Lo stress del reticolo endoplasmatico media l'autofagia indotta da radiazioni di perk-eif2α in cellule carenti di caspase-3/7 | oncogene

Lo stress del reticolo endoplasmatico media l'autofagia indotta da radiazioni di perk-eif2α in cellule carenti di caspase-3/7 | oncogene

Anonim

Soggetti

  • L'autofagia
  • Cancro al seno
  • Segnalazione cellulare
  • Radioterapia

Astratto

Poiché i difetti dell'apoptosi limitano l'efficacia degli agenti antitumorali, l'autofagia è stata proposta come una nuova strategia per il potenziamento della radioterapia. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'inibizione della caspasi-3/7 induce l'autofagia e promuove la radiosensibilità in vitro e in vivo . Pertanto, abbiamo ulteriormente studiato il meccanismo mediante il quale la radiazione innesca l'autofagia nelle cellule carenti di caspasi-3/7 e abbiamo trovato il coinvolgimento dello stress del reticolo endoplasmatico (ER). L'ER attiva una via di sopravvivenza, la risposta proteica spiegata, che coinvolge proteine ​​transmembrane localizzate ER come la chinasi ER simile alla proteina chinasi (PERK), l'enzima-1 che richiede inositolo e l'attivazione del fattore di trascrizione-6. In questo studio, abbiamo scoperto che PERK è essenziale per l'autofagia indotta da radiazioni e la radiosensibilità nelle cellule a doppio knockout caspase-3/7. L'irradiazione di queste cellule ha aumentato l'espressione di fosforilato-eIF2α. Risultati simili sono stati osservati dopo la somministrazione di tunicamicina (TM), un noto fattore di stress ER. È importante sottolineare che abbiamo scoperto che la somministrazione di TM con radiazioni nelle cellule del carcinoma mammario MCF-7, che mancano di caspasi-3 funzionale e relativamente resistente a molti agenti antitumorali, migliora la sensibilità alle radiazioni. I nostri risultati rivelano lo stress ER come un nuovo potenziale meccanismo di autofagia indotta da radiazioni nelle cellule carenti di caspase-3/7 e come una potenziale strategia per massimizzare l'efficienza della radioterapia nel carcinoma mammario.

introduzione

La maggior parte delle terapie per il cancro, inclusa la radioterapia, inducono la morte delle cellule tumorali, come l'apoptosi. Tuttavia, la capacità delle cellule tumorali di eludere l'apoptosi limita l'efficacia delle attuali strategie di trattamento. Nei nostri precedenti studi, abbiamo dimostrato che l'inibizione della caspasi-3/7 ha aumentato l'autofagia e la radiosensibilità al cancro in vitro e in vivo (Kim et al., 2008c). In effetti, è stato dimostrato che l'autofagia è promossa dalle radiazioni (Daido et al., 2005), in particolare seguendo l'obiettivo di inibizione della rapamicina nei mammiferi (Kim et al., 2008b) e nelle cellule tumorali indipendentemente dall'apoptosi (Paglin et al., 2001). L'autofagia è un meccanismo di sopravvivenza quando la sua funzione principale è quella di degradare proteine ​​di lunga durata e riciclare componenti cellulari come i mitocondri o il reticolo endoplasmatico (ER). Sotto stress eccessivo, tuttavia, l'autofagia porta alla morte cellulare per esaurimento del contenuto cellulare (Mizushima et al., 2002).

I meccanismi specifici con cui le radiazioni innescano l'autofagia e si traducono in una maggiore radiosensibilità rimangono poco chiari nelle cellule carenti di caspasi. Pertanto, abbiamo ulteriormente studiato la segnalazione di autofagia indotta da radiazioni e abbiamo scoperto che lo stress ER partecipa alla regolazione dell'autofagia e della radiosensibilità. In effetti, lo stress cellulare da agenti citotossici può provocare meccanismi di sopravvivenza in diversi compartimenti cellulari, incluso ER. L'interruzione di qualsiasi funzione di ER provoca stress ER e attiva una cascata di segnalazione citoprotettiva chiamata risposta proteica non spiegata (UPR) (Kim et al., 2009). Nelle cellule di mammifero, l'UPR è mediata da tre proteine ​​transmembrane localizzate ER che agiscono come sensori: ER chinasi proteica chinasi-simile attivata dall'RNA (PERK), enzima-1 (IRE1) che richiede inositolo e attivando il fattore di trascrizione-6 (ATF6) (Lai et al., 2007; Kim et al., 2008a). PERK appartiene a una famiglia di chinasi del fattore di iniziazione della traduzione eucariotica 2α (eIF2α) che regolano il controllo traslazionale durante l'UPR. La fosforilazione di eIF2α mediante PERK attivato porta all'attenuazione transitoria della sintesi proteica globale, ma induce la traduzione di ATF4. Activated-IRE1 e ATF6 innescano cascate di segnalazione che promuovono fattori di trascrizione come XBP-1 e CHOP e chaperone ER come GRP78 / BiP. Durante lo stress ER, la perdita di ciclina-D1 provoca l'arresto G1 e successivamente fornisce una finestra per ripristinare l'omeostasi cellulare. Tuttavia, lo stress ER prolungato o eccessivo innesca la via della morte programmata delle cellule, di solito l'apoptosi (Ma et al., 2002; Hitomi et al., 2004; Dahmer, 2005). Tra i fattori di stress ER, la tunicamicina (TM), un antibiotico naturale, induce lo stress ER bloccando la biosintesi di oligosaccaridi N-collegati e inibendo la glicosilazione proteica (Elbein, 1987). In caso di accumulo prolungato di proteine ​​non glicosilate mal ripiegate in ER, le cellule non sono in grado di ripristinare l'omeostasi cellulare e subiscono apoptotis (Kaufman, 1999). Più recentemente, è stato dimostrato che lo stress ER induce anche l'autofagia attraverso l'attivazione della formazione di autofagosomi con conversione LC3 nel lievito (Yorimitsu et al., 2006), e un crescente corpus di prove si aggiunge alla sovraregolazione delle proteine ​​dello stress ER direttamente coinvolte in autofagia (Kouroku et al., 2007; Kim et al., 2008a).

