Microduplicazioni de novo a 1q41, 2q37.3 e 8q24.3 in pazienti con associazione vater / vacterl | rivista europea di genetica umana

Microduplicazioni de novo a 1q41, 2q37.3 e 8q24.3 in pazienti con associazione vater / vacterl | rivista europea di genetica umana

Anonim

Soggetti

  • Genetica delle malattie
  • Duplicazione genica

Astratto

L'associazione acronimo VATER / VACTERL descrive la combinazione di almeno tre delle seguenti anomalie congenite: difetti vertebrali (V), malformazioni anorettali (A), difetti cardiaci (C), fistola tracheoesofagea con o senza atresia esofagea (TE), malformazioni renali (R) e difetti degli arti (L). Abbiamo cercato di identificare variazioni de novo di copie (CNV) altamente penetranti che contribuiscono all'associazione VATER / VACTERL. Il cariotipo molecolare basato su array è stato eseguito in una coorte di 41 pazienti con associazione VATER / VACTERL e 6 pazienti con fenotipo simile a VATER / VACTERL, inclusi tutti i genitori dei pazienti. Sono stati identificati tre CNV de novo che coinvolgono rispettivamente regioni cromosomiche 1q41, 2q37.3 e 8q24.3 comprendenti uno ( SPATA17 ), due ( CAPN10, GPR35 ) e tre ( EPPK1 , PLEC , PARP10 ). Dati preesistenti della letteratura ci hanno spinto a scegliere GPR35 ed EPPK1 per gli studi sull'espressione del mouse. Sulla base di questi studi, abbiamo dato la priorità a GPR35 per l'analisi del sequenziamento in una coorte estesa di 192 pazienti con associazione VATER / VACTERL e fenotipo simile a VATER / VACTERL. Sebbene non sia stata identificata alcuna mutazione patogena, i nostri studi sull'espressione del topo suggeriscono che GPR35 sia coinvolto nello sviluppo del fenotipo VATER / VACTERL. È garantito il follow-up di GPR35 e degli altri geni che comprendono le duplicazioni identificate.

introduzione

L'associazione VATER / VACTERL (OMIM # 192350) si riferisce alla rara ricorrenza non casuale delle seguenti caratteristiche dei componenti (CF): difetti vertebrali (V), malformazioni anorettali (A), difetti cardiaci (C), fistola tracheoesofagea con o senza atresia esofagea (TE), malformazioni renali (R) e difetti degli arti (L). 1 Studi epidemiologici basati sulla popolazione hanno riportato una prevalenza tra i neonati di 1 su 10.000 a 1 su 40.000 con prevalenza maschile. 2, 3, 4 Poiché questo complesso di malformazione multisistemica è stato associato a una riproduzione ridotta, è ragionevole supporre che una percentuale significativa di casi sia causata da mutazioni de novo . In conformità a ciò, studi precedenti hanno identificato diverse microaberrazioni cromosomiche de novo , che probabilmente causano malattie. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Tuttavia, nessuna di queste microaberrazioni cromosomiche de novo ha portato all'identificazione di un gene patogeno e l'eziologia nella maggior parte dei casi è ancora sconosciuto.

Utilizzando un approccio genome-wide basato su array SNP, abbiamo sistematicamente selezionato 41 pazienti con associazione VATER / VACTERL e 6 pazienti con un fenotipo simile a VATER / VACTERL, inclusi tutti i genitori dei pazienti, al fine di identificare la copia causale de novo variazioni numeriche (CNV). Dati preesistenti dalla letteratura sono stati usati per scegliere i geni candidati all'interno dei CNV identificati per l'ibridazione in situ (ISH) su sezioni di embrioni di topo in giorni embrionali (E) 12, 5-14, 5. Sulla base dell'ISH, ai geni candidati è stata data priorità per l'analisi del sequenziamento in una coorte estesa di 192 pazienti con associazione VATER / VACTERL e fenotipo simile a VATER / VACTERL al fine di identificare ulteriori mutazioni che causano malattie.

