasti non trattati. Le analisi sono state eseguite al giorno 7 dopo l'isolamento (Figura 1a). La proliferazione di questi HSC in vitro , valutata dal dosaggio BrdU, è stata significativamente ridotta in modo dose-dipendente da dosi più elevate di atorvastatina (10 −4 e 10 −5 M), indipendentemente dal punto di incubazione (d1, d3 ), mentre la dose più bassa (10 −6 M) non ha rivelato variazioni dell'assorbimento di BrdU rispetto ai controlli (Figura 1b). Allo stesso modo, i livelli di mRNA di PDGFβ-R, usati come marker per l'attivazione di HSC, erano significativamente più bassi in HSC d1 e d3 dopo l'incubazione con le dosi più elevate di atorvastatina (10 −4 e 10 −5 M). Ancora una volta, l'atorvastatina a 10 −6 M non ha influenzato il livello di mRNA di PDGFβ-R allo stato stazionario (Figura 1c). L'atorvastatina alla massima concentrazione (10 −4 M) ha ridotto l'espressione della proteina α-SMA (Figura 1d). Allo stesso modo, l'atorvastatina a 10 −5 M ha notevolmente ridotto l'espressione della proteina α-SMA di HSC come marker di attivazione, mentre 10 −6 M non ha sostanzialmente alcun effetto sull'attivazione di HSC (Figura 1d). In sintesi, questi risultati dimostrano che l'atorvastatina attenua l'attivazione dell'HSC quiescente e inibisce la proliferazione dell'HSC miofibroblastica.

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Proliferazione e attivazione di HSC 7 giorni dopo l'isolamento. Progetto sperimentale con ratto primario HSC ( a ). L'incubazione di HSC quiescente con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) è iniziata il giorno 1 (d1) o il giorno 3 (d3) dopo l'isolamento. Il controllo HSC non è stato trattato. Gli esperimenti di HSC sono stati condotti 7 giorni dopo il loro isolamento da fegati di ratto sani. La proliferazione cellulare è stata valutata mediante incorporazione di BrdU usando ELISA ( b ). L'espressione relativa di mRNA di PDGFβ-R ( c ) come marcatore di proliferazione è stata determinata nei lisati HSC mediante RT-PCR quantitativa, corretta a 18 S rRNA come gene di pulizia e confrontata con i controlli HSC (espressa come 2 ΔΔΔCt ). La dose di atorvastatina ha inibito in modo dipendente la proliferazione di HSC. L'espressione proteica dell'α-SMA nell'HSC trattato con atorvastatina e di controllo è stata misurata mediante western blotting ( d ). La dose di atorvastatina ha inibito in modo dipendente l'attivazione dell'HSC di ratto primario. Gli esperimenti sono stati condotti usando tre isolamenti indipendenti.

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L'incubazione dell'atorvastatina ha ridotto la trascrizione delle citochine profibrotiche e del collagene nell'HSC quiescente

In esperimenti successivi, abbiamo valutato il ruolo dell'atorvastatina sull'attività profibrotica dell'HSC, come riflesso dai livelli di mRNA di citochine profibrotiche e collagene. L'incubazione di HSC primario con atorvastatina a concentrazioni più elevate (10 −4 e 10 −5 M) ha determinato una riduzione significativa dei livelli di mRNA delle citochine profibrotiche TGF-β-1 e CTGF rispetto all'HSC non trattato, mentre nessun effetto è stato misurato al livello più basso dose di atorvastatina (Figura 2a eb). Al contrario, l'espressione dell'inibitore della metalloproteasi della matrice TIMP1 è stata bloccata a tutte le concentrazioni di atorvastatina e punti temporali, suggerendo un effetto diretto, indipendente dalla dose e dal tempo (Figura 2c). In accordo con l'effetto antifibrotico dell'atorvastatina, i livelli di mRNA di procollagen Ia erano significativamente diminuiti in entrambi i punti temporali e a tutte le concentrazioni (Figura 2d). La più alta concentrazione di atorvastatina ha ridotto i livelli di espressione del procollagen Ia quasi a zero (Figura 2d). Pertanto, l'atorvastatina apparentemente ha impedito l'attivazione dell'HSC di ratto primario, e quindi la loro proliferazione e attività profibrotica.