In questo studio, mostriamo prima che l'autofagia indotta da radiazioni è mediata dallo stress ER, e più specificamente dal PERK. Usando le nostre cellule knockout caspase-3/7 che sono difettose nell'apoptosi, mostriamo quindi che il ramo PERK-eIF2α dello stress ER regola la radiosensibilità. L'irradiazione di queste cellule ha elevato i livelli di eIF2α fosforilato, uno dei substrati per la caspasi-3 attivata. Risultati simili sono stati osservati dopo la somministrazione di TM. È importante sottolineare che abbiamo scoperto che la TM nelle cellule di carcinoma mammario MCF-7, che mancano di caspasi-3 funzionale e sono relativamente insensibili a molti agenti antitumorali (Devarajan et al., 2002), aumenta la radiosensibilità. I nostri risultati rivelano lo stress ER come un nuovo meccanismo di autofagia indotta da radiazioni nelle cellule carenti di caspasi e come una potenziale strategia per migliorare l'efficienza della radioterapia nel carcinoma mammario.

risultati

L'autofagia indotta da radiazioni è un processo di stress ER dipendente dal PERK nelle cellule DKO caspase-3/7

Abbiamo precedentemente dimostrato una maggiore radiosensibilità nelle cellule carenti di caspasi-3/7, che è mediata dall'autofagia (Kim et al., 2008c). Per valutare se lo stress ER regola l'autofagia indotta da radiazioni in queste cellule e per determinare quali proteine ​​ER residenti nello stress sono coinvolte nel processo, le cellule wild-type (WT) e caspase-3/7 double-knockout (DKO) sono state prima trasfettate con piccolo controllo RNA (siRNA) interferente o siRNA contro PERK, IRE1α e ATF6α in presenza o assenza di radiazioni (5 Gy). L'autofagia è stata determinata contando le cellule che presentano un pattern punteggiato di GFP-LC3 (Mizushima et al., 2002). Le fotografie rappresentative che mostrano il caratteristico aspetto punteggiato di GFP-LC3 sono presentate nella Figura 1. Come mostrato nella Figura 1a, il knockdown del PERK nelle cellule DKO caspase-3/7 ha ridotto significativamente l'espressione del GFP-LC3 punteggiato rispetto alle cellule trattate con controllo siRNA dopo irradiazione (24 ± 1 vs 50 ± 0, 5, P = 0, 0007). Al contrario, il knockdown di IRE1α e ATF6α nelle cellule DKO caspase-3/7 ha comportato una riduzione minore dell'espressione punteggiata di GFP-LC3 rispetto al controllo siRNA ( P = 0, 005 e 0, 009, rispettivamente). L'efficacia dei siRNA PERK, IRE-1α e ATF6α nel ridurre le proteine ​​target previste è mostrata nelle Figure 1c – e.

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L'autofagia indotta da radiazioni dipende dal PERK nelle cellule DKO MEF caspase-3/7. ( a ) Le cellule DKO MEF wild-type (WT) e caspase-3/7 (caspase-3/7 - / -) sono state trasfettate con siRNA 25 n M contro PERK, IRE1α e ATF6α. Dopo 5 ore, è stata eseguita la trasfezione di cDNA GFP-LC3 (3 μg). Le cellule trasfettate sono state irradiate con 0 o 5 Gy. Dopo 48 ore, è stata calcolata la percentuale di cellule con caratteristico pattern di fluorescenza punteggiata GFP-LC3 rispetto a tutte le cellule GFP-positive. Questo è stato eseguito in triplicato e la barra di errore è mostrata come media ± sd ( b ) WT e caspasi-3/7 DKO Le cellule MEF sono state trasfettate con siRNA 25 n M contro PERK per 24 ore e sono state irradiate (0–6 Gy). Dopo 8 giorni, le colonie sopravvissute furono macchiate e segnate. I valori mostrati sono la media ± sd di tre esperimenti ripetuti separati. ( c ) i livelli di espressione di PERK sono stati determinati mediante western blotting usando lisati di WT e caspase-3/7 cellule DKO MEF trattate con siRNA contro controllo e PERK. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico. ( d ) i livelli di espressione di IRE1α sono stati determinati mediante western blotting usando lisati di cellule WT e DKO MEF caspase-3/7 trattati con siRNA contro controllo e IRE1α. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico. ( e ) I livelli di espressione di ATF6α sono stati determinati mediante western blotting usando lisati di cellule WT e DKO MEF caspase-3/7 trattati con siRNA contro controllo e ATF6α. È stato sondato Actin per dimostrare un carico uguale.

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Per determinare più specificamente il ruolo di PERK nella regolazione della radiosensibilità, abbiamo eseguito test clonogenici con cellule WT e caspase-3/7 DKO, che sono state trasfettate con controllo siRNA o siRNA PERK. Come mostrato nelle Figure 1a eb, è stato osservato un aumento significativo della sopravvivenza nelle cellule DKO caspase-3/7 trattate con siRNA PERK rispetto al controllo siNRA (rapporto di aumento della dose (DER) = 0, 79, P = 0, 005). Il trattamento con siRNA PERK, tuttavia, non ha avuto effetti radiosensibilizzanti significativi nelle cellule WT rispetto al controllo (DER = 1, P = 0, 06). Questi dati suggeriscono che la proteina di stress ER PERK è un mediatore chiave nell'autofagia indotta da radiazioni nelle cellule DKO caspase-3/7 e un importante regolatore della radiosensibilità in assenza di caspase-3/7.