Materiali e metodi

Soggetti e isolamento del DNA

Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale e tutte le famiglie hanno fornito consenso informato scritto. Le famiglie sono state contattate attraverso l'organizzazione tedesca di auto-aiuto per i pazienti con malformazioni anorettali (SoMA eV) e vari dipartimenti chirurgici pediatrici in tutta la Germania. Tra i pazienti c'era un feto femmina abortito, arruolato attraverso il Dipartimento di Paidopatologia, Università di Bonn. Tutti i pazienti e le loro famiglie sono stati reclutati personalmente da uno dei quattro medici esperti a partire dal 2009. Nessuno dei pazienti utilizzati per l'analisi basata su array è stato riportato nei nostri studi precedenti. 15, 16 Per ottimizzare il rilevamento di CNV de novo , abbiamo incluso solo pazienti con anamnesi familiare negativa della malattia. Quarantuno pazienti presentavano tre o più CF dell'associazione VATER / VACTERL, mentre sei pazienti presentavano solo due, con o senza ulteriori anomalie (fenotipo simile a VATER / VACTERL). 1 Per l'analisi del sequenziamento delle mutazioni, altri 59 pazienti con associazione VATER / VACTERL e 60 pazienti con fenotipo simile a VATER / -VACTERL reclutati in Germania sono stati aggiunti al campione di pazienti, di cui 18 pazienti erano stati precedentemente descritti in Schramm et al. 15, 16 Altri 26 pazienti con associazione VATER / VACTERL sono stati reclutati nell'ambito del progetto AGORA e sono stati aggiunti al campione per l'analisi del sequenziamento delle mutazioni. Il progetto AGORA si svolge nei Paesi Bassi e i pazienti vengono reclutati da chirurghi pediatrici e genetisti clinici dell'Università Radboud, Nijmegen Medical Center, Nijmegen, Paesi Bassi. Il campione completo per l'analisi del sequenziamento delle mutazioni comprendeva 192 pazienti ( n = 132 pazienti con associazione VATER / VACTERL; n = 60 pazienti con fenotipo simile a VATER / -VACTERL). Poiché tutti i pazienti reclutati in Germania e nei Paesi Bassi facevano parte di progetti di ricerca sulla genetica delle malformazioni anorettali, tutti i pazienti presentavano malformazioni anorettali. Il sangue o la saliva sono stati prelevati dal paziente e da entrambi i genitori per l'isolamento del DNA del DNA genomico, effettuato utilizzando il modulo di separazione magnetica Chemagic I (Chemagen, Baesweiler, Germania) o, in caso di campioni di saliva, il kit del DNA Oragene (DNA Genotek Inc., Kanata, ON, Canada).

Analisi di ibridazione genomica di array

Per il cariotipo molecolare, abbiamo usato Illumina HumanOmni1-Quad-v1 BeadChip (contenuto del marker, 1 140 419; distanza del marker mediana 1, 5 kb) (San Diego, CA, USA). Un campione di DNA è stato considerato fallito se meno del 98% dei marcatori è stato generato sul rispettivo BeadChip.

Test di paternità

Il test di paternità è stato eseguito utilizzando il modulo di genotipizzazione GenomeStudio (v2010.3, www.illumina.com/) in conformità con le raccomandazioni del produttore.

Analisi CNV

Per identificare potenziali CNV, i dati di intensità di fluorescenza SNP di tutti i pazienti e i loro genitori sono stati analizzati con QuantiSNP (v2.1 e v2.2, www.well.ox.ac.uk/QuantiSNP/) utilizzando un modello di Bayes Hidden-Markov oggettivo per chiamare putativi CNV. 17 CNV con un fattore di Bayes inferiore a 7 sono stati scartati. 18 I risultati sono stati inoltre controllati visivamente utilizzando il modulo di genotipizzazione GenomeStudio (v2010.3, www.illumina.com/) per la qualità del marker e del segnale e il verificarsi di aberrazioni del mosaico. Il software Cartagenia Bench (Cartagenia nv, Leuven, Belgio) è stato utilizzato per filtrare i CNV rilevati per eventi de novo , regioni variabili nella nostra coorte di controllo di 531 controlli non affetti e contenuto genico. Le restanti aberrazioni sono state verificate per il contenuto genico in base alla build 18 del browser del genoma umano UCSC e per la loro presenza nei database DGV (//dgvbeta.tcag.ca/dgv/app/home?ref=NCBI36/hg18) e DECIPHER ( //decipher.sanger.ac.uk/). I CNV identificati come esistenti in una di queste basi di dati, con almeno 10 rapporti sovrapposti completi in DGV e almeno cinque rapporti sovrapposti completi in DECIPHER, sono stati esclusi. Tuttavia, non abbiamo escluso i CNV sebbene fossero completamente sovrapposti da almeno cinque rapporti in DECIPHER, se uno dei fenotipi associati comprendeva una delle caratteristiche componenti classiche dell'associazione VATER / VACTERL: ad es. Atresia esofagea (TE), malformazione anorettale ( A), difetti cardiaci (C).

