Gli estrogeni indeboliscono la resistenza muscolare attraverso la soppressione degli orosomucidi (orm) mediata dal recettore degli estrogeni-p38 | medicina sperimentale e molecolare

Gli estrogeni indeboliscono la resistenza muscolare attraverso la soppressione degli orosomucidi (orm) mediata dal recettore degli estrogeni-p38 | medicina sperimentale e molecolare

Anonim

Soggetti

  • Segnalazione cellulare
  • Meccanismi di malattia

Astratto

Le differenze di genere nell'affaticamento si manifestano quando le femmine sono più inclini a provare stanchezza e hanno una resistenza muscolare inferiore. Tuttavia, i meccanismi di questi effetti rimangono poco chiari. Abbiamo studiato se questo orosomucoide, una proteina anti-fatica endogena che migliora la resistenza muscolare, è coinvolto in questo regolamento. Le femmine di ratto hanno mostrato una resistenza muscolare inferiore e questa differenza di genere è scomparsa nei topi con deficit di orosomucoid-1. Le femmine di ratto hanno anche mostrato una più debole induzione orosomucoid nel siero, nel fegato e nei muscoli in risposta alla fatica rispetto ai ratti maschi. L'ovariectomia ha aumentato i livelli di orosomucoid e aumentato il tempo di nuoto e il rifornimento di estrogeni ha invertito questi effetti. Il trattamento con estrogeni esogeni in topi maschi e femmine ha prodotto effetti opposti. L'estrogeno ha ridotto l'espressione di orosomucoid e la sua attività di promotore nel muscolo C2C12 e nelle cellule del fegato di Chang in vitro , e il blocco degli estrogeni o il blocco della proteina chinasi attivato dal mitogeno p38 hanno eliminato questo effetto. Pertanto, gli estrogeni regolano negativamente l'espressione orosomucoid che è responsabile della resistenza muscolare più debole nelle femmine.

introduzione

L'affaticamento si manifesta generalmente come un declino reversibile delle prestazioni degli individui colpiti, 1 ed è diviso in affaticamento centrale e affaticamento fisico. I pazienti con affaticamento centrale, in particolare la sindrome da affaticamento cronico, si lamentano sempre della ridotta resistenza fisica, 2, 3 e l'affaticamento fisico è generalmente accompagnato da defecazione della funzione muscolare e dall'esaurimento del carburante. L'affaticamento muscolare è un fenomeno comune definito come una riduzione indotta dall'esercizio della capacità di un muscolo o di un gruppo muscolare di generare la forza massima 4 che limita la vita quotidiana, le prestazioni atletiche o altre attività faticose o prolungate. La resistenza muscolare viene generalmente utilizzata per valutare la resistenza muscolare all'affaticamento che si riferisce alla capacità di un muscolo o di un gruppo di muscoli di sostenere contrazioni ripetute contro una resistenza (ad esempio, un determinato carico o stimoli ripetitivi) per un lungo periodo di tempo. L'indice di fatica viene utilizzato per misurare la resistenza muscolare. 5, 6

La differenza di genere nell'affaticamento e nella resistenza muscolare è un fattore importante nella pratica clinica. 7, 8 Le femmine sono più inclini a lamentarsi della fatica e richiedono tempi di recupero maggiori rispetto ai maschi che svolgono la stessa intensità di lavoro. 9 La maggior parte degli studi ha riportato che il 75% o più dei pazienti con sindrome da affaticamento cronico erano donne. 7, 10 Le femmine che soffrono di malattie, come l'artrite reumatoide, l' 11 post-colpo 8 e l'infarto miocardico acuto, 12 hanno significativamente più probabilità di presentarsi con affaticamento e il loro grado di affaticamento è più grave di quello dei maschi. Punteggi di test di resistenza inferiori sono stati trovati anche per le donne rispetto agli uomini nelle persone sane e nei pazienti, specialmente negli atleti. 5, 6, 13, 14, 15, 16 Questi studi sono coerenti con il fatto che i record sportivi femminili non sono buoni come quelli dei maschi e che la durata del lavoro femminile è generalmente inferiore a quella dei maschi. Queste differenze di genere probabilmente proteggono le donne dal lavoro eccessivo e suggeriscono che alcuni fattori ormonali, in particolare gli estrogeni, siano coinvolti in questo fenomeno. Tuttavia, nessuna prova diretta o un meccanismo sottostante è stato chiaramente stabilito.