PERK media l'autofagia indotta da radiazioni di eIF2α in cellule DKO caspase-3/7

Studi precedenti hanno rivelato che la conversione di LC3 che porta all'autofagia è associata alla fosforilazione di eIF2α da parte di PERK in cellule C2C5 e fibroblasti embrionali di topo (MEF) trattate con aggregati di poliglutamina, un fattore di stress ER (Kouroku et al., 2007). Per determinare se l'autofagia indotta da radiazioni nelle cellule DKO caspase-3/7 dipende da eIF2α, WT e cellule DKO caspase-3/7 sono state trasfettate con controllo siRNA o siRNA eIF2α, quindi trasfettate con plasmide GFP-LC3 e infine irradiate o no. Come mostrato nella Figura 2a, siRNA eIF2α ha ridotto della metà la percentuale di cellule con punte di GFP-LC3 in cellule DKO caspase-3/7 irradiate rispetto al controllo siRNA (25 ± 1 vs 56 ± 2, 5, P = 0, 003). La risultante diminuzione dell'espressione di eIF2α dopo la trasfezione di siRNA eIF2α è mostrata nella Figura 2b. Inoltre, la radiosensibilità è stata esplorata usando saggi clonogenici (Figura 2c). siRNA eIF2α ha abolito gli effetti sensibilizzanti della delezione di caspase-3/7 rispetto al controllo siRNA nelle cellule DKO caspase-3/7 (DER = 0, 74, P = 0, 001) e ad un livello simile nelle cellule WT trattate con controllo siRNA. Nelle cellule WT trasfettate con siRNA eIF2α, tuttavia, c'era un vantaggio di sopravvivenza rispetto al WT con controllo siRNA (DER = 0, 94, P = 0, 01).

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eIF2α media l'autofagia indotta da radiazioni nelle cellule DKO MEF caspase-3/7. ( a ) Le cellule DKO MEF wild-type (WT) e caspase-3/7 sono state trasfettate con siRNA 25 n M contro eIF2α. Dopo 5 ore, il cDNA GFP-LC3 (3 μg) è stato trasfettato nelle cellule e quindi irradiato con 0 o 5 Gy. Dopo 48 ore, è stata calcolata la percentuale di cellule con fluorescenza puntata GFP-LC3 rispetto a tutte le cellule positive a GFP. Questo è stato eseguito in triplicato e la barra di errore è mostrata come i livelli di espressione media ± sd ( b ) eIF2α sono stati determinati mediante western blotting usando lisati da WT e cellule DKO MEF caspase-3/7 trattate con siRNA contro controllo ed eIF2α. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico. ( c ) Le cellule DKO MEF wild-type (WT) e caspase-3/7 sono state trasfettate con siRNA 25 n M contro eIF2α per 24 ore. Sono stati quindi irradiati con 0–6 Gy. Dopo 8 giorni, le colonie sono state colorate e segnate. I valori mostrati sono la media ± sd di tre esperimenti ripetuti separati. ( d ) Le cellule WK e caspasi-3/7 DKO MEF sono state trasfettate con plasmidi negativi al dominante eIF2α (S51A) o eF2α. Dopo 5 ore, il cDNA GFP-LC3 (3 μg) è stato trasfettato nelle cellule e quindi irradiato con 0 o 5 Gy. Dopo 48 ore, è stata calcolata la percentuale di cellule con fluorescenza puntata GFP-LC3 rispetto a tutte le cellule positive a GFP. Questo è stato eseguito in triplicato e la barra di errore è mostrata come media ± sd ( e ) WT e caspasi-3/7 DKO cellule MEF sono state trasfettate con mutante negativo dominante eIF2α (S51A) o plasmidi eIF2α per 24 ore. Sono stati quindi irradiati con 0–6 Gy. Dopo 8 giorni, le colonie sono state colorate e segnate. I valori mostrati sono la media ± sd di tre esperimenti ripetuti separati.

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Per confermare i risultati dell'esperimento siRNA, abbiamo usato un allele mutante dominante negativo di eIF2α che codifica una proteina con singola sostituzione aminoacidica in posizione 51 (S51A) che inibisce o ritarda la fosforilazione di eIF2α endogeno (Scheuner et al., 2001) . Come mostrato nella Figura 2d, la trasfezione con plasmide mutante eIF2α (S51A) ha ridotto significativamente la percentuale di cellule con punte di GFP-LC3 in cellule DKO irradiate di caspasi-3/7 rispetto al controllo vettoriale (26, 3 ± 1, 5 vs 40, 3 ± 1, P = 0, 0004 ). Al contrario, la sovraespressione di eIF2α WT nelle cellule DKO caspase-3/7 ha aumentato significativamente la percentuale di cellule con punteggiatura GFP-LC3 rispetto al controllo vettoriale (64, 7 ± 2, 5 vs 40, 3 ± 1, P = 0, 0001). Abbiamo anche usato il mutante eIF2α (S51A) nei test clonogenici (Figura 2e), che ha dimostrato che le cellule DKO caspase-3/7 che esprimono mutante eIF2α erano più resistenti alle radiazioni rispetto a quelle trasfettate con plasmide vettoriale vuoto (DER = 0, 78, P = 0, 009). Al contrario, la sovraespressione di eIF2α WT nelle cellule DKO caspase-3/7 ha aumentato significativamente la morte cellulare clonogenica rispetto al controllo vettoriale (DER = 1, 53, P = 0, 008). Insieme, questi risultati suggeriscono che eIF2α media l'autofagia indotta da radiazioni e la radiosensibilità in assenza di caspase-3/7, analogamente a PERK.

La fosforilazione di eIF2α da parte di marcatori di stress PERK ed ER è indotta in risposta alle radiazioni nelle cellule DKO caspase-3/7

I risultati di cui sopra portano all'ipotesi che PERK media l'autofagia indotta da radiazioni mediante fosforilazione di eIF2α. Abbiamo quindi valutato il contributo di PERK alla fosforilazione di eIF2α in cellule DKO WT e caspase-3/7 dopo irradiazione. I livelli di PERK fosforilato ((attivato) e di eIF2α (disattivato) fosforilato (P-eIF2α) sono stati determinati rispettivamente mediante immunoprecipitazione e immunoblotting (Figura 3a). Come previsto, le radiazioni hanno innescato l'attivazione del PERK e indotto la fosforilazione di eIF2α. Questi dati suggeriscono che le radiazioni producono segnali PERK / eIF2α robusti nelle cellule carenti di caspasi-3/7 e ai livelli più bassi nelle cellule WT. Inoltre, la Figura 3b mostra che i livelli spontanei di P-eIF2α sono elevati nelle cellule DKO caspase-3/7 rispetto alle cellule WT, suggerendo che la mancanza di caspase-3/7 promuove la fosforilazione di eIF2α.