PCR quantitativa

Per la verifica dei CNV filtrati, qPCR è stato eseguito come descritto in precedenza utilizzando SYBR Green per il rilevamento. T, ca. 1736 A> G) in una famiglia di sindrome di Lowe. Hum Genet 2011; 129: 513–519. "Href = / articles / ejhg201358 # ref19 aria-label =" Riferimento 19 "data-track = click data-track-label = link> 19 Tutte le sequenze di primer sono elencate nella Tabella Supplementare 2.

Ibridazione in situ di sezioni di embrioni di topo

Per dare la priorità ai geni candidati all'interno dei CNV rimanenti per ulteriori analisi delle mutazioni in coorti di pazienti più grandi, ISH su sezioni di embrioni di topo in E12, 5-14, 5, il periodo temporale embrionale cruciale per i tessuti rilevanti dell'associazione VATER / VACTERL, è stato eseguito come precedentemente descritto. 20 sonde antisenso sono state generate dalla PCR da una libreria di cDNA totale da E10.5 in cui i prodotti PCR contenevano un sito di legame alla RNA polimerasi 3 ′ T7 per la trascrizione in vitro . Le sonde sono state purificate utilizzando colonne G-50 Sephadex (GE Healthcare, Monaco, Germania). La sonda da 903 bp per Gpr35 (a partire da 13 bp a valle del sito iniziale ATG) si estende su quasi l'intera regione di codifica da 924 bp e riconosce entrambe le varianti di mRNA conosciute. Eppk1 è codificato da un singolo esone di grandi dimensioni (> 20 kb) costituito da 16 domini ripetitivi plakin, che sono il segno distintivo di tutti i membri della famiglia plakin. 21 Pertanto, l'esclusiva sonda da 647 bp per Eppk1 si estende su 3′UTR. Il rilevamento dell'attività della fosfatasi alcalina è stato visualizzato utilizzando BM Purple (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Dopo la colorazione, i vetrini sono stati rapidamente disidratati nell'80% e poi nel 100% di etanolo, eliminati due volte per 1 minuto in xilene (Roth, Karlsruhe, Germania) e i vetrini sono stati montati con mezzo di montaggio Entellan (Merck, Darmstadt, Germania). Le fotografie sono state ottenute utilizzando il software AxioVision (Zeiss, Göttingen, Germania) con un microscopio Zeiss AxioCam e SteREO DiscoveryV12. Sono state analizzate tre sezioni di almeno due diversi embrioni per ciascuna fase mostrata e vengono fornite immagini rappresentative.

Analisi della sequenza

L'analisi degli esoni che codificano le proteine ​​5 e 6 del gene GPR35 umano è stata eseguita utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) e i prodotti del DNA amplificati con PCR sono stati sottoposti a sequenziamento automatizzato diretto (analizzatore genetico 3130XL, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) secondo le specifiche del produttore. Entrambi i filoni di ciascun amplicone sono stati sequenziati. Tutte le sequenze di primer sono disponibili su richiesta.

risultati

Analisi di array

Il cariotipo molecolare ha identificato cinque possibili aberrazioni de novo con contenuto genico in cinque dei 47 pazienti. Tre di questi sono stati confermati de novo da qPCR (Tabella 1, Tabelle supplementari 1 e 2 e Figura supplementare), mentre gli altri sono stati trovati ereditati da un genitore (vedere Tabelle supplementari 1 e 2). Nei tre casi confermati, non c'erano altre caratteristiche dismorfiche, anomalie congenite (comprese anomalie cerebrali strutturali o evidenza di danno neurologico) o altri problemi medici ad eccezione di quelli indicati di seguito.

