Analisi dettagliata della topologia proteica delle vescicole extracellulari - evidenza di un orientamento non convenzionale delle proteine ​​di membrana | rapporti scientifici

Analisi dettagliata della topologia proteica delle vescicole extracellulari - evidenza di un orientamento non convenzionale delle proteine ​​di membrana | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Molecole di segnalazione extracellulari
  • Analisi proteomica

Astratto

Le vescicole extracellulari (EV) sono importanti mediatori della comunicazione intercellulare che cambiano la cellula ricevente spostando lipidi, RNA o carico proteico tra le cellule. Qui, studiamo la topologia del carico proteico presente nei veicoli elettrici, poiché questa topologia può influenzare fondamentalmente gli effetti biologici dei veicoli elettrici. Un approccio proteomico multiplo, che combina il trattamento con proteinasi e la marcatura con biotina, mostra che molte proteine ​​di origine citosolica sono localizzate sulla superficie dei veicoli elettrici. Un'analisi dettagliata del proteoma EV a livello del peptide ha rivelato che un certo numero di proteine ​​della membrana EV sono presenti in un orientamento topologicamente invertito rispetto a quanto è annotato. Sono stati confermati due esempi di tali proteine, SCAMP3 e STX4, con una topologia inversa. Questa tipologia inversa è stata determinata usando la citometria a flusso e la microscopia fluorescente con anticorpi diretti verso i loro epitopi citoplasmatici. Questi risultati descrivono un nuovo flusso di lavoro per definire il proteoma EV e l'orientamento di ciascuna proteina, compresa la topologia delle proteine ​​di membrana. Questi dati sono di fondamentale importanza per comprendere il proteoma EV e sono necessari per spiegare appieno la biogenesi EV e la funzione biologica nelle cellule riceventi.

introduzione

La comunicazione intercellulare è essenziale per gli organismi multicellulari per mantenere l'omeostasi e può essere mediata dal contatto diretto o attraverso la secrezione di molecole come proteine ​​bioattive e lipidi. Inoltre, la maggior parte dei tipi di cellule, comprese le cellule immunitarie e le cellule tumorali, secernono vescicole extracellulari (EV) che possono influenzare il fenotipo cellulare ricevente 1, 2 . I veicoli elettrici sono vescicole di membrana a doppio strato lipidico con un diametro di 30 ~ 1000 nm che trasportano più componenti di carico biologicamente attivi come proteine, acidi nucleici (mRNA, miRNA e piccoli RNA) e lipidi. Attraverso il trasferimento del suo carico, i veicoli elettrici mediano diverse funzioni biologiche che includono l'immunomodulazione 3, la progressione del cancro 4 e la riprogrammazione epigenetica 5 . Inoltre, poiché i veicoli elettrici hanno dimostrato di contenere marcatori specifici della malattia, il loro potenziale come marcatori diagnostici ha suscitato grande attenzione 6, 7 .

Le cellule secernono diversi tipi di EV, spesso divisi in esosomi e microvescicole. Gli esosomi vengono rilasciati dalla fusione del corpo multivicolare con la membrana plasmatica e le microvescicole escono direttamente dalla membrana plasmatica 8 . Sebbene vi siano alcune differenze nelle dimensioni e nella composizione di questi veicoli elettrici, rimane impossibile separare completamente gli esosomi e le microvescicole con i metodi di purificazione attualmente disponibili. Pertanto, utilizziamo il termine "EV" in questa pubblicazione.

Un'analisi approfondita del proteoma su larga scala può contribuire alla comprensione della biogenesi e del ruolo funzionale dei veicoli elettrici, nonché alla scoperta di marcatori diagnostici. I veicoli elettrici purificati da vari mezzi di coltura cellulare 9 e fluidi corporei, ad esempio urina 10, sangue 11, saliva 12 e latte materno 13, sono stati analizzati con la tecnologia proteomica. Questi dati del proteoma sono ben organizzati nei database EV EVpedia 14, 15 e Vesiclepedia 16 . Molte proteine ​​di superficie dei veicoli elettrici sono proteine ​​transmembrane 14, ma quelle che non lo sono possono essere legate in modo non covalente ai veicoli elettrici e potrebbero viaggiare con i veicoli elettrici tra le cellule. Man mano che vengono pubblicati studi più funzionali sui veicoli elettrici, diventa sempre più essenziale determinare l'orientamento dettagliato delle proteine ​​all'interno o all'interno dei veicoli elettrici. Dal punto di vista clinico, la comprensione dei dettagli del proteoma di superficie dei veicoli elettrici è essenziale per lo sviluppo di veicoli elettrici come biomarcatori per le malattie. È importante sottolineare che si sa molto poco sulla topologia di diverse proteine ​​identificate in diversi campioni di EV come biofluidi, tessuti o surnatanti cellulari.

Qui, presentiamo un nuovo flusso di lavoro progettato per identificare le proteine ​​che sono localizzate sulla superficie dei veicoli elettrici negli isolati di veicoli elettrici. Per identificare il proteoma di superficie, abbiamo progettato uno studio di proteomica ad approccio multiplo che combina il trattamento con proteinasi e la marcatura con biotina. Utilizzando una proteinasi e un reagente di biotinilazione che sono entrambi impermeabili a un doppio strato lipidico 17, 18, abbiamo valutato il proteoma superficiale dei veicoli elettrici per la digestione o l'etichettatura. I veicoli elettrici sono stati isolati dalla linea dei mastociti HMC-1 attraverso ultracentrifugazione differenziale seguita da galleggiamento del gradiente di densità. Gli EV isolati sono stati trattati con la proteinasi K (PK) per digerire completamente le proteine ​​di superficie o con tripsina / Lys-C e successivamente biotinilati. Attraverso la combinazione dei metodi descritti qui e la successiva proteomica comparativa e quantitativa senza etichetta, siamo stati in grado di descrivere un proteoma EV in cui il contenuto luminale di EV può essere distinto dalle proteine ​​presenti sulla superficie delle vescicole. Inoltre, attraverso una valutazione dettagliata a livello di peptidi, abbiamo chiarito la topologia di molte proteine ​​transmembrane e ancorate ai lipidi nei veicoli elettrici e identificato quale di queste proteine ​​esibiva una topologia "dentro-fuori" non convenzionale.