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Le radiazioni inducono marcatori di stress ER e fosforilazione di eIF2α. ( a ) Le cellule DKO MEF wild-type (WT) e caspase-3/7 sono state irradiate (5 Gy). Quindi, PERK è stato immunoprecipitato (IP) con anticorpo anti-PERK proveniente da lisati WK e caspasi-3/7 DKO, e gli immunocomplessi PERK sono stati separati da elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide e immunoblotati con PERK fosforilato (attivato) e PERK totale. Le cellule WK e caspase-3/7 DKO MEF sono state irradiate (5 Gy) e le cellule sono state quindi raccolte dopo 30 minuti per analisi di immunoblotting per P-eIF2α (ser 51) e eIF2α totale. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico. ( b ) le cellule WK e caspase-3/7 DKO MEF sono state irradiate (5 Gy) e le cellule sono state quindi raccolte dopo 30 minuti per analisi di immunoblotting per calreticulina e GRP78. È stato sondato Actin per dimostrare un carico uguale. ( c ) Le cellule WK e caspase-3/7 DKO MEF sono state trattate con tunicamicina (1 μg / ml) e le cellule sono state quindi raccolte dopo 30 minuti per analisi di immunoblotting per calreticulina e GRP78. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico.

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Per confermare ulteriormente se le radiazioni inducono stress ER nel nostro modello, abbiamo valutato i livelli di GRP78 (Lee, 2005) e calreticulin (Gelebart et al., 2005), due noti marker di stress ER. Come mostrato nella Figura 3b, le radiazioni sono state in grado di aumentare in modo robusto i livelli di calreticulina nelle cellule DKO caspase-3/7 e in misura inferiore nelle cellule WT. Allo stesso modo, i livelli di GRP78 sono stati significativamente promossi dalle radiazioni nelle cellule DKO di caspasi-3/7 a 12 e 24 ore, mentre il marker ha mostrato un modesto aumento già dopo 3 ore e più significativamente a 24 ore nelle cellule WT. Abbiamo confrontato questi risultati usando TM, un induttore classico dello stress ER (Figura 3c). Come previsto, la TM ha aumentato l'espressione di GRP78 e calreticulina in modo dipendente dal tempo in entrambe le cellule. È interessante notare che gli effetti della TM su entrambi i marker erano più pronunciati nelle cellule DKO caspase-3/7 rispetto alle cellule WT, suggerendo un'associazione tra assenza di caspase-3/7 e promozione dello stress ER. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che le radiazioni inducono stress ER nelle cellule DKO caspase-3/7.

La tunicamicina induce P-eIF2α, con conseguente autofagia e radiosensibilizzazione delle cellule DKO caspasi-3/7

Abbiamo confermato i nostri risultati studiando gli effetti della TM, un induttore di stress ER. La Figura 4a mostra l'espressione di P-eIF2α 30 min dopo la somministrazione di 0-10 μg / ml di TM nelle cellule WT e caspase-3/7 DKO. Come previsto, TM ha indotto P-eIF2α in cellule WT. Inoltre, la TM ha comportato un aumento più elevato e più robusto dei livelli di P-eIF2α nelle cellule DKO caspase-3/7 rispetto a quelle WT. Utilizzando un test GFP-LC3, abbiamo quindi determinato l'effetto della TM sulla formazione di autofagosomi (Figura 4b). Nelle cellule DKO caspase-3/7, il 22, 3% delle cellule trattate con TM ha mostrato un caratteristico pattern punteggiato GFP-LC3, rispetto al 4, 3% nel gruppo dimetilsolfossido ( P = 0, 007). Sebbene in misura minore, la percentuale di cellule che mostravano il modello punteggiato è stata aumentata di TM anche nelle cellule WT (3, 3 ± 0, 58 vs 12 ± 1, P = 0, 006). Questi risultati suggeriscono che lo stress ER indotto dalla TM si traduce in un aumento dell'autofagia da parte della fosforilazione di eIF2α, particolarmente elevata nelle cellule carenti di caspasi-3/7.

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La tunicamicina (TM), un fattore di stress ER, induce P-eIF2α con conseguente autofagia e radiosensibilizzazione delle cellule DKO MEF della caspasi-3/7. ( a ) Le cellule DKO MEF wild-type (WT) e caspase-3/7 sono state trattate con TM (0-10 μg / ml). Le cellule sono state quindi raccolte dopo 30 minuti per analisi occidentali che rilevavano P-eIF2α e eIF2α totale. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico. ( b ) Le cellule WT e caspase-3/7 DKO MEF sono state trasfettate con cDNA GFP-LC3 (3 μg) per 24 ore e sono state trattate con TM (1 μg / ml) per 30 minuti. Dopo 48 ore, è stata calcolata la percentuale di cellule con fluorescenza caratteristica punteggiata GFP-LC3 rispetto a tutte le cellule GFP-positive. Questo è stato eseguito in triplicato e la barra di errore è mostrata come media ± sd ( c ) WT e caspase-3/7 DKO Le cellule MEF sono state trattate con TM (1 μg / ml) e quindi irradiate con 0–6 Gy. Dopo 8 giorni, le colonie sono state colorate e segnate. I valori mostrati sono la media ± sd di tre esperimenti ripetuti separati.

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Per testare gli effetti della TM sulla radiosensibilità, sono state utilizzate cellule WK e DKO caspase-3/7 in saggi di sopravvivenza clonogenici. Come mostrato nella Figura 4c, l'induzione di stress ER da parte di cellule WT significativamente radiosensibilizzate (DER = 1, 14, P = 0, 02) rispetto al gruppo dimetilsolfossido. Tuttavia, la TM ha portato al massimo miglioramento della radiosensibilità nelle cellule DKO caspase-3/7 (DER = 1, 57, P = 0, 04) rispetto al gruppo dimetilsolfossido. Nel loro insieme, questi dati confermano che le radiazioni e la TM inducono una forte attivazione di eIF2α nelle cellule carenti di caspase-3/7 e suggeriscono che la TM migliora sia la sensibilità dell'autofagia che delle radiazioni sia nelle cellule carenti di WT che caspase-3/7.

