Confronto diretto di cassette di espressione specifiche per epatociti in seguito a trasferimento genico idrodinamico adenovirale e non virale | terapia genetica

Confronto diretto di cassette di espressione specifiche per epatociti in seguito a trasferimento genico idrodinamico adenovirale e non virale | terapia genetica

Anonim

Astratto

Gli epatociti sono un obiettivo chiave per il trattamento degli errori congeniti del metabolismo, della dislipidemia e dei disturbi della coagulazione. Lo sviluppo di potenti cassette di espressione è un obiettivo critico per migliorare l'indice terapeutico dei vettori di trasferimento genico. Qui abbiamo valutato 22 cassette di espressione specifiche dell'epatocita contenenti un transgene AI umano apo in seguito a trasferimento idrodinamico di plasmidi o trasferimento adenovirale con vettori E1E3E4 eliminati nei topi C57BL / 6. Il promotore DC172 costituito da un promotore di α 1 -antitripsina umana a 890 bp e due copie del potenziatore di microsplobulina α 1 da 160 bp determina livelli di espressione superiori rispetto ai costrutti contenenti il ​​promotore di antitripsina α 1 da 1, 5 kb, il fegato sintetico da 790 bp promotore specifico o il promotore DC190 contenente un promotore dell'albumina umana da 520 bp e due copie del potenziatore della protrombina da 99 bp. La cassetta di espressione più potente è costituita dal promotore DC172 a monte del transgene e da due copie della regione di controllo epatico-1. I minicerchi contenenti questa cassetta di espressione inducono livelli fisiologici persistenti di apo AI umano o fattore IX umano dopo trasferimento idrodinamico. In conclusione, in questo studio comparativo di 22 cassette di espressione specifiche per epatociti, il promotore DC172 in combinazione con due copie della regione di controllo epatico-1 induce i massimi livelli di espressione in seguito a trasferimento idrodinamico e adenovirale.

introduzione

Le cellule del fegato parenchimale (PC) o gli epatociti sono un obiettivo chiave per il trattamento degli errori congeniti del metabolismo, della dislipidemia e dei disturbi della coagulazione. La traduzione clinica del trasferimento genico richiede lo sviluppo di tecnologie con un indice terapeutico sufficientemente elevato. Lo sviluppo di potenti cassette di espressione è un obiettivo critico per migliorare l'indice terapeutico dei sistemi vettoriali di trasferimento genico. L'ottimizzazione dell'espressione del transgene può essere ottenuta modulando tutti i livelli di espressione tra cui trascrizione, modifica post-trascrizionale di RNA, esportazione di RNA, stabilità dell'RNA e traduzione. Il targeting trascrizionale mediante l'uso di cassette di espressione specifiche per epatociti può portare all'ignoranza immunologica o alla tolleranza per il prodotto transgenico. 1, 2, 3 Le cassette di espressione per il trasferimento diretto dagli epatociti sono state migliorate utilizzando nuove combinazioni promotore-potenziatore, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 inclusione di introni 5, 10, 11, 12, 13 e inclusione di sequenze trascrizionali aggiuntive come regioni attaccate a matrice di impalcature (SMAR) e regioni di controllo epatico (HCR). 12, 14, 15, 16, 17, 18 Tuttavia, poiché in questi studi sono stati utilizzati vettori di trasferimento genico diversi, dosi diverse e transgeni diversi, spesso mancano dati comparativi diretti per cassette di diversa espressione e ostacolano l'interpretazione della letteratura esistente.

Una delle principali limitazioni all'uso dei plasmidi nel trasferimento genico non virale è il silenziamento trascrizionale in vivo causato da sequenze batteriche legate covalentemente alla cassetta di espressione. 19, 20 I minicerchi sono privi di sequenze batteriche e possono indurre un'espressione persistente del transgene. 19, 21