Tabella a grandezza naturale

Il caso 1 è un paziente maschio con vertebra di farfalla (V), atresia anale senza fistola (A), difetti del setto atriale e ventricolare (C), atresia esofagea IIIb (secondo Vogt) 22 (TE), reni distopici bilaterali e sinistra- displasia renale bilaterale (R). Una microduplicazione de novo è stata trovata a 1q41 (Tabella 1) con una dimensione stimata di 132 kb, comprendente esoni 6-9 di SPATA17 , codificanti per la proteina 17 associata alla spermatogenesi.

Il caso 2 è un feto femmina abortito. La gravidanza è stata interrotta a 30 + 1 settimane di gestazione a causa della displasia renale bilaterale grave ecograficamente provata. I reperti macroscopici e istologici ottenuti all'autopsia hanno rivelato una malformazione cloacale con atresia anale (A), displasia renale bilaterale (R), agenesia uretrale, torace secondario a campana e facies con sequenza di Potter dovute all'anidrramion (Figura 1). Una microduplicazione de novo è stata trovata a 2q37.3 (Tabella 1) con una dimensione stimata di 25 kb, comprendente esoni 3-4 di una variante di giunzione di Calpain-10 ( CAPN10 ) ed esoni 3-6 di GPR35 , codificando il G- recettore accoppiato alle proteine ​​35.

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Atresia anale e malformazioni genitali del caso 2, un feto femminile che presenta anche una malformazione cloacale con atresia anale (A), displasia renale bilaterale (R), agenesia uretrale, torace a forma di campana secondaria e facies a sequenza di Potter dovute ad anidramnion .

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Il caso 3 è un paziente maschio con vertebra di farfalla (V), atresia anale con fistola rettovesicale (A), stenosi aortica subvalvolare congenita e difetto del setto ventricolare (C), atresia esofagea IIIb (secondo Vogt) 22 (TE), alta reflusso vescico-ureterale bilaterale (III ° e IV °) (R) e criptorchidismo bilaterale. Una microduplicazione de novo è stata trovata a 8q24.3 (Tabella 1) con una dimensione stimata di 120 kb. Questa regione comprende parti dell'esone 1 del gene epiplakin ( EPPK1 ), il gene completo della plectina-1 ( PLEC-1 ) e gli esoni 4-11 del gene codificante per poli (ADP-ribosio) polimerasi 10 ( PARP10 ).

I CNV trovati nella DGV con sovrapposizione parziale delle tre regioni di interesse duplicate (1q41, 2q37.3, 8q24.3) sono elencati nella Tabella supplementare 3. In DECIPHER, non sono stati trovati CNV parzialmente ma solo completamente sovrapposti. È interessante notare che la regione duplicata 8q24.3 trovata nel caso 3 contiene CNV parzialmente sovrapposti più frequentemente rispetto alle altre duplicazioni, molto probabilmente a causa degli elementi di ripetizione adiacenti associati ai confini di questa regione.