I nostri studi precedenti hanno riferito che l'orosomucoid (ORM), proteina endogena anti-affaticamento, ha migliorato la resistenza muscolare. L'ORM, noto anche come glicoproteina acida α-1, è una proteina in fase acuta che presenta un peso molecolare di 37-54 kDa, un basso pI di 2, 8-3, 8 e una glicosilazione pesante (45%). Il fegato sintetizza principalmente ORM, ma molti tessuti extraepatici producono anche ORM in varie condizioni fisiologiche e patologiche. L'ORM presenta molte attività biologiche, tra cui la modulazione dell'immunità, il legame e il trasporto di farmaci, il mantenimento della barriera capillare e la funzione di marker di malattia. 17 Il ruolo dell'ORM nel cancro, 18, 19, 20 malattie cardiovascolari 21, 22 e metabolismo energetico 23 è stato recentemente rivelato. In precedenza abbiamo riportato che l'ORM era significativamente elevato nei sieri, nei tessuti epatici e muscolari dei roditori affaticati (ad esempio, privazione del sonno, nuoto forzato e modelli con corsa su tapis roulant) e nei sieri dei pazienti con sindrome da affaticamento cronico. 2, 24 Ulteriori studi hanno dimostrato che l'ORM ha funzionato come proteina anti-fatica attraverso l'attivazione del CCR5 muscolare (recettore CC chemokine di tipo 5) per aumentare la conservazione del glicogeno e la resistenza muscolare. 2 Pertanto, abbiamo esaminato se ORM ha partecipato alla regolazione differenziale della fatica e della resistenza muscolare negli uomini e nelle donne.

Abbiamo scoperto che una resistenza muscolare più debole nelle femmine era strettamente correlata alla riduzione dell'induzione di ORM in risposta alla fatica. I dati in vivo e in vitro hanno dimostrato che gli estrogeni potrebbero sottoregolare l'espressione ORM attraverso i recettori degli estrogeni (ER) e la via della proteina chinasi attivata dal mitogeno p38 (MAPK) che ha ridotto la resistenza muscolare. Questa differenza nell'ORM può essere responsabile della differenza di genere nell'affaticamento muscolare.

Materiali e metodi

reagenti

Il 17β-estradiolo e l'ICI 182780 (un degradatore ER selettivo) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). BEZ235 (inibitore della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)) e SB203580 (inibitore MAPK) sono stati acquistati da Selleck Chemicals (Houston, TX, USA). L'anticorpo contro ORM (ratto) è stato acquistato da Abcam (Cambridge, Regno Unito) e l'anticorpo contro ORM (topo) è stato ottenuto da Genway (San Diego, California, USA). Un anticorpo contro la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato acquistato dal Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Cina). Gli anticorpi secondari coniugati con IRDye 800CW sono stati acquistati da Rockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA).

Animali

Ratti Sprague-Dawley del peso di 220 ± 7 ge topi C57BL / 6 del peso di 22 ± 2 g sono stati acquistati da Sino-British SIPPR / BK Laboratory Animals (Shanghai, Cina). Tutti gli animali sono stati ripesati e abbinati al peso prima degli esperimenti. Topi con deficit di ORM1 sono stati generati e identificati come riportato in precedenza. 2, 23 In generale, i topi knockout ORM1 sono stati generati attraverso la costruzione di vettori indirizzati agli esoni da 1 a 5 del gene ORM1, trasfezione e selezione di cellule staminali embrionali (SCR012) e iniezione di cellule staminali embrionali in blastocisti di topi C57BL / 6J. I maschi chimerici risultanti sono stati allevati con topi C57BL / 6J femmine per produrre topi mutanti eterozigoti che sono stati incrociati per ottenere topi omozigoti e wild-type.

Tutti gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 ± 3 ° C) e in condizioni di illuminazione (0800-2000 h) con libero accesso all'acqua e una dieta standard per roditori. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del National Institute of Health e con l'approvazione del Scientific Investigation Board della Second Military Medical University.