Precedenti studi del nostro gruppo che hanno confrontato la potenza di differenti cassette di espressione hanno dimostrato che la combinazione del promotore di α 1 -antitripsina umana (AT) specifico per epatociti da 1, 5 kb e quattro copie del potenziatore di apo E umano ( E 4 ) produce un'espressione superiore livelli rispetto al promotore del citomegalovirus (CMV) onnipresentemente attivo, al promotore dell'RNA nucleare piccolo U1b murino ubiquamente attivo U1b e la combinazione del promotore AI o apo C-II apolipoproteina (apo) e quattro copie del potenziatore apo E umano. 1, 8, 22, 23, 24 In questi studi, il promotore è stato collocato a monte dei quattro esoni e dei tre introni del gene umano Apo AI . I topi C57BL / 6 sono tolleranti nei confronti dell'IA umana dopo il trasferimento con vettori adenovirali contenenti cassette di espressione specifiche per gli epatociti. 1, 22, 23 L'obiettivo del presente studio era di confrontare direttamente 22 cassette di espressione specifiche per epatociti contenenti un transgene Apo AI umano in topi C57BL / 6. Per ognuna di queste cassette di espressione, sono stati effettuati il ​​trasferimento genico idrodinamico dei plasmidi e il trasferimento genico con i corrispondenti vettori adenovirali eliminati con E1E3E4. Nel presente studio, il promotore DC172, costituito da un promotore di AT umano 890 bp e due copie del potenziatore di microglobulina 160 bp α 1, combinato con due copie della regione di controllo epatico-1 da 774 bp ( HCR-1 ), è la cassetta di espressione più potente sia nella regolazione del trasferimento adenovirale che idrodinamico. Il trasferimento idrodinamico dei minicerchi contenenti queste sequenze regolatorie trascrizionali induce persistentemente livelli fisiologici di apo AI umano e fattore IX umano (FIX) nei topi C57BL / 6.

risultati

La combinazione del promotore DC172 e due copie della regione di controllo epatico-1 produce i massimi livelli di espressione transgenica dopo il trasferimento idrodinamico e adenovirale

Il costrutto contenente il promotore di AT umano a 1, 5 kb a monte della sequenza genomica di apo AI umano ( gA-I ) e quattro copie del potenziatore di apo E umano a 154 bp è stato precedentemente dimostrato di costituire la cassetta di espressione più potente negli studi di Van Linthout et al. 8, 24 Questo costrutto ( AT.gA-IE 4 ) era il costrutto di riferimento nel presente studio. Per ottimizzare ulteriormente l'espressione del transgene in seguito al trasferimento diretto dagli epatociti, il costrutto di riferimento è stato confrontato con 21 cassette di espressione aggiuntive specifiche per gli epatociti in topi C57BL / 6 a seguito del trasferimento idrodinamico di 70 μg di plasmidi o trasferimento genico con 5 × 10 10 particelle di E1E3E4 cancellate vettori adenovirali. La Figura 1 mostra la cinetica dell'espressione di apo AI umana dopo il trasferimento idrodinamico e adenovirale con il costrutto di riferimento. Mentre l'espressione di picco dopo il trasferimento idrodinamico e adenovirale era simile, i livelli di espressione al giorno 35 dopo il trasferimento idrodinamico erano 12 volte ( P <0, 0001) inferiori rispetto a dopo il trasferimento con vettori adenovirali eliminati con E1E3E4. Il picco dell'espressione di apo AI umana dopo il trasferimento idrodinamico di plasmidi convenzionali, l'espressione di picco dopo il trasferimento adenovirale e l'espressione al giorno 35 dopo il trasferimento adenovirale per tutti i 22 costrutti valutati in questo studio sono rappresentati nella Tabella 1. Espressione di apo AI umana al giorno 35 dopo il trasferimento idrodinamico di i plasmidi erano inferiori a 15 mg per 100 ml per tutti i costrutti (dati non mostrati). La Figura 2 mostra il grafico di regressione lineare per l'espressione di picco dopo trasferimento genico idrodinamico come variabile indipendente e l'espressione di apo AI apo umano (Figura 2a) o espressione di Apo AI umano al giorno 35 (Figura 2b) dopo il trasferimento con i corrispondenti vettori adenovirali come dipendenti variabile. Il coefficiente di correlazione era 0, 88 ( P <0, 0001) e 0, 83 ( P <0, 0001) per i dati rappresentati nelle figure 2a e b, rispettivamente.

