Death inducer-obliterator 1 (dido1) è un gene bersaglio del bmp e promuove la progressione del melanoma indotto dal bmp | oncogene

Death inducer-obliterator 1 (dido1) è un gene bersaglio del bmp e promuove la progressione del melanoma indotto dal bmp | oncogene

Anonim

Soggetti

  • Invasione cellulare
  • Migrazione cellulare
  • Melanoma

Astratto

È noto che le proteine ​​morfogenetiche ossee (BMP) svolgono un ruolo importante nello sviluppo e nella progressione del melanoma. Tuttavia, finora gli obiettivi a valle dei BMP non sono stati studiati. Pertanto, abbiamo trattato le linee cellulari di melanoma con l'inibitore BMP specifico di Smad Dorsomorphin ed eseguito un microarray di cDNA. Abbiamo identificato l' induttore-obliteratore di morte 1 ( Dido1 ) come un gene bersaglio regolato da Smad specifico per BMP, che è stato confermato da qRT-PCR, colorazione di immunofluorescenza e esperimenti di sbalzo di mobilità elettroforetica. Un'analisi dell'espressione di Dido1 ha rivelato una sovraregolazione dei livelli di Dido1 nelle linee e nei tessuti delle cellule di melanoma rispetto ai melanociti normali. I test di formazione delle colonie hanno mostrato che le cellule trasfettate da siDido1 formavano colonie significativamente più piccole quando coltivate in agar molle rispetto alle cellule di controllo. Inoltre, gli esperimenti di cernita cellulare attivati ​​dalla fluorescenza e gli esperimenti di western blot hanno rivelato che la trasfezione delle cellule di melanoma con piccoli RNA interferenti Dido1 ha portato a una sovraregolazione dell'apoptosi. Inoltre, i potenziali migratori e invasivi delle cellule sono stati fortemente ridotti nelle cellule trasfettate da siDido1 rispetto alle cellule di controllo. Infine, abbiamo dimostrato che Dido1 induce l'espressione dell'integrina αV, promuovendo in tal modo l'attaccamento, la migrazione, l'invasione e la resistenza all'apoptosi delle cellule di melanoma.

introduzione

I melanomi maligni rappresentano ∼ 4% di tutti i tumori cutanei, ma rappresentano> 80% delle morti per cancro della pelle. 1 Inoltre, l'incidenza del melanoma continua ad aumentare, con un aumento> 60% che si è verificato negli ultimi 30 anni.

Diversi studi hanno dimostrato che la cascata di segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP) è deregolamentata nel melanoma maligno. I BMP sono membri della famiglia del fattore di crescita trasformante-β. I BMP si legano a un complesso recettoriale eteromerico costituito dalle serine / treoninchinasi di tipo I e tipo II legate alla membrana (BMPRI e BMPRII). A seconda del complesso recettoriale, possono essere attivate diverse vie di segnalazione. Dopo il legame con il complesso etero-oligomerico preformato, i BMP iniziano la fosforilazione e l'attivazione di Smad1 / 5/8, che poi si alterano con il Co-Smad Smad4. Il complesso si trasloca nel nucleo e attiva la trascrizione dei geni target specifici del BMP. 2

Oltre a questa classica cascata di segnalazione dipendente da Smad, i BMP sono anche in grado di attivare percorsi di protein chinasi attivati ​​dal mitogeno. Qui, i BMP si legano al recettore BMP di tipo I, a cui segue il reclutamento del recettore di tipo II nel complesso. Il recettore BMP di tipo I si associa a TAK1, TAB1 e XIAP, determinando un'attivazione della chinasi p38 / mitogenica attivata, della chinasi N-terminale c-Jun o della chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK) che successivamente porta alla stimolazione di non -Geni sensibili alla piccola. 2, 3

La cascata di segnalazione BMP è strettamente regolata a più livelli. Ad esempio, antagonisti extracellulari come Chordin o Noggin si legano ai BMP e bloccano la loro capacità di legarsi al recettore. Inibitori intracellulari come Smad6 e Smad7 competono con Smad1 / 5/8 per il sito di legame del recettore di tipo I attivato. 4 La dorsomorfina agisce come un inibitore BMP specifico di Smad bloccando l'attività della chinasi della BMPRI. 5 Oltre al loro ruolo in numerosi processi cellulari, come proliferazione, differenziazione, motilità e morte cellulare, i BMP sono anche legati alla formazione e alla progressione del tumore. 6, 7

Il nostro gruppo è stato in grado di dimostrare che i BMP svolgono un ruolo importante durante la formazione e la progressione del melanoma maligno. Il livello di espressione di diversi BMP, in particolare BMP4 e BMP7, è sovraregolato nelle cellule di melanoma maligno rispetto ai melanociti normali. L'analisi funzionale ha rivelato che le linee cellulari di melanoma con ridotta attività della BMP, ottenute con la sovraespressione dell'inibitore della BMP Chordin o con la specifica downregulation della BMP4, mostravano ridotte capacità di migrazione e invasione. 8 Di conseguenza, l'iniezione sottocutanea di queste linee cellulari di melanoma nei topi nudi ha comportato una riduzione significativa della crescita tumorale. 9