Definizione delle priorità dei geni e analisi ISH

È stata eseguita una ricerca nel database sui dati di espressione e cancellazioni mirate nei topi per i geni Spata17 , Capn10 , Gpr35 , Eppk1 , Plec1 e Parp10 utilizzando il database Mouse Genome Informatics (MGI) per restringere l'elenco dei geni candidati. Le voci forniscono dati di espressione del progetto Eurexpress 23 liberamente disponibili dal database di Jackson Laboratory Mouse Genome Informatics (//www.informatics.jax.org/). Poiché l'espressione di Spata17 , che codifica per una proteina correlata all'apoptosi delle cellule spermatogeniche, è limitata al testicolo in diverse specie, 24, 25 non gli è stata data priorità per il follow-up. L'espressione del codice Capn10 per un membro della famiglia delle proteasi della cisteina simile al calpain è moderata e onnipresente a E14.5. La delezione mirata di Capn10 ha portato a topi vitali che mostravano adiposità aumentata e difetti metabolici 26 nello stato omozigote. Quindi, non è stata data la massima priorità. La plectina-1 collega i filamenti intermedi con microtubuli e microfilamenti e i dati di espressione dell'MGI su Plec1 durante lo sviluppo erano limitati alla retina dopo E14.0, ma probabilmente saranno anche altrove, considerando gli embrioni knockout omozigoti che mostrano morte neonatale con vesciche cutanee e difetti in tegumento. 27 Mutazioni nel PLEC1 nell'uomo sono state associate allo spettro fenotipico dell'epidermolisi bollosa. 28 Non sono stati trovati dati di espressione per Parp10 , ma questo gene condivide alcuni esoni comuni con Plec1 . 29 Nei loro studi sulla cancellazione mirata di Plec1 , Fuchs et al , 29 come conseguenza della condivisione dell'esone tra Plec1 e Parp10 , generano una linea del mouse P1c - / - che rappresenta in realtà un doppio knockout ( P1c - / - / Parp10 - / -). Sebbene si sia scoperto che questa delezione omozigote mirata influenza il sistema nervoso e la velocità di conduzione del nervo motore del modello di topo studiato, si può escludere che ciò fosse dovuto alla delezione mirata di Parp10 , come il condizionale nes-Cre / plecf / Δ il modello del topo (in cui la plectina è stata eliminata, lasciando inalterato il Parp10 ) ha mostrato fenotipi comparabili. 29 A causa dei dati di espressione del topo in MGI e della mancanza di malformazioni congenite in entrambi i modelli knockout murino omozigoti di Plec1 e Parp10, entrambi i geni non hanno avuto la massima priorità per il follow-up.

I candidati più promettenti dai dati di espressione di MGI sono stati trovati per essere Gpr35 ed Eppk1 . GPR35 è un membro della superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine ​​G di proteine ​​transmembrane coinvolte in una varietà di percorsi fisiologici. Precedenti studi hanno mostrato espressione di GPR35 nei tessuti del tratto gastrointestinale, del sistema nervoso e dei tessuti linfoidi. È stato riferito che l'acido cinurenico potrebbe essere un ligando endogeno per GPR35, 30 ma dati più recenti hanno suggerito che l'acido lisofosfatidico (in particolare 2-oleoil LPA) potrebbe essere un candidato più probabile. 31 Come Oka et al. 31 hanno suggerito che la segnalazione di RhoA potrebbe essere attivata a valle di GPR35 ( in vitro ) e RhoA è coinvolto nella via della polarità cellulare planare non canonica (PCP), si è tentati di ipotizzare che un ruolo di GPR35 potrebbe essere cellulare motilità / polarità durante lo sviluppo embrionale. Secondo la MGI, l' espressione di Gpr35 è stata rilevata a E14.5 all'interno dello stomaco, degli arti posteriori, del retto, dell'intestino medio, della regione del fondo vescicale e dell'uretra. Eppk1 è stato espresso a E14.5 nei tessuti del canale epidermico, polmonare e alimentare, inclusi stomaco, esofago e intestino. Tuttavia, la completa eliminazione di Eppk1 provoca un normale sviluppo embrionale, 32 mentre attualmente non esiste un modello per la cancellazione mirata di Gpr35 nei topi. Secondo questi dati preesistenti, abbiamo deciso di convalidare gli studi di espressione su Gpr35 ed Eppk1 tra E12, 5-14, 5, che è l'equivalente delle settimane gestazionali umane 6–8, 33 che comprende le fasi rilevanti di sviluppo nei topi per i sistemi di organi coinvolto nell'eziologia di VATER / VACTERL.

