Un metodo di microarray di proteine ​​chemiluminescenti per determinare l'indice di fucosilazione sieroglicidica | rapporti scientifici

Un metodo di microarray di proteine ​​chemiluminescenti per determinare l'indice di fucosilazione sieroglicidica | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Tecniche biologiche
  • Cancro
  • Marker diagnostici

Astratto

La frazione reattiva all'agglutinina di Lens culinaris di AFP (AFP-L3) è ampiamente usata per lo screening del carcinoma epatocellulare (HCC) in Giappone e Cina. Abbiamo sviluppato un microarray di proteine ​​chemiluminescenti per determinare l'indice AFP-L3 / AFP (il rapporto tra AFP-L3 e AFP totale, AFP-L3%) fissando anticorpi specifici dell'AFP e lectina culinaria Lens su vetrini rivestiti di aldeide. I campioni di siero sono stati testati per l'AFP utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per convalidare il microarray. AFP-L3 è stato rilevato utilizzando la tecnologia di pretrattamento della colonna di spin con glicosil di Hotgen Biotech e ELISA. Quando il valore di cut-off AFP era impostato su 20 ng / ml, il microarray proteico mostrava una sensibilità dell'89, 74% e una specificità del 100% per la diagnosi di carcinoma epatocellulare, e l'ELISA mostrava una sensibilità dell'87, 17% e una specificità del 100%. Quando il valore di cut-off AFP-L3% era impostato su 0, 1, il microarray proteico mostrava una sensibilità del 56, 41% e una specificità del 100% per la diagnosi di HCC, mentre l'ELISA mostrava una sensibilità del 53, 84% e una specificità del 100%. La curva ROC per la diagnosi HCC ha mostrato che l'area AFP sotto la curva ROC (AUC = 0, 996; IC 95%: 0, 986–1, 005) era molto più alta di quella dell'AFP-L3 (AUC = 0, 857; IC 95%: 0, 769-0, 94 ) e AFP-L3% (AUC = 0, 827; IC: 0, 730-0, 924). Il saggio di microarray utilizzato in questo studio è un saggio altamente sensibile, accurato ed efficiente per la determinazione dell'AFP-L3%.

introduzione

L'alfa-fetoproteina (AFP) prodotta dal carcinoma epatico primario è diversa da quella generata da epatite, cirrosi epatica e altre malattie epatiche benigne rispetto alla catena dei carboidrati. Rispetto all'AFP generato da malattie epatiche benigne, l'AFP generato dal cancro epatico ha un indice di fucosilazione molto più elevato. Il glucosio ha la caratteristica di legarsi a Lens culinaris agglutinin (LCA), che è isolato dai semi di Lens culinaris (lenticchie). Ha due subunità e un peso molecolare di 46 kDa e forma un complesso con saccarosio. LCA è un componente utile nelle colonne per cromatografia di affinità per la separazione dei glicoconiugati. L'AFP può essere classificato in AFP-L1, AFP-L2 e AFP-L3 in base all'affinità dei residui di fucosio per LCA. AFP-L3 ha un'alta affinità di legame per la Lectina LCA. AFP-L1 è prodotto principalmente nelle malattie epatiche benigne, AFP-L2 è prodotto principalmente da donne in gravidanza e AFP-L3 è prodotto principalmente nel carcinoma epatocellulare (HCC) 1, 2, 3 . Nel 2005, la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti d'America (USA) ha approvato l'uso dell'AFP-L3 come marker tumorale per il carcinoma epatico primario. AFP-L3 ha un'elevata specificità e sensibilità per la diagnosi precoce, la diagnosi differenziale, la valutazione degli effetti terapeutici e il monitoraggio della prognosi 4, 5, 6 .

Il glucosio è un esosio metilato presente nelle catene di carboidrati di varie glicoproteine ​​nei tessuti e nel siero e viene chiamato fucosio legato alle proteine ​​(P-bf). Un residuo di fucosio è presente nella catena dei carboidrati dell'AFP. Questo eteroplasmon si chiama AFF fucosilato (FucAFP) e la sua percentuale della quantità totale di AFP è chiamata indice di fucosilazione (Fuol) 7, 8, 9 . Il Fuol ha un importante significato teorico e clinico e può essere usato come un indicatore importante nelle applicazioni diagnostiche e prognostiche del cancro epatico. AFP-L3 è un indicatore del comportamento biologico dell'HCC. I livelli di AFP-L3 sono correlati alla sopravvivenza e al trattamento del paziente. L'HCC positivo per AFP-L3 ha il potenziale per una rapida crescita e metastasi a distanza precoce. Livelli elevati di AFP-L3 sono considerati indicativi di fallimento del trattamento.