In questo studio, abbiamo mirato a identificare e caratterizzare i nuovi geni target BMP dipendenti da Smad che promuovono la progressione del melanoma migliorando le capacità di migrazione e invasione delle cellule di melanoma.

risultati

Dido1 è un gene bersaglio specifico BMP regolato da Smad nel melanoma maligno

Precedenti studi hanno dimostrato che i membri della famiglia BMP promuovono la progressione del melanoma migliorando la migrazione e l'invasione delle cellule di melanoma; 8 tuttavia, gli obiettivi a valle dei BMP che mediano questi processi oncogenici sono in gran parte non identificati. È noto che i BMP segnalano tramite percorsi dipendenti da ERK, che sono frequentemente utilizzati da numerosi altri oncogeni, nonché attraverso cascate Smad1 / 5/8 che sono attivate solo da BMP. Per identificare nuovi geni target BMP, abbiamo trattato le linee cellulari di melanoma Mel Im e Mel Ju con Dorsomorfina 2 μ M, che è nota per inibire specificamente la segnalazione BMP dipendente dallo Smad. Uno studio di Boergermann et al. 10 si è chiesto se Dorsomorphin sia specifico per le vie di segnalazione BMP dipendenti da Smad; tuttavia, come mostrato dall'analisi Western Blot, il trattamento delle cellule di melanoma con Dorsomorfina ha bloccato specificamente la fosforilazione e l'attivazione della segnalazione di Smad, mentre l'attivazione di ERK è rimasta invariata (Figura 1a). Questi risultati suggeriscono che l'effetto di Dorsomorphin è fortemente di tipo cellulare e dipendente dalla concentrazione. L'analisi dei microarray ha rivelato che le cellule di melanoma trattate con Dorsomorfina hanno mostrato una riduzione di circa quattro volte dei livelli di espressione di Dido1 ( induttore della morte-obliteratore 1 ) rispetto alle cellule di controllo. Siamo stati in grado di confermare questi dati mediante qRT-PCR e colorazione di immunofluorescenza (Figure 1b e c). Inoltre, i cloni cellulari di melanoma con ridotta attività BMP, a causa della stabile trasfezione di entrambi i costrutti BMP4 antisenso o di un costrutto inibitore BMP di Chordin (i costrutti sono descritti in Rothhammer et al. 8 ), hanno mostrato una ridotta espressione di Dido1 (Figura 1d).

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Dido1 è un gene bersaglio BMP regolato da Smad. ( a ) Il trattamento delle cellule di melanoma Mel Im con 2 μ M di dorsomorfina per 6 ore ha comportato una ridotta fosforilazione di Smad1 / 5/8, mentre la fosforilazione di ERK è rimasta invariata. La colorazione dell'immunofluorescenza ( b ) qRT-PCR e ( c ) ha rivelato una ridotta espressione di Dido1 nelle cellule di melanoma Mel Im e Mel Ju rispetto alle cellule trattate con dimetilsolfossido (DMSO), dopo incubazione con 2 μ M di dorsomorfina. DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindolo) è stato usato per contrastare il nucleo. ( d ) I livelli di espressione dell'mRNA di Dido1 sono significativamente sottoregolati in Chordin (CHRD) e cloni di cellule di melanoma che sovraesprimono BMP4 come determinato da qRT-PCR. ( e ) Le cellule Mel Im sono state trasfettate con siRNA contro Smad4 (siSmad4) per 48 ore, con conseguente riduzione dell'espressione di mRNA Smad4 (a sinistra). La trasfezione di cellule Mel Im con siSmad4 per 72 ore ha ridotto fortemente i livelli di espressione di mRNA Dido1 rispetto alle cellule trasfettate da controllo (a destra). ( f ) Una rappresentazione schematica dei siti di legame Smad specifici di BMP all'interno della sequenza del promotore Dido1 . Le sequenze di oligonucleotidi sono state utilizzate per esperimenti di sbalzo di mobilità elettroforetica (EMSA). Per semplicità, le sequenze complementari non sono mostrate. I principali siti di legame con l'omologia alla consensuale sequenza vincolante di Smad sono sottolineati e in maiuscolo. Dido1 101 mut e Dido1 205 mut rappresentano gli oligonucleotidi mutati utilizzati per studi EMSA ed esperimenti di competizione per mostrare il legame specifico di Smad con le sequenze wild-type. Gli scambi di coppie di basi sono indicati da lettere minuscole. ( g ) L'EMSA ha confermato l'associazione di Smad 1/5/8 al promotore Dido1 . Il legame Smad1 / 5/8 è stato mostrato usando due oligonucleotidi che coprono regioni Smad specifiche del BMP (Dido1 101 e Dido1 205). Per esperimenti di competizione, sono stati usati gli oligonucleotidi mutati 101 mut e 205 mut. La generazione di complessi Dido1-Smad è stata significativamente inibita dall'incubazione di estratti nucleari Mel Im con rispettivamente gli anticorpi Smad5, p-Smad1 / 5/8 e p-Smad1 / 5. Inoltre, estratti nucleari di cloni cellulari di Mel Im sovraespressivi di Chordin (CHRD1) sono stati incubati con oligonucleotidi Dido1 , con conseguente formazione complessa fortemente ridotta rispetto alle cellule di controllo. Le barre mostrano la media ± sd di tre esperimenti indipendenti. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato ( * P <0, 5; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