La tunicamicina aumenta l'autofagia indotta da radiazioni e migliora la radiosensibilità delle cellule di carcinoma mammario MCF-7

Poiché la linea cellulare MCF-7 / neo cancer manca di caspase-3 (Janicke et al., 1998; Ostenfeld et al., 2005), queste cellule sono relativamente resistenti all'apoptosi indotta da radiazioni (Essmann et al., 2004). Pertanto, abbiamo applicato i nostri risultati studiando gli effetti delle radiazioni e della TM sulle cellule MCF-7 / neo e MCF-7 / casp3 (che esprimono caspasi-3 ectopica). Innanzitutto, i livelli di P-eIF2α sono stati confrontati in MCF-7 / neo e MCF-7 / casp3 a seguito di radiazioni (5 Gy) o TM (1 μg / ml), o combinazione di entrambi (Figura 5a). Entrambi gli agenti hanno aumentato i livelli di P-eIF2α in MCF-7 / neo rispetto a MCF-7 / casp-3, in linea con i dati precedenti che mostravano un aumento di P-eIF2α in DKO caspasi-3/7 rispetto alle cellule WT (Figura 3a) . La combinazione di radiazioni e TM ha ulteriormente aumentato i livelli di P-eIF2α nelle cellule MCF-7 / neo rispetto alla sola radiazione. Nelle cellule MCF-7 / casp-3, P-eIF2α è aumentato dopo il trattamento combinato ma è rimasto inferiore rispetto alle cellule MCF-7 / neo. Quindi, abbiamo determinato gli effetti della TM sull'autofagia in entrambe le linee cellulari MCF-7 (Figura 5b). La radiazione combinata / TM ha determinato la percentuale più alta di cellule punteggiate GFP-LC3 positive nel gruppo MCF-7 / neo (37, 5%) rispetto alla radiazione (15, 2%, P = 0, 001) o TM da sola (17, 2%, P = 0, 0001), mentre solo il 5, 3% di cellule autofagiche sono state rilevate nel gruppo di controllo. Al contrario, le cellule autofagiche sono state rilevate in un massimo del 14, 3% ( P = 0, 0006) di cellule MCF-7 / casp-3 dopo il trattamento con radiazioni / TM. Infine, i test clonogenici hanno mostrato che le cellule MCF-7 / neo erano più radiosensibili delle cellule MCF-7 / casp-3 (DER = 1.31, P = 0.01) (Figura 5c). Il trattamento con TM ha aumentato la sensibilità delle cellule MCF-7 / neo (DER = 1, 47, P = 0, 02) rispetto al gruppo dimetilsolfossido, mentre la sensibilità delle cellule MCF-7 / casp-3 è rimasta simile. Questi dati suggeriscono che la TM, un fattore di stress ER, aumenta l'autofagia indotta da radiazioni e migliora la radiosensibilità delle cellule tumorali MCF-7, che mancano di caspase-3.

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Effetti della MT sull'autofagia indotta da radiazioni e sulla radiosensibilità in un modello cellulare di carcinoma mammario MCF-7. ( a ) Le cellule MCF-7 / neo e MCF-7 / caspase-3 sono state trattate con TM (1 μg / ml), radiazioni (5 Gy) o combinazione di entrambi e sono state quindi raccolte dopo 30 minuti per analisi di immunoblotting per P-eIF2α (ser 51), eIF2α totale e caspase-3. È stato sondato l'actina per dimostrare lo stesso carico. ( b ) Le cellule MCF-7 / neo e MCF-7 / caspase-3 sono state trasfettate con cDNA GFP-LC3 (3 μg) per 24 ore e sono state trattate con TM (1 μg / ml per 30 min), radiazioni (5 Gy ) e combinazione TM (1 μg / ml per 30 min) più radiazioni (5 Gy). Dopo 48 ore, è stata calcolata la percentuale di cellule con fluorescenza puntata GFP-LC3 rispetto a tutte le cellule positive a GFP. Ciò è stato eseguito in triplicato e la barra di errore è mostrata come media ± sd ( c ) le cellule MCF-7 / neo e MCF-7 / caspase-3 sono state trattate con TM (1 μg / ml) e quindi irradiate con 0–6 Gy . Dopo 8 giorni, le colonie sono state colorate e segnate. I valori mostrati sono la media ± sd di tre esperimenti ripetuti separati. ( d ) Le cellule MCF-7 / neo e MCF-7 / caspase-3 sono state trasfettate con cDNA GFP-LC3 (3 μg) per 24 ore e sono state trattate con TM (1 μg / ml per 30 min), radiazioni (5 Gy ), siRNA PERK e combinazione di questi agenti. Dopo 48 ore, è stata calcolata la percentuale di cellule con fluorescenza puntata GFP-LC3 rispetto a tutte le cellule positive a GFP. Ciò è stato eseguito in triplice copia e la barra di errore viene visualizzata come media ± sd

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Successivamente abbiamo valutato se gli effetti della MT sull'autofagia indotta da radiazioni e sulla radiosensibilità nelle cellule tumorali MCF-7 siano processi dipendenti dal PERK. I saggi di autofagia hanno mostrato che la sola TM era in grado di aumentare la formazione di autofagosomi dal 5 al 18% nelle cellule MFC-7 / neo, mentre il knockdown PERK riduce l'autofagia indotta dalla TM al 10% (Figura 5d). Se combinato con radiazioni, la TM si traduce in cellule autofagiche al 40% (rispetto al 15% per il solo gruppo di controllo delle radiazioni) e siRNA PERK ha ridotto significativamente le radiazioni e l'autofagia indotta da TM al 18% nelle cellule MFC-7 / neo. Al contrario, il knockdown del PERK non ha ridotto significativamente l'autofagia indotta dalla TM nelle cellule MCF-7 / casp-3 trattate con radiazioni o meno. Questi risultati suggeriscono l'importanza dell'autofagia mediata da PERK nelle cellule MCF-7 / neo trattate con radiazioni e TM. Nei test clonogenici (Figura 6), l'ablazione del PERK con siRNA nelle cellule tumorali MCF-7 / neo ha abolito gli effetti delle radiazioni e della TM sulla sopravvivenza cellulare (DER = 0, 52, P = 0, 01), suggerendo la dipendenza del PERK per la radiosensibilizzazione dopo il trattamento con TM e radiazioni.

