Scoperta di un fabbisogno di crescita di sar11 per il precursore della pirimidina di tiamina e sua distribuzione nel mare di sargasso | il diario isme

Scoperta di un fabbisogno di crescita di sar11 per il precursore della pirimidina di tiamina e sua distribuzione nel mare di sargasso | il diario isme

Anonim

Soggetti

  • Fisiologia batterica
  • Microbiologia marina
  • Ecologia microbica

Astratto

Il traffico di vitamine, la produzione di fattori di crescita organici da parte di alcuni membri della comunità microbica e il loro uso da parte di altri taxa, viene esaminato come una potenziale spiegazione della variazione e del comportamento altamente connesso osservato nel plancton oceanico dall'analisi della rete della comunità. La tiamina (vitamina B 1 ), un cofattore in molte reazioni biochimiche essenziali che modificano i legami carbonio-carbonio dei composti organici, è distribuita in schemi complessi a concentrazioni subpicomolari nello strato di superficie marina (0–300 m). I genomi sequenziati da organismi appartenenti all'abbondante e onnipresente clade SAR11 di batteri chemietereterotrofi marini contengono geni che codificano per un percorso biosintetico completo della tiamina, ad eccezione del tiC , codificante per la 4-ammino-5-idrossimetil-2-metilpirpirididina (HMP), che è richiesto per la sintesi de novo della porzione di pirimidina di tiamina. Qui dimostriamo che l'isolato SAR11 ' Candidatus Pelagibacter ubique', ceppo HTCC1062, è auxotrofico per il precursore della tiamina HMP e non può usare la tiamina esogena per la crescita. In coltura, il ceppo HTCC1062 ha richiesto 0, 7 zeptomoli per cellula (circa 400 molecole HMP per cellula). Le misurazioni dell'HMP disciolto nello strato superficiale del Mare di Sargasso hanno mostrato che l'HMP variava da non rilevabile (limite di rilevazione: 2, 4 p M) a 35, 7 p M, con concentrazioni massime coincidenti con il massimo della clorofilla profonda. Nella cultura, alcuni cianobatteri marini, microalghe e batteri trasudavano HMP e, nel Mare del Sargasso occidentale, i profili HMP cambiarono tra la mattina e la sera, suggerendo un flusso biologico dinamico dai produttori ai consumatori.

introduzione

La tiamina (vitamina B 1 ) è un coenzima essenziale presente nelle proteine ​​che catalizzano trasformazioni cruciali del carbonio in tutti i sistemi viventi. In particolare, la tiamina è un cofattore essenziale per gli enzimi del ciclo dell'acido tricarbossilico, la porzione non ossidativa della via del pentoso fosfato, il ciclo di Calvin e per gli enzimi necessari per la biosintesi degli aminoacidi a catena ramificata e degli isoprenoidi (tramite il non mevalonato) percorso) (Lengeler et al., 1999). I percorsi, gli enzimi e la regolazione della sintesi e del salvataggio della tiamina de novo sono stati oggetto di approfondite ricerche su batteri, lieviti e alcune microalghe (Winkler and Breaker, 2005; Croft et al., 2007; Jurgenson et al., 2009). In tutti gli organismi in grado di biosintesi della tiamina de novo , la formazione di tiamina monofosfato (ThP) deriva dal legame catalizzato da enzimi di due frazioni sintetizzate separatamente: 4-ammino-5-idrossimetil-2-metilpirimidina difosfato e 4-metil-5- (2-fosfoetil) -tiazolo (Figura 1). La fosforilazione del ThP produce il coenzima attivo della tiamina, il difosfato di tiamina (ThPP) (Figura 1) (rivisto in Jurgenson et al., 2009).

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Illustrazione semplificata del metabolismo della tiamina in Ca. P. ubique. Linee colorate nere e abbreviazioni di enzimi rappresentano reazioni ed enzimi codificati dal Ca. Genoma di P. ubique. Le linee colorate rosse e le abbreviazioni degli enzimi rappresentano reazioni ed enzimi assenti dal Ca. Genoma di P. ubique. AIR, aminoimidazole ribotide; AmMP, 4-ammino-5-amminometil-2-metilpirimidina; cisti, cisteina; dDXP, 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato; glicina, glicina; suo, istidina; HMP (-P), 4-ammino-5-idrossimetil-2-metilpirimidina (-fosfato); Difosfato di HMP-PP, 4-ammino-5-idrossimetil-2-metilpirimidina; ThP, monofosfato di tiamina; ThPP, difosfato di tiamina; THZ-P, 4-metil-5- (2-fosfoetil) -tiazolo.