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Per confermare che Dido1 agisce come un gene bersaglio BMP dipendente da Smad, abbiamo trattato le cellule di melanoma Mel Im con un piccolo RNA (siRNA) interferente contro il comune Smad, Smad4. Questo trattamento ha comportato un'espressione ridotta di Smad4 e Dido1 (Figura 1e). L'analisi al computer ha rivelato la presenza di due putativi siti di legame Smad specifici per BMP all'interno del promotore del gene Dido1 (Figura 1f). Per dimostrare il legame diretto di Smads con i siti di legame Smad all'interno del promotore Dido1 , abbiamo eseguito saggi di spostamento dell'elettromobilità con due oligonucleotidi etichettati che hanno attraversato i potenziali siti di legame Smad nel promotore Dido1 . Come mostrato nella Figura 1g, l'incubazione di estratti nucleari di melanoma Mel Im con gli oligonucleotidi Dido1 101 o Dido1 205 ha portato alla generazione di un complesso, mentre l'incubazione con oligonucleotidi che ospitavano un sito mutante di legame con Smad non ha prodotto alcuna formazione complessa. Inoltre, l'incubazione degli estratti nucleari Mel Im con gli anticorpi Smad5 e p-Smad5 ha portato a una significativa repressione della formazione complessa da parte della competizione. Inoltre, l'incubazione degli oligonucleotidi Dido1 101 o Dido1 205 con estratti nucleari CHRD1 ha comportato una forte riduzione della generazione complessa rispetto all'incubazione con estratti nucleari Mel Im (Figura 1g). Questi dati dimostrano che il complesso Smad si lega direttamente al sito di legame Smad all'interno del promotore Dido1 , indicando che Dido1 è un gene bersaglio BMP dipendente da Smad.

Dido1 è sovraespresso nelle linee cellulari di melanoma e nei campioni di tessuto rispetto agli NHEM

Successivamente, abbiamo analizzato l'espressione di Dido1 in diverse linee cellulari di melanoma. Le linee cellulari di melanoma derivate da metastasi hanno mostrato livelli particolarmente elevati di espressione di mRNA di Dido1 rispetto ai normali melanociti epidermici umani (NHEM; Figura 2a). Inoltre, mediante colorazione di immunofluorescenza, abbiamo osservato una maggiore espressione della proteina Dido1 nei nuclei delle cellule di melanoma derivate da tumori sia primari che metastatici rispetto ai NHEM (Figura 2b). Per verificare questi risultati in vivo , abbiamo analizzato i livelli di espressione di Dido1 in diversi campioni di tessuto. qRT-PCR ha rivelato la presenza di livelli di Dido1 fortemente aumentati nei campioni di tessuto melanoma rispetto agli NHEM (Figura 2c). La colorazione immunoistochimica dei campioni di tessuto melanoma con uno specifico anticorpo Dido1 ha mostrato una forte espressione di Dido1 nei tessuti primari e metastatici del melanoma, mentre la colorazione immunofluorescente dei melanociti situati nella membrana basale della pelle normale (identificata dalla proteina 2 correlata al tirosina marcatore specifico melanocitico ( TRP2)) non ha mostrato espressione nucleare della proteina Dido1 (Figura 2d).

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L'espressione di Dido1 nel melanoma maligno. L'espressione dell'mRNA di Dido1 è stata analizzata mediante colorazione quantitativa di RT – PCR ( a ) e immunofluorescenza ( b ) in NHEM e in diverse linee cellulari di melanoma. ( c ) L' espressione dell'mRNA di Dido1 è stata determinata in campioni di tessuto di melanomi primari (PT1 – PT4) e metastasi di melanoma (Met1 – Met4) mediante RT – PCR quantitativa. ( d ) L'espressione della proteina Dido1 è stata analizzata mediante immunoistochimica nei melanomi primari e nelle metastasi del melanoma maligno. È stata rilevata una forte espressione della proteina Dido1 nei melanomi e nelle metastasi primarie, come mostrato dalla colorazione rossa AEC (ingrandimento di 200 volte). I melanociti situati nella membrana basale della pelle normale sono stati identificati mediante colorazione immunofluorescente del marcatore specifico TRP2 (proteina 2 correlata alla tirosina). L'espressione di Dido1 nucleare era assente in queste cellule. Le barre mostrano la media ± sd di tre esperimenti indipendenti. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato. NS, non significativo ( * P <0, 5; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

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L'influenza di Dido1 sulla proliferazione e senescenza delle cellule di melanoma

Per determinare la rilevanza funzionale di Dido1 nel melanoma maligno, abbiamo trattato cellule Mel Im e Mel Ju per 72 ore con due diversi siRNA contro Dido1 , individualmente o in combinazione. La trasfezione ha portato a una riduzione dell'espressione di Dido1 fino al 50% nel caso di cellule Mel Im e fino all'80% in caso di cellule Mel Ju, rispettivamente, come determinato da qRT-PCR (Figura 3a). Inoltre, la colorazione dell'immunofluorescenza ha rivelato una riduzione dei livelli proteici di Dido1 nelle cellule Mel Ju e Mel Im dopo la trasfezione con specifici siRNA Dido1 (Figura 3b).