risultati

Strategia globale per identificare il proteoma accessibile in superficie degli isolati EV

Per definire il proteoma luminale e accessibile in superficie degli EV, abbiamo progettato uno studio di proteomica ad approccio multiplo come descritto in Fig. 1. Per il primo approccio, gli EV sono stati trattati con PK per rimuovere le proteine ​​accessibili in superficie. Poiché la PK non riesce a penetrare attraverso il doppio strato lipidico, è molto probabile che le proteine ​​sensibili alla degradazione della PK siano localizzate sulla superficie dei veicoli elettrici. Per il secondo approccio, i veicoli elettrici sono stati trattati con tripsina e Lys-C per digerire le proteine ​​accessibili in superficie e quindi etichettati con biotina. I peptidi biotinilati sono stati isolati usando la separazione della base della colonna. Infine, sono stati analizzati campioni non trattati, trattati con PK e biotinilati con spettrometria di massa liquida tandem cromatografica (LC-MS / MS) e sono state eseguite bioinformatiche per confrontare i dati dei diversi campioni.

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I veicoli elettrici delle cellule HMC-1 sono stati trattati con proteinasi K (PK) o tripsina / Lys-C. I veicoli elettrici trattati con Tripsina / Lys-C sono stati ulteriormente trattati con solfo-LC-biotina e i peptidi biotinilati sono stati isolati mediante separazione basata su colonna. EV, EV trattati con PK e peptidi biotinilati sono stati analizzati con LC-MS / MS.

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Isolamento e caratterizzazione di veicoli elettrici da cellule HMC-1

Come sistema modello, abbiamo isolato i veicoli elettrici dalle cellule HMC-1 dei mastociti umani. Le cellule sono state coltivate in terreni integrati con siero bovino fetale impoverito di EV al 10% per tre giorni. In questa condizione di coltura, la vitalità cellulare era superiore al 98% (dati non mostrati). Sono stati raccolti terreni condizionati e gli EV sono stati isolati mediante centrifugazione seriale e ultracentrifugazione e ulteriormente purificati mediante galleggiamento su un gradiente di densità (Iodixanol). Un totale di dodici frazioni sono state raccolte e sottoposte all'analisi Western blot per identificare le proteine ​​vescicolari. Le classiche proteine ​​marker CD81 e TSG101 19 sono state rilevate rispettivamente nelle frazioni 2 e 3 e nella frazione 2 (Fig. 2a). Il numero di particelle di ciascuna frazione, che è stato contato usando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, ha mostrato che la maggior parte delle particelle sono state rilevate nella frazione 2 (Fig. 2b). Molte particelle sono state rilevate anche nelle frazioni più dense 5 e 6, ma non esprimevano le classiche proteine ​​di superficie (cioè CD81 e TSG101), suggerendo che queste particelle possono essere costituite da aggregati proteici o diverse sottopopolazioni di veicoli elettrici che non portano questi marcatori classici . Abbiamo raccolto le frazioni 2 e 3, le abbiamo diluite con PBS e le abbiamo poi pellettizzate mediante ultracentrifugazione. Infine, i veicoli elettrici sono stati nuovamente sospesi in PBS. Le micrografie crio e negative con EM colorate hanno mostrato che gli EV isolati sono per lo più sferici, hanno un diametro variabile e includono un doppio strato lipidico (Fig. 2c, pannello di sinistra). È importante sottolineare che, per evitare la possibilità che la struttura vescicolare degli EV sia compromessa dal congelamento e dallo scongelamento, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una fase durante la quale gli EV non sono stati congelati in nessun momento.

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( a ) Analisi Western blot con marcatori EV, CD81 e TSG101, in 12 frazioni dal gradiente di densità OptiPrep. ( b ) Il numero di particelle in ciascuna frazione di OptiPrep è stato analizzato mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle. ( c ) Immagini Cryo-EM di veicoli elettrici non trattati e trattati con PK. ( d ) analisi Western blot di EV non trattati e trattati con PK con CD81 e beta-actina.

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Analisi proteomica per la definizione del proteoma del carico EV e del proteoma EV accessibile dalla superficie

Per digerire le proteine ​​accessibili in superficie, i veicoli elettrici sono stati esposti alla PK. Questo enzima ha digerito la proteina transmembrana CD81 del plasma, ma non ha digerito la beta-actina della proteina luminale (Fig. 2d). Le micrografie crio e negative con EM colorate hanno rivelato che il trattamento con PK non ha modificato l'integrità o la morfologia dei veicoli elettrici (Fig. 2c, pannello di destra). Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che PK digerisce efficacemente le proteine ​​localizzate sulla superficie dei veicoli elettrici senza compromettere l'integrità dei veicoli elettrici stessi.