Il metodo convenzionale di separazione delle proteine ​​di fucosio nel siero prevede la tecnica di immunoelettroforesi per affinità incrociata 10, 11, blot di affinità 12, 13, cromatografia di affinità 14, 15, un test di immunoassorbimento enzimatico “dual-site sandwich” 16, un tester LiBASys (Chuo-ku Giappone), la tecnologia del sistema di rilevazione μTASWako ® i30 (Richmond, VA USA) e la tecnologia di pretrattamento con colonna di rotazione glicosilica Hotgen Biotech (Pechino, Cina). Di questi componenti, la tecnica di immunoelettroforesi per affinità da fitolectina e la tecnologia del sistema di rilevazione μTASWako ® i30 hanno requisiti sofisticati e utilizzano reagenti costosi, limitandone così la divulgazione e l'applicazione. Inoltre, la colonna di spin di cattura del glicosile rende le procedure più complicate perché il trattamento e la rilevazione del campione sono separati.

In questo studio, è stato sviluppato un metodo di microarray di proteine ​​per rilevare quantitativamente AFP e / o FucAFP in campioni biologici e affrontare la mancanza di tecnologia di rilevazione quantitativa per AFP e AFP-L3 nel siero. L'applicazione della tecnica del microarray di proteine ​​all'AFP non è nuova, ma la sua applicazione all'AFP-L3 è nuova. A nostra conoscenza, un metodo di microarray di proteine ​​per rilevare AFP-L3 non è stato riportato in precedenza. Questo metodo è applicabile sia per la rilevazione di antigeni AFP nel siero, sia per la rilevazione generale di altre proteine ​​fucosilate. Inoltre, ha il vantaggio di essere veloce, economico, preciso e conveniente.

Risultati e discussione

Tutti i campioni di siero, compresi quelli di soggetti con carcinoma epatocellulare e controlli sani, sono stati rilevati dal saggio di microarray di proteine ​​AFP-L3%. I livelli sierici di AFP e AFP-L3 erano marcatamente più alti nei pazienti con carcinoma epatocellulare che negli individui sani. L'attuale livello di rilevamento AFP adotta 20 ng / ml come limite 17, 18, con individui sani con valori AFP inferiori a 20 ng / ml. Un AFP-L3%> 10–15% è un indicatore positivo di HCC 17 .

Sono stati testati campioni di siero ottenuti da 39 donatori di sangue sani e 10 soluzioni di controllo in bianco per valutare la specificità di rilevamento del microarray proteico. I diagrammi di scansione di nove campioni di siero HCC e un campione di siero sano normale sono mostrati in Fig. 1. Né i livelli di AFP superiori a 20 ng / ml né l'AFP-L3% maggiore del 10% sono stati ottenuti dai campioni di siero sani, il che indica che il tasso di falsi positivi del microarray presentato qui era molto basso o addirittura zero. Livelli di AFP inferiori a 20 ng / ml ma superiori a 0 sono stati rilevati in 2 su 39 campioni sani e un AFP-L3% inferiore al 10% è stato rilevato in 1 su 39 campioni sani. Utilizzando il saggio ELISA, sono stati rilevati livelli di AFP inferiori a 20 ng / ml ma superiori a 0 in 3 su 39 campioni sani e un AFP-L3% inferiore al 10% è stato rilevato in 1 su 39 campioni sani. Né i livelli di AFP superiori a 20 ng / ml né un AFP-L3% superiore al 10% sono stati ottenuti dai campioni di siero sano da ELISA.

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Campioni di siero HCC, 1-9; campione di siero sano normale, 10.

