C2238 / αanp modula l'apolipoproteina e attraverso egr-1 / mir199a in cellule muscolari lisce vascolari in vitro | morte cellulare e malattia

C2238 / αanp modula l'apolipoproteina e attraverso egr-1 / mir199a in cellule muscolari lisce vascolari in vitro | morte cellulare e malattia

Anonim

Soggetti

  • Aterosclerosi
  • Segnalazione cellulare
  • Espressione genica
  • Le lipoproteine

Astratto

I soggetti portatori della variante del gene ANP T2238C hanno un rischio più elevato di soffrire di ictus o infarto del miocardio. I meccanismi attraverso i quali T2238C / α ANP esercita effetti dannosi vascolari devono essere completamente chiariti. Nel presente lavoro abbiamo mirato ad esplorare l'impatto dell'ANP C2238 / α (forma mutante) sui percorsi correlati all'aterosclerosi. Come primo passo, è stata eseguita un'analisi macroarray dell'espressione genica dell'aterosclerosi nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) esposte a ANP T2238 / α (tipo selvaggio) o ANP C2238 / α . La scoperta principale è stata che l'espressione genica dell'apolipoproteina E ( ApoE ) era significativamente sotto-regolata dall'ANP C2238 / α ed era sovraregolata dall'ANP T2238 / α . Successivamente abbiamo scoperto che l'ANP C2238 / α induce la downregulation di ApoE attraverso meccanismi dipendenti dal recettore del peptide natriuretico di tipo C (NPR-C) che coinvolgono l'upregulation di miR199a-3p e miR199a-5p e la downregulation di DNAJA4. In effetti, il knockdown di NPR-C ha salvato il livello ApoE. La sovraregolazione di miR199a da parte di NPR-C è stata mediata da un aumento reattivo dipendente dalla specie di ossigeno del fattore di trascrizione proteina-1 (Egr-1) a risposta di crescita precoce. In effetti, il knockdown di Egr-1 ha abolito l'impatto di C2238 / α ANP su ApoE e miR199a. Da notare che la downregulation di ApoE da parte di C2238 / α ANP è stata associata ad un aumento significativo di infiammazione, apoptosi e necrosi che è stata completamente salvata dalla somministrazione esogena di AombE ricombinante. In conclusione, il nostro studio ha analizzato un nuovo meccanismo di danno vascolare esercitato dall'ANP C2238 / α che è mediato dalla downregulation di ApoE. Forniamo la prima dimostrazione che C2238 / α ANP sottoregola ApoE in VSMCs attraverso l'attivazione dipendente da NPR-C di Egr-1 e la conseguente upregulation di miR199a. Il ripristino dei livelli di ApoE potrebbe rappresentare una potenziale strategia terapeutica per contrastare gli effetti dannosi dell'ANP C2238 / α .

Principale

Il peptide atriale natriuretico (ANP) svolge importanti funzioni cardiovascolari citoprotettive, come effetti antiipertrofici, antiproliferativi e prosurvivi nei cardiomiociti, cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), fibroblasti e cellule endoteliali. 1 Lavori recenti hanno dimostrato che una variante molecolare di α ANP (C2238 / α ANP), che è caratterizzata dall'estensione C-terminale del peptide con due residui di arginina ed è secondaria alla sostituzione di una timina con una citosina in posizione 2238 di il gene ANP , esercita effetti vascolari dannosi. In effetti, noi e altri gruppi in precedenza abbiamo mostrato che i soggetti portatori della variante del gene ANP T2238C hanno un rischio significativamente più elevato di avere un ictus o un infarto del miocardio e mostrare un aumento significativo dei marcatori circolanti di attivazione dei leucociti. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Complessivamente, questa evidenza evidenzia la necessità di trovare obiettivi terapeutici per prevenire o ridurre gli effetti dannosi della variante del gene C2238 / α ANP, che è relativamente frequente nella popolazione generale. Tuttavia, questo è possibile solo se i meccanismi molecolari attraverso i quali C2238 / α ANP favorisce lo sviluppo di disfunzione vascolare, aterosclerosi e incidenti cardiovascolari sono completamente chiariti.

Abbiamo precedentemente riferito che la variante molecolare C2238 / α ANP promuove l'apoptosi cellulare, la necrosi e lo stress ossidativo, mentre riduce la proliferazione cellulare, l'angiogenesi e la vasodilatazione. 9, 10, 11 Meccanisticamente, abbiamo scoperto che gli effetti deleteri della variante C2238 / α ANP sono mediati da un'attivazione deregolata del recettore del peptide natriuretico di tipo C (NPR-C) con una conseguente diminuzione dei livelli di cAMP e dell'attività PKA. 10, 11 L'attivazione anormale di NPR-C è risultata associata a una riduzione della via Akt / eNOS e ad un aumento dell'attività delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) derivate dall'ossidasi NADPH nelle cellule endoteliali. 9, 10 Inoltre, un fenomeno epigenetico che coinvolge miR21 ha contribuito in modo significativo agli effetti dannosi dell'ANP C2238C / α sulla vitalità e funzione cellulare nelle VSMC. 11 Tuttavia, questi meccanismi molecolari possono solo spiegare le proprietà deletere dell'ANP C2238 / α sulla stabilità della placca aterosclerotica. D'altra parte, l'interazione di C2238 / α ANP con più geni / proteine ​​direttamente correlati al processo aterosclerotico rimane sconosciuta. Quest'ultima possibilità è supportata dal noto coinvolgimento dei peptidi natriuretici nell'aterosclerosi. 1

Per questo motivo, abbiamo condotto un'analisi macroarray dell'espressione genica nei VSMC, un elemento cellulare chiave nello sviluppo dell'aterosclerosi 12 e un obiettivo di ANP, 1 al fine di studiare il potenziale impatto dell'ANP T2238C / α sui meccanismi alla base dell'aterosclerosi. Abbiamo scoperto che C2238 / α ANP induce una significativa downregulation dell'espressione genica dell'apolipoproteina E ( ApoE ), codificando una nota proteina antiaterosclerotica e antinfiammatoria, attraverso l'attivazione della via di segnalazione NPR-C / Egr-1 / miR199a / DNAJA4 che sezioniamo qui per la prima volta. La downregulation di ApoE è risultata responsabile delle dannose anomalie cellulari indotte da ANP T2238C / α nei VSMC.

risultati

Espressione genica differenziale ApoE in VSMC indotta da TT2238 / α ANP e CC2238 / α ANP