Gli EV non trattati e quelli trattati con PK sono stati lisati e la digestione con tripsina associata alla colonna è stata condotta con una preparazione del campione con filtro. Infine, i peptidi triptici eluiti sono stati sottoposti a LC-MS / MS. Dall'analisi proteomica, abbiamo identificato le proteine ​​1956 e 1784 rispettivamente da EV non trattati e trattati con PK. Come mostrato nel diagramma di Venn (Fig. 3a), 1662 proteine ​​sono state identificate in entrambi i preparati EV, mentre 294 e 122 proteine ​​sono state identificate in modo univoco rispettivamente in EV non trattati e trattati con PK. L'abbondanza relativa di diverse proteine ​​è stata ottenuta utilizzando il software MaxQuant ed è stata tracciata (Fig. 3b). Sulla base dell'abbondanza proteica relativa, le proteine ​​sono state divise in due gruppi: "PK sensitive" e "PK protetto". Tra le 1662 proteine ​​comuni, 748 proteine ​​non sono cambiate marcatamente in abbondanza, mentre 450 e 464 proteine ​​sono state relativamente aumentate e diminuite dopo il trattamento con PK, rispettivamente (Fig. 3c). Le proteine ​​uniche degli EV non trattati e quelle che erano due volte diminuite negli EV trattati con PK sono state classificate come "PK-sensitive" e il resto è stato classificato come "PK-protetto" (Fig. 3d). Successivamente, una suddivisione in proteine ​​di membrana e non di membrana è stata condotta in base alla loro localizzazione subcellulare primaria, secondo il database Uniprot (sono state utilizzate solo localizzazioni primarie). Tra le 1320 proteine ​​protette dalla PK, 368 e 952 proteine ​​avevano localizzazioni di membrana e non di membrana, rispettivamente. Inoltre, tra le 758 proteine ​​sensibili alla PK, 188 e 570 proteine ​​avevano localizzazioni di membrana e non di membrana, rispettivamente.

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( a ) Diagramma di Venn del proteoma EV non trattato e trattato con PK. Il numero presente nel cerchio rappresenta il numero totale di proteine ​​identificate in un particolare set di dati. ( b ) Grafico del valore log2 dell'abbondanza relativa di proteine ​​da EV non trattati e trattati con PK. La linea e la linea tratteggiata indicano rispettivamente un cambio di metà e 2 volte. ( c ) Tra le proteine ​​comuni, le proteine ​​sono divise in tre gruppi: aumento di 2 volte, diminuzione di 2 volte e nessun cambiamento dopo il trattamento con PK, in base all'abbondanza di proteine ​​relative. ( d ) Diagramma gerarchico per la definizione di EV e proteoma accessibile in superficie.

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Parallelamente, abbiamo anche applicato un metodo aggiuntivo per identificare le proteine ​​accessibili in superficie. In primo luogo, i veicoli elettrici sono stati trattati con tripsina e Lys-C, quindi biotinilati con solfo-LC-biotina, che è impermeabile al doppio strato lipidico. Il reagente di biotinilazione etichetta i gruppi amminici liberi di residui di lisina e il terminale N degli amminoacidi, entrambi i quali sono teoricamente resi più abbondanti attraverso il trattamento con tripsina e Lys-C. I peptidi digeriti e biotinilati sono stati isolati mediante separazione su colonna e analizzati con LC-MS / MS. In totale, 155 proteine ​​sono state identificate con almeno un peptide biotinilato. Analogamente, come descritto sopra, le proteine ​​sono state divise in membrana (56 proteine) e non membrana (99 proteine) in base alla loro localizzazione primaria (Fig. 3d).

Molte proteine ​​di membrana sono esposte sulla superficie dei veicoli elettrici, consentendo loro di essere digerite dalle proteinasi e etichettate con biotina. Dato che queste proteine ​​sono incorporate nella membrana, le abbiamo considerate parte del proteoma EV anche se potenzialmente sono sensibili ai suddetti reagenti. Tenendo conto di questo e applicando un rigoroso approccio analitico, abbiamo selezionato solo proteine ​​non di membrana tra le proteine ​​sensibili alla PK e biotinilate e le abbiamo considerate per contribuire sicuramente al proteoma accessibile in superficie. Confrontando le proteine ​​non di membrana delle proteine ​​sensibili alla PK e quelle biotinilate, abbiamo definito 14 proteine ​​sovrapposte che contribuiscono definitivamente al proteoma accessibile in superficie e 641 proteine ​​non sovrapposte in quanto potenzialmente contribuiscono al proteoma accessibile in superficie. Complessivamente, si ritiene che 655 proteine ​​contribuiscano al proteoma accessibile in superficie. Inoltre, si ritiene che le proteine ​​non degradate dalla PK (1320 proteine) e le proteine ​​di membrana dalle proteine ​​sensibili alla PK (188 proteine) contribuiscano al proteoma EV, poiché le proteine ​​di membrana molto probabilmente sono associate al doppio strato lipidico EV. Un elenco completo di proteine ​​è fornito come tabella supplementare S1. È importante sottolineare che le classiche proteine ​​marcatore EV citosoliche, tra cui la syntenina, TSG101 e le proteine ​​nelle famiglie Annexin e Rab 19 (tranne Rab31), sono definite come proteomi del carico EV perché non sono state biotinilate o degradate da PK (Tabella S2), confermando ulteriormente la validità della nostra classificazione topologica del proteoma EV.

Localizzazione subcellulare e analisi dell'ontologia genica

Successivamente, abbiamo analizzato i termini GO della localizzazione subcellulare e del processo biologico del carico EV e del proteoma accessibile in superficie. La localizzazione subcellulare delle proteine ​​accessibili alla superficie ha mostrato che il 51, 1% e il 16, 8% del proteoma accessibile alla superficie sono rispettivamente proteine ​​citosoliche e nucleari (Fig. 4a). In particolare, la percentuale di proteine ​​del nucleo nel proteoma accessibile in superficie è doppia rispetto al proteoma EV (8, 3%). Nel termine GO analisi del processo biologico, il carico EV e il proteoma accessibile in superficie hanno mostrato caratteristiche distinte. Il proteoma EV è arricchito con processi biologici tra cui la creazione di localizzazione delle proteine, trasporto di proteine, localizzazione di proteine, trasporto e localizzazione mediati da vescicole (Fig. 4b). Al contrario, il proteoma accessibile in superficie è arricchito con processi biologici tra cui la traduzione, il processo metabolico delle proteine ​​cellulari, il processo metabolico delle proteine, l'allungamento traslazionale e il processo cellulare (Fig. 4c). Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono che molte proteine ​​citosoliche e / o nucleari sono co-isolate con i veicoli elettrici e sono localizzate nella parte esterna dei veicoli elettrici.