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Effetti del knockdown del PERK sulla radiosensibilizzazione indotta da TM di cellule di carcinoma mammario MCF-7. Le cellule MCF-7 / neo e MCF-7 / caspase-3 sono state trattate con TM (1 μg / ml), siRNA PERK o combinazione di entrambi e quindi irradiate con 0–6 Gy. Dopo 8 giorni, le colonie sono state colorate e segnate. I valori mostrati sono la media ± sd di tre esperimenti ripetuti separati.

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Discussione

Lo scopo di questo studio era di esplorare i meccanismi dell'autofagia indotta da radiazioni in cellule carenti di caspase-3/7. I nostri risultati hanno rivelato che lo stress ER, principalmente attraverso l'attivazione dell'asse PERK / eIF2α, regola la sensibilità alle radiazioni nelle cellule carenti di caspasi-3/7 e in misura molto inferiore anche nelle cellule WT. È importante sottolineare che dimostriamo anche che le cellule di carcinoma mammario MFC-7, che sono relativamente resistenti all'apoptosi indotta da radiazioni perché prive di caspasi-3, sono più sensibili alle radiazioni quando un fattore di stress ER, in questo caso TM, viene somministrato contemporaneamente.

La capacità delle cellule tumorali di eludere l'apoptosi è un segno distintivo del cancro e la relativa resistenza all'apoptosi costituisce un importante problema clinico. Come alternativa alla morte cellulare dell'apoptosi, l'autofagia è attualmente un importante obiettivo di ricerca per la terapia, principalmente perché molti agenti antitumorali inducono l'autofagia e le sue implicazioni nella tumorigenesi. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'inibizione della caspasi-3/7 ha aumentato l'autofagia e successivamente aumentato la radiosensibilità del cancro in vitro e in vivo (Kim et al., 2008c). In questo studio, mostriamo che la segnalazione di stress ER è un meccanismo che partecipa all'autofagia indotta da radiazioni. Numerosi rapporti recenti hanno dimostrato che lo stress ER è associato all'autofagia e principalmente come tentativo di sopravvivenza cellulare (Bernales et al., 2006; Ogata et al., 2006; Yorimitsu et al., 2006; Ding et al., 2007; Kouroku et al., 2007). Sebbene l'esito opposto non sia ancora ben esplorato, noi e altri abbiamo dimostrato che l'accumulo eccessivo o prolungato di stress provoca la morte cellulare autofagica, specialmente se l'apoptosi non è disponibile (Cao et al., 2006; Kim et al., 2006, 2008b, 2008c; Ullman et al., 2008). In questo studio, abbiamo anche confermato che l'autofagia indotta da stress ER avrebbe comportato la radiosensibilizzazione in assenza di apoptosi caspase-dipendente. In effetti, il knockdown del PERK ha comportato una maggiore radioresistenza nelle cellule DKO WT e caspase-3/7 rispetto ai rispettivi controlli (Figura 1b). Allo stesso modo, il knockdown di eIF2α (Figura 2c) o la sovraespressione del mutante eIF2α (S51A) (Figura 2e) hanno aumentato la radioresistenza nelle cellule WT e caspase-3/7 DKO rispetto ai controlli. Questi dati sono coerenti con un recente studio che mostra che lo stress ER può provocare la morte cellulare simile alla necrosi promossa dall'autofagia in cellule DKO Bax / Bak o cellule che sovraesprimono Bcl-xL che sono quindi difettose dell'apoptosi (Ullman et al., 2008). In precedenza abbiamo anche riferito che le cellule DKO Bax / Bak erano più radiosensibili attraverso l'autofagia e che l'inibizione dell'autofagia con siRNA ATG5 / Beclin-1 induce la radioresistenza (Kim et al., 2006). Inoltre, i nostri studi precedenti hanno dimostrato che l'autofagia modula la radiosensibilità delle cellule tumorali polmonari MDA-MB-231 e H460 (Kim et al., 2006, 2008c). Coerentemente, riportiamo qui che, in assenza di caspase-3/7, TM ha aumentato l'autofagia di cinque volte e ha migliorato la radiosensibilità con un DER di 1, 57 (Figura 4). Negli scenari in cui l'autofagia porta alla sopravvivenza cellulare, la caspasi-3, oltre al suo ruolo di carnefice di apoptosi, può prevenire la protezione dell'autofagia al fine di accelerare la morte cellulare. In effetti, una funzione dell'autofagia è l'eliminazione degli aggregati proteici e delle proteine ​​mal ripiegate al fine di limitare la risposta allo stress ER e la successiva apoptosi (Ding et al., 2007). Pertanto, si potrebbe ipotizzare che l'assenza di caspase-3/7 consenta la promozione dell'autofagia e porti a una maggiore sopravvivenza. Tuttavia, quando lo stress è eccessivo o incapace di risolvere, l'autofagia diventa un processo autodistruttivo, come illustrato nel nostro studio. Tuttavia, l'autofagia e il suo dialogo incrociato con l'apoptosi sono complessi (Eisenberg-Lerner et al., 2009) e meritano ulteriori indagini per una migliore caratterizzazione.