Coltura della linea cellulare

Le cellule C2C12 (mioblasti muscolari di topo) sono state acquistate dagli Istituti di Shanghai per le scienze biologiche, dall'Accademia cinese delle scienze (Shanghai, Cina) e coltivate in terreni integrati con siero composti dal mezzo di aquila modificato di Dulbecco e dal siero bovino fetale al 10%. Le cellule epatiche di Chang umano sono state acquistate dalla tecnologia biomedica BioHermes (Wuxi, Cina) e coltivate in terreno RPMI-1640 con siero bovino fetale al 10%.

Nuoto forzato carico di peso

Gli esperimenti sono stati eseguiti come precedentemente descritto. 2 ratti maschi e femmine sono stati abbinati per un peso controllato a 220 ± 7 g. In breve, topi o ratti sono stati collocati singolarmente in un serbatoio d'acqua (46 cm di altezza, 20 cm di diametro, 21-23 ° C). Gli animali da esperimento sono stati costretti a nuotare con un carico dell'8% di ogni peso corporeo attaccato all'estremità prossimale della coda. Il tempo di nuoto è stato misurato dal momento in cui il nuoto ha avuto inizio al momento in cui gli animali non sono potuti tornare sulla superficie dell'acqua 10 s dopo l'affondamento. 25

Affaticamento da privazione del sonno

I ratti maschi e femmine sono stati abbinati per un peso controllato a 220 ± 7 g. I ratti sono stati privati ​​del sonno per 5 giorni consecutivi in ​​una gabbia riempita con acqua ad un'altezza di 1, 5 cm, come precedentemente descritto, 2, 26 e il grado di fatica è stato valutato usando il nuoto forzato carico.

Tapis roulant-running

I ratti maschi e femmine sono stati abbinati per un peso controllato a 220 ± 7 g. Questi ratti sono stati sottoposti a esaurimento su un sistema di tapis roulant per esaurimento come descritto in precedenza. 2 I ratti sono stati costretti a correre 1 ora al giorno a una velocità di 30 m min-1 per un allenamento di adattamento di 1 settimana. La velocità iniziale era di 12 m min −1, ma aumentava gradualmente ogni 5 min ad una velocità di 3 m min −1 fino a raggiungere 30 m min −1 . I ratti sono stati costretti a correre a una velocità di 30 m min -1 -1 settimana dopo fino a quando gli animali non sono stati in grado di mantenere il ritmo del tapis roulant per un massimo di 10 s. I ratti erano considerati sfiniti quando non potevano raddrizzarsi se posti in posizione supina per controllare. Il tempo di esaurimento è stato registrato.

ovariectomia

Le femmine di ratto sono state ovariectomizzate bilateralmente come precedentemente descritto. 27 In generale, gli animali sono stati iniettati per via intraperitoneale con 30 mg kg −1 di nembutale per l'anestesia. L'area chirurgica dall'anca alla costola più bassa su entrambi i lati è stata rasata e sterilizzata. È stata praticata un'incisione di 1, 5 cm attraverso la pelle, il tessuto connettivo e lo strato muscolare e le ovaie sono state esteriorizzate con il cuscinetto adiposo associato e la tuba di Falloppio. Gli animali operati con sham (non ovariectomizzati) sono stati anestetizzati e sottoposti solo a chirurgia senza rimozione delle ovaie.

Indice biochimico sierico

I livelli sierici di ORM e di estradiolo sono stati misurati utilizzando kit di saggi per immunosorbenti (ELISA) specifici per enzima. Il kit ELISA ORM per topi è stato ottenuto da Abcam. Il kit mouse ELM ORM è stato ottenuto dalla Shanghai Westang Bio-Tech (Shanghai, Cina). I kit ELISA per estradiolo di topo e topo (E2) sono stati ottenuti dalle proteine ​​Shanghai West-Bio-Tech sono state rilevate secondo le istruzioni del produttore.

Western blotting per ORM

La western blotting è stata eseguita come precedentemente riportato. 28 I tessuti o le cellule sono stati omogeneizzati su ghiaccio e lisati in un tampone di lisi che conteneva una miscela di inibitori della proteasi (Kangchen, Shanghai, Cina). Le concentrazioni di proteine ​​sono state misurate utilizzando un kit di test proteici BCA (Beyotime Institute of Biotechnology). Le proteine ​​sono state separate su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e trasferite su una membrana di nitrocellulosa che è stata incubata con anticorpi specifici per ORM. Lo stesso caricamento del campione è stato confermato riesaminando le macchie per GAPDH.