Il profilo di espressione dei geni di aterosclerosi delle cellule muscolari lisce delle vene ombelicali umane (HUVSMCs) esposte a TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP, rispetto alle cellule non stimolate, è riportato nella Tabella 1. Tra le sequenze che erano regolate in modo significativo e differenziato (almeno 5 volte) dalle due forme ANP α , il gene ApoE è stato significativamente ridotto di CC2238 / α ANP, mentre è stato notevolmente stimolato da TT2238 / α ANP. Abbiamo convalidato i risultati del macroarray dimostrando che sia i livelli di espressione di mRNA di ApoE che quelli di espressione proteica erano sottoregolati in HUVSMC (Figure 1a e b) e SMC dell'arteria coronarica (CAMSC) (Figure 1c ed d) da CC2238 / α ANP, mentre erano sovraregolati da TT2238 / α ANP. Poiché è risaputo che ApoE esercita azioni antioterosclerotiche e antinfiammatorie critiche, 13 abbiamo deciso di valutare se la downregulation di ApoE media gli effetti dannosi di CC2238 / α ANP.

Tabella a grandezza naturale

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Regolazione differenziale dei livelli di mRNA e proteina ApoE mediante TT2238 / α ANP e CC2238 / α ANP in HUVSMC e CAMSC. Risultati di RT-PCR ( a e c ) e di western blotting ( b, d, con corrispondente analisi densitometrica) per i livelli di espressione di ApoE in HUVSMC (parte superiore) e CASMC (parte inferiore). I risultati sono espressi come media ± SD Numero di esperimenti indipendenti = 6. Δ P <0, 005 per TT2238 / α ANP rispetto a CTR. ** P <0, 0001 per TT2238 / α ANP contro CC2238 / α ANP ( a e b ) e per CC2238 / α ANP rispetto sia a CTR che a TT2238 / α ANP ( b e d ). CC2238 / α ANP, variante α ANP; TT2238 / α ANP, ANP wild-type α ; CTR, controllo

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CC2238 / α ANP induce la downregulation di ApoE attraverso meccanismi dipendenti da NPR-C associati alla upregulation di miR199a

Abbiamo quindi analizzato i meccanismi attraverso i quali CC2238 / α ANP induce la riduzione dell'espressione di ApoE. Precedenti lavori del nostro laboratorio hanno dimostrato che CC2238 / α ANP induce effetti vascolari dannosi attraverso un'attivazione deregolata di NPR-C. 10, 11 Pertanto, abbiamo studiato se NPR-C media gli effetti di CC2238 / α ANP sui livelli di espressione di ApoE. I nostri risultati hanno confermato questa ipotesi, poiché abbiamo scoperto che il knockdown dell'NPR-C ha salvato i livelli di espressione di ApoE sia nelle HUVSMC che nelle cellule muscolari lisce dell'arteria coronarica (CASMC) esposte all'ANP CC2238 / α (Figure 2a e 3a).

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C2238 / α ANP induce la downregulation di ApoE attraverso meccanismi dipendenti da NPR-C associati alla upregulation di miR199a e di Egr-1 in HUVSMCs. ( a ) Analisi mediante RT-PCR e mediante western bloting dei livelli di espressione di ApoE su CC2238 / α ANP in cellule non silenziate e silenziate NPR-C. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri campioni. ( b ) livelli di mRNA di miR199a-3p, miR199a-5p, DNAJA4 sotto TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (parte superiore del pannello) e in NPR-C non silenziate e silenziate sotto CC2238 / α ANP (parte inferiore del pannello). Sono stati usati due siRNA specifici per ottenere il silenziamento del gene NPR-C. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a TT2238 / α ANP e CTR. Δ P <0, 005 per TT2238 / α ANP contro CTR e per CC2238 / α ANP rispetto a CTR (miR199a-3p e miR199a-5p). ( c ) Western blotting rappresentativo di Egr-1, con corrispondente analisi densitometrica sotto esposizione TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (lato sinistro) e sotto CC2238 / α ANP nelle cellule NPR-C non silenziate e silenziate (lato destro) . ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri campioni. I risultati sono espressi come media ± SD Numero di esperimenti indipendenti = 6. CC2238 / α ANP, variante α ANP; TT2238 / α ANP, ANP wild-type α ; siRNA1, silenziatore genico NPR-C 1; siRNA2, silenziatore genico NPR-C 2; hsa-miR199a, microRNA199a umano; Egr-1, risposta alla crescita precoce proteina-1; CTR, controllo

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C2238 / α ANP induce la downregulation di ApoE attraverso meccanismi dipendenti da NPR-C associati alla upregulation di miR199a e di Egr-1 nei CASMC. ( a ) Analisi mediante RT-PCR e mediante western bloting dei livelli di espressione di ApoE su CC2238 / α ANP in cellule non silenziate e silenziate NPR-C. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri campioni. ( b ) livelli di mRNA di miR199a-3p, miR199a-5p, DNAJA4 sotto TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (parte superiore del pannello) e in NPR-C non silenziate e silenziate sotto CC2238 / α ANP (parte inferiore del pannello). Sono stati usati due siRNA specifici per ottenere il silenziamento del gene NPR-C. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a TT2238 / α ANP e CTR. Δ P <0, 005 per TT2238 / α ANP contro CTR e per CC2238 / α ANP rispetto a CTR (miR199a-3p e miR199a-5p). ( c ) Western blotting rappresentativo di Egr-1, con corrispondente analisi densitometrica sotto esposizione TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (lato sinistro) e sotto CC2238 / α ANP nelle cellule NPR-C non silenziate e silenziate (lato destro) . ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri campioni. I risultati sono espressi come media ± SD Numero di esperimenti indipendenti = 6. Per le abbreviazioni vedere la Figura 2

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Da notare, prove precedenti hanno dimostrato che i livelli di espressione di ApoE sono regolati epigeneticamente da miR199a-3p e miR199a-5p, che a loro volta possono colpire direttamente ApoE o colpire la proteina shock termico DNAJA4, che promuove l'upregolazione di ApoE. 14 In linea con questa evidenza, abbiamo scoperto che i livelli di espressione di miR199a-3p e miR199a-5p sono significativamente sovraregolati da ANP CC2238 / α , mentre sono down-regolati da ANP TT2238 / α . D'altra parte, il livello di espressione di DNAJA4 risultava essere regolato verso il basso da CC2238 / α ANP, mentre era invariato nelle cellule esposte a TT2238 / α ANP (Figure 2b e 3b). È interessante notare che abbiamo osservato che il knockdown di NPR-C ha salvato i livelli di espressione di miR199a-3p, miR199a-5p e DNAJA4 in entrambe le linee VSMC trattate con ANP CC2238 / α (Figure 2b e 3b). Questi dati suggeriscono che NPR-C regola i livelli di ApoE attraverso la regolazione di miR199a-3p, miR199a-5p e DNAJA4.