Per quanto riguarda la segnalazione dell'autofagia indotta da stress ER, non è ancora chiaro quale trasduttore UPR abbia un ruolo nelle cellule di mammifero. In effetti, Yorimitsu et al. (2006) hanno mostrato che lo stress ER (indotto da dithiothreitol o TM) innesca l'autofagia nelle cellule di lievito attraverso la segnalazione IRE1. Coerentemente, Ogata et al. (2006) hanno riferito che IRE1 è richiesto per l'autofagia indotta da stress ER nelle cellule SK-N-SH trattate con TM o thapsigargin. Ciò è in contrasto con i nostri risultati, che indicano che principalmente il knockdown del PERK ha ridotto significativamente la formazione di autofagosomi (Figura 1a), in particolare nelle cellule DKO caspase-3/7. Di conseguenza, la diminuzione della formazione di autofagosomi era correlata con un aumento della radioresistenza, suggerendo che PERK / eIF2α è necessario per l'autofagia indotta da radiazioni (Figure 1b e 2c). Questa discrepanza può suggerire un diverso meccanismo per l'attivazione dell'autofagia nelle cellule carenti di caspase-3/7 rispetto alle cellule di lievito o SK-N-SH. Tuttavia, i nostri risultati sono coerenti con lo studio di Kouroku et al. (2007), che ha dimostrato che PERK-eIF2α, e non IRE1, induce l'autofagia da stress ER nelle cellule MEF e C2C5 trattate con aggregato di poliglutamina. Da notare che l'associazione tra eIF2α-fosforilazione e autofagia indotta da fame era stata precedentemente riportata in cellule di lievito e di mammifero (Talloczy et al., 2002). Come mostrato in Figura 4a, TM ha aumentato P-eIF2α, in cellule DKO WT e caspase-3/7, con un'induzione particolarmente robusta in quest'ultima. Allo stesso modo, i livelli di P-eIF2α sono stati indotti dalla TM nelle cellule tumorali MCF-7 / neo rispetto alle cellule MCF-7 / casp-3 (Figura 5a). Pertanto, tra i due percorsi UPR, la segnalazione specifica dell'autofagia mediata da stress ER sembra variare a seconda del tipo di cellula e dello stimolo da stress.

È interessante notare che il nostro studio suggerisce la presenza di un livello spontaneo di PERK e P-eIF2α fosforilati (attivati) nelle cellule carenti di caspasi-3/7 indipendentemente dalle radiazioni, al contrario delle cellule WT (Figura 3a). Come sappiamo, PERK media i suoi effetti con P-eIF2α (Harding et al., 1999). Nel contesto dello stress ER, P-eIF2α inattivo ha dimostrato di ridurre l'ATF4, la cui traduzione di mRNA dipende dalla fosforilazione di eIF2α a Ser51 (Scheuner et al., 2001). In assenza di serina fosforilata, l'mRNA di ATF4 viene trascritto, ma non tradotto. Più recentemente, Kouroku et al. (2007) hanno dimostrato che la fosforilazione del Ser51 è necessaria per la conversione di LC3 e quindi la formazione di autofagosomi. Coerentemente, abbiamo trovato una ridotta formazione di autofagosomi e radiosensibilità utilizzando un mutante eIF2α (S51A) in cellule DKO irradiate di caspasi-3/7 (Figure 2d ed e). Al contrario, la sovraespressione di eIF2α ha ulteriormente aumentato l'autofagia indotta da radiazioni e la radiosensibilità nelle cellule DKO caspase-3/7. Questi risultati supportano l'idea che la maggiore sensibilità delle cellule carenti di caspase-3/7 sia mediata dalla fosforilazione di PERK / eIF2α.

È stato precedentemente dimostrato che la caspasi-3 attiva divide eIF2α nel suo terminale C in cellule Saos-2, HeLa, K562 e Jurkat T (Satoh et al., 1999; Marissen et al., 2000). Pertanto, un'altra ipotesi che abbiamo testato è se caspase-3 divida eIF2α nel nostro modello. Per rilevare la scissione endogena di eIF2α, abbiamo usato due anticorpi disponibili in commercio: un anticorpo (Ab-A) che riconosce il terminale C, l'altro (Ab-B) che riconosce il terminale N. So, the event of cleavage will eliminate the C terminus and make the cleaved product be recognized by Ab-B but not Ab-A. We induced active recombinant caspase-3 in WT cells, and found a reduction of uncleaved-eIF2α and total-eIF2α levels (Supplementary Figure 2a). This is consistent with previous findings that caspase-3 cleaves eIF2α at C terminus, altering its function (Satoh et al., 1999; Marissen et al., 2000). We then found that eIF2α cleavage by caspase-3 is promoted by TM in WT cells and, although to a lesser extent, radiation as well (Supplementary Figure 2b). Similarly to experiment shown in Supplementary Figure 2b, we also tested eIF2α cleavage by active caspase-3 after apoptosis induction by radiation and TM in caspase-3/7 DKO cells (Supplementary Figure 2c). As expected, caspase-3 was not detected in caspase-3/7 DKO cells, and high levels of uncleaved-eIF2α were detected as opposed to WT cells. These results suggest that radiation, similarly to TM, reduces uncleaved-eIF2α levels in WT cells, and not in caspase-3/7-deficient cells. Thus, these data suggest that active caspase-3 is associated with cleavage of eIF2α after exposure to stressors such as radiation and that cleaved-eIF2α could potentially be an additional factor limiting radiation-induced autophagy in WT cells.

Function of ER is disrupted in many diseases, including cancer, thus activating UPR, mainly to resolve cellular stress. In addition, tumor microenvironment is characterized by a 'baseline' level of ER stress response that promotes tumor development and metastasis (Romero-Ramirez et al., 2004; Lee, 2007). It has previously been shown by immunohistochemistry studies that caspase-7 is downregulated in 85% of colon cancer samples compared with normal mucosa (Palmerini et al., 2001). Similarly, in a study examining caspase-3 expression in malignant breast tissue samples, it was showed that 75% of breast tumor samples lacked caspase-3 transcript and expression, whereas remaining samples showed substantial decreases in caspase-3 expression (Devarajan et al., 2002). These results suggest that defects in caspase-3 or caspase-7 are prevalent in human breast and colon cancer. Therefore, we wanted to translate our findings from caspase-deficient MEF cells to cancer models that harbor defects in caspase-3. MCF-7 human breast carcinoma cells have been used to study ER stress mechanisms (Delom et al., 2007a, 2007b), although not related to autophagy. In our study, we looked at autophagy levels in these cells as well as MCF-7/casp-3 cells after treatment with TM and radiation (Figure 5). Data showed almost 40% of cells lacking caspase-3 underwent autophagy after combination treatment, as opposed to only 15% of cells expressing caspase-3. As anticipated, absence of caspase-3 also correlated with increased radiosensitization, consistent with our observations in caspase-3/7 DKO cells (Figure 4c). Taken together, these data support the use of an ER stressor, such as TM, to sensitize MCF-7 cancer cells to radiation. Of note, classic agents inducing ER stress, such as TM, are broadly toxic and subsequently not suitable for use in cancer patients. However, drugs including proteasome inhibitors, selenium and fatty acid synthase inhibitors were shown to induce ER stress in addition to their specific targeted effects, and, therefore, are more indicated for clinical trials.