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I risultati del microarray proteico hanno mostrato che l'AFP è stato rilevato in 37 su 39 campioni di HCC (94, 87%). Un livello di AFP superiore a 20 ng / ml è stato osservato in 35 su 39 campioni di HCC (89, 74%). Sia AFP che AFP-L3 sono stati rilevati in 26 su 39 campioni di HCC. Né AFP né AFP-L3 sono stati rilevati in 2 su 39 campioni di HCC. Un AFP-L3% maggiore del 10% è stato osservato in 22 campioni su 26 HCC (84, 61%), mentre un AFP-L3% inferiore al 10% è stato osservato in 4 su 26 campioni. Tutti i dati sono riassunti nella Tabella 1. Il saggio di microarray di proteine ​​ha mostrato una sensibilità dell'89, 74% e una specificità del 100% per il rilevamento di AFP e quindi può essere utilizzato in modo affidabile in applicazioni cliniche.

Tabella a grandezza naturale

Tutti i campioni sopra descritti sono stati inoltre testati utilizzando la tecnologia di pretrattamento con colonna di spin con glicosil di Hotgen Biotech e il saggio ELISA presso il laboratorio clinico dell'ospedale YouAn di Pechino. I dati precedenti con il pretrattamento della colonna di spin di captazione glicosilica Hotgen Biotech e ELISA sono stati confrontati con i risultati del microarray di proteine ​​del presente studio per valutare il test del microarray. AFP è stato rilevato in 37 su 39 campioni di HCC (94, 87%). Un livello di AFP superiore a 20 ng / ml è stato osservato in 34 su 39 campioni di HCC (87, 17%). Sia AFP che AFP-L3 sono stati rilevati in 26 su 39 campioni di HCC. Né AFP né AFP-L3 sono stati rilevati in 2 su 39 campioni di HCC. Un AFP-L3% maggiore del 10% è stato osservato in 21 campioni su 26 HCC (80, 76%), mentre un AFP-L3% inferiore al 10% è stato osservato in 5 su 26 campioni (Tabella 1). Non ci sono state differenze statisticamente significative tra i saggi ELISA e proteine ​​in entrambi i gruppi (P> 0, 05; χ2-test). C'era una differenza statisticamente significativa nelle misurazioni della proteina microarray e ELISA tra i pazienti con carcinoma epatico e controlli sani (P <0, 01). Quando il valore di cut-off AFP era impostato su 20 ng / ml, il microarray proteico mostrava l'89, 74% di sensibilità e il 100% di specificità per la diagnosi di HCC, mentre l'ELISA mostrava l'87, 17% di sensibilità e il 100% di specificità. Quando il valore di cut-off AFP-L3% era impostato su 0, 1, il microarray proteico mostrava una sensibilità del 56, 41% e una specificità del 100% per la diagnosi di HCC, mentre l'ELISA mostrava una sensibilità del 53, 84% e una specificità del 100%.

La curva ROC per la diagnosi di HCC è mostrata in Fig. 2. L'area sotto la curva ROC (AUC) indica l'utilità clinica di un marker tumorale. I nostri risultati hanno mostrato che l'area AFP sotto la curva ROC (AUC = 0, 996; IC al 95%: 0, 986–1, 005) era molto più alta di quella di AFP-L3 (AUC = 0, 857; IC al 95%: 0, 769-0, 94) e AFP-L3 % (AUC = 0, 827; IC: 0, 730-0, 924). I nostri dati hanno mostrato che i livelli elevati di AFP-L3 erano correlati positivamente con i livelli di AFP (r = 0.974, P = 0.000). Tuttavia, AFP-L3 non è correlato con le fasi del tumore, che possono essere dovute al numero limitato di pazienti (informazioni supplementari).

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L'area sotto la curva ROC (AUC) indica l'utilità clinica di un marker tumorale. I nostri risultati hanno mostrato che l'area AFP sotto la curva ROC (AUC = 0, 996; IC al 95%: 0, 986–1, 005) era molto più alta di quella di AFP-L3 (AU = 0, 857; IC al 95%: 0, 769-0, 94) e AFP-L3 % (AUC = 0, 827; IC: 0, 730-0, 924).