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Confronto della cinetica dell'espressione di apo AI umana dopo trasferimento idrodinamico con 70 μg del plasmide di riferimento pAT.gA-IE 4 (•; n = 5) o con 5 × 10 10 particelle del vettore adenovirale di riferimento AdAT.gA-IE 4 (○; n = 20). Tutti i dati sono espressi come media ± sem

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Tabella a grandezza naturale

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Grafico di regressione lineare per l'espressione di picco dopo trasferimento genico idrodinamico come variabile indipendente e l'espressione di apo AI apo umana ( a ) o espressione di apo AI umana al giorno 35 ( b ) dopo il trasferimento con vettori adenovirali eliminati E1E3E4 come variabile dipendente. Le 22 cassette di espressione specifiche per epatociti mostrate in questi grafici sono elencate nella Tabella 1. Il coefficiente di correlazione è 0, 88 ( P <0, 0001) e 0, 83 ( P <0, 0001) per i dati rappresentati nei pannelli aeb, rispettivamente.

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Per i costrutti contenenti il ​​promotore di AT umano 1, 5 kb e quattro copie del potenziatore di apo E umano ( E 4 ), l'espressione del transgene è stata confrontata per la sequenza di cDNA AI di apo umano, la sequenza di cDNA preceduta da una regione 5 'non tradotta (UTR) contenente il primo introne del gene umano Apo AI ( introne AI ) o un primo introne troncato del gene fattore IX ( introne FIX ) e gA-I (Tabella 1). I livelli di espressione di apo AI umano erano significativamente più alti quando il primo introne del gene di apo AI o FIX umano era incorporato nella cassetta dell'espressione (Tabella 1). La presenza di tutti e tre gli introni del gene umano apo AI nel costrutto AT.gA-IE 4 ha comportato un ulteriore significativo incremento dei livelli di espressione rispetto ai costrutti AT.AI intron.cDNA.E 4 e AT.FIX intron.cDNA .E 4 . Tutti gli ulteriori esperimenti sono stati condotti con costrutti contenenti il ​​genomico gA-I umano. La presenza di SMAR da 2, 0 kb dalla regione 5 ′ del gene dell'interferone -β umano nel costrutto E 4 .AT.gA-I.SMAR non ha aumentato i livelli di espressione a seguito del trasferimento adenovirale (Tabella 1).

Successivamente, il costrutto di riferimento ( AT.gA-IE 4 ) è stato confrontato con costrutti contenenti il ​​promotore specifico del fegato sintetico ( LSP ), il promotore DC190 e il promotore DC172 . Questi tre promotori sono stati combinati con zero, due o quattro copie del potenziatore di apo E umano a 154 bp. Rispetto al costrutto di riferimento, le cassette di espressione contenenti il ​​promotore LSP hanno prodotto livelli di espressione significativamente più bassi mentre i costrutti contenenti il ​​promotore DC190 hanno indotto un'espressione transgenica equivalente o inferiore indotta (Tabella 1). La combinazione del promotore DC172 e quattro copie del potenziatore dell'atopo umano A ha portato a livelli di espressione superiori dopo il trasferimento adenovirale rispetto al costrutto di riferimento.

Il potenziatore apo E fa parte dell'HCR-1 . Abbiamo valutato se la sostituzione di esaltatori di apo E con una o più copie di HCR-1 determina livelli di espressione migliorati in costrutti contenenti il ​​promotore AT o DC172 (Tabella 1). La combinazione del promotore DC172 e due copie di HCR-1 ( DC172.gA-I.HCR 2 ) ha portato a livelli di Apo umano picco apice umano 1, 7- ( P <0, 01) e 2, 9 volte più alti ( P <0, 01) dopo idrodinamica ( Tabella 1) e trasferimento genico adenovirale (Tabella 1), rispettivamente. L'espressione di apo AI umana al giorno 35 dopo il trasferimento con AdDC172.gA-I.HCR 2 era 2, 6 volte maggiore ( P <0, 01) rispetto a dopo il trasferimento con il vettore di riferimento AdAT.gA-IE 4 (Tabella 1). La combinazione del promotore DC172 e quattro copie di HCR-1 ha prodotto livelli di espressione equivalenti rispetto al promotore DC172 combinato con due copie di HCR-1 (Tabella 1).