NPR-C regola miR199a attraverso l'attivazione ROS-dipendente della risposta di crescita precoce protein-1 (Egr-1)

Quindi, abbiamo cercato di chiarire i meccanismi di segnalazione attraverso i quali NPR-C promuove l'upregulation di miR199a-3p e miR199a-5p, la downregulation di DNAJA4 e, in definitiva, la downregulation dei livelli di espressione di ApoE in risposta a CC2238 / α ANP. Il fattore di trascrizione Egr-1 è stato precedentemente trovato per promuovere la sovraregolazione di miR199a. 15 Inoltre, Egr-1 si trova spesso attivato nel sistema vascolare durante lo stress ed è stato descritto per essere coinvolto nel processo aterosclerotico. 16 Pertanto, abbiamo valutato se Egr-1 è coinvolto nella regolazione dipendente dalla NPR-C di miR199a-3p e miR199a-5p in risposta a CC2238 / α ANP. Abbiamo scoperto che Egr-1 è sovraregolato in risposta a CC2238 / α ANP e questo effetto è stato abrogato dal knockdown NPR-C (Figure 2c e 3c). È noto che CC2238 / α ANP induce l'attivazione della NADPH ossidasi NPR-C e la produzione di ROS. 9, 10 Egr-1 può essere attivato da ROS. 17 In conformità, abbiamo scoperto che l'upregolazione C2238 / α ANP-dipendente di Egr-1 è stata smussata dall'apocinina, un inibitore della NADPH ossidasi (Figura supplementare S1). Infine, abbiamo scoperto che il knockdown Egr-1 ha normalizzato i livelli di miR199a e DNAJA4 e bloccato la downregulation di ApoE in entrambe le linee VSMC trattate con CC2238 / α ANP (Figura 4). Nel complesso, questi dati indicano che CC2238 / α ANP porta a upregulation di miR199a e downregulation di ApoE in VSMCs attraverso la produzione di ROS NPR-C dipendente che a sua volta porta all'attivazione di Egr-1.

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Impatto del silenziamento genico Egr-1 sul percorso regolatorio ApoE in HUVSMC e CAMSC. ( a ) Impatto del silenziamento genico Egr-1 su Egr-1, miR199-3p, miR199-5p, livelli di espressione di DNAJA4 (rilevati da RT-PCR) e sui livelli di espressione di ApoE (rilevati sia da RT-PCR che da western blotting ) in HUVSMC. Sono stati usati due siRNA specifici per ottenere la distruzione del gene Egr-1. ( b ) Impatto del silenziamento genico Egr-1 su Egr-1, miR199-3p, miR199-5p, livelli di espressione di DNAJA4 (rilevati da RT-PCR) e sui livelli di espressione di ApoE (rilevati sia da RT-PCR che da western macchia) in CASMC. I risultati sono espressi come media ± SD Numero di esperimenti indipendenti = 4 per ciascuna linea cellulare. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri punti. siRNA1, silenziatore genico Egr-1 1; siRNA2, silenziatore genico Egr-1 2; per altre abbreviazioni vedere le figure 2 e 3

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CC2238 / α ANP modula l'apoptosi, la necrosi e l'infiammazione nei VSMC attraverso la downregulation ApoE dipendente dalla NPR-C

Quindi, abbiamo valutato il significato biologico della downregulation di ApoE nelle cellule esposte a CC2238 / α ANP. Le figure supplementari S2 e S3 mostrano i risultati dell'analisi western bloting per valutare i livelli di espressione del caspase-3 scisso, il repressore cellulare del gene stimolato E1A (CREG) e le forme sia fosforilate che totali di JNK e p38MAPK in HUVSMCs (figura supplementare S2 ) e in CASMC (figura complementare S3) in presenza di CC2238 / α ANP. Caspase-3 scisso è stato aumentato di CC2238 / α ANP (figure supplementari S2A e S3A). D'altra parte, l'espressione di CREG, un fattore antiapoptotico, è stata ridotta (figure supplementari S2B e S3B). Coerentemente con studi precedenti che hanno dimostrato che CREG inibisce l'apoptosi del VSMC attraverso l'inibizione delle vie di segnalazione di p38MAPK e JNK, 18 abbiamo osservato un aumento della fosforilazione parallela di entrambi p38MAPK e JNK in entrambi HUVSMC e CASMC trattati con CC2238 / α ANP rispetto alle cellule di controllo (Supplemento Figure S2C, D, S3C e D). Da notare che il knockdown di NPR-C ha completamente salvato gli effetti ANP CC2238 / α su cleaved-caspase-3, phospho-p38MAPK, phosphoJNK e CREG. Anche i livelli cellulari di NF- κ B e Smad4, noti marker di infiammazione, sono aumentati significativamente in HUVSMC e CASMC esposti a CC2238 / α ANP (Figure supplementari S2E, F, S3E e F). Il silenziamento del gene NPR-C ha attenuato l'aumento di NF- κ B e Smad4 nonostante la presenza di CC2238 / α ANP in entrambe le linee VSMC (figure supplementari S2E, F, S3E e F). Complessivamente, questi risultati indicano che C2238 / α ANP induce apoptosi e infiammazione nelle VSMC attraverso meccanismi NPR-C-dipendenti.

Da notare, abbiamo scoperto che questi meccanismi sono mediati dalla downregulation di ApoE. Innanzitutto, l'analisi del sequenziamento ha rivelato che gli HUVSMC esprimono le isoforme ApoE 2 e 3 (APOE2 / APOE3) mentre i CASMC esprimono le isoforme ApoE 3 e 4 (APOE3 / APOE4) (Figura aggiuntiva 4). Ancora più importante, abbiamo scoperto che il ripristino dei livelli di ApoE in HUVSMC (Figura 5a) e CASMC (Figura 5b) trattati con CC2238 / α ANP attraverso la concomitante somministrazione esogena della corrispondente isoforma ricombinante ApoE è stato in grado di salvare la vitalità cellulare, che era significativamente alterato dal CC2238 / α ANP da solo rispetto alle cellule non trattate. La somministrazione di ApoE ha ridotto significativamente l'apoptosi precoce e tardiva e la necrosi indotta da CC2238 / α ANP. Inoltre, le VSMC hanno mostrato una significativa riduzione dell'infiammazione in caso di esposizione ad ApoE ricombinante nonostante la presenza di CC2238 / α ANP (Figura 6).