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Qui, presentiamo un chip proteico chemiluminescente per rilevare l'indice di fucosilazione serogliccoide. Il chip proteico chemiluminescente si basa sui principi di reazione sandwich anticorpo-antigene-anticorpo e chemiluminescenza 19, 20 . Gli anticorpi specifici AFP e i composti LCA sono stati fissati sulla superficie di vetrini rivestiti di aldeide. Gli anticorpi specifici AFP sono stati usati per legare tutti gli AFP (AFP-L1, AFP-L2 e AFP-L3) nel siero, mentre l'LCA è stato usato per legare FucAFP (AFP-L3) 21, 22 . Sono stati inclusi anche punti di controllo. Pertanto, la concentrazione totale di AFP e la concentrazione di FucAFP nel siero potrebbero essere rilevate simultaneamente in condizioni identiche; pertanto, l'indice di fucosilazione dei sieroglicidi potrebbe essere stimato con precisione. L'anticorpo anti-AFP (0, 5 mg / ml) e LCA (4 mg / ml) individuati sulle diapositive rivestite con aldeide erano specificamente legati all'antigene AFP e AFP-L3, rispettivamente. L'AFP è una proteina ben nota associata al tumore. Le misurazioni dei livelli sierici di AFP sono utili per rilevare l'HCC. Tuttavia, la correlazione tra i livelli sierici di AFP o AFP-L3 e il grado di positività istochimica AFP o AFP-L3 non è stata dimostrata 23 . La mancanza di segnale nei campioni di pazienti HCC (o sani) riflette le basse concentrazioni di AFP e AFP-L3. L'intervallo di riferimento per le proteine ​​sieriche totali è in genere 60–80 g / l. Le concentrazioni al di sotto dell'intervallo di riferimento di solito riflettono una bassa concentrazione di albumina, come nelle malattie del fegato o in un'infezione acuta. In questo studio, uno studio retrospettivo all'Ospedale Youan di Pechino è stato condotto su 43 pazienti con infezione da HBV, 79 pazienti con cirrosi e 189 pazienti con HCC (stadio 0, 48; stadio A, 47; stadio B, 46; e stadio C, 48). I livelli di AFP e i livelli sierici totali di proteine ​​nel sangue sono stati misurati nei 311 pazienti. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando SPSS versione 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) per Windows. I nostri risultati hanno mostrato che i livelli sierici di AFP erano negativamente correlati con i livelli di proteine ​​sieriche totali (r = −0, 113, P = 0, 046).

L'alfa-fetoproteina (AFP) è il componente principale del siero fetale dei mammiferi. È sintetizzato dall'endoderma viscerale del sacco vitellino e dal fegato fetale, ed è non rilevabile o rilevato solo in tracce negli adulti. AFP-L3 è un'isoforma di alfa-fetoproteina (AFP), una sostanza tipicamente utilizzata nel triplo test durante la gravidanza e per lo screening di pazienti con malattia epatica cronica per carcinoma epatocellulare (HCC). L'AFP è prodotto dalla maggior parte dei carcinomi epatocellulari ed è direttamente correlato alla gravità della malattia 24 . Oltre alla secrezione di AFP, il 90% delle cellule di carcinoma epatocellulare esprime telomerasi. È stato anche riferito che l'AFP può modulare i segnali apoptotici indotti da vari fattori citotossici promuovendo o inibendo l'apoptosi 25 . Uno studio recente ha dimostrato che l'AFP citoplasmatico può funzionare come regolatore della crescita cellulare interagendo con PTEN (fosfatasi e omologo tensinico eliminato sul cromosoma dieci) e stimolando la crescita cellulare attraverso la via di segnalazione PI3K / AKT 26 .

Nel primo trimestre di gravidanza, i livelli di AFP erano più alti nelle donne con l'anticorpo anti-HCV rispetto alle donne senza di essa 27 . PLAP, CD117, AFP e β-HCG sono marcatori immunoistochimici di routine per la diagnosi e la diagnosi differenziale dei tumori maligni delle cellule germinali 28, 29, 30 . I livelli di AFP sono talvolta aumentati nei pazienti con epatite virale cronica e cirrosi che non hanno HCC 31, 32, 33, 34 . I livelli di AFP e (o) AFP-L3 possono essere elevati in risposta alle suddette malattie. Pertanto, questo test può essere eseguito anche in donne in gravidanza con epatite acuta o fulminante, tumori a cellule germinali, infezioni virali e cirrosi.