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Dido1 migliora il comportamento proliferativo delle cellule di melanoma. ( a, b ) Una riduzione dell'espressione di Dido1 è stata ottenuta mediante transfezione transitoria di cellule Mel Im e Mel Ju con diversi siRNA contro Dido1 (siDido1 # 1, siDido1 # 2, siDido1 # 1/2). La trasfezione con un siRNA strapazzato serviva da controllo. Una forte riduzione dell'espressione di Dido1 è stata osservata dopo 72 ore nelle linee cellulari di melanoma Mel Im e Mel Ju a livello di mRNA ( a ) e proteina ( b ), come mostrato rispettivamente dall'analisi qRT-PCR e dalla colorazione di immunofluorescenza. ( c ) La crescita indipendente dall'ancoraggio è fortemente ridotta nelle cellule Mel Ju trasfettate da siDido1 come determinato da un test di formazione di colonie. Le immagini rappresentative delle colonie sono mostrate a sinistra. I diametri di almeno 10 colonie sono stati determinati e quantificati (a destra). ( d ) La colorazione della β-galattosidasi non ha rivelato differenze significative nella quantità di cellule senescenti tra quelle trasfettate con il siRNA di controllo o con i siRNA contro Dido1 . Le immagini rappresentative delle cellule di Mel Ju sono mostrate a sinistra e la quantificazione delle cellule senescenti è visualizzata a destra. Le barre mostrano la media ± sd di tre esperimenti indipendenti. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato. NS, non significativo ( * P <0, 5; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

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Successivamente, la crescita indipendente dall'ancoraggio delle cellule trasfettate da siDido1 è stata analizzata mediante un saggio di formazione di colonie. Dopo la crescita dell'agar molle, le colonie derivate dalle cellule melanoma Mel Ju e Mel Im trasfettate con siDido1 erano significativamente più piccole rispetto a quelle derivate dalle cellule trasfettate da controllo (Figura 3c e Figura supplementare S1). Per studiare se il ridotto potenziale di formazione di colonie di cellule di melanoma trattate con siDido1 fosse dovuto a un'induzione di senescenza, abbiamo eseguito una colorazione β-galattosidasi associata a senescenza. È interessante notare che non abbiamo osservato differenze nelle attività β-galattosidasi associate alla senescenza citoplasmatica tra cellule Mel Ju e Mel Im trasfettate da siDido1 e cellule di controllo. Pertanto, Dido1 non ha avuto effetti significativi sull'induzione della senescenza nelle cellule di melanoma (Figura 3d e Figura supplementare S2).

Dido1 inibisce l'apoptosi nelle cellule di melanoma

Per analizzare gli effetti a lungo termine del knockdown di Dido1 , abbiamo generato cloni cellulari di melanoma che sono stati trasfettati stabilmente con un costrutto Dido1 antisenso. Dopo la selezione clonale, le cellule Mel Im che erano state trasfettate stabilmente con Dido1 antisenso presentavano una riduzione fino al 90% nell'espressione di Dido1 rispetto alle cellule di controllo pcDNA3 stabilmente trasfettate (Figura 4a). Sorprendentemente, dopo una coltivazione per 2 settimane in condizioni di selezione, è stata osservata una re-espressione di Dido1 nei cloni di cellule asDido1. Questo livello di reespressione era paragonabile a quello osservato nelle cellule di controllo di pcDNA3 (Figura 4b). Pertanto, abbiamo ipotizzato se l' abbattimento dell'espressione di Dido1 possa indurre l'apoptosi nelle cellule di melanoma.

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L'effetto di Dido1 sull'apoptosi nelle cellule di melanoma. ( a ) La trasfezione stabile delle cellule Mel Im con costrutti di espressione di asDido1 ha determinato un'espressione di mRNA Dido1 fortemente ridotta rispetto alle cellule trasfettate di controllo di pcDNA3 (i). L'analisi PCR ha confermato l'espressione del costrutto asDido1 (ii). ( b ) Gli esperimenti qRT-PCR hanno mostrato che la coltivazione di cloni cellulari Dido1 stabilmente trasfettati per oltre 2 settimane ha portato alla reespressione di Dido1 (i). Dopo 2 settimane, i cloni di asDido1cell non hanno mostrato espressione del costrutto asDido1, come determinato dalla PCR (ii). ( c ) L'analisi FACS ha rivelato un'induzione dell'apoptosi nelle cellule di melanoma trasfettate da siDido1, mentre la trasfezione delle cellule di melanoma con un costrutto di espressione Dido1 ha comportato una riduzione dell'apoptosi rispetto alle cellule trasfettate con controllo pEGFP. Le misure rappresentative (pannello superiore) sono mostrate come un grafico (pannello inferiore). ( d ) Abbattere l' espressione di Dido1 ha comportato una sovraregolazione del PARP scisso, come mostrato dalla macchia occidentale. Le barre mostrano la media ± sd di tre esperimenti indipendenti. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato ( * P <0, 5; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

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È noto che Dido1 è coinvolto nella regolazione dell'apoptosi. Pertanto, abbiamo studiato se un'inibizione dell'espressione di Dido1 nelle cellule di melanoma attraverso specifici siRNA potesse influenzare il comportamento apoptotico. Mediante esperimenti di classificazione cellulare a fluorescenza attivata (FACS), siamo stati in grado di dimostrare che un abbattimento dell'espressione di Dido1 ha portato a un'induzione dell'apoptosi (Figura 4c). Inoltre, la trasfezione delle cellule di melanoma Mel Ju con un costrutto di espressione Dido1 ha fortemente ridotto il tasso di apoptosi rispetto alle cellule trasfettate da vettore di controllo (Figura 4c). Inoltre, l'analisi Western Blot ha rivelato una sovraregolazione dei livelli di proteina PARP (poli (ADP-ribosio) polimerasi) suddivisa in cellule trasfettate con siDido1 rispetto alle cellule di controllo (Figura 4d).