Il trasferimento genico con minicerchi contenenti il ​​promotore DC172 e due copie della regione di controllo epatico-1 induce un'espressione persistente di apo AI umana

Il trasferimento idrodinamico dei plasmidi provoca un forte calo dei livelli di espressione, come mostrato nella Figura 3a per il trasferimento genico con 70 μg di pDC172.gA-I.HCR 2 . Al contrario, l'espressione di apo AI umana è stata sostenuta a livelli fisiologici per l'intero periodo di follow-up di 3 mesi dopo il trasferimento idrodinamico con 20 μg di minicerchi contenenti il ​​promotore DC172 a monte del genomico gA-I umano e due copie di HCR-1 ( mcDC172.gA-I.HCR 2 ) (Figura 3a). I livelli di Apo umana al giorno 35 dopo il trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.HCR 2 (83 ± 6, 4 mg per 100 ml) erano 6, 5 volte ( P <0, 0001) più alti rispetto al trasferimento con 70 μg del corrispondente plasmide (13 ± 1, 7 mg per 100 ml). L'espressione al giorno 35 dopo il trasferimento con mcDC172.gA-I.HCR 2 era 2, 8 volte inferiore ( P <0, 0001) e non significativamente diversa rispetto al trasferimento genico con 5 × 10 10 particelle dei vettori adenovirali AdDC172.gA-I.HCR 2 (Figura 3a) e AdAT.gA-IE 4 (Figura 1). Dosi più elevate di minicerchi non aumentavano i livelli di espressione (dati non mostrati). Per confermare la potenza del promotore DC172 e due copie di HCR-1, l'espressione umana FIX è stata valutata dopo il trasferimento genico con 5 × 10 10 particelle di AdDC172.AI intron.FIX.HCR 2 e dopo trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172. AI intron.FIX.HCR 2 (Figura 3b). I livelli di FIX nell'uomo erano soprafisiologici dopo il trasferimento adenovirale e nel range fisiologico dopo il trasferimento genico con minicerchi (Figura 3b).

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( a ) Confronto dell'espressione di apo AI umana in seguito a trasferimento idrodinamico del gene con 70 μg del plasmide pDC172.gA-I.HCR 2 (•; n = 10), trasferimento genico con 5 × 10 10 particelle di AdDC172.gA-I. HCR 2 (○; n = 15) o trasferimento genico idrodinamico di 20 μg di minicerchi mcDC172.gA-I.HCR 2 (▴; n = 20). ( b ) Confronto dell'espressione del fattore IX umano a seguito del trasferimento genico con 5 × 10 10 particelle di AdDC172.AI intron.FIX.HCR 2 (○; n = 5) o trasferimento idrodinamico di 20 μg di minicerchi mcDC172.AI intron.FIX. HCR 2 (▴; n = 5). Tutti i dati sono espressi come media ± sem

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Confronto tra cinetica del DNA transgenico a seguito di trasferimento idrodinamico di minicerchi e trasferimento adenovirale che esprime apo AI umana

Per confrontare la cinetica del DNA transgenico intraepatico a seguito del trasferimento idrodinamico di minicerchi e trasferimento adenovirale, PC e cellule epatiche non parenchimali (NPC) sono stati separati mediante perfusione di collagenasi e centrifugazione di Nycodenz a 1, 24 ore e 35 giorni dopo il trasferimento (Tabella 2). I livelli iniziali di DNA transgenico nel PC fegato e NPC erano significativamente più alti dopo il trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.HCR 2 rispetto al trasferimento con 5 × 10 10 particelle di AdDC172.gA-I.HCR 2 . Non vi è stata alcuna riduzione significativa del numero di copie del DNA transgenico nel PC tra 24 ore e il giorno 35 dopo il trasferimento adenovirale. Il numero di copie nel PC a 24 ore era 5, 8 volte ( P <0, 01) superiore dopo il trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.HCR 2 rispetto a dopo il trasferimento con AdDC172.gA-I.HCR 2, ma un 8, 0 -piegata riduzione ( P <0, 01) si è verificata tra 24 ore e 35 giorni dopo il trasferimento idrodinamico con conseguenti livelli di DNA del transgene simili rispetto a dopo il trasferimento adenovirale al giorno 35.