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Il rinnovato interesse per le distribuzioni vitaminiche negli ecosistemi marini è stato guidato dallo sviluppo di tecniche analitiche più sensibili per misurare le concentrazioni di vitamine (Sañudo-Wilhelmy et al., 2012) e da un maggiore apprezzamento dell'importanza dei composti in tracce per la produttività del plancton. Mentre le fonti, le distribuzioni e la speciazione dei metalli in traccia sono state ampiamente studiate in relazione alla produttività degli oceani (rivista in Morel e Price, 2003), si sa relativamente poco sulla biogeochimica della vitamina o sull'effetto delle vitamine sulla struttura e composizione delle comunità planctoniche . Misurazioni dirette delle concentrazioni di vitamina B nei sistemi oceanici costieri hanno trovato concentrazioni picomolari e schemi complessi nelle distribuzioni di diverse vitamine, tra cui la tiamina (Sañudo-Wilhelmy et al., 2012; Barada et al., 2013). Negli esperimenti sulle bottiglie, ferro e vitamine del gruppo B, in particolare la vitamina B 12, hanno agito in sinergia per aumentare il fitoplancton e la produttività batterica, suggerendo la colimitazione (Panzeca et al., 2006; Bertrand et al., 2007). A sostegno dell'opinione che lo scambio di vitamine tra le specie sia importante, nelle diatomee sono state identificate strategie adattive per far fronte a basse concentrazioni di vitamine (Bertrand et al., 2012). Inoltre, ci sono prove che alcuni batteri marini producono vitamina B 12 che viene utilizzata dal fitoplancton (Croft et al., 2005).

La tiamina è una vitamina particolarmente interessante perché i genomi di molti microrganismi ecologicamente abbondanti non codificano per percorsi biosintetici della tiamina completi e canonici (Bertrand e Allen, 2012; Helliwell et al., 2013), suggerendo che l'auxotrofia è comune. La distribuzione dei geni biosintetici della tiamina nei genomi delle alghe non si correla bene con la filogenesi, un'indicazione che il metabolismo della tiamina si è evoluto e diversificato in risposta a pressioni selettive che variano con l'habitat (rivisto in Croft et al., 2006; Helliwell et al., 2013 ). L'evoluzione del metabolismo della tiamina nel fitoplancton è probabilmente complessa, come evidenziato dalla capacità di alcuni ceppi di utilizzare i gruppi di tiamina 4-metil-5-tiazoletanolo (THZ) o 4-ammino-5-amminometil-2-metilpirimidina (AmMP), presumibilmente prodotti naturali di degradazione della tiamina, al posto della tiamina (Droop, 1958; Lewin, 1962). Un requisito specifico per il precursore della tiamina pirimidina 4-ammino-5-idrossimetil-2-metilpirimidina (HMP) è stato descritto per il protista Plasmodium falciparum (Wrenger et al., 2006) e il batterio Listeria monocytogenes (Schauer et al., 2009 ). Inoltre, la tiamina è ottenuta esclusivamente attraverso il recupero delle frazioni di tiamina dal batterio Rhizobium leguminosarum bv. ceppo viciae 3841 (Karunakaran et al., 2006). Le concentrazioni ambientali di questi precursori o prodotti di degradazione della tiamina non sono state misurate e il metabolismo della tiamina nei batteri marini è un argomento relativamente inesplorato.

Questo studio esamina il metabolismo della tiamina nel clade SAR11 di α-proteobacteria ( Pelagibacterales ). Questi organismi sono il batterioplancton chemioeterotrofico più abbondante negli oceani, che spesso comprende il 25-50% delle cellule nella zona eufotica (Morris et al., 2002; Carlson et al., 2009). Sia gli studi in situ che quelli con colture asseniche mostrano che i Pelagibatteri contribuiscono in modo significativo al ciclo del carbonio e dello zolfo nell'oceano (rivisto in Tripp, 2013). Il primo batterio Pelagibacterales coltivato, il ceppo ' Candidatus Pelagibacter ubique' HTCC1062 ( Ca. P. ubique), contiene uno dei più piccoli genomi trovati negli organismi viventi. Il piccolo genoma di Ca. P. ubique è attribuito alla razionalizzazione della selezione (Giovannoni et al., 2005). La perdita genica correlata alla razionalizzazione della selezione è stata proposta come una spiegazione per l'insolita combinazione di aminoacidi, composti di organosolfuro ridotti e acidi organici necessari per la crescita di Ca. P. ubique (Carini et al., 2013; Tripp, 2013). Sebbene i requisiti di macronutrienti di Ca. P. ubique è stato identificato, i loro requisiti di vitamine e altre molecole in tracce non sono stati studiati.