La HRP è il catalizzatore più utilizzato nelle reazioni enzimatiche 35, 36 . È isolato dalle radici di rafano e contiene residui di fucosio. Se i campioni fossero etichettati con HRP, i residui di fucosio nell'HRP si legerebbero all'LCA, interferendo così con il test. Gli esperimenti condotti in questo studio hanno mostrato che un indice di fucosilazione accurato non può essere ottenuto in questo modo perché il tasso di falsi positivi è molto alto e valori di indice di fucosilazione molto alti possono essere ottenuti per siero normale. Tuttavia, il saggio di microarray di proteine ​​presentato in questo studio può essere utilizzato per il rilevamento qualitativo e può anche determinare quantitativamente i livelli di AFP e FucAFP in base all'intensità della chemiluminescenza. Il microarray di proteine ​​presentato qui fornisce anche un metodo per determinare quantitativamente i livelli di FucAFP. Con l'uso di un legame specifico tra anticorpi e antigeni e il legame specifico tra LCA e fucosio combinato con anticorpi policlonali AFP marcati con biotina, avidina marcata con HRP e un substrato chemiluminescente HRP, le concentrazioni di AFP e fucose AFP-L3 nel campione può essere ottenuto inserendo i valori di segnale acquisiti dallo scanner in un'equazione di regressione lineare prestabilita.

Sebbene ELISA possa essere combinato con la chemiluminescenza, il nostro saggio di microarray di proteine ​​presenta molti vantaggi rispetto al metodo ELISA. 1) I livelli sierici di AFP e FucAFP sono rilevati in condizioni simili per garantire che l'indice di fucosilazione rilevato sia accurato e affidabile. 2) È possibile analizzare contemporaneamente più campioni. Campioni duplicati o campioni prelevati in punti temporali diversi possono essere analizzati per ottenere valori dinamici, oppure è possibile analizzare campioni diversi, consentendo in tal modo un rilevamento ad alto rendimento. Di conseguenza, il costo del rilevamento può essere ridotto e l'efficienza del rilevamento può essere migliorata. 3) Le quantità di siero e anticorpi richiesti per il chip proteico qui descritto sono sostanzialmente inferiori a quelle richieste per altre tecniche: sono necessari solo 10 μl di siero originale (o diluito), mentre sono richiesti 50 μl di siero originale (o diluito) per il metodo ELISA. Per le applicazioni di anticorpi sui chip proteici, 5 ml di siero possono essere applicati ai campioni su almeno 20 chip proteici; pertanto, la quantità di anticorpo richiesta è sostanzialmente inferiore a quella del metodo ELISA quando vengono analizzati 200 campioni di siero e i costi e le spese di rilevazione possono essere notevolmente ridotti. 4) Il microarray proteico è stato eseguito in 1, 5–2 ore nel presente studio (escluso il tempo necessario per fabbricare il microarray), mentre il kit ELISA utilizzato in questo esperimento ha richiesto> 3, 5 ore. In conclusione, il metodo di rilevazione della chemiluminescenza, la curva standard e la tecnologia del chip proteico garantiscono alta sensibilità, accuratezza, efficienza e basso costo quando vengono utilizzati per l'analisi quantitativa dei livelli di AFP e AFP-L3. Il metodo di rilevazione riportato qui è un metodo fattibile, affidabile, economico, semplice e che fa risparmiare tempo.

Materiali e metodi

Raccolta di campioni di siero da pazienti e controlli sani

Un totale di 78 campioni di sangue intero da pazienti con HCC (n = 39) e controlli sani (n = 39) sono stati raccolti presso l'Ospedale YouAn di Pechino. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti prima della raccolta del campione. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale YouAn di Pechino. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale YouAn di Pechino, Pechino, Cina. Lo studio ha reclutato pazienti con carcinoma epatocellulare sottoposti a chirurgia di resezione epatica o chemioembolizzazione arteriosa transcatetere (TACE) e ablazione con radiofrequenza (RFA) presso il Dipartimento di Chirurgia epatobiliare, Beijing YouAn Hospital, Pechino, Cina. I pazienti dovevano essere positivi per l'antigene di superficie dell'epatite B sierica e privi di infezione da epatite C cronica. La diagnosi di HCC è stata istologicamente confermata dopo resezione chirurgica. Il sistema di stadiazione del Barcellona Clinic Liver Cancer (BCLC) è la linea guida di gestione dell'HCC più comunemente usata. Secondo il sistema di stadiazione BCLC, la stadiazione HCC include HCC molto precoce o stadio 0; HCC in fase iniziale; e fasi A, B, C e D (fase avanzata). Non tutti i pazienti HCC arruolati in questi studi sono stati classificati in base al sistema di stadiazione BCLC. Alcuni pazienti sono stati classificati come stadio 0, A, B o C secondo il sistema di stadiazione BCLC. I campioni di sangue sono stati centrifugati a 3.400 RPM / min per 10 minuti dopo la coagulazione e le aliquote sieriche sono state conservate a -70 ° C. Tutte le diagnosi di HCC sono state istologicamente confermate dopo resezione chirurgica. I volontari sani senza diagnosi di malattie gastrointestinali o epatobiliari o altri tipi di malattie sono stati reclutati dal reparto ambulatoriale e utilizzati come controlli.