Dido1 induce la migrazione e l'invasione delle cellule di melanoma

Poiché è noto che i BMP inducono la migrazione e l'invasione delle cellule di melanoma, 8 abbiamo analizzato le cellule Mel Im e Mel Ju trattate con siDido1 nei test della camera di Boyden. Questi saggi hanno rivelato una significativa riduzione del potenziale migratorio delle cellule di melanoma trasfettate da siDido1 rispetto alle cellule mock-trasfettate (Figura 5a). Ciò potrebbe essere confermato da esperimenti di xCELLigence, come mostrato nella Figura S3 supplementare. Inoltre, il comportamento invasivo è stato chiaramente ridotto nelle cellule di melanoma Mel Im e Mel Ju trasfettate con siDido1 rispetto alle cellule trasfettate di controllo, come determinato dai saggi della camera di Boyden modificati (Figura 5b). Inoltre, i test di scratch eseguiti con lo strumento xCELLigence hanno mostrato un potenziale migratorio fortemente ridotto delle cellule di melanoma Mel Ju trasfettate da siDido1 rispetto alle cellule mock-transfected (Figura complementare S4). Successivamente, abbiamo studiato l'influenza di Dido1 sulle cellule di melanoma cresciute come sferoidi tridimensionali incorporati nel collagene. In accordo con i nostri dati precedenti, le cellule trasfettate da siDido1 hanno mostrato un potenziale fortemente ridotto di invadere la matrice di collagene circostante (Figura 5c).

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Dido1 aumenta i potenziali migratori e invasivi delle cellule di melanoma. ( a ) I test di migrazione e ( b ) di invasione usando il modello della camera di Boyden hanno rivelato una significativa riduzione dei potenziali migratori e invasivi delle cellule di melanoma dopo la downregulation mediata dal siRNA dell'espressione di Dido1 . ( c ) Le cellule Mel Ju trasfettate da siDido1 che sono state coltivate come sferoidi e incorporate nel collagene hanno mostrato una capacità di migrazione ridotta rispetto alle cellule trasfettate da siRNA di controllo. ( d ) Cloni cellulari di melanoma che sovraesprimono stabile (CHRD1 e CHRD9) sono stati trasfettati con un costrutto di espressione Dido1. I saggi della camera di Boyden hanno mostrato un potenziale fortemente migratorio e invasivo delle cellule CHR Im MelD Dido1 che sovraesprimono rispetto ai cloni cellulari simulati. ( e ) Le cellule Mel Im e Mel Ju sono state trattate con Dorsomorfina 2 μ M che porta a una riduzione del comportamento migratorio e ( f ) come determinato dai test della camera di Boyden. Trasfezione aggiuntiva di queste cellule con un'espressione di Dido1 costruisce una migliore ( e ) migrazione e ( f ) invasione delle cellule trattate con Dorsomorfina rispetto alle cellule trasfettate da pEGFP. Le barre mostrano la media ± sd di tre esperimenti indipendenti. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato ( * P <0, 5; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

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Per analizzare l'impatto della reespressione di Dido1 nelle cellule con ridotta attività BMP, abbiamo usato cloni di cellule di melanoma Mel Im che sono stati trasfettati stabilmente con l'inibitore generale BMP Chordin (CHRD1 e CHRD9) 8 e incubati con un costrutto di espressione Dido1 (gentilmente fornito del dott. Martinez, Madrid, Spagna). Gli esperimenti qRT-PCR hanno rivelato un'espressione fortemente indotta dell'mRNA di Dido1 in cellule trasfettate con Dido1 rispetto ai controlli correlati (Figura supplementare S5). Come determinato dai test della camera di Boyden, il trattamento dei cloni cellulari CHRD1 e CHRD9 con il costrutto dell'espressione Dido1 ha migliorato i loro potenziali migratori e invasivi rispetto alle cellule trasfettate da controllo (Figura 5d). Successivamente, abbiamo trattato le cellule di melanoma Mel Im e Mel Ju con l'inibitore Dorsomorfina di BMP Smad-dipendente che ha determinato un potenziale migratorio e invasivo fortemente ridotto, come previsto. La trasfezione di queste cellule con il costrutto dell'espressione di Dido1 migliora significativamente la migrazione e l'invasione rispetto alle cellule di melanoma pEGFP trasfettate da controllo (Figura 5e), indicando così ulteriormente che il gene target BMP specifico di Smad Dido1 è il principale mediatore della migrazione e dell'invasione indotte da BMP di cellule di melanoma.