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( a ) Localizzazione subcellulare di EV e proteoma accessibile in superficie. ( b ) I 10 migliori termini di ontologia genica dei processi biologici arricchiti con proteoma EV. ( c ) Primi 10 termini di ontologia genica dei processi biologici arricchiti con proteoma accessibile in superficie.

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Topologia di transmembrane e proteine ​​ancorate ai lipidi

Inoltre, abbiamo analizzato la topologia delle proteine ​​transmembrane e ancorate ai lipidi nei veicoli elettrici usando le informazioni sui peptidi dai risultati della spettrometria di massa. È stato utilizzato un semplice sistema di punteggio per stabilire criteri imparziali per determinare la topologia delle proteine ​​di membrana. Dal 2078 proteine ​​di EV non trattati e trattati con PK sono state selezionate e classificate 410 proteine ​​transmembrane e ancorate con lipidi. Le illustrazioni della topologia di queste proteine ​​sono state ottenute utilizzando lo strumento Protter (//wlab.ethz.ch/protter/, versione 1.0, giugno 2016) 20 e i peptidi identificati sono stati mappati sulle illustrazioni della topologia. I peptidi 2 volte arricchiti in EV non trattati e localizzati nella regione extracellulare sono stati valutati come +1. Tuttavia, se si localizzavano nella regione citoplasmatica, venivano segnati come -1. Allo stesso modo, i peptidi che sono 2 volte arricchiti in EV trattati con PK e localizzati nella regione citoplasmatica sono stati segnati come +1, ma se localizzati nella regione extracellulare, sono stati segnati -1. I peptidi con un cambiamento inferiore a 2 volte non sono stati presi in considerazione. Le proteine ​​con un valore superiore a 0 sono state considerate avere una "topologia convenzionale", vale a dire le loro parti citoplasmatiche o extracellulari sono individuate come annotate da Uniprot. Le proteine ​​con un punteggio inferiore a 0 sono state considerate avere una "topologia al rovescio". Se il punteggio era 0, non è stato possibile trarre alcuna conclusione e sono stati designati come "non conclusivi". Tra queste 410 proteine, 154, 136 e 120 proteine ​​sono state classificate rispettivamente come "topologia convenzionale", "topologia al rovescio" e "non conclusiva" (Fig. 5a). Allo stesso modo, sono state selezionate 49 proteine ​​transmembrane e ancorate ai lipidi tra 155 proteine ​​biotinilate. Anche la localizzazione dei peptidi biotinilati di tali proteine ​​è stata analizzata e similmente valutata. Se i peptidi biotinilati appartenevano alla regione citoplasmatica di una proteina, quella proteina veniva considerata come una "topologia al rovescio". Trentadue proteine ​​sono state classificate come "topologia convenzionale", sedici come "topologia al rovescio" e una come "non conclusiva" (Fig. 5a). Dopo aver confrontato le proteine ​​dentro e fuori dagli elenchi di PK e biotinilazione, abbiamo trovato quattro proteine ​​sovrapposte con topologia non convenzionale. Abbiamo assegnato a queste quattro proteine ​​una topologia dentro e fuori definitivamente e le 139 proteine ​​non sovrapposte aggiuntive come potenzialmente con una topologia dentro e fuori. Per cinque proteine, i dati erano contraddittori, quindi queste proteine ​​sono state assegnate come "non conclusive". Le quattro proteine ​​definitivamente capovolte e le proteine ​​totali sono elencate nella Tabella Supplementare S3. Nella Fig. 5b sono mostrati due esempi di proteine ​​decisamente dentro e fuori e dei loro peptidi identificati. Chiaramente, è concepibile e persino probabile che alcune delle potenziali proteine ​​dentro e fuori a volte siano orientate “dentro e fuori” e talvolta abbiano una topologia convenzionale.

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( a ) Diagramma gerarchico di definizione della topologia delle proteine ​​transmembrane e ancorate ai lipidi. Le proteine ​​sono state visualizzate con lo strumento Protter e le informazioni sui peptidi identificati sono state integrate. In base alla localizzazione dei peptidi, sono state definite la topologia corretta e il rovescio. ( b ) Illustrazione della topologia di due esempi di proteine ​​decisamente dentro e fuori. I peptidi trovati in LC-MS / MS sono stati visualizzati da Protter.

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Convalida del proteoma accessibile in superficie e al rovescio

I risultati finora indicano fortemente la presenza di proteine ​​localizzate sulla superficie dei veicoli elettrici, nonché di alcune proteine ​​legate alla membrana che non sono orientate nel loro orientamento annotato secondo Protter. Per confermare questi risultati, abbiamo eseguito numerosi esperimenti di validazione. Le macchie occidentali sono state condotte con EV sia trattati con PK che non trattati con sonde dirette verso le proteine ​​Flotillin-1, TSG101, GAPDH, STUB1, Histone H1 e PCNA (Fig. 6a). Flotillin-1 e TSG101 sono stati usati come marker per la parte luminale protetta. GAPDH, STUB1, Histone H1 e PCNA sono proteine ​​prese dal gruppo di proteine ​​"definite accessibili alla superficie" tra cui GAPDH e STUB1 sono precedentemente annotate per essere un componente del citoplasma, mentre l'istone H1 e il PCNA sono componenti nucleari. La macchia mostra che l'intensità di banda di GAPDH, STUB1, Histone H1 e PCNA era diminuita negli EV trattati con PK rispetto a quelli negli EV non trattati, mentre le bande TSG101 e Flotillin-1 non sono cambiate in modo marcato. Questi risultati confermano la nostra classificazione del proteoma accessibile dalla superficie usando il nostro approccio proteomico ad approccio multiplo, suggerendo inoltre che gli isolati EV contengono proteine ​​non EV localizzate sulla superficie dei veicoli elettrici.