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Effetto dell'ApoE ricombinante sulla vitalità cellulare in presenza di ANP CC2238 / α in entrambi gli HUVSMC ( a ) e CASMC ( b ) Le cellule sono state esposte contemporaneamente ad APE ricombinanti e ANP CC2238 / α . Alla fine della stimolazione, la vitalità cellulare è stata analizzata dal FACS. Ogni pannello di figure mostra diagrammi a dispersione rappresentativi per ciascuna condizione sperimentale (lato sinistro) e corrispondente analisi densitometrica (lato destro). I risultati sono espressi come media ± SD Numero di esperimenti indipendenti = 3 per ogni isoforma ApoE. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri punti. CC2238 / α ANP, variante α ANP; CTR, controllo; PI, ioduro di propidio; ApoE, apolipoproteina E; CTR, controllo

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Effetto dell'ApoE ricombinante sui marker di infiammazione in presenza di CC2238 / α ANP sia in HUVSMC ( a ) che in CASMC ( b ). Le cellule sono state esposte contemporaneamente ad ApoE ricombinante e AN22 CC2238 / α . Ventiquattro ore dopo il completamento della stimolazione, le proteine ​​totali sono state analizzate per i marker di infiammazione mediante western blot. ( a ) Western blot rappresentativo di Nf- κ B e Smad4, con corrispondente analisi densitometrica, in HUVSMC. ( b ) Western blot rappresentativo di Nf- κ B e Smad4, con corrispondente analisi densitometrica, in CASMC. I dati sono espressi come media ± SD Numero di esperimenti indipendenti = 3 per ogni isoforma ApoE. ** P <0, 0001 per CC2238 / α ANP rispetto a tutti gli altri punti. CC2238 / α ANP, variante α ANP; ApoE, apolipoproteina E; CTR, controllo

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Discussione

La variante del gene T2238C / α ANP è un emergente fattore di rischio cardiovascolare non modificabile. In effetti, i soggetti portatori di questa variante genetica hanno un rischio più elevato di insorgenza di eventi avversi cardiovascolari, come ictus e infarto del miocardio. Inoltre, questi soggetti presentano segni di disfunzione endoteliale già in giovane età. Qui, abbiamo analizzato l'impatto della variante del gene T2238C / α ANP sui meccanismi correlati all'aterosclerosi. Abbiamo scoperto che l'ANP C2238 / α downregula significativamente l'espressione del gene ApoE nelle VSMC attraverso meccanismi dipendenti dalla NPR-C. Abbiamo anche dimostrato che C2238 / α ANP svolge questo effetto attraverso una regolazione epigenetica selettiva di ApoE che coinvolge Egr-1 e due piccoli RNA non codificanti (miR199a-3p e miR199a-5p). Soprattutto, abbiamo fornito prove del fatto che gli effetti dannosi indotti dall'asse C2238 / α ANP – NPR-C nelle VSMC, come un aumento del tasso di apoptosi, necrosi e infiammazione, potrebbero essere completamente recuperati dalla supplementazione ricombinante di proteine ​​ApoE (Figura 7).

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Rappresentazione schematica del percorso che coinvolge NPR-C, Egr-1, miR199a-3p e miR199a-5p su modulazione ApoE su esposizione ANP CC2238 / α in VSMCs. Gli effetti positivi della supplementazione di ApoE sui VSMC, nonostante l'esposizione ANP CC2238 / α , supportano il forte contributo di questo percorso alla promozione del danno vascolare attraverso la downregulation finale di ApoE. C2238 / α ANP, variante α ANP; NPR-C, recettore del peptide natriuretico di tipo C; ROS, specie reattive dell'ossigeno; Egr-1, risposta alla crescita precoce proteina-1; miR199a, microRNA199a; CREG, repressore cellulare del gene stimolato dall'E1A; JNK, chinasi N-terminale c-giu

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Questi dati estendono in modo significativo le nostre prove precedenti che dimostrano che l'ANP C2238 / α induce la morte delle cellule endoteliali e lo stress ossidativo, riduce l'angiogenesi e promuove la disfunzione endoteliale attraverso l'attivazione deregolata della segnalazione NPR-C / cAMP e la riduzione della via PKA / Akt / eNOS. 9, 10 Inoltre, abbiamo recentemente scoperto che C2238 / α ANP aumenta lo stress ossidativo e la migrazione cellulare e promuove la vasocostrizione attraverso la via di segnalazione NPR-C / cAMP / PKA / CREB / miR21. 11 Il presente studio dimostra per la prima volta un impatto diretto dell'ANP C2238 / α sui meccanismi alla base dell'aterosclerosi nelle VSMC, un elemento chiave in questo processo. Infatti, C2238 / α ANP induce una significativa downregulation di ApoE che svolge un ruolo importante nello sviluppo dell'aterosclerosi. 19, 20 ApoE è una proteina 34-kDa che partecipa alla mobilizzazione e alla distribuzione del colesterolo e di altri lipidi tra i vari tessuti del corpo. 20 È noto che la sola deficienza di ApoE promuove lo sviluppo di placche aterosclerotiche aortiche nei topi. 21 Precedenti studi hanno dimostrato che ApoE esercita anche effetti cellulari antiaterosclerotici e antinfiammatori pleiotropici. ApoE è stato precedentemente trovato per essere espresso in VSMCs in cui la downregulation di ApoE è correlata positivamente con marcatori tipici di infiammazione come Smad4 22 e NF- κ B. 23 Inoltre, ApoE ostacola le funzioni proinfiammatorie delle cellule infiammatorie. 24 Nell'uomo, dove la mancanza di ApoE è rara, il rischio di aterosclerosi è fortemente associato a tre isoforme di apoE comuni nell'ordine di APOE4> APOE3> APOE2. 20 Inoltre, è noto che ApoE svolge un ruolo nello sviluppo di 25 malattie cardiovascolari e neurologiche. 26 Pertanto, il nostro studio può suggerire che C2238 / α ANP induca anomalie cellulari attraverso l'inibizione degli effetti pleiotropici sopra descritti di ApoE. Inoltre, poiché nei topi Apo - / - sono stati riportati livelli più alti di mieloperossidasi, 27 possiamo postulare che l'ANP C2238 / α può, almeno in parte, associarsi a livelli più elevati di mieloperossididasi, come precedentemente riportato nei pazienti con malattia coronarica, 4 attraverso la sua capacità per ridurre l'espressione genica ApoE.