Induzione della fatica nei muscoli isolati

L'affaticabilità muscolare è stata misurata come precedentemente descritto. 2 I muscoli del soleo del ratto e del topo sono stati isolati nell'integrità senza danni ai nervi. Un'estremità del muscolo era fissa e l'altra era collegata a un sensore di raccolta del segnale biotico e un sistema di elaborazione (MedLab-U / 4CS, MeiYi, Nanchino, Cina). Le contrazioni evocate delle strisce muscolari sono state continuamente rilevate per 3 minuti sotto treni di stimolazione elettrica a 10 V della durata di 5 ms erogati ogni secondo per 3 minuti. L'indice di fatica è stato calcolato come rapporto di tensioni a 1, 2 e 3 minuti rispetto alla tensione iniziale (media delle prime 5 contrazioni).

Trascrizione inversa-PCR (RT-PCR)

RT-PCR è stata eseguita come precedentemente riportato. 29 L'RNA totale è stato estratto dalle cellule C2C12 utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) e trascritto inverso utilizzando un kit PrimeScript Perfect Master in tempo reale (Takara, Otsu, Giappone). L'analisi quantitativa RT-PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando i kit SYBR RT-PCR (Takara). I livelli di espressione sono stati normalizzati al gene di controllo GAPDH. Sono state utilizzate le seguenti sequenze di primer: 23 ORM, 5′-ACACAATAGAGCTTCGGGAGTC-3 ′ (forward), 5′-ATATCTGGCCTTTTGGCATAGA-3 ′ (reverse); e GAPDH, 5 ′ -− GTATGACTCCACTCACGGCAAA-3 ′ (avanti), 5′-GGTCTCGCTCCTGGAAGATG-3 ′ (retromarcia).

Saggi transitori di transfezione e doppia luciferasi

Il plasmide della luciferasi ORM conteneva un frammento da -1, 4 kb a -150 bp del promotore ORM del topo di fronte a un gene reporter luciferasi 30 che è stato gentilmente fornito da Yun Sok Lee (School of Biological Sciences, Seoul National University, Seoul, Corea). Le cellule HEK293 sono state trasfettate con il plasmide reporter della luciferasi e incubate con le dosi indicate di estrogeni per 24 ore. Le attività di Luciferase sono state misurate utilizzando il sistema di dosaggio Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, USA) secondo le istruzioni del produttore. 31

analisi statistica

Il test t di Student è stato usato per confrontare due gruppi distinti. L'analisi unidirezionale della varianza seguita dalla differenza meno significativa t- test è stata utilizzata per confrontare più di due gruppi. Le interazioni sono state analizzate utilizzando un'analisi bidirezionale della varianza seguita dal test t differenza meno significativo. Friedman M -test è stato utilizzato quando i dati mostravano eterogeneità di varianza. I dati sono presentati come la media ± sem P <0, 05 è stata considerata statisticamente significativa. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software JMP 4.0.4 del SAS Institute (Cary, NC, USA).

risultati

Le femmine hanno mostrato una resistenza muscolare inferiore rispetto ai maschi in vivo e in vitro

Abbiamo studiato se esistessero differenze di genere nell'affaticamento e nella resistenza muscolare nei modelli di affaticamento dei roditori. È noto che i modelli di nuoto forzato a carico pesante e di corsa su tapis roulant sono simili alla fatica fisica e il modello di privazione del sonno viene generalmente utilizzato nello studio dei pazienti con sindrome da stanchezza cronica. 32 Ratti sono stati usati per valutare le differenze di resistenza nei tre modelli di affaticamento a causa dell'elevato tasso di mortalità nel modello di privazione del sonno nel ratto. Le figure 1a eb mostrano che i ratti maschi nuotavano o correvano molto più a lungo rispetto ai ratti femmine. I ratti maschi nuotavano anche molto più a lungo rispetto alle femmine dopo 5 giorni di privazione del sonno (Figura 1c). Le differenze di genere nella resistenza muscolare sono state misurate anche in vitro . Le fibre a contrazione lenta di tipo I sono fortemente coinvolte nell'esercizio di resistenza. Pertanto, abbiamo usato i muscoli del soleo isolati. 33 La stimolazione elettrica ripetitiva induce affaticamento muscolare che si manifesta come un declino della capacità di contrazione muscolare. 34 L'indice di fatica misurava la resistenza muscolare. Questo indice è stato calcolato come rapporti di tensione a 1, 2 o 3 minuti rispetto alla tensione iniziale. Le femmine di ratto hanno mostrato un indice di fatica significativamente più basso in risposta alla stimolazione elettrica continua (Figure 1d ed e). Questi risultati suggeriscono che le femmine sono inclini all'esaurimento e hanno una resistenza muscolare inferiore.