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a ) analisi Western blot del proteoma EV accessibile alla superficie. STUB1, GAPDH, Histone H1 e PCNA sono proteomi accessibili in superficie, mentre Flotilin 1 e TSG101 sono proteomi EV. È stata misurata l'intensità della banda relativa. ( b ) Citometria a flusso di proteine ​​di membrana dentro e fuori. I veicoli elettrici sono stati catturati da microsfere coniugate con anticorpo SCAMP3 (pannello sinistro) o STX4 (pannello destro) e quindi rilevati con CD63 o CD81. ( c ) La percentuale di EV positivi per SCAMP3, STX4 e beta-actina è stata calcolata dopo l'incubazione con o senza lo 0, 1% di Tween-20.

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Sono state effettuate analisi citometriche di flusso per convalidare l'orientamento delle proteine ​​legate alla membrana, che i nostri dati di proteomica suggeriscono contraddire l'attuale dogma. Le perle magnetiche sono state rivestite con anticorpi diretti verso il dominio "interno" di SCAMP3 o STX4, proteine ​​prelevate rispettivamente dall'elenco delle proteine ​​"definitivamente dentro-fuori" o "potenzialmente dentro-fuori". Gli anticorpi sono diretti verso epitopi che dovrebbero essere presenti sulla parte luminale / citoplasmatica di queste proteine; pertanto, i granuli dovrebbero legarsi solo alle proteine ​​rovesciate sui veicoli elettrici. I veicoli elettrici catturati con perline sono stati quindi analizzati per i marcatori EV comuni CD81 e CD63. Si può osservare uno spostamento dell'MFI, che suggerisce la presenza di veicoli elettrici che trasportano proteine ​​dentro e fuori, nonché CD63 con la topologia corretta (Fig. 6b). Pertanto, questi esperimenti di citometria a flusso mostrano che alcuni EV ospitano effettivamente proteine ​​con topologia al rovescio, anche se questo sembra essere vero solo per una parte degli EV e delle proteine ​​della membrana EV. Per rafforzare ulteriormente questa conclusione, abbiamo anche valutato queste due proteine ​​usando la microscopia a campo largo. I veicoli elettrici sono stati colorati con il colorante lipidico PKH 26 e colorati in modo fluorescente con gli stessi anticorpi verso i domini interni di SCAMP3 e STX4 con o senza permeabilizzazione. Successivamente, abbiamo contato la fluorescenza sovrapposta tra il colorante PKH e gli anticorpi. Questa sovrapposizione significa EV che trasportano proteine ​​di membrana dentro e fuori. La beta-actina è stata usata come controllo proteico luminale, ma solo l'anticorpo secondario è stato usato come controllo per il legame non specifico. Il confronto tra l'uso di anticorpi primari e quello del solo secondario mostra chiaramente un aumento degli eventi di co-localizzazione in tutte e tre le proteine ​​(Fig. 6c). Permeabilizzando gli EV, l'aumento sostanziale della co-localizzazione della beta-actina indica che una certa quantità di beta-actina è presente sulla superficie degli EV, sebbene la maggior parte di questa proteina sia luminale. Questa scoperta conferma anche il successo della permeabilizzazione dei veicoli elettrici. È importante sottolineare che il numero di punti co-localizzati dopo la permeabilizzazione è notevolmente aumentato per STX4 ma non per SCAMP3, indicando che solo una parte degli EV che trasportano STX4 ha la topologia al rovescio, mentre appare come SCAMP3 esiste solo nel suo orientamento inverso. Nel loro insieme, questi risultati confermano che una porzione di proteine ​​legate alla membrana nei veicoli elettrici ha una topologia capovolta.

Discussione

Vi è un crescente interesse per la biologia e la funzione dei veicoli elettrici poiché queste vescicole hanno il potenziale per essere biomarcatori diagnostici o usati come vettori di trattamento. Tuttavia, prima che i veicoli elettrici possano svolgere i loro ruoli clinici, è necessario superare numerosi ostacoli. Ad esempio, il proteoma di superficie e il proteoma del carico devono essere identificati separatamente e la topologia delle proteine ​​della membrana EV deve essere determinata.

Qui descriviamo il carico EV con una prospettiva proteomica dettagliata. È stato applicato un approccio bidirezionale in cui i campioni sono stati sottoposti a proteinasi o biotina di sulfo-NHS, che degrada o biotinilano le proteine ​​con epitopi (lisina e terminali N) esposti alla superficie del bi-strato lipidico EV. È importante sottolineare che vari gruppi di ricerca hanno già esaminato l'effetto del congelamento e dello scongelamento sui veicoli elettrici. Poiché questi studi suggeriscono che il contenuto di proteine ​​e dimensioni è influenzato dal congelamento e dallo scongelamento 21, 22, abbiamo scelto di analizzare il proteoma solo in campioni freschi. Usando l'analisi comparativa e quantitativa, abbiamo definito 14 proteine ​​come proteine ​​definitivamente accessibili in superficie e 641 proteine ​​come proteine ​​potenziali / probabilmente accessibili in superficie (Fig. 2d). I nostri risultati suggeriscono che sulla superficie degli isolati EV sono presenti più proteine ​​citosoliche e nucleari. Queste proteine ​​potrebbero essere collegate ai veicoli elettrici mediante legame non covalente e non è chiaro se queste proteine ​​siano molecole di superficie EV naturali o se questo sia il risultato di condizioni di coltura in vitro .