D'altra parte, i nostri risultati attuali indicano che l'ANP α di tipo selvaggio può esercitare effetti antioterosclerotici fisiologici sovraregolando i livelli di ApoE. Questa possibilità è supportata da prove precedenti che suggeriscono una stretta relazione tra peptidi natriuretici (NP) e aterosclerosi. In effetti, le NP sono significativamente più espresse negli espianti coronarici umani di lesioni aterosclerotiche avanzate. 28 L'inibizione della degradazione NP da parte del candoxatril inibitore della NEP ha impedito il deposito di grasso in un modello di coniglio. 29 I livelli circolanti di NP aumentano parallelamente all'aumento della stenosi della placca coronarica, raggiungendo un livello di plateau al più alto grado di stenosi dei vasi. 30

In particolare, lavori precedenti hanno dimostrato che l'aterosclerosi aumenta in un modello animale privo di topi NPR-A e ApoE (topi Npr1 - / - ApoE - / - ) 31, suggerendo che la mancanza di NPR-A potrebbe indurre la crescita di VSMC attraverso altri segnali del recettore, quindi aumentando gli effetti vascolari negativi a causa della mancanza di ApoE.

Un'altra scoperta originale del nostro studio è la dimostrazione che l'ANP C2238 / α induce la downregulation di ApoE attraverso l'upregulation Ngr-C-dipendente di Egr-1. Questo effetto è mediato dall'attività dell'ossidasi NADPH, poiché l'apocinina ha abrogato gli effetti dell'ANP C2238 / α sull'attivazione di Egr-1. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che una regolazione epigenetica negativa di ApoE di Egr-1 viene dimostrata nel contesto vascolare. Questa scoperta estende anche le prove precedenti a sostegno di un ruolo dell'attivazione di Egr-1 nello sviluppo dell'aterosclerosi e può suggerire che l'attivazione di Egr-1 possa contribuire all'aterosclerosi attraverso la downregulation di ApoE. È interessante notare che precedenti lavori hanno dimostrato che l'aterosclerosi è ridotta in un modello a doppio knockout di topi Egr-1 e ApoE, rispetto a quello osservato solo nel modello ApoE - / - knockout, suggerendo così che la mancanza di Egr-1 è protettiva in assenza di ApoE. 32 Il nostro studio estende queste prove dimostrando che Egr-1 può essere a monte di ApoE, regolando negativamente la sua espressione.

Da notare, abbiamo scoperto che l'attivazione di Egr-1 da parte di C2238 / α ANP promuove l'upregulation di miR199a-3p e miR199a-5p, confermando così i risultati precedenti che dimostrano che Egr-1 regola miR199a. 15 Questi dati suggeriscono che Egr-1 può regolare epigeneticamente ApoE attraverso questi due microRNA (miRNA). In effetti, Pencheva et al. 14 hanno recentemente dimostrato che miR199a-3p e miR199a-5p regolano la formazione di metastasi del melanoma attraverso la downregulation dei livelli di ApoE. Gli autori hanno scoperto che questi miRNA possono colpire gli ApoE direttamente o indirettamente inibendo i livelli di ApoE attraverso il targeting del DNAJA4, una proteina di shock termico che stimola i livelli di ApoE. In linea con questa evidenza, abbiamo anche scoperto che la segnalazione C2238 / α ANP / NPR-C / Egr-1 / miR199a promuove la downregulation dei livelli di DNAJA4.

Da notare, questi risultati rafforzano le prove disponibili che chiariscono il ruolo dei miRNA nella patogenesi delle anomalie del VSMC e delle malattie vascolari in generale. A questo proposito, in precedenza abbiamo scoperto che una disregolazione di miR21 ha contribuito alle variazioni del VSMC sulla stimolazione ANP C2238 / α . 11 Inoltre, recentemente è stato scoperto che la downregulation di miR23b nella parete vascolare ferita modula la commutazione fenotipica del VSMC attraverso il coinvolgimento di SMAD3 e FOXO4. Nel complesso, questa evidenza supporta la conoscenza che i meccanismi epigenetici dipendenti dal miRNA possono regolare la patogenesi delle malattie umane in modo altamente integrativo.

Precedenti consegne di ApoE3 umano mediante iniezione di plasmidi intramuscolari e adenovirus, 34 da peptidi mimetici di apolipoproteina sintetica 35 o da una piattaforma cellulare, 36 hanno inibito lo sviluppo di lesioni aterosclerotiche. Per prima cosa abbiamo valutato l'isoforma ApoE specifica espressa dalle due linee VSMC utilizzate nei nostri studi, che non era mai stata riportata prima. Di conseguenza, abbiamo osservato tutti i benefici dell'esposizione di VSMCs alle specifiche isoforme ApoE ricombinanti, nonostante la presenza di C2238 / α ANP. Gli effetti pleiotropici di ApoE possono ben spiegare i nostri risultati, poiché questa proteina è ateroprotettiva non solo attraverso il suo effetto ipolipemizzante ma anche attraverso attività antiossidanti e antinfiammatorie. 19 I risultati benefici ottenuti attraverso il trattamento ApoE di VSMC danneggiati esposti all'ANP C2238 / α evidenziano il potenziale ruolo chiave di questa molecola nel trattamento dell'aterosclerosi nei soggetti con variante ANP C2238 / α , sebbene esistano ancora alcune limitazioni per la sua applicazione clinica.

In sintesi, riportiamo le prime prove di un nuovo meccanismo di malattia vascolare nei VSMC mediato da NPR-C, che coinvolge Egr-1 e due piccoli RNA non codificanti dipendenti, che alla fine portano alla downregulation di ApoE, in presenza della variante del gene C2238 / α ANP, un emergente fattore di rischio cardiovascolare. Questa cascata di trasduzione appena scoperta contribuisce all'ampia gamma di azioni vascolari dannose dovute all'ANP C2238 / α che sono in contrasto con le proprietà benefiche note dell'ANP α selvaggio. Inoltre, i nostri nuovi risultati scoprono azioni pleiotropiche sconosciute di NPR-C nelle cellule vascolari attraverso il suo coinvolgimento nella regolazione epigenetica delle proteine ​​vascolari antiaterosclerotiche, come l'apolipoproteina E.