Abbiamo usato la genomica comparativa per esaminare la distribuzione dei geni per il metabolismo della tiamina tra i pelagibatteri e abbiamo studiato il requisito della tiamina o dei suoi precursori in Ca. P. ubique. In seguito alla sorprendente scoperta che Ca. P. ubique richiede il precursore della tiamina HMP, abbiamo applicato spettrometria di massa tandem accoppiata con cromatografia liquida ad alte prestazioni (LC-MS) per dimostrare che l'HMP disciolto è presente a concentrazioni picomolari negli oceani. Questi risultati offrono importanti nuove informazioni sul ciclismo con tiamina e identificano l'HMP come un fattore di crescita che probabilmente avrà un ruolo importante nelle interazioni mediate dalla vitamina nell'oceano.

risultati

Le vie biosintetiche della tiamina erano incomplete in tutti e otto i genomi dei pelagibatteri che abbiamo studiato (Tabella 1). Nonostante l'apparente incapacità di sintetizzare la tiamina de novo , sono stati identificati più geni che codificano per gli enzimi ThPP-dipendenti in Ca. P. ubique, che indica la tiamina è necessaria per il normale metabolismo (Figura complementare S3). Quattro ceppi di Pelagibacterales contenevano la stessa biosintesi della tiamina e geni di trasporto di Ca. P. ubique (Tabella 1). Due ceppi Pelagibacterales aggiuntivi, IMCC9063 e HIMB114, hanno complementi della biosintesi della tiamina e geni di trasporto simili a Ca. P. ubique, ad eccezione di entrambi mancano thiL (Tabella 1). Inoltre, IMCC9063 codifica l'enzima di salvataggio AmMP , tenA (Tabella 1). In Pelagibacterales str. HIMB59, thiC , thiD , thiG , thiE e thiE2 e thiS sono assenti. Tuttavia, un gene codificante per una proteina legante periplasmatica specifica per tiamina ( thiB ) (Webb et al., 1998) è stato identificato in HIMB59 (Tabella 1).

Tabella a grandezza naturale

I geni che codificano per la HMP sintasi ( thiC ) sono assenti da tutti i genomi dei pelagibatteri (Tabella 1). Il ThiC catalizza il riarrangiamento molecolare del nucleotide purinico medosintetico intermedio 5-aminoimidazolo ribotide per formare HMP (Figura 1) (Martinez-Gomez and Downs, 2008) ed è essenziale per la biosintesi de novo della tiamina in batteri, archei e piante. I geni che codificano per la sintesi HMP alternativa o le proteine ​​di salvataggio non sono stati identificati nel Ca. Genoma di P. ubique. Ad esempio, Ca. P. ubique manca di geni codificanti per NMT1, che sintetizza HMP dalla vitamina B 6 e dall'istidina in Saccharomyces cerevisiae (Figura 1) (Wightman and Meacock, 2003). I geni che codificano per gli omologhi TenA, che catalizzano l'idrolisi di AmMP per produrre HMP (Jenkins et al., 2007), non erano presenti in Ca. P. ubique (Figura 1). Alcuni organismi possono trasportare la tiamina intatta con il trasportatore ABC specifico per tiamina codificato da thiBPQ . Nessun omologo della proteina legante specifica della tiamina, ThiB, è stato identificato in Ca. Genomi di P. ubique (Figura 1). Inoltre, Ca. P. ubique non codifica per gli omologhi dei complessi di trasporto di batteri HMP / AmMP ABC previsti ThiXYZ (Jenkins et al., 2007) e YkoEDC, né per il putativo HMP / AmMP permeano HmpT e CytX (Rodionov et al., 2002, 2008) .

Un singolo riboswitch RNA attivato da ThPP previsto è stato identificato nel Ca. Genoma di P. ubique (Meyer et al., 2009) in un'insolita configurazione a monte di una sequenza di codifica annotata come sodio: proteina della famiglia del solutore simboleggiante (codificata da Ca. P. ubique ORF SAR11_0811). Un riboswitch configurato in modo simile era stato precedentemente identificato nel genoma di Methylobacillus flagellatus , a monte di una sequenza codificante per un trasportatore putativo non caratterizzato chiamato thiV (Rodionov et al., 2002). L'analisi filogenetica della massima verosimiglianza degli omologhi Pelagibacterales thiV ha mostrato che formano un gruppo monofiletico con le sequenze thiV di M. flagellatus e un gruppo eterogeneo di microbi, tra cui aloarchaea, batteri Gram-positivi e proteobatteri β e γ (Figura 2a e Figura supplementare S4). I geni ortogenici a thiV in tutti gli organismi (ad eccezione di Marinobacter algicola ) sono (i) in un operone con geni che codificano per gli enzimi che consentono il recupero di porzioni di HMP e THZ per la sintesi di tiamina ( thiD , thiM e thiE ; Figura 2b); (ii) in un operone con una o due copie del gene tenA (codificante per un enzima di salvataggio AmMP; Figura 2b); oppure (iii) sono preceduti da un motivo a riboswitch ThPP (figure 2b e c).