Dido1 regola l'espressione di Integrin αV

Come analisi di sequenza di Rojas et al. 12 ha rivelato che Dido1 contiene diversi domini di fattori di trascrizione noti, abbiamo selezionato potenziali geni bersaglio di Dido1 nel melanoma che potrebbero essere coinvolti nella regolazione della migrazione e dell'invasione (Figura supplementare S6). Attraverso questa schermata, abbiamo identificato Integrina αV come fortemente ridotta nelle cellule Mel Ju trasfettate con siDido1 rispetto alle cellule mock-trasfettate, come determinato da saggi qRT-PCR e western blot (Figure 6a e b). Inoltre, i cloni cellulari di melanoma con attività BMP ridotta hanno mostrato una significativa riduzione dell'espressione di Integrin αV (Figura 6c). Inoltre, cellule di controllo, come BMP4 e cloni cellulari sovraespressivi di Chordin sono state iniettate in topi nudi come descritto in Rothhammer et al. 9 L'analisi immunoistologica ha rivelato un'espressione proteica fortemente ridotta di p-Smad1 / 5/8 , Dido1 e Integrina αV nei cloni cellulari asBMP4 e Chordin-sovraespressivi rispetto ai tumori di controllo (Figura 6d).

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Dido1 sovraregola l'espressione dell'integrina αV, influenzando così l'attaccamento, l'apoptosi e la migrazione delle cellule di melanoma. ( a ) La riduzione dell'espressione di Dido1 nelle cellule di Mel Ju ha comportato una forte riduzione dell'espressione di mRNA e proteina b ) di Integrina αV, come determinato rispettivamente da qRT-PCR e western blot. ( c ) I cloni cellulari che sovraesprimono Chordin e asBMP4 hanno mostrato livelli ridotti di mRNA di Integrina αV rispetto alle cellule mock-transfected. ( d ) come cloni cellulari sovraespressivi di BMP4 e Chordin sono stati iniettati in topi nudi. L'analisi immunoistologica ha mostrato una colorazione indebolita di p-Smad1 / 5/8, Dido1 e Integrina αV nei cloni cellulari con sovraespressione di asBMP4 e Chordin rispetto ai tumori di controllo del PCDNA. ( e ) Gli esperimenti di xCELLigence hanno rivelato un potenziale di attaccamento significativamente ridotto delle cellule Mel Ju trasfettate da siDido1 rispetto alle cellule di controllo (a sinistra). L'analisi quantitativa del comportamento migratorio durante il periodo di tempo indicato è mostrata a destra. ( f ) Il trattamento delle cellule Mel Ju trasfettate con siDido1 con un anticorpo inibitorio Integrin αV (inib. ITG) ha avuto solo effetti minori sull'adesione cellulare a piastre rivestite con vitronectina, mentre l'incubazione delle cellule di controllo con l'anticorpo inibitore Integrin αV ha determinato una riduzione significativa attaccamento cellulare. Le barre mostrano la media ± sd di tre esperimenti indipendenti. Le misurazioni sono state eseguite in triplicato. NS, non significativo ( * P <0, 5; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

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Gli esperimenti di xCELLigence hanno mostrato una riduzione della capacità di attaccamento delle cellule Mel Ju trasfettate da siDido1 rispetto alle cellule di controllo (Figura 6e). Per analizzare se l'impatto osservato di Dido1 sull'attaccamento è stato mediato tramite Integrin αV, abbiamo eseguito test di attaccamento su piastre rivestite con vitronectina. Le cellule Mel Ju trasfettate con siRNA contro Dido1 o siRNA di controllo sono state trattate con 20 μ M di un anticorpo inibitore Integrin αVβ3. Il trattamento con l'anticorpo inibitore dell'integrina αVβ3 ha fortemente ridotto l'attaccamento delle cellule trasfettate da siRNA di controllo alla vitronectina, mentre un trattamento simile delle cellule trasfettate da siDido1 ha prodotto solo effetti marginali sul potenziale di attaccamento delle cellule (Figura 6f).

Infine, abbiamo analizzato il potenziale migratorio dei cloni cellulari che sovraesprimono Chordin dopo l'incubazione con l'anticorpo inibitore dell'integrina. Come mostrato nella Figura 5d, il potenziale migratorio dei cloni cellulari CHRD trasfettati con un costrutto di espressione Dido1 è stato fortemente potenziato. Il trattamento aggiuntivo con l'anticorpo inibitore dell'integrina αVβ3 ha ridotto la migrazione delle cellule CHRD1 al 41, 53%, mentre la migrazione dei cloni delle cellule CHRD9 è stata ridotta al 57, 69%.