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Le femmine mostrano una resistenza muscolare inferiore rispetto ai maschi, come dimostrato da studi in vivo e in vitro . ( a ) Tempi di nuoto forzato di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine ( n = 7–8 / gruppo). ( b ) Tempi di corsa su tapis roulant di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine dopo allenamenti di adattamento per 1 settimana ( n = 6 / gruppo). ( c ) Tempi di nuoto forzato di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine dopo privazione del sonno di 5 giorni ( n = 5−6 / gruppo). ( d ) Contrazioni evocate elettricamente del muscolo soleo isolate da ratti Sprague-Dawley maschi e femmine. Il rapporto di tensione a 1, 2 o 3 minuti rispetto alla tensione iniziale (media delle prime 5 contrazioni) è espresso come indice di fatica. ( e ) Record rappresentativi delle prove di fatica di ( d ). I ratti maschi e femmine sono stati abbinati per peso. I dati sono presentati come media ± sem * P <0, 05 e ** P <0, 01 dal test t di Student.

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Il knockout ORM ha abolito la differenza di genere nella resistenza muscolare

L'ORM è una proteina antifatica endogena. 2 Pertanto, abbiamo esaminato il ruolo di ORM nella differenza di genere nella resistenza muscolare utilizzando topi con deficit di ORM. Esistono due isoforme di ORM nell'uomo (ORM1 e ORM2), una isoforma nei ratti (ORM) e tre isoforme nei topi (ORM1, ORM2 e ORM3). Gli ORM1 umani e di topo sono gli ORM sierici predominanti e rappresentano la maggior parte dei cambiamenti nella dimensione del pool di ORM durante le risposte in fase acuta. 17 topi knockout ORM1 sono stati costruiti come precedentemente riportato. 2 L'indice di affaticamento muscolare nei topi ORM1 + / + femmine era inferiore a quello nei topi maschi (figure 2a eb), simile ai risultati nei ratti. Tuttavia, questa differenza è scomparsa nei topi ORM1 - / - (Figure 2c ed d), indicando un ruolo essenziale di ORM in questo processo.

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Il knockout di Orosomucoid (ORM) ha abolito la differenza di genere nella resistenza muscolare. ( a, b ) Record rappresentativi delle contrazioni evocate elettricamente del muscolo soleo isolato dai topi ORM1 + / + ( n = 6−7 per gruppo). ( c, d ) Record rappresentativi delle contrazioni evocate elettricamente del muscolo soleo isolato dai topi ORM1 - / - ( n = 5−6 per gruppo). I dati sono presentati come media ± sem * P <0, 05 dal test t di Student.

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L'elevazione dell'ORM indotta dalla fatica nelle donne era più debole che nei maschi

Abbiamo esaminato se esistessero differenze di genere nell'espressione ORM indotta dalla fatica. La fatica è stata indotta come descritto nella Figura 1. La fatica ha indotto un aumento significativo di ORM nei tessuti sierici, epatici e muscolari, e questo aumento era più evidente nei modelli di privazione del sonno e di corsa su tapis roulant. È interessante notare che l'aumento è stato significativamente più forte nei ratti maschi che nei ratti femminili in risposta allo stesso modello di fatica (figure 3a eb), suggerendo che la differenza di genere nell'induzione dell'ORM indotta dalla fatica partecipa alla differenza di genere nella resistenza muscolare. In particolare, i livelli di ORM indotti nel siero e nei tessuti erano scarsamente correlati. L'ORM viene sintetizzato nelle cellule e secreto nella circolazione. L'espressione ORM tissutale rappresenta il livello intracellulare e l'espressione ORM sierica rappresenta il livello secreto. La scarsa correlazione probabilmente indica un rilascio non lineare di ORM dai tessuti.