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Filogenesi genetica, sintesi e conservazione della struttura del riboswitch per il sodio della famiglia Pelagibacterales ThiV: soluti symporter. Gli elementi del genoma dei pelagibatteri sono evidenziati in rosso. ( a ) Albero filogenetico a massima verosimiglianza che mostra un sottoinsieme di sequenze di aminoacidi estratto da un albero completo (Figura supplementare S4). ( b ) Per gli stessi taxa mostrati in a, la colocalizzazione cromosomica di geni thiV con putativi riboswitch di legame ThPP (struttura rossa del gambo del gambo) e geni codificanti per gli enzimi di salvataggio della tiamina ( thiDME o tenA ). La linea tratteggiata indica che non sono stati identificati riboswitch che legano il ThPP o geni di salvataggio associati. ( c ) Sequenze nucleotidiche dei riboswitch previsti per il legame al ThPP rappresentati in b . La casella tratteggiata incapsula le sequenze di riboswitch di nove genomi Pelagibacterales e la loro sequenza di consenso (illustrata in alto). È stato previsto che le sequenze contrassegnate con (*) contengano motivi di associazione ThPP utilizzando lo strumento di ricerca sequenziale rfam (//rfam.sanger.ac.uk).

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Abbiamo ipotizzato che Ca. P. ubique è auxotrofico per HMP perché mancavano geni che codificano per i percorsi di sintesi HMP noti ( thiC e NMT1 ) e meccanismi di salvataggio AmMP ( tenA ) (Figura 1 e Tabella 1). Per verificare questa ipotesi, le risposte di crescita di Ca. P. ubique a HMP, AmMP e thiamin sono stati studiati su sette ordini di grandezza (Figura 3). Le colture cresciute in terreno senza aggiunta di HMP, senza tiamina o precursori aggiuntivi, hanno raggiunto una densità cellulare massima di 3, 09 ± 0, 75 × 10 7 cellule ml −1 (media ± sd, n = 3) (Figura 3). Le rese cellulari hanno risposto linearmente alle aggiunte di HMP tra 1 e 100 p M (Figura supplementare S5) e hanno raggiunto le rese massime delle cellule (circa 3, 5 × 10 8 cellule ml −1 ) a concentrazioni di HMP 1 n M (Figura 3). Il fabbisogno di HMP cellulare è stato calcolato in 0, 66 zeptomoli (396 molecole) per cellula dalla pendenza della regressione lineare tra 1 e 100 p M (Figura supplementare S5). Tiamina e AmMP erano inefficaci nel ripristinare la crescita limitata della tiamina a concentrazioni pico o nanomolari; questi composti hanno ripristinato la crescita solo se forniti a 1, 0 μ M (Figura 3). Il tasso di crescita medio di Ca. P. ubique era 0, 29 ± 0, 03 al giorno (media ± sd, n = 123) e non variava con trattamenti vitaminici o precursori (ad esempio, vedere la Figura S6 supplementare).

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Resa cellulare massima di Ca. Colture batch di P. ubique in risposta ad aggiunte di AmMP, tiamina e HMP. Le cellule sono state coltivate in AMS1 modificato con tiamina, HMP o AmMP come indicato. Le altezze delle barre sono le densità medie dei replicati biologici ± sd ( n = 3). La linea tratteggiata rappresenta la densità massima calcolata prevista (∼ 1, 8 × 10 7 celle ml −1 ) dal livello 'sfondo' di HMP (vedere il testo per i dettagli). Attribuiamo la crescita con 1 μ M di tiamina o AmMP a HMP "contaminante" (vedere il testo per i dettagli).

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Per escludere l'attività NMT1 come potenziale fonte di HMP, la tiamina è stata sostituita con istidina e vitamina B 6 (substrati di NMT1; Ishida et al., 2008). Coerentemente con la previsione che Ca. P. ubique non ha la capacità di sintetizzare l'HMP attraverso l'attività NMT1, l'istidina + la vitamina B 6 non ha alleviato la crescita limitata della tiamina (Figura supplementare S7). La crescita limitata della tiamina non è stata alleviata dal pantotenato o dall'aggiunta di THZ (Figura supplementare S7) come è stato precedentemente riportato per altri organismi (Droop, 1958; Downs, 1992).