Discussione

I BMP svolgono un ruolo importante nella formazione e nella progressione del melanoma maligno. 13, 14, 15 Studi del nostro gruppo hanno dimostrato che la sovraespressione di BMP4 induce la migrazione e l'invasione delle cellule di melanoma. Inoltre, BMP4 promuove la neoangiogenesi e la crescita tumorale; 8, 9, tuttavia, gli obiettivi a valle dei BMP che mediano queste funzioni oncogeniche sono scarsamente caratterizzati. Fino ad ora, sono stati scoperti solo pochi geni target BMP. Le cellule di melanoma con ridotta attività BMP mostrano livelli di espressione di mRNA ridotti di EphA2 , VE-Cadherin , Id-1 e TEK / Tie-2 , 9 con conseguente riduzione dello sviluppo della rete vascolare e dell'angiogenesi. 16, 17, 18 Analisi dettagliate hanno rivelato che VE-Cadherin , EphA2 e TEK / Tie - 2 sono geni target indiretti della via di segnalazione BMP, mentre Id-1 agisce come gene target BMP diretto. 9 Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare che i BMP inducono l'espressione di diverse metalloproteinasi a matrice, contribuendo così alla diffusione delle cellule di melanoma dal tumore primario. 19

Per identificare ulteriori geni target BMP, le linee cellulari di melanoma sono state trattate con Dorsomorphin, che è noto come un inibitore specifico Smad della cascata di segnalazione BMP. L'uso di questo inibitore della BMP ci ha permesso di identificare i geni target specifici della BMP, poiché la Dorsomorfina non ha alcun impatto sulle cascate di segnalazione ERK alternative. Le linee cellulari di melanoma trattate con dorsomorfina sono state analizzate utilizzando un microarray genico, che ha portato all'identificazione del potenziale gene bersaglio BMP Dido1 . L'incubazione delle cellule di melanoma con Dorsomorfina ha determinato una downregulation dell'espressione di Dido1 , che è stata verificata mediante qRT-PCR e colorazione di immunofluorescenza. Inoltre, nei cloni cellulari di melanoma è stata osservata una ridotta espressione di Dido1 stabilmente trasfettata con BMP4 antisenso o costrutti di Chordin. Per validare ulteriormente la regolazione Smad-dipendente di Dido1 , le cellule sono state trattate con un siRNA contro Smad4. L' espressione di Dido1 è stata significativamente ridotta nelle cellule trattate con siSmad4 rispetto alle cellule di melanoma trasfettate in modo falso. Inoltre, esperimenti di saggi di mobilità elettroforetica hanno confermato l'associazione diretta di Smad1 / 5/8 al promotore Dido1 . Questi esperimenti hanno dimostrato che Dido1 è un gene bersaglio BMP dipendente da Smad nel melanoma maligno. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio che dimostra che una cascata di segnali regola l'espressione di Dido1 .

Poiché, fino ad ora, non erano disponibili dati riguardanti i livelli di espressione di Dido1 in diversi tipi di tumore, abbiamo determinato i livelli di mRNA Dido1 in numerose linee cellulari di melanoma e siamo stati in grado di mostrare un'espressione migliorata di mRNA Dido1 principalmente nelle linee cellulari di melanoma derivate da metastasi. Tuttavia, a livello proteico, l' espressione di Dido1 era fortemente aumentata nelle cellule di melanoma che erano state derivate sia da tumori primari che da metastasi rispetto ai normali melanociti, indicando che, a parte la regolazione trascrizionale osservata dell'espressione Dido1 , meccanismi di regolazione post-trascrizionale come l'interferenza dell'RNA o sono anche possibili la stabilizzazione delle proteine. La colorazione di immunofluorescenza ha rivelato l'espressione di Dido1 nel nucleo delle cellule di melanoma, il che è in contrasto con gli studi di Garcia-Domingo et al. , 11 che hanno osservato la localizzazione di Dido1 nel nucleo dei fibroblasti embrionali di topo solo in condizioni apoptotiche. Una possibile spiegazione di questa discrepanza potrebbe essere che la localizzazione e la funzione di Dido1 dipendono dal tipo di cellula o dalle condizioni di coltura. I livelli di espressione dell'mRNA e della proteina Dido1 sono stati migliorati nei campioni di tessuto melanoma rispetto ai melanociti normali, indicando così un impatto di Dido1 sulla progressione del melanoma maligno.

Per studiare la rilevanza funzionale di Dido1 nel melanoma, l'espressione di Dido1 è stata inibita dalla trasfezione di siRNA. Innanzitutto, abbiamo studiato se Dido1 modula il potenziale di formazione delle colonie delle cellule di melanoma. Qui, siamo stati in grado di dimostrare che le cellule trasfettate da siDido1 formano colonie significativamente più piccole rispetto alle cellule di controllo, mentre il numero di colonie è rimasto invariato (dati non mostrati). Ulteriori studi hanno dimostrato che questo effetto è causato da un'inibizione della proliferazione anziché da un'induzione di senescenza.

Per esperimenti successivi, sono stati generati cloni di cellule di melanoma Dido1 antisenso stabili. Poiché la coltivazione per 2 settimane ha comportato la riespressione di Dido1 in queste cellule, abbiamo ipotizzato che Dido1 influenza l'apoptosi. Esperimenti FACS e analisi Western Blot hanno verificato la nostra ipotesi. L'inibizione dell'espressione di Dido1 da parte della trasfezione di siRNA ha provocato un'induzione dell'apoptosi, mentre la sovraespressione di Dido1 utilizzando un costrutto di espressione di Dido1 ha portato a una riduzione dell'apoptosi, dimostrando così che Dido1 media la resistenza delle cellule di melanoma all'apoptosi. Queste osservazioni sono in contrasto con lo studio condotto dal gruppo Martinez, 11 che ha dimostrato che la sovraespressione di Dido1 nei fibroblasti embrionali di topo ha comportato la traslocazione di Dido1 dal citoplasma nel nucleo, che ha successivamente portato all'attivazione dell'apoptosi. Inoltre, questo gruppo ha dimostrato una maggiore espressione di Dido1 durante le prime fasi dell'apoptosi. 20 Come discusso in dettaglio di seguito, Dido1 regola l'espressione dell'integrina αV nelle cellule di melanoma. Diversi studi hanno dimostrato un'associazione tra segnalazione di integrina e apoptosi / anoiki. 21, 22 Ad esempio, Zhang et al. 23 hanno descritto che il trattamento delle cellule di melanoma con un inibitore dell'integrina αVβ3 promuove l'anoiki e attiva le cascate di caspasi. Pertanto, è possibile che l' upregolazione dipendente dall'integrina αV di Dido1 nel melanoma maligno determini una maggiore resistenza all'apoptosi.