Preparazione di reagenti e campioni

Sono stati utilizzati i seguenti reagenti: Mouse monoclonale [AFP-11] per alfa 1 Anticorpo fetoproteico (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Cina), Fetoproteina umana alfa 1 ricombinante (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Cina), LCA (Sigma), trucioli di vetro rivestiti con aldeide (Shanghai Baiao, Cina), anticorpo anti-AFP marcato con biotina (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Cina), perossidasi di streptavidina-rafano (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Cina), RapidStep ™ ECL (Merck KgaA, Darmstadt, Germania) e tampone salino tamponato con fosfato (PBS) contenente 0, 05% di Tween 20 (PBST). Lo scanner a chemiluminescenza utilizzato è stato sviluppato dal laboratorio del professor Wang Sheng-Qi dell'Accademia delle scienze mediche militari. L'anticorpo anti-AFP marcato con biotina è stato diluito 1: 100 in PBST, pH 7, 5. La streptavidina marcata con HRP è stata diluita 1: 100 in PBST. Il siero è stato diluito 1: 4 in PBST e 0, 5% BSA, pH 7, 5. Dopo lo scongelamento sul ghiaccio, tutti i campioni di siero e le soluzioni di reagente anticorpale sono stati conservati per non più di 7 giorni a 4 ° C, sebbene siano i migliori entro un giorno. In questo studio, il microarray di proteine ​​e i test ELISA sono stati eseguiti entro 24 ore. I campioni di siero potrebbero essere utilizzati per rilevare AFP e AFP-L3 dopo la conservazione a 4 ° C per 7 giorni. I risultati del microarray proteico usando siero conservato a 4 ° C per 7 giorni sono stati trascurati in modo trascurabile rispetto al siero conservato a 4 ° C per un giorno.

Una carta idrofobica contenente 10 fori è stata bloccata sulla superficie di un vetrino (chip) rivestito di aldeide per formare 10 griglie di reazione (vedere Fig. 3A). L'anticorpo anti-AFP (0, 5 mg / ml), LCA (4 mg / ml) e l'albumina sierica bovina al 10% (BSA) sono stati avvistati sui vetrini rivestiti con aldeide in quadruplicato con uno spot di microarray (Cartesian Technologies, USA) ( Fig. 3A). BSA è stato usato come controllo negativo. Dopo l'individuazione, i vetrini sono stati incubati per 24 ore a 4 ° C. Le diapositive sono state bloccate con 20 ml di tampone bloccante (siero di capra normale al 10% contenente NaN 3 allo 0, 1%) per 2 ore a 37 ° C e quindi lavate quattro volte con PBST. Dopo l'essiccazione, i chip di microarray sono stati conservati a 4 ° C fino al momento dell'uso.

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( A ) Lo schema dell'anticorpo AFP e le applicazioni LCA sul chip proteico. ( B ) Il diagramma di flusso del metodo sandwich anticorpale AFP / LCA con chip di microarray di proteine.

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Esecuzione dei microarrays proteici

Un campione di 2, 5 ml di siero o 10 ml di siero diluito 1: 4 è stato aggiunto a ciascuna griglia del microarray e incubato per 30 minuti a 37 ° C. La diluizione del siero può ridurre la capacità del test di rilevare AFP e / o AFP-L3. Quando la concentrazione sierica di AFP era di 1, 25 ng / ml, con questo dosaggio è stato possibile rilevare l'AFP nel siero originale. Dopo un'ulteriore diluizione, la concentrazione di AFP era troppo bassa (inferiore a 1, 25 ng / ml) per essere rilevata. Non è stato possibile rilevare l'antigene AFP nel siero diluito quando il livello di AFP nel siero originale era inferiore a 1, 25 ng / ml.