L'espressione di Eppk1 a E12.5 è stata trovata nel fegato, nell'epitelio orale, nei passaggi nasali, nel cervello e nel tubo neurale. A E14.5, è stato anche trovato nei boccioli dei denti in via di sviluppo e nell'epitelio esofageo (Figura 2). Espressione di Gpr35 a E12.5 è stata trovata nei mesonefri, nel cuore, nell'esofago e nella trachea, nei gangli della radice dorsale, nel tubercolo genitale e nella regione rettale, e un pattern di espressione simile è stato rilevato in E14.5 (Figura 2) . Questa espressione non solo rifletteva i sistemi di organi interessati del paziente / feto che esibivano il GPR35 comprendente la duplicazione, ma mostrava anche espressione nei tessuti rilevanti per l'associazione VATER / VACTERL in generale. Sebbene il tubercolo genitale e i gangli della radice dorsale non appartengano principalmente ai tessuti riflessi dai CF dell'associazione VATER / VACTERL, li segnaliamo perché una percentuale significativa di pazienti presenta anomalie / difetti genitali derivanti dal tubercolo genitale. 3 I neuroni dei gangli della radice dorsale sono strettamente associati allo sviluppo vertebrale e sono derivati ​​dalle cellule della cresta neurale, che sono coinvolte nella formazione di tessuti tra cui il tratto di deflusso cardiaco e il sistema nervoso enterico dell'intestino, suggerendo un ruolo in VATER / Associazione VACTERL.

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Espressione del mouse embrionale di Eppk1 e Gpr35 . ( a ) L' espressione di Eppk1 a E12.5 è rilevabile nel cervello anteriore (fb), nel mesencefalo (mb), nell'orecchio interno (cioè), nel fegato (li), nel passaggio nasale (np), nel tubercolo genitale (gt), nei gangli della radice dorsale ( drg) e midollo spinale (sc). ( b ) L' espressione di Eppk1 a E14.5 è rilevabile nel fegato, nella tasca di Rathke (Rp), nell'esofago (e), nel corpus striatum mediale (csm), nel tubercolo genitale, nel bocciolo del dente (tb), nel midollo spinale e nei passaggi nasali. ( c ) Espressione Gpr35 in E12.5. Le trascrizioni sono evidenti nel fegato, nel ganglio trigemino (trg), nel ganglio vestibolocochlear (vcg), nel ventricolo cardiaco (h), nello stomaco (st), nei mesonephros (me), nel tubercolo genitale, nei gangli della radice dorsale e attorno alla fessura mascillo-mandibolare ( mmc). ( d ) L' espressione di Gpr35 a E14.5 è rilevabile nel fegato, corpus striatum mediale, ipotalamo (ht), gemma dentale, polmone (lu), tubercolo genitale e retto.

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Analisi del gene candidato

Abbiamo ulteriormente dato la priorità a Gpr35 rispetto a Eppk1 sia per la sua espressione che per le informazioni disponibili in letteratura, e abbiamo effettuato un'analisi di mutazione di GPR35 in 192 pazienti simili a VATER / VACTERL / VACTERL. Il sequenziamento di pericolo dei due esoni codificanti proteine ​​(esone 5 e 6) di GPR35 in questi 192 pazienti (incluso il caso 2) non ha identificato alcuna variante di sequenza di probabile significato patologico. Anche le varianti di sequenza eterozigoti con una frequenza di allele minore inferiore all'1% (rs139197368, rs35146537, rs201441371) sono state verificate per il loro stato de novo . Sono stati trovati ereditati da un genitore, ad eccezione di una variante di sequenza, in cui il DNA del padre non era disponibile per il test. La previsione di patogenicità con quattro algoritmi (PolyPhen-2, SNPs & Go, MutPred, SIFT) ha predetto che nessuno dei tre SNP all'unanimità era causa di malattia. È stato previsto che due di queste varianti sono benigne in tutti e quattro gli algoritmi di predizione applicati. SNP rs201441371 che porta a una sostituzione p.Val237Met è stata classificata come possibilmente causa di malattia in due e benigna negli altri due algoritmi di previsione della patogenicità. Pertanto, la penetranza incompleta non può essere esclusa per questa variante e dovrebbe giustificare studi funzionali.