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L'elevazione dell'orosomucoid (ORM) indotta dalla fatica nelle femmine è più debole rispetto ai maschi. ( a ) Livelli sierici di ORM di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine in modelli di affaticamento del nuoto forzato, della privazione del sonno e del tapis roulant. ( b ) Macchie occidentali rappresentative di ORM nei tessuti del fegato e dei muscoli derivati ​​dai ratti menzionati in ( a ) ( n = 6−7 / gruppo nel gruppo di controllo, n = 4 / gruppo nei modelli di affaticamento). I dati sono presentati come media ± sem NS, non significativa, * P <0, 05 e ** P <0, 01 mediante analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) con il test t differenza meno significativa (LSD).

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L'ovariectomia ha aumentato il livello di ORM e la resistenza muscolare

I fattori ormonali, in particolare gli estrogeni, possono essere responsabili della differenza di genere. L'ovariectomia è stata eseguita su femmine di ratto Sprague-Dawley per esaminare la possibile relazione tra estrogeno endogeno, espressione di ORM e resistenza muscolare. Le concentrazioni sieriche di estrogeni sono diminuite in modo significativo 1 mese dopo l'ovariectomia (Figura 4a) e questa riduzione è stata accompagnata da un elevato livello di ORM nei sieri (Figura 4b), fegato e muscoli (Figura 4c). Anche il tempo di nuoto è aumentato significativamente nei ratti ovariectomizzati (Figura 4d). Tre estrogeni naturali in circolazione sono estrone, 17β-estradiolo (E2) ed estriolo, ed E2 è l'estrogeno bioattivo più potente e più comunemente usato negli esperimenti. 35 Iniezioni sottocutanee di E2 (0, 5 mg kg −1 ) per 15 giorni hanno invertito gli effetti sopra menzionati nei ratti ovariectomizzati, indicando una relazione causale tra estrogeni, ORM e resistenza muscolare.

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L'ovariectomia (OVX) aumenta il livello di orosomucoid (ORM) e la resistenza muscolare. ( a ) Livello di estrogeni nel siero in femmine di ratto Sprague-Dawley con operazione simulata, OVX senza o con E2 riempimento (0, 5 mg kg −1 di E2 è stato iniettato per via sottocutanea per 15 giorni dopo l'intervento OVX). ( b, c ) Livello di ORM nel siero ( b ), nel fegato e nei muscoli ( c ) dei ratti trattati come indicato in ( a ). d ) i tempi di nuoto forzato dei ratti trattati come indicato alla lettera a ). N = 8 / gruppo. I dati sono presentati come media ± sem * P <0, 05 e ** P <0, 01 mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con test di differenza meno significativa (LSD).

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Gli estrogeni esogeni hanno soppresso l'espressione ORM e la resistenza muscolare

E2 (0, 5 mg kg −1 ) è stato somministrato mediante iniezione sottocutanea per 15 giorni (Figura 5a) in topi knockout wild-type e ORM1 - / - per studiare ulteriormente l'effetto degli estrogeni esogeni sull'espressione di ORM e sulla resistenza muscolare. Le figure 5b e c mostrano che il trattamento con estrogeni ha ridotto significativamente i livelli basali di ORM nel siero, nel fegato e nei muscoli di topi maschi e femmine. Questi topi hanno mostrato una riduzione significativa dei tempi di nuoto (Figura 5d) e una più bassa induzione dell'ORM in risposta alla fatica indotta dal nuoto (Figure 5e e f). Questo trattamento a lungo termine con estrogeni ha anche ridotto significativamente l'indice di affaticamento muscolare del soleo nei topi di tipo selvatico (Figure 5 geh) ma non nei topi knockout ORM1 (Figure 5i e j).

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Gli estrogeni esogeni sopprimono l'espressione orosomucoid (ORM) e la resistenza muscolare. a ) Livello di estrogeni nel siero di topi C57BL / 6J maschi e femmine trattati con o senza iniezioni sottocutanee di E2 per 15 giorni ad una dose di 0, 5 mg kg −1 ( n = 7−9 / gruppo). ( b, c ) Livello basale di ORM nel siero ( b ), nel fegato e nei muscoli ( c ) dei topi trattati come indicato in ( a ) ( n = 3−8 / gruppo). ( d ) I tempi di nuoto dei topi trattati come indicato in ( a ) ( n = 10–16 / gruppo). ( e, f ) Livelli di ORM indotti dal nuoto nel siero ( e ), nel fegato e nei muscoli ( f ) dei topi trattati come indicato in ( a ) ( n = 4−7 / gruppo). ( g, h ) Record rappresentativi delle contrazioni evocate elettricamente del muscolo soleo isolate da topi di tipo selvatico trattati come indicato in ( a ) ( n = 6-9 / gruppo). ( i, j ) Record rappresentativi delle contrazioni evocate elettricamente del muscolo soleo isolate da topi con deficit di ORM1 trattati come indicato in ( a ) ( n = 6 / gruppo). I dati sono presentati come media ± sem per ( e ), ** P <0, 01 mediante analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) con il test t differenza meno significativa (LSD). Per ( a, b, d ), * P <0, 05 e ** P <0, 01 di Friedman M -test.