Poiché è noto che le cellule di melanoma presentano un'alta resistenza all'apoptosi, che spesso porta al fallimento della terapia, 24, 25 un'inibizione dell'espressione di Dido1 potrebbe essere un promettente approccio terapeutico. Tale inibizione può comportare un aumento dell'apoptosi in risposta alla chemioterapia convenzionale, consentendo di superare il problema comune della chemoresistenza. Oltre al melanoma maligno, l'inibizione di Dido1 può anche essere terapeutica in altri tipi di cancro.

Precedenti studi del nostro gruppo hanno dimostrato che i BMP svolgono un ruolo importante nelle capacità di migrazione e invasione delle cellule di melanoma. 19 Poiché Dido1 è un gene bersaglio della BMP, abbiamo analizzato la migrazione e l'invasione delle cellule di melanoma trattate con siDido1. Successivamente, siamo stati in grado di dimostrare che le cellule trasfettate da siDido1 presentavano un potenziale di migrazione e invasione fortemente diminuito sia nelle colture bidimensionali che tridimensionali. È stato anche mostrato il contrario: il trattamento dei cloni di cellule di melanoma con ridotta attività BMP con un costrutto di espressione Dido1 ha aumentato il loro comportamento di migrazione e invasione rispetto alle cellule di controllo. Pertanto, il trattamento terapeutico con inibitori di Dido1 può anche servire a contrastare la metastasi e la progressione del melanoma maligno.

L'analisi della sequenza ha indicato che Dido1 può agire come fattore di trascrizione. 12 Pertanto, abbiamo selezionato potenziali geni target Dido1 che influenzano la migrazione e l'invasione delle cellule di melanoma analizzando i livelli di espressione di metalloproteinasi di matrice, caderine, Mia, Ski, Sno e integrine nelle cellule di melanoma trasfettate con siRNA contro Dido1 . Siamo stati in grado di identificare l'integrina αV come fortemente influenzata nelle cellule di melanoma con ridotta espressione di Dido1 , mostrando così per la prima volta che i BMP regolano l'espressione delle integrine nel melanoma maligno. È interessante notare che la sovraespressione di Dido1 nei melanociti primari (NHEM) ha determinato solo un lieve aumento dei livelli di espressione dell'mRNA ITGαV (dati non mostrati). Sembra che nei melanociti sani molecole aggiuntive accanto a Dido1 regolino l'espressione dell'integrina αV.

La regolazione delle integrine BMP-dipendente potrebbe essere un passo essenziale nella progressione di altri tipi di cancro che mostrano un'espressione deregolamentata di BMP e integrine, sebbene ciò rimanga da studiare. È noto che Integrina αV si lega ai componenti della matrice extracellulare come la fibronectina e la vitronectina, regolando in tal modo l'adesione, la migrazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali. 26, 27, 28, 29 L'attaccamento delle cellule di melanoma trasfettate da siDido1 è significativamente ridotto rispetto alle cellule trasfettate da controllo, come determinato dagli esperimenti di xCELLigence. I test di attaccamento eseguiti con specifiche piastre rivestite con vitronectina hanno confermato che la ridotta capacità di adesione delle cellule trasfettate da siDido1 è mediata da Integrin αV. Coerentemente con studi precedenti che hanno dimostrato che un'inibizione della segnalazione di Integrin αV ha diminuito l'invasione delle cellule di melanoma, 30, 31 il trattamento dei cloni di cellule di melanoma sovraespressivi di Chordin con un costrutto di espressione Dido1 insieme a un inibitore di Integrin αV ha comportato un comportamento migratorio significativamente ridotto rispetto a controllare i cloni cellulari trasfettati.

Inoltre, abbiamo dimostrato che Dido1 contribuisce alla capacità delle cellule di melanoma di resistere all'apoptosi. Per quanto riguarda lo studio di Koistinen et al. , 32 che ha dimostrato che l'esaurimento di Integrin αV ha provocato il distacco di cellule di melanoma dalla matrice extracellulare e una successiva induzione di apoptosi, l'influenza di Dido1 sulla resistenza all'apoptosi è molto probabilmente mediata da un'induzione dell'espressione di Integrin αV.

In sintesi, abbiamo identificato Dido1 come un nuovo gene target BMP dipendente da Smad che contribuisce alla progressione del melanoma inducendo l'espressione dell'integrina αV, migliorando in tal modo l'attaccamento, la migrazione, l'invasione e la crescita indipendente dalle cellule di melanoma e promuovendo la resistenza tumorale all'apoptosi.

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