Un'analisi più dettagliata del proteoma EV a livello di peptidi ha rivelato che in alcuni casi parti citoplasmatiche o piuttosto luminali di alcune proteine ​​di membrana sembravano essere degradate dalla PK. Questa scoperta ci ha portato a formare l'ipotesi che alcune di queste proteine ​​esistessero nella membrana con un orientamento topologicamente invertito rispetto a quanto precedentemente annotato. Due esempi di proteine ​​con topologia al rovescio, SCAMP3 e STX4, sono stati validati usando diverse tecniche sperimentali (Fig. 6). È interessante notare che la maggior parte delle proteine ​​di Rab, che sono molecole ancorate ai lipidi, sono state classificate come aventi una topologia capovolta o nessuna conclusione (Tabella S2). Abbiamo scoperto che la proteina Rab5b ha una topologia capovolta e uno studio precedente ha scoperto che Rab5b è localizzato sulla superficie dei veicoli elettrici 23 . Oltre a questa osservazione, alcuni studi dimostrano che l'RNA può essere localizzato sulla superficie dei veicoli elettrici, come suggerito dagli effetti del trattamento RNase 24, anche se la maggior parte degli studi afferma che l'RNA è protetto all'interno dei veicoli elettrici 1, 25, 26 . I nostri risultati e studi precedenti sostengono l'esistenza di veicoli elettrici interni-esterni o la topologia interna-esterna di alcuni componenti specifici di veicoli elettrici, sebbene sia necessario uno studio più approfondito per confermare queste conclusioni.

La presenza di "proteine ​​dentro e fuori" è sconcertante e il potenziale significato di questo fenomeno ancora di più. Una spiegazione per questo è che l'EV proviene da un'area in cui è avvenuta la traslocazione delle proteine, come il reticolo endoplasmatico 27 . Inoltre, la topologia proteica è influenzata da molteplici fattori 28 come la composizione lipidica locale 29 . Si può ipotizzare che durante la biogenesi, se una vescicola ER trasporta una proteina durante la sua traslazione nell'endosoma tardivo o nell'MVB in allattamento, l'ambiente lipidico alterato favorirebbe un orientamento topologico non convenzionale. In alternativa, l'ambiente alterato potrebbe essere sufficiente per indurre una proteina già completamente inserita a modificarne la conformazione.

Recenti studi sulla diversità dei veicoli elettrici rivelati da cryo-EM hanno dimostrato che i veicoli elettrici hanno una morfologia molto varia, non solo vescicole a membrana singola ma anche vescicole a membrana doppia 30 . In tali casi, la vescicola interna è protetta dalla membrana della vescicola esterna, che deve essere presa in considerazione quando si interpretano sia il trattamento farmacologico che i dati di biotinilazione. Un'altra possibile ragione per le proteine ​​che hanno invertito la topologia potrebbe essere che la stabilità della proteina di membrana è compromessa dal trattamento con PK e quindi la topologia nativa diventa energicamente sfavorevole, determinando l'espulsione di alcune regioni citoplasmatiche nell'ambiente extra-vescicolare. In alternativa, il trattamento con PK potrebbe destabilizzare alcune proteine ​​di membrana in modo tale che le sequenze luminali che sarebbero altrimenti inaccessibili alle proteasi endogene diventino accessibili e quindi alla degradazione sembrerebbero mancanti nella proteomica. Tuttavia, entrambe queste spiegazioni sono speculative ed è necessario un ulteriore studio.

In conclusione, il nostro studio fornisce una mappa globale della topologia del proteoma dei veicoli elettrici isolati dalle cellule HMC-1 (Fig. 7). Molte proteine ​​sono localizzate sulla superficie del doppio strato lipidico EV e alcune proteine ​​di membrana hanno una topologia capovolta. Questi risultati forniscono una nuova visione del proteoma EV e aiutano a spiegare la presenza di impurità come risultato dell'isolamento EV. Il nostro flusso di lavoro presentato sarà molto utile per il campo proteomico EV e potrebbe essere applicato ad altri tipi di EV per descrivere il loro orientamento proteico vescicolare, eventualmente spiegando alcune funzioni EV.

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Sono illustrati esempi selezionati di proteine. Le proteine ​​negli isolati EV possono essere localizzate all'interno (scatola blu) o sulla superficie (scatola grigia) degli EV. Inoltre, alcune delle proteine ​​transmembrane e ancorate ai lipidi hanno una topologia al rovescio (scatola verde).

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metodi

Coltura cellulare

La linea di mastociti umani HMC-1 (Dr. Joseph Butterfield, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) è stata coltivata su terreno IMDM (HyClone) integrato con siero bovino fetale impoverito di EV al 10% (Sigma Aldrich), 2 mM L- glutammina (HyClone), 100 unità / ml di penicillina, 100 μg / ml di streptomicina (HyClone) e 1, 2 U / ml di 1-tioglicerolo (Sigma Aldrich). L'FBS è stato ultracentrifugato a 118.000 × g avg (rotore di Tipo 45 Ti, fattore k 178.6, Beckman Coulter, CA, USA) per 18 ore e filtrato attraverso un filtro da 0, 22 μm per impoverirlo di EV, come precedentemente descritto 31 .

Isolamento di vescicole extracellulari

Le cellule HMC-1 sono state seminate in terreni IMDM con FBS impoverito di EV al 10% a una concentrazione di 5 × 10 5 cellule / ml e incubate per tre giorni a 37 ° C in atmosfera umidificata con CO 2 al 5%. I terreni condizionati sono stati raccolti e centrifugati a 300 × g per 10 minuti per rimuovere le cellule. Il surnatante è stato quindi centrifugato a 16.500 × g avg per 20 minuti per rimuovere corpi apoptotici e particelle più grandi. Infine, il surnatante è stato ultracentrifugato a 118.000 × g avg (Tipo 45 Ti) per 3, 5 ore e il pellet risultante è stato risospeso in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Per ottenere una maggiore purezza di EV, è stata condotta una centrifugazione isopycnic, usando un gradiente di iodixanolo (OptiPrep, Sigma Aldrich, Saint Louis, USA). I veicoli elettrici in PBS (1 ml) sono stati miscelati con il 60% di iodixanolo (3 ml) e posati sul fondo di una provetta per ultracentrifuga. Un gradiente discontinuo di iodixanolo (35, 30, 28, 26, 24, 22, 20%; 1 ml ciascuno, ma 2 ml per il 22%) in saccarosio 0, 25 M, 10 mM Tris e 1 mM EDTA sono stati sovrapposti e infine le provette sono stati riempiti fino al completamento con circa 400 ml di PBS. I campioni sono stati ultracentrifugati a 178.000 × g avg (SW 41 Ti, fattore k 143.9, Beckman Coulter) per 16 ore. Le frazioni (1 ml) sono state raccolte dall'alto verso il basso e sottoposte all'analisi Western blot per identificare i marcatori EV. La miscela della frazione 2 e 3 è stata diluita con PBS (fino a 94 ml) e ultrancetrifugata a 118.000 × g avg (Tipo 45 Ti) per 3, 5 ore. I veicoli elettrici pellettizzati sono stati risospesi in PBS. La concentrazione di proteine ​​è stata misurata con il kit di dosaggio delle proteine ​​BCA (Thermo Fisher Scientific). I veicoli elettrici isolati mediante ultracentrifugazione con gradiente di densità sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti in questo studio. È importante sottolineare che tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in sequenza e i veicoli elettrici non sono mai stati congelati.