Materiali e metodi

Stimolazione di HUVSMC con estrazione di ANP e RNA TT2238 e CC2238 / α per l'analisi di macroarray di aterosclerosi

Gli HUVSMC disponibili in commercio sono stati stimolati con ANP di tipo sintetico (TT2238) o mutante (CC2238) / α ad una concentrazione finale di 10 9 mol / l per 12 ore, come precedentemente descritto. 9, 10, 11 Le piastre di controllo hanno ricevuto un mezzo privo di ANP. Sono stati eseguiti tre esperimenti. L'RNA totale, ottenuto al termine della stimolazione, è stato utilizzato per la sintesi di cDNA e quindi per l'analisi dei macroarray. La conferma della modulazione del gene e della proteina ApoE su CC2238 / α ANP e TT2238 / α ANP è stata successivamente ottenuta in esperimenti indipendenti in HUVSMC e anche in CASMC (numero di esperimenti = 6 per ogni linea cellulare) mediante RT-PCR, basata sulla metodologia SYBR Green e mediante western blotting delle proteine ​​totali.

Impatto del silenziamento del gene NPR-C sulla modulazione del gene e della proteina ApoE su CC2238 / α ANP

La stimolazione di HUVSMC e CASMC con ANP CC2238 / α è stata ripetuta sia in presenza che in assenza di NPR-C (numero di esperimenti = 6) per verificare il ruolo di questo recettore nel mediare gli effetti dell'ANP CC2238 / α sul gene ApoE e livelli di espressione proteica, secondo i nostri precedenti rapporti. 10, 11

Ruolo dell'attivazione NPR-C-dipendente di miRNA199a-3p e miRNA199a-5p nella modulazione di ApoE mediante CC2238 / α ANP. Coinvolgimento di Egr-1

Per verificare se una modulazione epigenetica nota di ApoE, dipendente da miRNA199a-3p e 199a-5p, 14 ha svolto un ruolo nel nostro contesto sperimentale, l'RNA totale, estratto da entrambi i NPR-C non silenziati e silenziati HUVSMC e CASMC, è stato purificato per isolare piccoli RNA utilizzando un kit disponibile in commercio. Per RT-PCR di DNAJA4, un target noto di miRNA199a, 14 è stato utilizzato un test di espressione genica TaqMan. Successivamente, sulla base della precedente conoscenza che i livelli di espressione di miRNA199a sono modulati da Egr-1, 15 abbiamo valutato il livello di espressione della proteina Egr-1 su TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP mediante western blotting. Abbiamo anche stabilito meglio il ruolo di Egr-1 nella modulazione ApoE sotto CC2238 / α ANP con ulteriori esperimenti. In primo luogo, il ruolo noto dello stress ossidativo sulla stimolazione Egr-1 17 è stato verificato esponendo VSMC a CC2238 / α ANP sia in assenza che in presenza di apocinina (numero di esperimenti = 3), seguendo le condizioni precedentemente descritte. 9 livelli di espressione di Egr-1 sono stati quindi valutati mediante western blotting. Successivamente, la modulazione di miRNA199a-3p e miRNA199a-5p, di DNAJA4 e di ApoE è stata determinata in VSMC silenziate Egr-1 esposte a ANP CC2238 / α (numero di esperimenti = 4).

Valutazione dei livelli di espressione di caspase-3, CREG, JNK, p38MAPK, Nf- k Bp65 e TGF β (Smad4) suddivisi come marcatori di apoptosi, necrosi e infiammazione su CC2238 / α ANP sia in presenza che in assenza di NPR-C

Per verificare se la downregulation dell'espressione di ApoE nelle nostre condizioni sperimentali fosse associata, come previsto, all'aumento del tasso di apoptosi, necrosi e infiammazione, sono state analizzate 13 proteine ​​totali utilizzando i seguenti anticorpi primari specifici: caspase-3 anti-scissione, anti-CREG, anti-fosfoJNK, anti-JNK, anti-fosfo-p38MAPK, anti-p38MAPK, anti-NF κ Bp65, anti-Smad4, anti- β -attina. Quest'ultimo è stato usato come proteina per le pulizie. Dopo l'incubazione con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano, i segnali sono stati rivelati come descritto di seguito.

Impatto dell'esposizione all'ApoE ricombinante sulla vitalità cellulare, sull'apoptosi, sulla necrosi e sull'infiammazione sia in HUVSMC sia in CASMC in presenza di CC2238 / α ANP

Per testare la capacità della supplementazione di ApoE di salvare gli effetti dannosi indotti da ANP CC2238 / α , e sulla base dei risultati di sequenziamento di isoforme ApoE specifiche espresse nelle due linee cellulari, gli HUVSMC sono stati esposti per 12 ore a AN22 CC2238 / α e entrambi ricombinanti ApoE2 o proteina ApoE3 (10 μ g / ml; Sigma). I CAMSC sono stati esposti alla CC2238 / α ANP e alla proteina ricombinante ApoE3 o ApoE4 (10 μ g / ml; Sigma). Le proteine ​​ricombinanti per ApoE sono state aggiunte alle VSMC come precedentemente descritto. 37

Ventiquattro ore dopo il completamento dell'esposizione a CC2238 / α ANP e alle specifiche isoforme ApoE ricombinanti, il conteggio delle cellule apoptotiche è stato eseguito mediante analisi di citometria a flusso (FACS) e le proteine ​​totali sono state estratte per l'analisi di Western blotting di Nf- κ Bp65 e Smad4.

Sono stati condotti esperimenti in triplicato per ciascuna isoforma ApoE.

Coltura cellulare

Gli HUVSMC disponibili in commercio, acquistati presso ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA), sono stati coltivati ​​nel terreno F12 di Kaighn contenente 2 mM di l-glutammina, 1, 5 g / l di bicarbonato di sodio e integrato con 0, 1 mg / ml di eparina, 0, 03 mg / ml integratore per la crescita delle cellule endoteliali, siero bovino fetale al 10%. I CASMC disponibili in commercio (acquistati da Lonza, Walkersville, MD, USA) sono stati coltivati ​​in Smooth Muscle Growth Medium-2 (SmgM-2; Lonza). Per ogni linea cellulare sono stati utilizzati quattro lotti per eseguire tutti gli esperimenti.

Le cellule sono state utilizzate nel quinto passaggio e al 70% di confluenza. Per la stimolazione con TT2238 o CC2238 / α ANP, sono stati seminati in piastre da 24 pozzetti (8 × 10 4 cellule / pozzetto), coltivati ​​nel rispettivo terreno di crescita per 24 ore, successivamente affamati e stimolati con α ANP ad una concentrazione finale di 10 9 mol / l per 12 ore in presenza di siero di vitello fetale al 10%. Le piastre di controllo hanno ricevuto un mezzo privo di ANP.