In questo studio, tutti i campioni di siero sono stati diluiti 1: 4 con PBST. Quando il livello di AFP nel siero originale era superiore a 5 ng / ml, l'antigene AFP poteva essere rilevato nel siero diluito (10 μl). Le proteine ​​AFP-L1, -L2 e -L3 nel siero erano specificamente legate agli anticorpi monoclonali anti-AFP del topo, mentre la proteina AFP-L3 nel siero era legata all'LCA (Fig. 3B). Non possiamo escludere la possibilità che AFP-L3 si leghi all'anticorpo monoclonale anti-AFP del mouse. I chip sono stati lavati quattro volte con PBST per eliminare il legame non specifico. Successivamente, è stato aggiunto l'anticorpo policlonale di coniglio anti-AFP marcato con biotina diluito con PBS e i chip sono stati incubati per 30 minuti a 37 ° C. I chip sono stati lavati quattro volte con PBST per eliminare il legame non specifico. Successivamente, è stata aggiunta streptavidina-HPR diluita con PBS e i chip sono stati incubati per 30 minuti a 37 ° C. I chip sono stati nuovamente lavati quattro volte con PBST per eliminare il legame non specifico. Successivamente, è stato aggiunto il substrato HRP chemiluminescente (RapidStep ™ ECL) e i chip sono stati incubati per 30 minuti a 37 ° C e quindi scansionati con uno scanner chemiluminescente sviluppato dal laboratorio del professor Wang Sheng-Qi. Questo test può essere riprodotto utilizzando uno scanner disponibile in commercio, ChemiDoc ™ MP System (Bio-Rad, California 94547 USA). Era uno strumento completo per l'imaging di microarray di proteine ​​progettato per applicazioni di rilevazione di chemiluminescenza. Le sue funzionalità si basano sulla tecnologia di rilevamento CCD ad alta risoluzione e alta sensibilità. Il sistema è controllato dal software Image Lab per ottimizzare le prestazioni per l'acquisizione e l'analisi rapide, integrate e automatizzate delle immagini di vari campioni. Il valore di pixel chemiluminescenti (valore OD) su un veicolo in fase solida correla positivamente con la quantità di antigene nel campione. L'anticorpo anti-chip (anticorpi monoclonali anti-AFP di topo) e l'anticorpo utilizzato per il rilevamento (anticorpo policlonale anti-AFP di coniglio marcato con biotina) provenivano da diverse specie di animali. La Figura 3B mostra un diagramma di flusso del metodo sandwich anticorpale con chip proteico.

Curve standard di AFP e AFP-L3

La curva standard di AFP è stata creata applicando diverse concentrazioni di antigene AFP (5, 10, 20, 40 e 80 ng / ml) sulla piastra di microarray rivestita con l'anticorpo anti-AFP, che è stato quindi incubato per 30 minuti a 37 ° C (Fig. 4A, B). L'anticorpo di cattura anti-AFP è stato applicato sui vetrini a diverse concentrazioni: a, 1 mg / ml; b, 0, 5 mg / ml; c, 0, 25 mg / ml; e d, 0, 125 mg / ml. AFP è stato rilevato come descritto sopra. L'anticorpo anti-AFP (0, 5 mg / ml) è stato usato per progettare la curva standard scegliendo la migliore concentrazione di anticorpo anti-AFP. Concentrazioni più basse di AFP non erano rilevabili quando ai vetrini venivano applicati 0, 25 mg / ml di anticorpo anti-AFP. Una concentrazione più elevata (1 mg / ml) di anticorpo anti-AFP non era adatta per progettare la curva standard poiché i valori dei pixel chemiluminescenti (valore OD) erano generalmente superiori al limite superiore dell'analisi dei pixel di questo chip.