Ad oggi, non sono state riportate misurazioni delle concentrazioni di HMP o AmMP nell'ambiente. Per determinare se l'HMP è presente in un ambiente in cui si trovano anche batteri Pelagibacterales , la tiamina e l'HMP sono state estratte dall'acqua di mare del Sargasso raccolte in due diverse ore del giorno (2000 e 0800 ore locali, circa 1 ora dopo il tramonto e l'alba, rispettivamente ) e misurato quantitativamente da LC-MS. L'HMP variava da non rilevabile (limite di rilevamento: 2, 4 p M) a 35, 7 p M (Figura 4). La concentrazione massima di HMP è stata osservata nei campioni raccolti a 0800 ore vicino al massimo della clorofilla profonda (Figura 4). Le concentrazioni di HMP a 2000 ore erano sostanzialmente più elevate a 0 m di profondità, ma inferiori a 40, 80, 120, 160 e 200 m, rispetto ai campioni raccolti a 0800 ore (Figura 4). L'HMP non è stato rilevato nel campione di 250 m raccolto alle 0800 ore. La tiamina è stata misurata negli stessi campioni e variava da non rilevabile (limite di rilevazione: 0, 81 p M; Sañudo-Wilhelmy et al., 2012) a 23 p M ed era presente nei campioni da 0 a 160 m, ma non rilevata nei campioni da 250 a 300 m (Figura 4).

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Distribuzione approfondita dell'HMP disciolto e della tiamina nel Mare del Sargasso. I tempi di raccolta sono presentati in ora locale. I valori HMP sono la media delle analisi tecniche di replica per ciascun campione. Non vi è stata alcuna replica tecnica per le misurazioni della tiamina a causa di campione insufficiente. L'HMP non è stato rilevato nel campione di 250 m raccolto alle 0800 ore. La tiamina non è stata rilevata in campioni raccolti da 200 ma 2000 ore o tra 250 e 300 m in entrambi i tempi. DCM, massimo clorofilla profonda; LOQ, limite di quantificazione; ML, strato misto.

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Per determinare se i microbi marini trasudano HMP, abbiamo misurato le concentrazioni di HMP nei terreni di crescita prima e dopo la crescita cellulare in ceppi noti per avere un complemento completo di geni biosintetici della tiamina (Tabella 2). Il cyanobacterium marino Synechococcus sp. WH8102 e il clorofita marino D. tertiolecta trasudavano quantità nanomolari di HMP durante la crescita (Tabella 2). Sono state rilevate anche moderate quantità di HMP in eccesso nei media esauriti dal cianobatterio Prochlorococcus MED4 e dal clade OM43 dell'isolato marino di β-proteobatteri, ceppo HTCC2181 (Giovannoni et al., 2008). Sono state testate anche due colture pelagibatteriche: Ca. P. ubique e Pelagibacterales sp. ceppo HTCC7211. In entrambi i casi, l'HMP non è stato rilevato dopo la crescita cellulare (Tabella 2).

Tabella a grandezza naturale

Discussione

La tiamina è stata a lungo riconosciuta come una vitamina importante per la crescita delle microalghe (rivista in Croft et al., 2006). Il requisito fisiologico per la tiamina ha portato all'ipotesi che le concentrazioni ambientali di tiamina possano esercitare il controllo su alcune popolazioni di fitoplancton (Natarajan, 1968; Panzeca, et al., 2006). Le distribuzioni ambientali di tiamina, determinate dal biotest, erano variabili e, in alcuni casi, associate alla produttività (Natarajan e Dugdale, 1966; Natarajan, 1968, 1970). Studi di auxotrofia della tiamina in laboratorio hanno dimostrato che le porzioni di tiamina o i prodotti di degradazione erano in grado di soddisfare il fabbisogno di tiamina di alcune microalghe (Droop, 1958; Lewin, 1962). Tuttavia, la ricerca che persegue l'importanza ecologica di questi risultati si è ridotta. I risultati sperimentali qui presentati reintroducono l'idea che le pirimidine di tiamina sono importanti fattori di crescita negli ecosistemi marini. Mostriamo che il precursore della piramide di tiamina, HMP, è necessario per la crescita del batterio chemioeterotrofico marino Ca. P. ubique (Figura 3), un isolato rappresentativo di uno dei gruppi più abbondanti di organismi sul pianeta. Sorprendentemente, né la stessa tiamina né AmMP hanno soddisfatto questo requisito (Figura 3). La genomica comparativa ha esteso il significato di questo requisito a più membri del clade Pelagibacterales (Tabella 1). L'importanza di questi risultati è stata ulteriormente supportata dal rilevamento dell'HMP disciolto nel mare di Sargasso (Figura 4), uno dei sistemi oceanici più oligotrofici sulla Terra, a concentrazioni spesso superiori a quelle della tiamina. Questa scoperta mostra che le informazioni fondamentali necessarie per comprendere la biogeochimica della tiamina negli ecosistemi marini sono incomplete, in particolare che le misurazioni ambientali della sola tiamina possono spiegare solo parzialmente le interazioni correlate ai requisiti di tiamina delle cellule planctoniche.