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Espressione di citochine profibrotiche e collagene di HSC quiescente. Le HSC sono state incubate con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) a partire dal giorno 1 (d1) o dal giorno 3 (d3) dopo l'isolamento. I risultati sono stati confrontati con i controlli HSC completamente attivati ​​7 giorni dopo l'isolamento. Espressione relativa di mRNA di TGF-β-1 ( a ), CTGF ( b ), TIMP1 ( c ) e procollagen di tipo Ia ( d ) sono stati determinati in lisati HSC mediante RT-PCR quantitativa e corretti a 18 S rRNA come gene di pulizia e confrontati con controlli HSC (espressi come 2 −ΔΔCt ). Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando tre isolamenti indipendenti.

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Incubazione dell'atorvastatina: riduzione della proliferazione dell'MFB

In uno studio precedente, abbiamo potuto dimostrare che il trattamento con atorvastatina dei ratti BDL nella fibrosi epatica accertata ha ridotto la proliferazione dell'MFB. 8 Tuttavia, l'effetto dell'atorvastatina sull'MFB già attivato è rimasto poco chiaro. Abbiamo quindi utilizzato HSC di ratto primario attivato per coltura dopo il primo passaggio, uno stadio in cui le HSC sono cellule simili a miofibroblasti (MFB). Queste cellule sono state incubate con atorvastatina per 3 giorni o sono rimaste non trattate (Figura 3a). Contrariamente all'HSC quiescente (Figura 1), l'incubazione con atorvastatina di MFB non ha modificato la loro espressione α-SMA (Figura 3b). È interessante notare che la proliferazione di MFB valutata mediante dosaggio BrdU è stata attenuata in modo significativo e in modo dose-dipendente da dosi più elevate di atorvastatina (10 −4 e 10 −5 M), mentre la dose più bassa (10 −6 M) non ha influenzato l'assorbimento di BrdU nell'MFB rispetto ai controlli (Figura 3c). Allo stesso modo, i livelli di mRNA di PDGFβ-R nell'MFB sono stati notevolmente ridotti dopo l'incubazione con atorvastatina a tutte le dosi (Figura 3d). Ancora una volta, l'atorvastatina a 10 −6 M ha avuto meno influenza sull'espressione di PDGFβ-R rispetto alle concentrazioni più elevate di atorvastatina, ma l'effetto era ancora significativo (Figura 3d). Questa serie di esperimenti ha dimostrato che sebbene l'atorvastatina abbia ridotto la proliferazione dell'MFB, non ha modificato l'espressione dell'α-SMA, un marker per la loro attivazione.

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Proliferazione e attivazione dell'MFB. Progettazione sperimentale in MFB ( a ). L'incubazione di MFB con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) è iniziata dopo il primo passaggio per 3 giorni. L'MFB di controllo non è stata trattata. L'espressione proteica di α-SMA ( b ) nell'MFB trattato con atorvastatina e controllo è stata misurata mediante western blot, ma non differiva tra i gruppi. La proliferazione cellulare è stata valutata mediante incorporazione di BrdU usando ELISA ( c ). L'espressione relativa di mRNA di PDGFβ-R ( d ) nei lisati di MFB è stata determinata mediante RT-PCR quantitativa e corretta a 18 S rRNA come gene di pulizia e confrontata con i controlli MFB (espressi come 2 ΔΔCt ). La dose di atorvastatina ha inibito in modo dipendente la proliferazione dell'MFB. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando tre isolamenti indipendenti.