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Confronto dell'infiammazione del fegato a seguito di trasferimento idrodinamico di minicerchi e trasferimento adenovirale che esprime apo AI umana

Le figure 4a eb mostrano il numero di neutrofili infiltranti e cellule T positive per CD3, rispettivamente, in punti temporali diversi dopo il trasferimento adenovirale e idrodinamico. Il numero di neutrofili infiltranti per mm 2 era 1, 5- ( P <0, 02) e 3, 8 volte ( P <0, 0001) superiore a 6 e 24 ore, rispettivamente, dopo il trasferimento idrodinamico con i minicerchi rispetto a dopo il trasferimento adenovirale e tornato al basale in un secondo momento punti per trasferimento sia idrodinamico che adenovirale (Figura 4a). La Figura 4b illustra che il numero di linfociti T CD3 positivi infiltranti era significativamente più alto a 24 ore e al giorno 3 dopo il trasferimento idrodinamico rispetto al trasferimento adenovirale mentre al giorno 7 e al giorno 10 è stato osservato il contrario. Il numero di linfociti T CD3 positivi è tornato al basale il giorno 21 dopo il trasferimento sia per trasferimento idrodinamico che adenovirale (Figura 4b).

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Infiammazione del fegato a seguito di trasferimento adenovirale con 5 × 10 10 particelle di AdDC172.gA-I.HCR 2 (barre bianche) e trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.HCR 2 (barre nere). Il numero di neutrofili infiltranti e linfociti T positivi per CD3 è mostrato rispettivamente nei pannelli aeb. Tutti i dati sono espressi come media ± sem ( n = 5 per ogni condizione sperimentale). * P <0, 01 rispetto al gruppo di base del vettore adenovirale; P <0, 01 rispetto al gruppo di base idrodinamico.

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Assenza di replicazione episomica a seguito del trasferimento idrodinamico del gene con minicerchi contenenti SMAR e l'origine della replicazione SV40

Per valutare se l'origine della replicazione SV40 e il SMAR interferone β umano possano conferire replicazione episomica ai minicerchi, è stato eseguito il trasferimento idrodinamico del gene con 20 μg di minicerchi contenenti il ​​promotore DC172 a monte di gA-I, il SMAR interferone β umano, due copie di HCR-1 e l'origine della replica SV40 (mcDC172.gA-I.SMAR.HCR 2 .SV40ori). Le figure 5a e b mostrano che un'epatectomia parziale al 70% al giorno 6 dopo il trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.HCR 2 e mcDC172.gA-I.SMAR.HCR 2 .SV40ori, rispettivamente, hanno provocato un forte calo dei livelli di espressione AI di apo umano. Rispetto ai topi senza epatectomia parziale, il numero di copie del DNA transgenico di apo AI umano al giorno 35 dopo il trasferimento nei topi con epatectomia parziale al giorno 6 era 5, 4- ( P <0, 01) e 5, 5 volte ( P <0, 01) inferiore per mcDC172.gA -I.HCR 2 e mcDC172.gA-I.SMAR.HCR 2 .SV40ori, rispettivamente (Tabella 3).

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Assenza di replicazione episomica a seguito del trasferimento idrodinamico del gene con minicerchi. Tutti i dati sono espressi come media ± sem ( a ) Espressione di apo AI umana dopo trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.HCR 2 con (▵; n = 5) o senza (▴; n = 10) epatectomia parziale a giorno 6; ( b ) Espressione di apo AI umana dopo trasferimento idrodinamico con 20 μg di mcDC172.gA-I.SMAR.HCR 2 .SV40ori con (▵; n = 5) o senza (▴; n = 5) epatectomia parziale al giorno 6. Tutto i dati sono espressi come media ± sem

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Discussione

I principali risultati del presente studio sul trasferimento genico diretto dagli epatociti sono che (1) il promotore DC172 è più potente dell'AT umano 1, 5 kb, dell'LSP e dei promotori DC190 ; (2) la combinazione del promotore DC172 e due copie dell'HCR -1 umano si traduce nei massimi livelli di intelligenza artificiale apo umana dopo trasferimento genico idrodinamico e adenovirale; (3) trasferimento genico idrodinamico di minicerchi contenenti la più potente cassetta di espressione determina livelli fisiologici sostenuti di apo AI umano e FIX umano e (4) trasferimento genico idrodinamico di minicerchi contenenti l'interferone β umano SMAR e l'origine della replica SV40 non provocare una replicazione episomica dei minicerchi dopo epatectomia parziale.