L'incapacità di Ca. P. ubique per usare la tiamina o il suo prodotto di degradazione AmMP fu sorprendente dato che molte specie di alghe sono in grado di usare questi composti (Droop, 1958; Lewin, 1962). The Ca. Il genoma di P. ubique non codifica per il trasportatore di tiamina (Figura 1 e Tabella 1), in linea con l'osservazione che la tiamina esogena non supporta la crescita (Figura 3). Allo stesso modo, proponiamo che l'assenza del gene tenA (Figura 1 e Tabella 1), necessaria per la conversione di AmMP in HMP, spiega perché AmMP non sostituisce l'HMP nella biosintesi della tiamina. Tuttavia, l'analisi del genoma del ceppo Pelagibacterales HIMB59 mostra che questo ceppo manca di geni richiesti per la sintesi de novo della tiamina ( thiC , thiD , thiG , thiE e thiS ), nonché dell'enzima di salvataggio AmMP ( tenA ; Tabella 1) e thiV ; pertanto, postuliamo che questa varietà richiede tiamina esogena. A sostegno di questa idea, il thiB , che codifica per la subunità periplasmatica di un trasportatore ABC di tiamina specifico per la tiamina, è stato identificato in HIMB59 (Tabella 1).

I nuovi dati riportati qui indicano che il ciclismo della tiamina negli oceani può seguire schemi complessi e coinvolgere più processi e intermedi. Considerando che dimostriamo che i microbi marini possono rilasciare HMP nell'ambiente circostante (Tabella 2), alcuni fitoplancton trasudano tiamina (Carlucci e Bowes, 1970a, 1970b). Sebbene la tiamina sia labile nell'acqua di mare (Gold, 1968; Gold et al., 1966), i suoi prodotti di decomposizione nell'acqua di mare non sono stati completamente caratterizzati e l'effetto di vari fattori ambientali sul degrado è scarsamente compreso. Ad esempio, la tiamina è una molecola sensibile alla luce che viene prontamente divisa dalla radiazione UV-B verso AmMP e altri prodotti (Okumura, 1961; Machlin, 1984). Sebbene non siano state riportate misurazioni delle concentrazioni di AmMP nell'ambiente, le risposte fisiologiche del fitoplancton ad AmMP (Droop, 1958; Lewin, 1962) e la presenza di geni tenA in alcuni genomi batterici privi del gene thiC (Tabella supplementare S1), tra cui Pelagibacterales sp. ceppo IMCC9063 (Tabella 1), suggerisce la presenza di AmMP ambientale e potrebbe anche essere un importante fattore di crescita negli ecosistemi marini.

Il decadimento della tiamina mediato dalla luce può essere un fattore importante nella geochimica della tiamina e influenzare i modelli di produzione di HMP nelle acque marine superficiali. I profili di profondità che mostrano che il massimo di HMP disciolto coincide con il massimo di clorofilla profonda (Figura 4) suggeriscono che il fitoplancton marino può essere un importante produttore di HMP. Curiosamente, studi precedenti hanno riportato la periodicità della diel nella trascrizione e traduzione del tiC (HMP sintasi) nelle colture da laboratorio di Prochlorococcus MED4 (Waldbauer et al., 2012). Allo stesso modo, l'abbondanza di trascrizioni ambientali mappate al thC di Synechococcus sp. ha seguito un modello di diel (Ottesen et al., 2013). In entrambi i rapporti, sono stati osservati livelli massimi di trascrizione di tiC a metà pomeriggio, poco dopo i periodi di maggiore intensità luminosa. Noi ipotizziamo che le grandi differenze nelle concentrazioni di HMP disciolte dai profili raccolti in momenti diversi (Figura 4) possano essere un'indicazione che l'essudazione di HMP da parte dei cianobatteri contenenti criC segue un modello di diel. Sebbene le misurazioni delle vitamine disciolte (e dei precursori) riflettano le concentrazioni di equilibrio, non i flussi, i rapporti di tassi rapidi di assorbimento di 3 -H-tiamina da parte delle comunità di plancton (Koch et al., 2012) suggeriscono che è possibile una rapida deplezione di vitamine nella colonna d'acqua dovuta allo scavenging biologico . La notevole produzione di HMP di Synechococcus sp. WH8102 e modesto essudazione da parte di colture discontinue di Prochlorococcus MED4 (Tabella 2) è coerente con l'idea che i cianobatteri siano importanti produttori di HMP; tuttavia, i modelli di diel di produzione di HMP non sono stati testati nei nostri esperimenti.