Estrazione di RNA totale

L'RNA totale è stato ottenuto utilizzando il reagente Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), sottoposto al trattamento con DNAse I (Qiagen, Venlo, Paesi Bassi) e successivamente purificato utilizzando il Mini Kit RNeasy (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. L'integrità dell'RNA è stata valutata denaturando l'elettroforesi su gel di agarosio e la sua concentrazione è stata verificata utilizzando lo spettrofotometro UV-Vis NanoDrop2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA USA).

Analisi di macroarray RT-PCR

Sono stati condotti tre esperimenti con ogni stimolo e l'RNA è stato raggruppato per l'analisi dei macroarray. Due microgrammi di RNA totale sono stati usati per la sintesi di cDNA usando il kit RT 2 First Strand (Qiagen). Abbiamo effettuato analisi quantitative di macroarray RT-PCR utilizzando un array di PCR Profiler per aterosclerosi umana RT 2 acquistato da Qiagen. Gli esperimenti sono stati eseguiti come precedentemente descritto. 9 In breve, il modello di cDNA è stato miscelato con uno di Master Mix per PCR verde in tempo reale SYBR RT 2 pronto all'uso (Qiagen). L'array scelto contiene un gruppo di 84 set di primer per geni focalizzati sul pathway (aterosclerosi umana), cinque geni di housekeeping e tre controlli di qualità RNA e PCR. La miscela è stata aliquotata in ciascun pozzetto della stessa piastra contenente set di primer specifici del gene predispensati e la PCR è stata eseguita sul sistema Real-Time PCR ViiA 7 (Life Technologies). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il portale Web di analisi dei dati della matrice PCR (//www.superarray.-com/pcrarraydataanalysis.php) e il metodo ΔΔCt. 38 I risultati sono stati espressi come livelli relativi di ciascun gene mRNA sotto l'effetto di CC2238 o TT2238 / α ANP riferito all'espressione di questo gene in cellule non stimolate (che sono state scelte per rappresentare 1x espressione di ciascun gene). I risultati sono stati considerati significativi quando l'espressione dell'mRNA era 5 volte superiore o inferiore a quella delle cellule non stimolate.

RT-PCR quantitativa di ApoE, NPR-C, Egr-1 (metodologia SYBR Green)

Due microlitri di cDNA sono stati miscelati con 5 μl di Master Mix PCR verde SYBR (Life Technologies) e 0, 5 μl di primer specifici: ApoE (forward 5′-GAGCAAGCGGTGGAGACAG-3 ′ e reverse 5′-CATCAGCGCCCTCAGTTCC-3 ′); NPR-C (avanti 5′-GGAAGACATCGTGCGCAATA-3 'e inversa 5'-GATGCTCCGGATGGTGTCA-3'); Egr-1 (avanti 5′-ACCGCAGAGTCTTTTCCTGACA-3 ′ e retromarcia 5′-GGTGCAGGCTCCAGGGAAAA-3 ′).

β -Actin è stato usato come gene di pulizia (in avanti 5′-GCAAGAGATGGCCACGGCTG-3 ′ e inversa 5′-CCACAGGACTCCATGCCCAG-3 ′). La RT-PCR è stata eseguita sul sistema Real-Time PCR ViiA 7 con condizioni di ciclo di 50 ° C per 2 minuti, 95 ° C per 10 minuti seguite da 95 ° C per 15 se 60 ° C per 60 s per un totale di 40 cicli. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato in ciascun test. I risultati sono stati espressi come livelli relativi di ciascun gene mRNA rispetto alle cellule di controllo.

RT-PCR quantitativa di miRNA199a-3p, miRNA199a-5p, DNAJA4 (metodologia TaqMan)

L'RNA totale è stato purificato per isolare piccoli RNA con un kit specifico (miRNeasy Mini Kit; Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. Per la sintesi di cDNA di miR199a-3p, miR199a-5p e controllo miRU87, 1 μ g di RNA purificato è stato miscelato con 3 μl di NCode VILO miRNA kit di sintesi cDNA (Life Technologies) e 1 × RT-primer (Life Technologies) in un volume di reazione totale di 20 μ l. La reazione è stata incubata a 16 ° C per 30 minuti, 42 ° C per 30 minuti e 85 ° C per 5 minuti in un termociclatore T-100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Quindi, 2 μl di reazione RT sono stati aggiunti a 1 μl di un dosaggio TaqMan MicroRNA specifico 20 × (miR199a-3p, miR199a-5p, miRU87; Life Technologies) e 10 μ l di TaqMan Universal PCR Master Mix II con UNG (Tecnologie della vita) in un volume finale di 20 μl . La RT-PCR è stata eseguita utilizzando il sistema PCR in tempo reale ViiA 7 con condizioni di ciclo di 95 ° C per 10 minuti seguite da 95 ° C per 15 se 60 ° C per 60 s per un totale di 40 cicli. Ogni dosaggio TaqMan è stato eseguito in triplice copia. I risultati sono stati espressi come livelli relativi di ciascun miRNA sotto l'effetto di diversi trattamenti relativi alle cellule non stimolate.

Per RT-PCR di DNAJA4, 2 μl di cDNA sono stati miscelati con 10 μl di TaqMan Universal Master Mix II con UNG e 1 μl di DNAJA4 TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies) in un volume finale di 20 μl . β -Actin è stato usato come gene per le pulizie. RT-PCR è stata eseguita utilizzando il sistema Real-Time PCR ViiA 7 con condizioni di ciclo di 50 ° C per 2 minuti, 95 ° C per 10 minuti seguite da 95 ° C per 15 se 60 ° C per 60 s per un totale di 40 cicli. Ogni dosaggio è stato eseguito in triplice copia. I risultati sono stati espressi come livelli di mRNA sotto l'effetto di diversi trattamenti relativi alle cellule non stimolate.