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L'incubazione di atorvastatina ha attenuato i livelli di espressione di citochine profibrotiche e collagene in MFB

Il trattamento con atorvastatina nei ratti BDL nella fibrosi epatica accertata ha ridotto l'espressione delle citochine a livello dei tessuti, ma non il contenuto di collagene epatico. 8 Qui, abbiamo analizzato in dettaglio l'espressione di citochine profibrotiche e collagene di MFB dopo l'incubazione con atorvastatina. Anche i livelli di mRNA di citochine profibrotiche TGF-β-1 e CTGF erano significativamente diminuiti nell'MFB dopo l'incubazione con atorvastatina rispetto all'MFB non trattato (Figura 4a eb). Analogamente, anche la trascrizione di TIMP1 e procollagen Ia è stata significativamente ridotta a tutte le concentrazioni (Figura 4c ed). La più alta concentrazione di atorvastatina ha mostrato l'effetto più pronunciato sulla trascrizione di CTGF e procollagen Ia, mentre la più bassa concentrazione di atorvastatina ha prodotto l'effetto più lieve ma ancora significativo sui livelli di mRNA di TGF-β-1 e TIMP1 (Figura 4). Questi risultati mostrano che l'atorvastatina inibisce l'attività profibrotica dell'MFB riducendo la trascrizione di citochine profibrotiche e collagene.

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Espressione di citochine profibrotiche e collagene di MFB. L'incubazione di MFB con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) è iniziata dopo il primo passaggio per 3 giorni. L'MFB di controllo non è stata trattata. L'espressione relativa di mRNA di TGF-β-1 ( a ), CTGF ( b ), TIMP1 ( c ) e procollagen di tipo Ia ( d ) nei lisati MFB è stata determinata mediante RT-PCR quantitativa e corretta a 18 S rRNA come gene di pulizia e confrontata con controlli MFB (espressi come 2 −ΔΔCt ). La dose di atorvastatina ha inibito in modo dipendente la proliferazione dell'MFB. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando tre isolamenti indipendenti.

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Analisi dell'apoptosi e morte cellulare nell'MFB dopo incubazione di atorvastatina

L'atorvastatina riduce la proliferazione dell'MFB senza modificare l'espressione dell'α-SMA (Figura 3). Per escludere che questi effetti sono semplicemente dovuti all'induzione dell'apoptosi, come dimostrato da altri per l'HSC (ma non per l'MFB), 31 è stata utilizzata un'analisi FACS dell'Allegatoina V per rilevare l'apoptosi nell'MFB dopo l'incubazione con atorvastatina rispetto ai controlli dell'MFB. La più alta concentrazione di atorvastatina (10 - 4 M) ha aumentato il numero di annessina V-positiva, cioè apoptotica, MFB (Figura 5a eb). La concentrazione intermedia applicata (10 −5 M atorvastatina), tuttavia, non ha aumentato il numero di MFB positivi con annessina V e ha mostrato un MFB apoptotico significativamente inferiore rispetto alla dose più alta. C'era una tendenza verso una diminuzione dell'apoptosi dell'MFB, ma questo non era statisticamente significativo (Figura 5a eb). La più bassa concentrazione di atorvastatina non ha indotto alterazioni significative nei livelli di apoptosi rispetto ai controlli MFB, ma significativamente più MFB apoptotica rispetto a 10 −5 M e significativamente meno apoptosi rispetto alla più alta concentrazione di atorvastatina (Figura 5a eb) .

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Apoptosi dell'MFB in vitro . L'incubazione di MFB con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) è iniziata dopo il primo passaggio per 3 giorni. L'MFB di controllo non è stata trattata. L'analisi FACS del legame con l'annessina V è stata utilizzata per rilevare l'apoptosi nell'MFB dopo l'incubazione con atorvastatina e confrontata con i controlli dell'MFB ( a ). Gli esperimenti rappresentativi sono mostrati in b . Le frazioni cellulari subG1 ( c ) sono state rilevate mediante analisi FACS utilizzando il metodo descritto da Watson 28 e confrontate con i controlli MFB. La più alta concentrazione di atorvastatina (10 −4 M) ha indotto l'apoptosi nell'MFB, mentre atorvastatina a 10 −5 M mostra una tendenza a proteggere dall'apoptosi. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando tre isolamenti indipendenti.