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Gli estrogeni hanno inibito l'espressione di ORM nelle cellule muscolari e epatiche in vitro

L'effetto dell'estrogeno sull'espressione di ORM è stato ulteriormente esaminato in vitro . Il trattamento con E2 ha ridotto l'espressione della proteina ORM in modo dose-dipendente nel tempo nelle cellule muscolari C2C12 e nelle cellule epatiche di Chang (Figure 6a e b). Ha anche ridotto l'espressione di mRNA di ORM (Figure supplementari S1a – d). I risultati dei reporter di Luciferase hanno dimostrato che il trattamento con estrogeni ha attenuato l'attività del promotore ORM di topo, indicando un effetto negativo dell'estrogeno a livello trascrizionale di ORM (Figura 6c).

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Gli estrogeni inibiscono in vitro l'espressione orosomucoid (ORM) delle cellule muscolari e epatiche. ( a, b ) Western blot rappresentativo di ORM nella linea cellulare del muscolo C2C12 di topo ( a ) e nella linea cellulare epatica di Chang umana ( b ) trattata con le dosi indicate di estrogeno per estrogeno 48 ore o 50 μ M per il tempo indicato. ( c ) Attività della luciferasi in 293 cellule epiteliali renali trasfettate con il plasmide reporter della luciferasi ORM e le dosi indicate di estrogeni per 24 ore ( n = 5 / gruppo). Le macchine occidentali sono rappresentative di tre esperimenti indipendenti. I dati sono presentati come media ± sem ** P <0, 01 mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test t differenza meno significativa (LSD).

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Gli estrogeni hanno soppresso l'espressione ORM attraverso un percorso dipendente da ER

L'effetto degli estrogeni sulla trascrizione ORM è stato ulteriormente studiato. La maggior parte delle vie di segnalazione mediate dagli estrogeni sono ER dipendenti, ma esistono anche vie indipendenti da ER. 36 Il blocco ER utilizzando il degradatore selettivo ER ICI 182780 ha completamente abolito l'effetto inibitorio dell'estrogeno sull'espressione di ORM nelle cellule muscolari C2C12 e nelle cellule epatiche di Chang (Figura 7a e Figure supplementari S2a e b). L'attivazione di ER avvia le sue vie di segnale nel nucleo o sulla membrana plasmatica. La segnalazione ER iniziata dal nucleare regola direttamente la trascrizione del gene bersaglio mediante legame all'elemento di risposta ER e la via iniziata dalla membrana è mediata dall'attivazione di diverse chinasi proteiche, come p38 MAPK, PI3K, chinasi extracellulare regolata dal segnale e fosfolipasi C 36, 37 I nostri risultati hanno dimostrato che l'inibitore MAP38 p38 SB203580 ha bloccato l'effetto inibitorio dell'E2 sull'espressione di ORM in queste cellule e il doppio PI3K competitivo ATP e il bersaglio dei mammiferi dell'inibitore della rapamicina BEZ235, la chinasi extracellulare-regolata dal segnale / 2 inibitore SCH772984 e l'inibitore della fosfolipasi C U73122 non hanno bloccato questo effetto (Figura 7b e Figure supplementari S2c – d e S3). Questi dati suggeriscono che gli estrogeni regolano l'espressione ORM tramite ER e la sua via MAPK p38 a valle (Figura 8).