Estrazione totale di proteine ​​e western blotting

Le proteine ​​totali sono state estratte dalle cellule 24 ore dopo il completamento dell'esposizione TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP. I campioni sono stati lisati in 1: 10 peso / volume in tampone di lisi (NaCl 50 mM, 100 mM Tris-HCl pH 7, 4, acido etilendiamminotetracetico 1 mM (EDTA), 1% SDS) integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA), incubato su ghiaccio per 15 minuti. e centrifugato a 13000 giri / min per 15 minuti. La concentrazione di proteine ​​è stata determinata mediante il kit di analisi delle proteine ​​DC (Bio-Rad) seguendo le istruzioni del produttore. I lisati proteici sono stati fatti bollire a 95 ° C per 5 minuti in presenza di tampone di caricamento del gel (Bio-Rad). Cinquanta microgrammi di ciascun campione sono stati caricati su gel di poliacrilammide SDS al 10% e fatti scorrere per 120 minuti a 100 V. Le proteine ​​sono state quindi trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF; Bio-Rad) utilizzando il Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad ). Siti di legame non specifici sono stati bloccati a temperatura ambiente per 1 ora in albumina sierica bovina al 5% in tampone salino tamponato con Tris con 0, 1% di Tween 20 (Sigma) (TBS-T). Membranes were incubated at 4 °C overnight with the following primary antibodies:

anti-ApoE (1 : 1000; Millipore, Temecula, CA, USA), anti-Egr-1 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-phosphoJNK (1 : 200; Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), anti-JNK (1 : 200; Santa Cruz), anti-phospho-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-NF κ Bp65 (1 : 200; Santa Cruz), anti-cleaved caspase-3 (1 : 1000; Cell Signaling), anti-Smad4 (1:1000; Cell Signaling); anti-CREG (1:1000; R&D System, Minneapolis, MN, USA), anti- β -actin (1 : 1000; Santa Cruz).

Following three washes of 10 min in TBS-T, membranes were incubated for 1 h at room temperature with 1 : 5000 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat (for ApoE) or goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies diluted in TBS-T. After three washes of 10 min in TBS-T, signals were revealed with an enhanced chemiluminescence detection system (Luminata Crescendo; Millipore, Darmstadt, Germany) and the immunoreactivity of bands was visualized using ChemiDoc XRS+Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were scanned and quantified densitometrically. They were finally normalized using β-actin levels.

NPR-C and Egr-1 gene silencing

NPR-C and Egr-1 gene silencing was performed with specific siRNAs (Mission siRNA; Sigma) by following conditions previously described. 10, 11 Twenty-four hours after transfection, both silenced and not silenced cells were exposed to CC2238/ α ANP for 12 h and subsequently extracted for total RNA and total proteins. Efficiency of gene silencing was assessed by RT-PCR, following conditions described above.

Role of oxidative stress in the Egr-1 induced increase by CC2238/ α ANP

The known role of oxidative stress on Egr-1 stimulation 17 was verified by exposing VSMCs to CC2238/ α ANP both in the absence and in the presence of apocynin, following conditions previously described. 9 Egr-1 expression levels were therefore assessed by western blotting.

Sequencing of apoE gene expressed in HUVSMCs and CASMCs

Genomic DNA was isolated from both HUVSMCs and CASMCs using a commercially available kit (Qiagen, Chicago, IL, USA). In order to identify the three allelic forms of human ApoE gene (allele ɛ2, ɛ3, ɛ4) PCR reactions were set up by using a specific pair of primers: forward 5′-CTCCCACTGTGCGACACC-3′, reverse 5′-CTGCTCCTTCACCTCGTCC-3′. DNA was first amplified by PCR with 40 cycles at an annealing temperature of 55 °C using a T-100 Thermal Cycler (Bio-Rad). Following purification of the PCR product (562 bp) with MinElute PCR purification kit (Qiagen), sequence reactions were prepared using the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Unincorporated dye terminators from sequencing reactions were removed using DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen). Purified fragments were electrophoresed on an ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol. All sequencing results were compared with those present in the NCBI databases using BLAST to confirm the allelic variants.

Flow-cytometry analysis

Twenty-four hours after completion of exposure to CC2238/ α ANP and the specific recombinant ApoE isoform, counting of apoptotic cells was performed by FACS using Annexin V-Fitc and propidium iodide (PI) staining (ImmunoStep, Salamanca, Spain). For this purpose, cells were harvested by incubation with 1 ml of trypsin/EDTA (Lonza) for 3 min at 37 °C. Trypsinization was stopped by addition of medium and the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 5 min at 4 °C. Each pellet was washed with cold phosphate-buffered saline (PBS 1 × ). Then, tubes were vortexed thoroughly and centrifuged again as before. Cells were gently resuspended and vortexed in binding buffer at a concentration of 3 × 10 6 cells/ml. Then, 100 μ l of cell suspension was added to 5 μ l of Annexin V and 10 μ l of PI. Samples were mixed for 15 min in the dark at 4 °C and 400 μ l of PBS 1x was added to the solution. Ten thousand cells were analyzed by FACS on a BD Accuri C6 flow cytometer (Biosciences, Erembodegem-Dorp, Belgium) to count apoptotic cells. Both negative control (untreated cells) and positive control (cells treated with hydrogen peroxide) were included in the analysis.

analisi statistica

Continuous variables are expressed as mean±SD Comparisons between two groups were performed using Student's t- test. When the analysis was adjusted for the multiplicity of compared groups, one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test was performed. Normality of variables distribution was tested by the Kolmogorov–Smirnov test. GraphPad Software (San Diego, CA, USA; version 5.0) and SPSS statistical software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA; version 12.0) were used for statistical analysis. P <0, 05 è stato considerato significativo.

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Glossario

Akt

protein kinase B

ApoE

apolipoprotein E

ANP

atrial natriuretic peptide

TT2238/ α ANP

wild-type atrial natriuretic peptide at pos. 2238

CC2238/ α ANP

mutant atrial natriuretic peptide at pos. 2238

campo

monofosfato ciclico di adenosina

CREG

cellular repressor of E1A-stimulated gene

CREB

cAMP responsive element binding protein

DNAJA4

DnaJ (Hsp40) homolog

Egr-1

early growth response protein-1

eNOS

ossido nitrico endoteliale sintasi

EDTA

ethylenediaminetetracetic acid

FOXO4

forkhead box O4

FACS

analisi citometrica a flusso

JNK

chinasi N-terminale c-giu

miRNA

microRNA

NADPH

nicotinamide adenina dinucleotide fosfato-ossidasi

Nf- κB

nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells

NPR-C

type C natriuretic peptide receptor

NPR-A

type A natriuretic peptide receptor

PKA

protein chinasi A

ROS

specie reattive dell'ossigeno

RT-PCR

real time-polymerase chain reaction

Smad4

mothers against decapentaplegic Homolog 4

TGF

tumor growth factor

VSMC

cellula muscolare liscia vascolare

HUVSMC

human umbilical vein smooth muscle cell

CASMC

coronary artery smooth muscle cell

Informazioni supplementari accompagna questo documento sul sito Web di Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)