Promotori fortemente attivi come il citomegalovirus umano promotore genico precoce immediato (CMV) e il promotore del fattore di allungamento 1-α sono stati spesso usati per indurre alti livelli di espressione del transgene. 25 Tuttavia, l'espressione nelle cellule presentanti l'antigene potenzia le risposte immunitarie adattive e questo può essere eluso dall'uso di promotori specifici per gli epatociti. 1, 2, 3 Inoltre, in precedenza, abbiamo dimostrato che la combinazione del promotore AT e quattro copie del potenziatore dell'atopo E umano produce livelli di espressione superiori rispetto al promotore CMV onnipresente attivo. 1, 8, 23 I promotori specifici dell'epatocita più frequentemente utilizzati, con o senza fusione di uno o due elementi esaltatori eterologhi, sono il promotore umano AT, 4, 12, 26, 27 il promotore dell'albumina 28, 29 e il promotore LSP . 3, 7, 9 In questo studio comparativo diretto usando il trasferimento genico idrodinamico e adenovirale, mostriamo che il promotore DC172 , costituito da un promotore di AT umano a 890 bp e due copie del potenziatore di 1- microroglobulina 160 bp α, combinato con due o quattro copie dell'HCR-1 3 ′ del transgene costituiscono la cassetta di espressione più potente. Il promotore del precursore α 1 -microglobulina / bikunin è debole e onnipresente, ma l'espressione nel PC è potentemente aumentata da un potenziatore specifico dell'epatocita situato a 2, 7 kb a valle del promotore. 30, 31, 32 Poiché è improbabile che vi siano differenze sostanziali nell'attività trascrizionale dei promotori AT 1, 5 kb e 890 bp AT, i nostri risultati suggeriscono che l'effetto di due copie del potenziatore della α 1- microroglobulina nel promotore DC172 è equivalente all'effetto di quattro copie del potenziatore apo E ( DC172.gA-I contro AT.gA-IE 4 ). La combinazione di due copie del potenziatore della microroglobulina α 1 e di quattro copie del potenziatore dell'apo E umano determina un ulteriore significativo incremento dei livelli di espressione, ma i livelli di espressione più elevati si osservano quando quattro esaltatori dell'apogeo umano E vengono sostituiti da due o quattro copie dell'HCR-1 . L' HCR-1 , precedentemente descritto da Simonet et al. , 33 contiene il potenziatore di 154 bp apo E. 34 I nostri dati indicano chiaramente che parte dell'effetto di HCR-1 è mediata da sequenze in HCR-1 diverse dal potenziatore di apo E.

Il potenziamento dell'espressione del transgene da parte degli introni 5, 10, 11, 12, 13 è confermato nel presente studio. Tutti i costrutti nel presente studio contengono un introne nel sito di giunzione / poliadenilazione SV40. L'incorporazione di un introne aggiuntivo nel costrutto includendo il primo introne del gene apo AI o un introne FIX troncato 5 ′ della sequenza di codifica cDNA di apo AI aumenta l'espressione del transgene più del doppio. Usando la genomica gA-I umana, contenente tre introni, ha indotto un aumento incrementale più che duplice dei livelli di apo AI umano, suggerendo che la conservazione dell'intera struttura introne-esone può essere importante per massimizzare l'espressione del transgene. Sebbene non sia noto l'esatto meccanismo dell'effetto stimolante degli introni, le sequenze introniche o il processo di giunzione stessa possono promuovere l'elaborazione dell'RNA 3 ′, facilitare l'esportazione dell'RNA messaggero dal nucleo al citoplasma 35 e promuovere la traduzione. 36, 37, 38