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Le cellule necrotiche / apoptotiche (cellule subG1) sono state rilevate in FACS usando il metodo descritto da Watson. 28 Analogamente al test sull'Annexin V, la dose più alta di atorvastatina (10 −4 M) ha indotto una morte cellulare massiccia, mentre atorvastatina a 10 −5 M sembrava agire in modo protettivo (Figura 5c). Ancora una volta, l'atorvastatina a 10 −6 M non ha aumentato la morte cellulare rispetto ai controlli, ma ha mostrato una morte cellulare significativamente maggiore rispetto a una concentrazione di 10 −5 M (Figura 5c).

Riassumendo questi risultati, l'incubazione con atorvastatina di MFB per 3 giorni a una concentrazione di 10 −5 M sembra proteggere dall'apoptosi e dalla morte cellulare. Al contrario, concentrazioni più elevate di atorvastatina hanno determinato livelli significativamente più alti di apoptosi e necrosi dell'MFB rispetto alla concentrazione intermedia.

Senorenza indotta da incubazione di atorvastatina in MFB

I nostri risultati suggeriscono che l'atorvastatina ha ridotto la proliferazione, l'attività profibrotica e l'apoptosi modificata dell'MFB. Il fenotipo MFB analizzato dall'espressione α-SMA è rimasto invariato, ma le cellule sembrano essere più quiescenti. Pertanto, abbiamo analizzato l'espressione del marcatore di senescenza stabilito p21 22, 23 al fine di spiegare questo stato di MFB. La più alta concentrazione di atorvastatina (10 −4 M) non è riuscita a indurre un aumento dell'espressione di p21 nell'MFB rispetto alle cellule di controllo non trattate (Figura 6a). Al contrario, l'incubazione con atorvastatina a 10 −5 e 10 −6 M per 3 giorni ha aumentato notevolmente l'espressione di p21 in MFB (Figura 6a).

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Senescenza dell'MFB in vitro . L'incubazione di MFB con atorvastatina (10 −4, 10 −5 e 10 −6 M) è iniziata dopo il primo passaggio per 3 giorni. L'MFB di controllo non è stata trattata. L'espressione proteica di p21, un marcatore di senescenza, è stata misurata mediante western blot nell'MFB trattato con atorvastatina e confrontata con i controlli ( a ). Sezioni rappresentative di colorazioni β-galattosidasi (blu) di MFB ( b ) hanno rilevato MFB senescente. La quantificazione della colorazione è mostrata in c . L'espressione relativa di mRNA di Wnt1 ( d ) e WISP-2 ( e ) nei lisati di MFB è stata determinata mediante RT-PCR quantitativa e corretta a 18 S rRNA come gene di pulizia e confrontata con i controlli MFB (espressa come 2 ΔΔΔCt ). La senescenza è stata indotta da atorvastatina a 10 −5 M in MFB. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando tre isolamenti indipendenti.

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Per rafforzare questa scoperta, abbiamo usato la colorazione β-galattosidasi come strumento complementare per rilevare la senescenza. 19, 20 Ancora una volta, l'atorvastatina ha aumentato notevolmente la colorazione della β-galattosidasi dell'MFB (10 −4 e 10 −5 M) rispetto alle cellule di controllo (Figura 6b ec). Tuttavia, l'incubazione di MFB con atorvastatina a 10 - 6 M non ha comportato la colorazione della β-galattosidasi (dati non mostrati).

Un ulteriore suggerimento per la presenza di senescenza nelle cellule mesenchimali è l'attivazione della via Wnt. 24 Abbiamo studiato questo come una terza linea di evidenza per una maggiore senescenza dell'MFB durante l'incubazione con atorvastatina. In effetti ad una concentrazione di 10 - 4 M, l'espressione di Wnt1 non era rilevabile, ma i livelli di mRNA di Wnt1 erano fortemente aumentati a concentrazioni di 10 - 5 e 10 - 6 M (Figura 6d). A valle della via di segnalazione Wnt , viene indotta l'espressione di WISP-2 (CCN5), che ha ruoli importanti nell'arresto della crescita e nella repressione delle vie TGFβ, 25, 26 . Ancora una volta, un forte aumento dei livelli di mRNA WISP-2 è stato rilevato nell'MFB dopo incubazione con atorvastatina a 10 - 5 M (Figura 6e). Nel loro insieme, i nostri risultati dimostrano che una concentrazione di atorvastatina 10 - 5 M è in grado di indurre sencescenza in HSC miofibroblastica in vitro (Figura 6).