L'assenza di tiC , e quindi il requisito per le pirimidine di tiamina esogene, non è unica per i Pelagibatteri , ma è ampiamente e irregolarmente distribuita tra i diversi taxa microbici che abitano le acque marine. Complementi di geni biosintetici di tiamina incompleti erano stati precedentemente riportati nei genomi del clavicola SAR86 non coltivata di proteobatteri marini γ (Dupont et al., 2012) e in alcuni fitoplancton (recensiti a Bertrand e Allen, 2012; Helliwell et al., 2013). I geni per il ThiC sono inoltre assenti dai genomi di molti altri batteri e archaea ecologicamente importanti (Tabella supplementare S1). L'osservazione che le vie biosintetiche della tiamina canonica sono incomplete negli organismi sequenziati è stata ulteriormente rispecchiata nei set di dati metagenomici. Confronti delle abbondanze di thiC , thiD e thiG attraverso un profilo di profondità metagenomica del Mare del Sargasso hanno scoperto che i geni thiC erano esauriti rispetto ai geni thiD e thiG a 0, 40 e 80 m, ma vicino al massimo della clorofilla profonda, le copie di thiC superavano quelli del thiD (figura complementare S8). La relativa carenza di tiC rispetto ad altri geni essenziali della biosintesi della tiamina in acque poco profonde è coerente con l'idea che il salvataggio dell'HMP sia importante per la sintesi della tiamina a quelle profondità.

Postuliamo che il ThiV sodico: i solubili solubili costituiscono una nuova famiglia di proteine ​​di trasporto della tiamina pirimidina. Precedentemente Worden et al. ipotizzato che ThiV e i suoi omologhi (identificati come 'SSSF-P') potrebbero trasportare precursori della tiamina in alcuni fitoplancton eucariotici e SAR11 privi di geni canonici di biosintesi della tiamina (Worden et al., 2009). Notando la conservazione della relazione tra TPP e ThiV attraverso i taxa, hanno concluso che ThiV e i suoi omologhi potrebbero rappresentare "antichi componenti del percorso della tiamina", ma la loro funzione è rimasta incerta. Una filogenesi degli ortologi ThiV batterici e arcaici supporta questa interpretazione dimostrando che i geni thiV si collocano nei geni codificanti per gli enzimi di salvataggio della tiamina pirimidina ( tenA nei genomi archaeal e con thiD , thiM e thiE nel genoma Alkaliphilus oremlandii ) (Figura 2), implicando che Gli ortologi ThiV trasportano le pirimidine di tiamina (HMP o AmMP). Noi ipotizziamo che Ca. P. ubique regola l'acquisizione di HMP dall'ambiente controllando l'espressione di ThiV con un riboswitch di legame ThPP, in un modo simile alla regolazione riboswitch di legame ThPP della sintesi HMP de novo (via ThiC) in altri organismi (Winkler et al., 2002). Quando la tiamina è legata ai riboswitch ThPP, la trascrizione e la traduzione della sequenza di codifica a valle viene repressa, e quindi il rilevamento di ThiV e altri prodotti genici regolati da ThPP nei metaproteomi può essere un utile indicatore della deprivazione di tiamina nell'ambiente. Ad esempio, i peptidi che mappano gli ortologi Pelagibacter ThiV sono stati rilevati nei metaproteomi ambientali del Mare dei Sargasso (Sowell et al., 2009), ma non nell'Oceano Antartico (Williams et al., 2012), forse indicando differenze nello stato di tiamina del due biomi.

La dipendenza di Ca. P. ubique, e probabilmente altri Pelagibacterales , su HMP implica che queste cellule ottengono un vantaggio esternalizzando la produzione di HMP ad altri plancton, basandosi essenzialmente su HMP come merce disponibile pubblicamente. Questa prospettiva è coerente con la teoria della semplificazione del genoma e con precedenti rapporti di insoliti requisiti nutrizionali associati alla riduzione del genoma nei pelagibatteri (Tripp et al., 2008; Carini et al., 2013). La teoria della razionalizzazione prevede che i microrganismi atipici possano avere requisiti atipici di nutrienti con dimensioni effettive della popolazione elevate in risposta alla selezione che favorisce la dimensione cellulare ridotta e l'uso efficiente della limitazione delle risorse nutritive (Giovannoni et al., 2005). L '"ipotesi della regina nera" ha esplorato le implicazioni coevolutive della teoria della razionalizzazione del genoma, esaminando il contesto più ampio della perdita di geni adattativi in ​​un quadro che considerava la concorrenza per i beni pubblici (Morris et al., 2012). In questo contesto, poiché i Pelagibacterales dipendono dall'HMP ambientale, esiste un potenziale di limitazione della crescita del Pelagibacter da parte dell'HMP, che lega intimamente il successo di questi organismi ai produttori di HMP.