Discussione

Sebbene siano stati pubblicati solo pochi studi di grandi dimensioni, esistono diverse linee di prova che i CNV de novo sono associati all'espressione di difetti strutturali alla nascita. 34 A seconda del difetto di nascita indagato, i CNV de novo sono stati ritenuti causali fino al 20% dei casi. 35 Nel nostro studio su pazienti con associazione VATER / VACTERL e fenotipo simile a VATER / VACTERL, abbiamo identificato tre (6%) probabili CNV de novo causativi a 1q41, 2q37.3 e 8q24.3. Questi CNV contenevano tra uno e tre geni, inclusi GPR35 ed EPPK1 , che sono noti, secondo i dati di espressione dell'IGM, per partecipare allo sviluppo di tessuti rilevanti per il fenotipo simile a VATER / VACTERL (Tabella 1). Per l'analisi delle mutazioni del gene candidato, abbiamo dato priorità al GPR35 in base alla sua espressione nei topi nella regione rettale, nel tubercolo genitale e nei mesonefri, mostrando una chiara sovrapposizione con i tessuti malformati nel paziente portatore di duplicazione (caso 2) (Figure 1 e 2). L'analisi della sequenza degli esoni codificanti le proteine ​​non ha identificato alcuna mutazione patogena. È quindi improbabile che le mutazioni che colpiscono il gene GPR35 siano una causa frequente dell'associazione VATER / VACTERL; tuttavia, la nostra coorte di pazienti potrebbe essere stata troppo piccola per rilevare eventi mutazionali causali rari. Inoltre, potremmo aver perso le mutazioni non analizzando gli esoni non codificanti proteine ​​o la regione del promotore. Tuttavia, secondo i nostri dati di espressione del mouse che riflettono sia i sistemi di organi interessati del paziente / feto che esibiscono la GPR35 che comprende la duplicazione sia i tessuti rilevanti per l'associazione VATER / VACTERL, GPR35 sembra essere un gene candidato promettente che merita un ulteriore follow-up negli studi genetici e funzionali. Tuttavia, poiché non possiamo escludere EPPK1 , SPATA17 , CAPN10, PLEC1 o PARP10 come geni candidati, è garantito anche il follow-up di questi geni.

Il nostro studio non ha studiato se le microduplicazioni identificate alterano l'espressione dei geni coinvolti o portano a prodotti genici alterati. Ciò richiederà ulteriori studi. In particolare, nel caso di un effetto negativo sulla funzione genica, rimane anche la possibilità che le anomalie riscontrate nei pazienti siano il risultato di mutazioni autosomiche recessive, con un allele alterato dall'evento de novo e il secondo allele alterato da un cambiamento ereditato. Non abbiamo investigato esaurientemente questa possibilità. Tuttavia, la mancanza di una mutazione in GPR35 nel caso 2 e la mancanza di mutazioni GPR35 nel campione esteso dei pazienti rendono improbabile questa possibilità per GPR35 . Non possiamo anche escludere la possibilità che l'espressione di un gene residente in una regione che fiancheggia una microduplicazione possa essere influenzata da un effetto di posizione. Tuttavia, uno screening accurato delle regioni fiancheggianti non è riuscito a rilevare evidenti geni candidati. Infine, rimane possibile che esistessero CNV associati alla malattia tra i molti CNV ereditati e che la piena penetranza possa essere esercitata solo dall'interazione con un insulto ambientale, come è stato recentemente dimostrato per l'ipossia e la segnalazione di fattore di crescita dei fibroblasti nell'eziologia del congenito scoliosi. 36

In sintesi, un'analisi a livello del genoma in pazienti con associazione VATER / VACTERL o fenotipo simile a VATER / VACTERL ha identificato tre CNV potenzialmente patogeni che colpiscono i geni coinvolti nello sviluppo dei tessuti rilevanti per il fenotipo. Sebbene lo screening delle mutazioni del gene candidato più promettente, GPR35 , non lo abbia confermato come causa frequente del disturbo, sono state acquisite nuove intuizioni e i loci di variante identificati giustificano un'ulteriore valutazione.

Informazione supplementare

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    Figura supplementare

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    Tabella supplementare 1

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    Tabella Supplementare 2

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    Tabella Supplementare 3

    Informazioni supplementari accompagnano questo documento sul sito Web dell'European Journal of Human Genetics (//www.nature.com/ejhg)