Analisi di senescenza in fegato di ratti BDL

In precedenza, abbiamo dimostrato che il trattamento con atorvastatina nei ratti per 1 settimana riduce la proliferazione e l'apoptosi dell'MFB epatico α-SMA-positivo senza modificarne il numero. 8 Poiché i nostri esperimenti in vitro indicano senescenza nella MFB attivata, abbiamo studiato la senescenza nei fegati di questi ratti usando i segni sopra descritti, p21 e β-galattosidasi. I ratti BDL sono stati trattati con atorvastatina per 1 settimana dopo 3 o 5 settimane di BDL, oppure non sono stati trattati (Figure 7a e b). Abbiamo precedentemente descritto che il trattamento con atorvastatina ha comportato una riduzione significativa dell'espressione delle citochine, della proliferazione e dell'apoptosi dell'MFB epatico, senza influenzare il loro numero totale o l'accumulo di collagene in entrambi i regimi di trattamento. 8

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espressione di proteina p21 e desmina nel modello di ratto BDL in vivo . Progetto sperimentale in ratti BDL in vivo ( a, b ). I ratti hanno ricevuto l'induzione della fibrosi mediante legatura del dotto biliare e sono stati tenuti per 4 settimane ( a ) e 6 settimane, rispettivamente, con il trattamento con atorvastatina solo durante l'ultima settimana in entrambi i gruppi (ogni gruppo n = 4). L'espressione proteica epatica di p21 ( c, d ) e desmin ( e, f ) è stata analizzata mediante analisi Western Blot. I pannelli c, d, e ed f mostrano macchie occidentali rappresentative e quantificazioni densitometriche in media ± sem unità densitometriche relative (du) rispetto ai ratti BDL di controllo (100 du). L'atorvastatina ha indotto l'espressione epatica della proteina p21 in ratti BDL da 6 W in vivo ( d ) e ha ridotto l'espressione epatica della proteina desmina in questi ratti ( f ).

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Il trattamento con atorvastatina per 1 settimana, dopo 3 settimane di BDL (Figure 7a), non ha modificato significativamente l'espressione epatica di p21 o desmina in questi ratti (Figure 7c ed e). Al contrario, il trattamento con atorvastatina iniziato dopo 5 settimane di BDL (Figura 7 b) ha comportato un aumento dell'espressione epatica di p21 e una riduzione dei livelli di espressione proteica desminata rispetto ai controlli (Figure 7d e f).

Oltre a questi risultati, i nostri esperimenti hanno anche rivelato che il trattamento con atorvastatina ha aumentato significativamente il numero di cellule β-galattosidasi-positive in entrambi i regimi di trattamento (Figura 8a e b). Le immunocolorazioni hanno mostrato la localizzazione perinucleare dell'espressione della β-galattosidasi - possibilmente nei lisosomi - come descritto per l'espressione della β-galattosidasi associata alla senescenza. 19, 20, 21 Queste cellule esprimono α-SMA o desmina nel loro citoplasma, come mostrato dalla doppia colorazione e dalla microscopia confocale (Figura 8c e d). Questi dati suggeriscono l'induzione della senescenza in HSC attivato e MFB epatico (Figura 8c ed d).