This study provides novel findings that radiation-induced ER stress mediates autophagy. In addition, our data suggest that caspase-3 has a critical role in modulating the PERK/eIF2α pathway after radiation. To our knowledge, this is the first report of radiation-induced autophagy through UPR mechanisms. Many cancers exhibit multiple deregulations in cell death pathways, allowing for the subsequent promotion of tumor cell survival. As we showed here, there is a potential for novel anticancer strategies to overcome resistant cancer cells with defective apoptosis machinery in order to improve overall therapeutic outcomes.

Materiali e metodi

Coltura cellulare e reagenti

Primary MEFs derived from WT and caspase-3/7 DKO mice, immortalized by transfection with SV40-T-antigen-containing plasmid, were generously provided by Dr Richard Flavell (Yale University, New Haven, CT, USA). MEFs were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) supplemented with 1 m M non-essential amino acids, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, and 0.5 μmol/l 2-mercaptoethanol (kindly provided by Dr Ronald Wek, Indiana University, Indianapolis). Human breast cancer MCF-7/neo and MCF-7/casp3 cells were kindly provided by Dr Marja Jäättelä (Danish Cancer Society, Copenhagen, Denmark) (Janicke et al., 1998; Ostenfeld et al., 2005) and cultured in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, and 400 μg/ml G418 (Research Products International, Mt Prospect, IL, USA). TM was purchased from Sigma (St Louis, MO, USA).

trasfezione siRNA

siRNA eIF2α, siRNA PERK, siRNA ATF6α, siRNA IRE1α (mouse) and siRNA control were purchased from Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Cells were transfected with 25 n M siRNAs using Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Transfected cells were used for subsequent experiments 24 h later.

immunoblotting

Cells (0.5 × 10 6 ) were treated with radiation and drugs, and collected at various time points, and then washed with ice-cold phosphate-buffered saline twice before addition of lysis buffer (M-PER Mammalian Protein Extraction reagent, Thermon scientific, Rockford, IL, USA), which included protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail I 5 μg/ml (Sigma, St Louis, MO, USA). Protein concentration was quantified by Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Equal amounts of protein were loaded into each well and separated by 12.5% SDS–polyacrylamide gel electrophoresis gel, and transfered onto polyvinylidene difluoride-membranes (Bio-Rad). Membranes were blocked with 5% nonfat dry milk in PBS-T for 1 h at room temperature. Blots were incubated with PERK, IRE1α, ATF6α, GRP78 (Santa Cruz), Caspase3, P-PERK, eIF2α and calrecticulin (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), and P-eIFα (Ser 51) (Upstate, Temecula, CA, USA) and actin antibodies for 1 h at 4 °C. Goat anti-rabbit IgG secondary antibody (1:5000, Santa Cruz) was incubated for 45 min at room temperature. Western blots were developed using chemoluminescence detection system (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) according to the manufacturer's protocol, and autoradiography.

immunoprecipitazione

Cells (5 × 10 5 ) received 5 Gy ( 137 Cs irradiator). After 30 min, they were harvested and lysed in isotonic immunoprecipitation buffer (142.5 m M KCl, 5 m M MgCl 2, 10 m M HEPES and 0.25% Nonidet P-40), which included protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail I (Sigma, 5 μl/ml). Cell lysates (400 μg) were incubated with PERK-antibody overnight and precipitated with protein A/C Sepharose for 2 h. Equal amounts of protein were fractionated by 8% SDS–polyacrylamide gel electrophoresis, and transferred to polyvinylidene difluoride membranes (Bio-Rad). Western blots were developed using chemoluminescence detection system (Perkin-Elmer) according to the manufacturer's protocol, and autoradiography.

Test clonogenico

Cells were irradiated with 0–6 Gy (dose rate of 1.8 Gy/min) using 137 Cs irradiator (JL Shepherd and Associates, Glendale, CA, USA). After irradiation, cells were incubated at 37 °C for 8–10days. Cells were fixed for 15 min with 3:1 methanol/acetic acid and stained for 15 min with 0.5% crystal violet (Sigma) in methanol. After staining, colonies were counted by naked eye (cut-off of 50 viable cells). Surviving fraction was calculated as (mean colony counts)/(cells inoculated) × (plating efficiency), with plating efficiency defined as (mean colony counts)/(cells inoculated for irradiated controls). The DER was calculated as the dose (Gy) for radiation alone divided by the dose (Gy) for radiation plus additional agent (normalized for agent toxicity) necessary for a surviving fraction of 0.25.

Autophagy assay

Cells were transfected with 2.5 μg GFP-LC3 (a gift from Dr Mizushima), eIF2αwt and eIF2αmt-(Ser51) plasmids using lipofectamine reagent (Invitrogen Life Technologies). After 24 h, cells were treated with 5 Gy. After 48 h, GFP-LC3 fluorescence was observed under a confocal fluorescence microscope. Cells with punctate-GFP signaling were counted as autophagic cells because of the characteristic lysosomal localization of LC3-protein during autophagy (Mizushima et al., 2001). Punctate-GFP cells were quantified by randomly selecting three separate × 100 fields and counting the number of punctate-GFP cells/field. The percent of punctate-GFP cells per total GFP-transfected cells was calculated (experiments conducted in triplicate).

analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test t di Student (non accoppiato, a due code, n = 3). Le differenze sono state considerate statisticamente significative quando P <0, 05. I valori sono espressi come media ± sd

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    Figura supplementare 1

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    Figura complementare 2

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