Microscopio elettronico

Per Cryo-EM, EVs appena isolati, trattati con PK e non trattati, sono stati congelati a immersione come precedentemente descritto 30, usando un Vitrobot Mk2 (FEI; Eindhofen, Paesi Bassi). Le immagini sono state acquisite utilizzando il software TVIPS EMMENU 3.0 e una telecamera TVIPS TemCam F224 su un microscopio FEI CM200 operato a 200kV in modalità a basso dosaggio. Per la microscopia elettronica a macchia negativa, le vescicole trattate con PK e non trattate sono state posizionate su griglie per microscopia elettronica formvar e con rivestimento in carbonio (Cu; 200 mesh) per 5 min. I campioni sono stati lavati (3 volte con PBS) e quindi fissati con glutaraldeide al 2, 5% in PBS. Dopo altri due lavaggi in acqua filtrata, i campioni sono stati colorati con uranil acetato al 2% per 1, 5 minuti. Le immagini sono state scattate utilizzando una telecamera CCD SiS Morada (Olympus, Münster, Germania) su un microscopio elettronico Omega LEO 912AB (Carl Zeiss NTS, Jena, Germania) operato a 120kV.

Analisi Western blot

Le proteine ​​EV sono state separate da SDS-PAGE e trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene. La membrana è stata bloccata con latte secco senza grassi al 5% in soluzione salina tamponata con Tris con 0, 05% di interpolazione 20 (TBST) per 2 ore. Le membrane sono state quindi incubate con i seguenti anticorpi primari: anti-CD81 (H-121, Santa Cruz Biotechnology), anti-TSG101 (Abcam), anti-GAPDH (6c5, Santa Cruz Biotechnology), anti-beta-actina (C4, Santa Cruz Biotechnology), anti-STUB1 (Abcam), anti-KIF14 (Abcam). Tutti gli anticorpi sono stati diluiti con latte secco senza grassi allo 0, 25% in TBST allo 0, 05% a 4 ° C durante la notte. La membrana è stata lavata con 0, 05% TBST e quindi incubata con l'anticorpo secondario per 2 ore. Dopo il lavaggio con lo 0, 05% di TBST, le bande immuno-reattive sono state visualizzate utilizzando il substrato SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity (Thermo Fisher Scientific) o il reagente di rilevamento Western Blotting ECL Prime Amersham (GE healthcare) con VersaDoc 4000 MP (Bio-Rad Laboratories) . L'intensità della banda è stata misurata utilizzando il programma Image J e normalizzata dall'intensità di EV non trattati.

Misurazione delle particelle

Il numero di veicoli elettrici è stato misurato utilizzando ZetaView PMX 110 (Particle Metrix). Ogni frazione del gradiente OptiPrep è stata diluita con PBS e misurata. La temperatura della camera è stata misurata automaticamente e applicata al calcolo. I dati sono stati ottenuti da misurazioni triplicate e ogni singolo dato è stato ottenuto da due strati fissi con una misurazione cinque volte in ciascun livello. La sensibilità della telecamera era 70. I dati sono stati analizzati utilizzando il software di analisi ZetaView versione 8.2.30.1 con una dimensione minima di 5, una dimensione massima di 1000 e una luminosità minima di 20.

Trattamento con proteinasi K.

I veicoli elettrici sono stati diluiti a una concentrazione di 860 μg / ml di proteine ​​e incubati con 20 μg / ml di proteinasi K (Invitrogen) e 5 mM CaCl 2 in PBS per 1 ora a 37 ° C con leggero vortice ogni 15 minuti. L'attività della proteinasi è stata quindi inibita aggiungendo 5 mM di fenilmetilsolfonil fluoruro per 10 minuti a temperatura ambiente.

Digestione di tripsina / Lys-C ed etichettatura della biotina

I veicoli elettrici sono stati trattati con una miscela di 20 μg / ml di tripsina e 10 μg / ml di Lys-C per 2 ore a 37 ° C. Dopo il trattamento con proteinasi, i veicoli elettrici sono stati incubati con 20 mM EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Thermo Fischer Scientific) per 30 minuti a temperatura ambiente. L'eccessiva biotina è stata spenta usando idrossilammina 10 mM. La separazione è stata eseguita utilizzando l'elaborazione del campione FASP e la dissalazione delle colonne di centrifuga C18 secondo le istruzioni del produttore.