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Localizzazione di cellule senescenti nel fegato di ratti BDL in vivo . L'espressione epatica originale della β-galattosidasi (blu, freccia) è stata trovata nei ratti trattati con atorvastatina quando il trattamento è stato iniziato 3 settimane (4 W) e 5 settimane (6 W) dopo BDL, come mostrato nelle sezioni rappresentative ( a ). La quantificazione delle colorazioni della β-galattosidasi è data in b come mezzo ± sem Il pannello c mostra una sezione confocale rappresentativa della colorazione immunofluorescente per α-SMA (pannello superiore) o desmin (pannello inferiore) in rosso, colorazione nucleare DAPI (blu) e lisosomiale perinucleare β -galattosidasi colorazione (nera) nelle sezioni epatiche di 4 W BDL + atorvastatina. Il pannello d fornisce sezioni confocali rappresentative di colorazioni di immunofluorescenza per α-SMA (pannello superiore) o desmin (pannello inferiore) in rosso, colorazione nucleare DAPI (blu) e perinucleare lisosomiale β-galattosidasi colorazione (nero) in sezioni epatiche di 6 W BDL + atorvastatina. Nelle sezioni confocali sovrapposte (colorazione per DAPI, βGal e desmin / αSMA), la colorazione lisosomiale della β-galattosidasi lisosomiale è localizzata tra nuclei citoplasmatici α-SMA e DAPI-positivi, suggerendo un'induzione di senescenza nelle cellule HSC e MFB attivate in vivo in entrambi i gruppi trattati con atorvastatina.

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DISCUSSIONE

In questo studio, abbiamo studiato gli effetti cellulari dell'atorvastatina sull'HSC quiescente in vitro, nonché sull'MFB attiva in vitro e in vivo . Abbiamo scoperto che l'incubazione con atorvastatina inibisce l'attivazione di HSC primario di ratto quiescente in coltura. Inoltre, l'atorvastatina ha indotto senescenza nell'MFB, sia in vitro che in vivo . L'induzione della senescenza potrebbe almeno in parte spiegare perché la MFB mostra una diminuzione della proliferazione, dell'apoptosi e dell'attività profibrotica dopo il trattamento con atorvastatina.

La MFB epatica ha un ruolo centrale nel promuovere la fibrosi epatica indotta da lesioni, indipendentemente dalla sua origine. 2, 3, 4, 5 La lesione epatica attiva la MFB caratterizzata da aumento delle citochine (TGF-β, PDGF e CTGF) ed espressione di collagene, alterazione della formazione dei recettori (upregulation di PDGFβR) e aumento della proliferazione. 2, 4, 5 È stato anche dimostrato che l'HSC inattivato in vitro modifica la loro morfologia con perdita di goccioline lipidiche e aumento dell'espressione di α-SMA. 32, 33, 34

Nel nostro studio precedente, il trattamento profilattico che iniziava subito dopo la BDL ha comportato un numero inferiore di MFB nel fegato e un minore accumulo di collagene, ma senza una significativa riduzione della produzione o dell'infiammazione di citochine. 8 Se l'atorvastatina è stata somministrata successivamente, ma ancora prima della fibrosi stabilita, la formazione di collagene è stata ridotta. 8 Questi risultati in vivo sono stati ora sostanzialmente sottolineati dai nostri esperimenti di coltura cellulare. In particolare, l'atorvastatina ha inibito in maniera dipendente dalla dose la proliferazione di HSC quiescente (Figura 1) senza induzione dell'apoptosi come precedentemente descritto da altri. 31 Poiché l'espressione di PDGFβR (un marker di proliferazione) e α-SMA (un marker MFB) sono state significativamente ridotte (Figura 1), la spiegazione più probabile è l'inibizione dell'attivazione dell'HSC. 4, 6 A supporto di questa ipotesi, la MFB incubata con atorvastatina ha espresso meno citochine e collagene profibrotici (Figura 2).

Al contrario, l'effetto dell'atorvastatina sull'MFB rimane enigmatico. Nella fibrosi completamente consolidata in vivo , il trattamento con atorvastatina ha ridotto l'espressione delle citochine senza causare una riduzione rilevabile dell'infiammazione o del danno cellulare epatico, come mostrato nei nostri dati precedentemente pubblicati. 8 Inoltre, la proliferazione di MFB è stata ridotta, suggerendo un effetto diretto di atorvastatina su MFB nei fegati fibrotici. 8 Questi effetti sono stati ora analizzati in modo più dettagliato in vitro e abbiamo scoperto che sia la proliferazione che l'espressione dei mediatori profibrotici erano diminuite dall'incubazione di atorvastatina in modo dose-dipendente (Figure 3 e 4). È interessante notare che questo effetto non è stato associato a cambiamenti nell'espressione della proteina α-SMA (Figura 3b), suggerendo che, sebbene l'MFB sia rimasto attivato, la loro attività profibrotica è stata attenuata dall'atorvastatina.