Perché Ca. Le cellule P. ubique sono tra le più piccole conosciute e si replicano in modo efficiente a concentrazioni di nutrienti molto basse, chiarire il fabbisogno di nutrienti in tracce di queste cellule è tecnicamente impegnativo. Anche in un mezzo minimo definito, quando sono state prese precauzioni per ridurre al minimo lo sfondo di tracce di vitamina, Ca. P. ubique ha raggiunto 2–3 × 10 7 cellule ml −1 in assenza di vitamine o precursori aggiunti (Figura 3 e Figure supplementari S6 e S7). Queste rese rientrano in un fattore due delle rese teoriche (1, 8 × 10 7 celle ml −1 ) in base al requisito HMP cellulare (Figura supplementare S5) e alla quantità di HMP "di fondo" misurata nel mezzo (12 p M). Questo HMP di "sfondo" è scomparso in presenza di Ca. P. ubique, implicando il consumo del nutriente (Tabella 2). In precedenza, i livelli di sfondo di vitamine nel mezzo di crescita eterotrofico erano proposti per sostenere la scarsa crescita di auxotrofi vitaminici in assenza di vitamine aggiunte (Norman et al., 1981; Wu et al., 2005) e la difficoltà associata alla rimozione della tiamina dalla crescita il medium è stato notato (Button, 1968). Il numero di molecole HMP richieste per Ca. La cellula P. ubique è nell'ordine di 400 molecole per cellula (Figura supplementare S5). Supponendo che ciascuna molecola HMP sia utilizzata per produrre una molecola di tiamina e una stima di 6 fg di carbonio per cellula (dati non pubblicati), il rapporto tiamina / carbonio di Ca. P. ubique è stato calcolato come 25 ng di tiamina per mg di carbonio — simile ai valori misurati per il fitoplancton marino (5–100 ng di tiamina per mg di carbonio; Carlucci e Bowes, 1972; Brown et al., 1999). Pertanto, i titoli cellulari che abbiamo osservato in assenza di HMP aggiunto sono coerenti con la spiegazione che anche i reagenti puri (ad esempio, 98-99%) e l'acqua dei depuratori ad osmosi inversa possono contenere concentrazioni molto basse di vitamine e precursori vitaminici, abbastanza per supportare la crescita di cellule che richiedono minuscole quantità di vitamine.

L'HMP contaminante è stato rilevato nella soluzione madre di tiamina che è stata aggiunta ai trattamenti modificati con tiamina. Il livello di "contaminazione" dell'HMP nello stock di tiamina concentrato è stato misurato (tramite LC-MS) a ∼ 2, 6 n M HMP per 1 μ M di tiamina (= 0, 0012 g HMP per g di tiamina) (Figura supplementare S9). L'aggiunta involontaria di circa 2, 6 n M HMP come contaminante del brodo di tiamina è la probabile spiegazione per il ripristino della crescita da parte della tiamina a concentrazioni di coltura di 1 μ M (Figura 3). La fonte di contaminazione dell'HMP sembra essere il risultato del processo commerciale di produzione di tiamina. Non è stato possibile determinare quantità contaminanti di HMP nello stock AmMP poiché HMP e AmMP hanno tempi di ritenzione di cromatografia liquida simili, e quindi l'applicazione di grandi quantità di AmMP alla colonna cromatografica ha oscurato il rilevamento di possibili tracce di HMP. Proponiamo che la contaminazione da HMP nella preparazione di AmMP sia anche una spiegazione plausibile per le rese leggermente elevate ad alte concentrazioni di AmMP.

Questa indagine illustra il valore della combinazione della ricostruzione metabolica dai genomi con la sperimentazione in laboratorio e misurazioni sul campo di composti specifici per esplorare i cicli biogeochimici. La dimostrazione che l'HMP soddisfa esclusivamente il fabbisogno di tiamina di un organismo marino molto abbondante (Figura 3), si trova nell'oceano (Figura 4) ed è trasudato da alcuni organismi marini (Tabella 2), identifica questo composto come un importante fattore di crescita sconosciuto nei sistemi marini. It is particularly surprising that thiamin and AmMP were not used by Ca . P. ubique, implying that HMP-producing organisms potentially could exert control over Pelagibacterales populations. Extending these findings outside of the Pelagibacterales , multiple genomes of cosmopolitan marine bacteria display incomplete thiamin synthesis pathways (Supplementary Table S1), suggesting that thiamin moiety scavenging may be a common strategy in marine waters. The specific mechanism of HMP exudation by marine phytoplankton is unknown. It is possible that in high light environments, intracellular thiamin is relatively unstable, preventing repression of the ThPP-regulated HMP synthase gene ( thiC ), and resulting in HMP overproduction. However, HMP might also partition to the membrane and from there to the extracellular environment because it is relatively hydrophobic, or its exudation could be driven by coevolutionary interactions. As yet, there is no evidence that favors one of these alternatives over another. A more complete understanding of HMP production patterns, as they pertain to vitamin cycling, will likely be important for understanding turnover and connectedness in plankton communities (Fuhrman et al., 2006; Steele et al., 2011).

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