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( A ) Livelli di antigene AFP rilevati dal microarray di proteine ​​AFP. Gli anticorpi AFP sono stati applicati ai vetrini a diverse concentrazioni: a, 1 mg / ml; b, 0, 5 mg / ml; c, 0, 25 mg / ml; e d, 0, 125 mg / ml. Sono state utilizzate diverse concentrazioni di antigene AFP: 1, 80 ng / ml, 2, 40 ng / ml, 3, 20 ng / ml, 4, 10 ng / ml e 5, 5 ng / ml. Sono stati inclusi anche sieri di pazienti affetti da carcinoma epatocellulare e controlli sani: 6, siero HCC; 7, siero HCC; 8, controllo vuoto; 9, siero sano; e 10, siero HCC. ( B ) Il diagramma delle curve standard e l'equazione di regressione per determinare i livelli di AFP usando il test di microarray di proteine ​​AFP.

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Il siero di una concentrazione nota di AFP-L3 è stato diluito in più proporzioni per stabilire una curva standard. Aliquote di dieci microlitri di siero contenenti diverse concentrazioni di antigeni AFP-L3 (12, 5, 25, 50, 100 e 200 ng / ml) sono state aggiunte al microarray, che è stato quindi incubato per 30 minuti a 37 ° C (Fig. 5A, B). AFP-L3 è stato rilevato come descritto sopra.

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( A ) Grafico di scansione delle sostanze standard AFP-L3 rilevate dai chip con rivestimento AFP / LCA. Anticorpi AFP e LCA sono stati applicati alle diapositive. a: anticorpo AFP, 0, 5 mg / ml; b: LCA, 4 mg / ml. Sono stati utilizzati campioni di siero con diverse concentrazioni di AFP-L3: (1–5) 100, 50, 25, 12, 5 e 6, 25 ng / ml; (6–9) 100, 50, 25 e 12, 5 ng / ml; (10) controllo del bianco. (B) Il diagramma delle curve standard e l'equazione di regressione di AFP-L3 determinati usando il dosaggio di microarray di proteine ​​AFP / LCA.

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I risultati sono stati usati per creare una curva standard con la concentrazione dell'antigene AFP sull'asse xe il valore OD sull'asse y. I valori di OD sull'asse y e la concentrazione corrispondente sull'asse x sono stati letti e moltiplicati per il rapporto di diluizione per ottenere le concentrazioni. In alternativa, la concentrazione del campione potrebbe essere calcolata determinando l'equazione di regressione lineare della curva standard usando le concentrazioni e i valori di OD dell'antigene AFP e quindi moltiplicando per il rapporto di diluizione (Fig. 5B).

ELISA

I livelli sierici di AFP sono stati quantificati utilizzando il kit ELISA umano alfa-fetoproteina (AFP) (Abcam ab108838) secondo le istruzioni del produttore. Innanzitutto, 50 microlitri dello standard o del campione di alfa-fetoproteina sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. I pozzetti sono stati coperti con nastro sigillante e incubati per due ore. Quindi, i pozzetti sono stati lavati manualmente cinque volte con 200 ml di tampone di lavaggio 1X. In secondo luogo, 50 ml di anticorpo alfa-fetoproteina biotinilato 1X sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per un'ora. La micropiastra è stata lavata come descritto sopra per il microarray di proteine. In terzo luogo, 50 μl di coniugato SP 1X sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per 30 minuti. La micropiastra è stata lavata come descritto sopra per il microarray di proteine. In quarto luogo, 50 microlitri di substrato cromogeno sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per 10 minuti o fino a ottenere la densità di colore blu ottimale. Infine, 50 microlitri di soluzione di arresto sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Il colore è passato dal blu al giallo. L'assorbanza è stata immediatamente determinata su un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 450 nm. L'ELISA potrebbe essere combinato con la chemiluminescenza.

analisi statistiche

Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando SPSS versione 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) per Windows. I risultati sono stati confrontati usando il test Pear2 di Pearson. Un valore P <0, 05 è stato considerato statisticamente significativo. L'analisi delle caratteristiche di funzionamento del ricevitore (ROC) è stata eseguita per determinare le prestazioni diagnostiche del microarray di proteine. I dati sono stati presentati come media ± DS (coefficiente di variazione) o mediana (intervallo di confidenza al 95% [CI]).

Informazioni aggiuntive

Come citare questo articolo : Zhang, A. et al . Un metodo di microarray di proteine ​​chemiluminescenti per determinare l'indice di glucosilazione seroglicosidica. Sci. Rep. 6, 31132; doi: 10.1038 / srep31132 (2016).

Informazione supplementare

Documenti Word

  1. 1.

    Set di dati supplementari 1

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