Pertanto, la dose di atorvastatina ha diminuito in modo dipendente la proliferazione di MFB, così come la trascrizione di fattori profibrotici, in questi MFB attivati ​​e completamente transdifferenziati.

In precedenza, è stato dimostrato che l'HSC attivato per coltura mostra un aumento dose-dipendente dell'apoptosi dopo incubazione con atorvastatina per 22 ore. 31 Aprigliano et al. 31 hanno attribuito questo effetto all'arresto del ciclo cellulare e all'induzione della caspasi e questi effetti potrebbero indicare effetti tossici precoci di atorvastatina nella coltura cellulare. Contrariamente a questi dati in vitro , nelle nostre mani il trattamento cronico con atorvastatina per 1 settimana non ha modificato l'attività della caspasi; ha persino ridotto l'apoptosi dell'MFB nelle cellule con fibrosi completamente consolidata, come mostrato precedentemente nei ratti. 8 Pertanto, nel presente studio, abbiamo usato un MFB completamente transdifferenziato (dopo il primo passaggio) e li abbiamo incubati con atorvastatina per un periodo più lungo (3 giorni) rispetto ad Aprigliano et al . 31 In questa situazione, l'apoptosi dell'MFB è aumentata solo dopo l'incubazione con la dose più alta (10 −4 M) di atorvastatina, ma è diminuita a 10 −5 M (Figura 5). L'effetto dopo 3 giorni di incubazione con 10 −5 M era piuttosto stabile, senza una possibile sovrapposizione tossica che avrebbe potuto essere il caso della dose elevata (10 −4 M). Gli effetti tossici potrebbero anche spiegare gli effetti a breve termine osservati come descritto in precedenza. 31

Nel loro insieme, l'atorvastatina ha ridotto (almeno per 10 −5 M) la proliferazione, l'attività profibrotica e l'apoptosi nell'MFB. Suggeriamo la senescenza di MFB, precedentemente descritta per HSC, 15, 16, 17 come una spiegazione per questo risultato. Tuttavia, gli effetti dell'atorvastatina sull'induzione dell'apoptosi o della senescenza sono dose-dipendenti. L'elevata dose di atorvastatina (10 −4 M) ha indotto senescenza (colorazione β-galattosidasi), seguita da apoptosi (Figure 5 e 6). Al contrario, la dose più bassa (10 −5 M) induce prevalentemente l'espressione di p21 e β-galattosidasi come marcatori di senescenza, senza aumentare l'apoptosi di queste cellule. Recently, it has also been shown that Wnt1 might induce senescence in mesenchymal cells. 24 Interestingly, atorvastatin at 10 −5 M induced the expression of Wnt1 and its downstream effector WISP-2 (Figure 6), a repressor of the TGF-β pathway. 26

We also investigated senescence in vivo using p21 and β-galactosidase staining in rats treated for 1 week with atorvastatin 3 and 5 weeks after BDL (Figures 7 and 8). 8 In these rats, atorvastatin did not affect collagen and MFB accumulation, but decreased proliferation, transcription of profibrotic factors and apoptosis of MFB. 8 At the same time our present work revealed an induction of senescence, as assessed by β-galactosidase stainings (Figure 8a and b). This was more pronounced in more advanced stages of fibrosis (6 W BDL, Figure 8b), and might explain why p21 expression, a further senescence marker, was only increased in the 6-week BDL group treated with atorvastatin. The higher rate of senescent cells is probably caused by the fact that livers with more advanced fibrosis harbor more MFB. Co-localization microscopy (Figure 8c and d) identified MFB (α-SMA-positive cells) and HSC (desmin-positive cells) as the senescent cells (β-galactosidase-positive cells). This senescence of MFB we found is currently believed to be a stage between their profibrotic active state and apoptosis. 15, 16, 17

Thus, our in vivo and in vitro findings suggest that atorvastatin drives MFB to senescent, inactive cells, which are not yet apoptotic.