Analisi LC-MS / MS

I peptidi sono stati ricostituiti con 15 ml di acido formico allo 0, 1% (Sigma Aldrich) in acetonitrile al 3% e analizzati su uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Tribrid interfacciato con un Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific). I peptidi (volume di iniezione di 2 μl) sono stati separati usando una colonna analitica (200 × 0, 075 mm ID) confezionata internamente con particelle di Reprosil-Pur C18-AQ da 3 μm (Dr. Maisch, Germania). È stato eseguito un gradiente a 200 nl / min; dal 5% di solvente B (acetonitrile in acido formico 0, 2%) all'80% B, oltre 90 minuti in solvente A (acido formico 0, 2%). Gli ioni sono stati iniettati nello spettrometro di massa con una tensione di spruzzatura di 1, 6 kV in modalità ioni positivi. Le scansioni MS sono state eseguite a una risoluzione di 120.000, intervallo m / z 400–1500, l'analisi MS / MS è stata eseguita in modalità dipendente dai dati, con un ciclo di velocità massima di 3 secondi per ioni precursori caricati doppiamente o moltiplicati. Gli ioni in ogni scansione MS sono stati selezionati per la frammentazione (MS2) per dissociazione indotta da collisione (CID) al 30% e il rilevamento nella trappola ionica e l'esclusione dinamica entro 20 ppm durante 30 secondi sono stati usati per valori m / z già selezionati per la frammentazione. Ogni campione è stato analizzato due volte utilizzando prima i precursori più intensi al di sopra della soglia 10000 e poi i precursori meno intensi nella seconda iniezione.

Identificazione e quantificazione delle proteine

Sono stati generati elenchi di picco di dati MS e peptidi / proteine ​​identificati e quantificati utilizzando lo strumento di quantificazione MaxQuant con il motore di ricerca Andromeda (versione 1.5.2.8). I parametri di ricerca utilizzati erano i seguenti: specificità enzimatica, tripsina; modifica variabile per ossidazione della metionina (15.995 Da) e modifica fissa per carbamidometilazione della cisteina (57.021 Da); due fenditure mancate; 20 ppm per la tolleranza agli ioni precursore e 4, 5 ppm per la tolleranza agli ioni frammento. Per la ricerca è stato utilizzato il set di proteomi di riferimento Homo sapiens dal database Swiss-Prot (20196 voci), contaminanti e sequenze inverse. Per l'identificazione di peptidi e proteine, l'1% della percentuale di falsi scoperti è stata determinata accumulando l'1% dei risultati inversi del database. La lunghezza minima del peptide era di sette aminoacidi. Il primo ID proteico di maggioranza è stato selezionato come proteina rappresentativa del gruppo proteico e utilizzato come ID proteico per ulteriori analisi. Per ottenere i dati quantitativi, è stata applicata la quantificazione senza etichetta (LFQ) con un minimo di due conteggi del rapporto. È stata ottenuta un'intensità LFQ normalizzata.

Analisi sistemica

I dati sulla localizzazione delle proteine ​​sono stati ottenuti dal database Uniprot e la localizzazione primaria viene utilizzata per ulteriori analisi. I termini del processo biologico dell'analisi dell'ontologia genica (GO) sono stati ottenuti usando DAVID (//david.ncifcrf.gov/).

Microscopia fluorescente

I veicoli elettrici sono stati sparsi su un vetrino per microscopia (superfrost +) e sono stati lasciati attaccare alla superficie durante la notte a 4 ° C. I vetrini sono stati lavati tre volte con PBS e quindi bloccati per 30 minuti utilizzando BSA all'1% in PBS. Per la permeabilizzazione, i campioni sono stati incubati con Tween-20 allo 0, 1% in PBS per 5 minuti e quindi lavati tre volte con PBS prima della fase di blocco. Dopo il blocco, i campioni sono stati incubati con anticorpi primari contro STX4, SCAMP3 o beta-actina che sono stati diluiti in PBS contenente 1% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente, lavati con PBS e quindi incubati con anticorpi secondari che sono stati diluiti in PBS contenente 1% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Seguirono altri tre lavaggi con PBS. Il kit di collegamento cellulare fluorescente rosso PKH26 (Sigma Aldrich) è stato utilizzato per colorare la membrana EV e i campioni sono stati montati utilizzando il mezzo di montaggio contenente DAPI. I campioni sono stati ripresi con un osservatore Axio (Zeiss). Il tempo di esposizione per i due canali valutati è stato costante per tutti i campioni. L'analisi computazionale è stata effettuata utilizzando il software ZEN Blue e ImageJ.

Citometria a flusso

L'analisi EV con citometria a flusso è stata eseguita utilizzando microsfere rivestite di anticorpo. Le perle rivestite anti-CD63 sono state acquisite commercialmente (reagente di isolamento / rilevamento CD63 Exosome-Human (dai terreni di coltura cellulare), Thermo Fisher Scientific), mentre le perle rivestite anti-STX4 e anti-SCAMP3 sono state realizzate utilizzando un kit di coniugazione del tallone (Dynabeads Kit di accoppiamento anticorpo, Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. Le perle sono state lavate con PBS e quindi incubate con 15 μg di EV durante la notte a 4 ° C. Dopo l'incubazione, i campioni sono stati lavati 3 volte con PBS contenente 1% di FBS impoverito di EV, seguito da 15 minuti di incubazione con anticorpo IgG umano a 4 ° C. Dopo altri tre lavaggi, i campioni sono stati incubati per 40 minuti con anticorpi primari contro CD63 (PE Mouse Anti-Human CD63, BD Pharmingen), CD81 (PE Mouse Anti-Human CD81, BD Pharmingen), STX4 o SCAMP3 diluiti in PBS contenente 1% di FBS impoverito di EV. I campioni sono stati lavati e incubati per 20 minuti con anticorpi secondari coniugati Alexa 488 per STX4 e SCAMP3, dopo di che è stato eseguito un altro lavaggio. I campioni sono stati analizzati in una FACSAria (BD Pharmingen) e i risultati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (Tri Star).

Informazioni aggiuntive

Come citare questo articolo : Cvjetkovic, A. et al . Analisi dettagliata della topologia proteica delle vescicole extracellulari - Evidenza dell'orientamento non convenzionale delle proteine ​​di membrana. Sci. Rep. 6, 36338; doi: 10.1038 / srep36338 (2016).

Nota dell'editore: Springer Nature rimane neutrale per quanto riguarda le rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e nelle affiliazioni istituzionali.

Informazione supplementare

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