La correlazione tra picco di espressione di apo umana apo dopo trasferimento genico idrodinamico e espressione di apo AI umana al giorno 35 trasferimento con i corrispondenti vettori adenovirali era 0, 83. Ciò indica che la valutazione delle cassette di espressione usando il trasferimento idrodinamico può essere una strategia adatta per prevedere i livelli di espressione seguendo altre modalità di trasferimento genico. Le sequenze di DNA batterico su plasmidi convenzionali causano il silenziamento trascrizionale, mentre un'espressione transgenica prolungata può essere ottenuta dopo il trasferimento di minicerchi. 19, 20, 21, 39 La persistenza dell'espressione del transgene in seguito al trasferimento idrodinamico dei minicerchi e il forte declino dell'espressione dopo il trasferimento di plasmidi nel presente studio sono stati osservati anche quando il trasferimento idrodinamico è stato eseguito con una dose identica di 50 μg. Pertanto, la differenza nella cinetica dell'espressione del transgene dopo il trasferimento idrodinamico di plasmidi e minicerchi nella Figura 3a non può essere attribuita alla differenza di dose. I livelli di AI umano e FIX umano dopo il trasferimento idrodinamico di 20 μg di minicerchi erano nel range fisiologico. Il confronto della cinetica del DNA transgenico nel PC tra trasferimento idrodinamico di minicerchi e trasferimento adenovirale mostra che i numeri di copie iniziali sono significativamente più alti dopo il trasferimento di minicerchi. In base al peso molecolare del DNA, 20 μg di un minicerchio di 5, 5 kb corrispondono a una dose di 3, 3 × 10 12 copie del genoma del transgene, che è 66 volte maggiore rispetto a una dose vettoriale adenovirale di 5 × 10 10 particelle. La discrepanza tra i numeri di copia del DNA transgenico nell'intero fegato e nel PC nel punto temporale di 1 ora può essere spiegata dalla presenza di quantità significative di DNA transgenico nello spazio extracellulare. Dopo il trasferimento genico idrodinamico, il DNA transgene intracellulare viene intrappolato all'interno delle vescicole macropinocitotiche e nel citoplasma degli epatociti. 40, 41, 42, 43 Pertanto, la forte caduta del DNA transgenico copia i numeri tra 1 e 24 ore dopo il trasferimento idrodinamico del gene, molto probabilmente corrisponde alla degradazione del DNA del minicerchio prima che raggiunga il nucleo. Mentre i livelli plasmatici di apo AI umano al giorno 35 erano significativamente più alti dopo il trasferimento adenovirale con particelle 5 × 10 10 rispetto a dopo il trasferimento idrodinamico con 20 μg di minicerchi, i numeri delle copie in PC al giorno 35 dopo il trasferimento erano simili. Noi ipotizziamo che l'assemblaggio della cromatina e il superavvolgimento del DNA del DNA episomico possano differire a seguito del trasferimento genico dei minicerchi e dopo il trasferimento adenovirale. Poiché l'assemblaggio della cromatina e il superavvolgimento del DNA influiscono sulle interazioni tra promotore e esaltatori, 44 ciò può spiegare le differenze nell'espressione del transgene.

Mentre gli epatociti maturi negli adulti si dividono a bassa frequenza, la divisione cellulare nel PC si verifica più frequentemente nei bambini. Pertanto, la replicazione episomica dei minicerchi sarebbe una caratteristica desiderabile per la correzione dei disturbi epatici ereditari del metabolismo e della coagulazione nei bambini. I minicerchi contenenti un'origine di replicazione SV40 e uno SMAR non erano replicativi episomicamente dopo epatectomia parziale in questo studio. Questi dati sono in linea con le osservazioni di Papapetrou et al. 45 che hanno mostrato che 4 settimane dopo la trasduzione delle cellule progenitrici ematopoietiche umane con un plasmide contenente un SMAR , il DNA è stato trattenuto in meno dell'1% delle cellule trasdotte. Al contrario, la stabilità mitotica di un vettore episomico contenente una SMAR umana è stata dimostrata in studi in vitro . 46 Inoltre, il trasferimento genico mediato dallo sperma di plasmidi contenenti un SMAR ha prodotto feti di suini geneticamente modificati. 47 La struttura ricca di AT della SMAR può indurre lo svolgersi dell'origine della replicazione SV40 e può stimolare la replicazione del vettore. 46 Una trascrizione a monte che si imbatte nello SMAR è strettamente necessaria per la replicazione episomica. 48 Più recentemente, è stato dimostrato che uno SMAR può conferire una replicazione episomica in assenza di un'origine SV40 di replicazione. 49 La discrepanza di diversi rapporti sulla replicazione in vivo di episodi contenenti SMAR in vivo può essere spiegata dalle differenze nei tipi di cellule specifici studiati in questi studi.

In conclusione, in questo studio comparativo diretto di 22 cassette di espressione specifiche per epatociti, la combinazione del promotore DC172 e due copie dell'HCR -1 induce la più alta espressione di transgene dopo il trasferimento idrodinamico e adenovirale. Il trasferimento genico idrodinamico di minicerchi contenenti questa cassetta di espressione più potente induce in modo persistente apo AI fisiologico umano e livelli FIX umani nei topi C57BL / 6. L'elevata correlazione tra i livelli di espressione dopo il trasferimento idrodinamico e adenovirale suggerisce che la combinazione del promotore DC172 e due copie dell'HCR -1 può anche essere ottimale per altre modalità di trasferimento genico.