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L'estrogeno sopprime l'espressione di orosomucoid (ORM) attraverso il recettore degli estrogeni (ER) e la via della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK). a ) Macchia occidentale rappresentativa di ORM nella linea cellulare del muscolo C2C12 del topo e nella linea cellulare del fegato Chang umano trattata con veicolo o estrogeno 50 μ M per 48 ore in presenza o in assenza di IC IC 182780 50 μ M (un antagonista ER selettivo). ( b ) Western blot rappresentativo di ORM nella linea cellulare del muscolo C2C12 del topo e nella linea cellulare del fegato Chang umano trattata con veicolo o 50 μ M di estrogeni per 48 ore in presenza o assenza di 50 μ M SB203580 (un inibitore MAP38 p38) o 1 μ M BEZ235 (un inibitore della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)). Le macchine occidentali sono rappresentative di tre esperimenti indipendenti.

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Modello di lavoro proposto per la regolazione degli estrogeni dell'orosomucoid (ORM) nella resistenza dei muscoli scheletrici. La trascrizione ORM ha alterato negativamente gli estrogeni attraverso una via della protein chinasi p38 mitogenica attivata dal recettore degli estrogeni (MAPK) per influenzare la resistenza dei muscoli scheletrici.

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Discussione

Studi storici sull'affaticamento muscolare sono stati condotti esclusivamente nei maschi e la comprensione delle potenziali differenze di genere nell'affaticamento muscolare è stata al centro delle indagini solo negli ultimi decenni. Tuttavia, le differenze di genere osservate nell'affaticamento muscolare sono controverse. Alcuni ricercatori non riscontrano differenze di affaticamento muscolare basate sul sesso e altri studi riportano che le femmine mostrano una maggiore resistenza alla fatica rispetto ai maschi. 38, 39 Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che gli uomini mostrano una maggiore resistenza muscolare (minore affaticabilità) rispetto alle donne. 5, 6, 13, 14, 15, 16 La mancanza di consenso sull'affaticabilità di genere è probabilmente il risultato di una varietà di fattori, tra cui i protocolli di contrazione utilizzati per produrre affaticamento, l'indice di misurazione (ovvero il tempo di resistenza vs forza), età, ormoni e altri indici individuali di soggetti. Sono stati studiati 40 fattori periferici (come la massa muscolare, il metabolismo e la perfusione) e fattori centrali (come la produzione di forza ai motoneuroni) per la differenza di genere nella resistenza muscolare, ma non sono stati completamente compresi.

Abbiamo verificato per la prima volta che le femmine mostravano prestazioni peggiori e resistenza muscolare in diversi modelli di affaticamento dei roditori in vivo e in vitro . L'ORM è una proteina antifatica endogena indotta dalla fatica e agisce sul CCR5 muscolare per aumentare il contenuto di glicogeno e la resistenza muscolare. 2, 24 Pertanto, abbiamo studiato il suo ruolo nella differenza di genere di affaticamento e resistenza muscolare. Abbiamo scoperto che le prestazioni più scarse e la resistenza muscolare nelle femmine erano accompagnate da una più debole induzione dell'ORM nella fatica fisica (nuoto forzato e corsa su tapis roulant) e nella fatica mentale (privazione del sonno) rispetto a quella nei maschi, suggerendo che l'ormone femminile regola l'ORM.

L'ORM è una proteina in fase acuta che è sovraregolata da glucocorticoidi, fattore di necrosi tumorale-α, interleuchina (IL) -1, IL-8, IL-11 e IL-6 nelle citochine nelle cellule del fegato di esseri umani, ratti, topi e conigli, e gli acidi retinoici, il fenobarbital, il recettore X del farnesoide, la rifampicina e gli antibiotici macrolidi. 17 Il presente studio ha scoperto che l'ORM potrebbe essere sotto-regolato dagli estrogeni a livello trascrizionale attraverso un percorso ER-dipendente nei tessuti del fegato e dei muscoli. Questa inibizione dell'ORM da parte degli estrogeni può essere responsabile della resistenza muscolare più debole nelle donne. Anche se altri ormoni sessuali (come testosterone e progesterone) influenzano l'espressione di ORM è anche degno di future ricerche. In particolare, i livelli sierici di ORM basali erano simili tra maschi e femmine, ma il muscolo soleo isolato delle femmine presentava una riduzione della resistenza muscolare in risposta all'elettrostimolazione continua (Figure 1e e 2) che potrebbe essere strettamente correlata al livello ORM basale inferiore nei muscoli femminili sotto condizioni fisiologiche (Figura 5c).

L'importanza del glicogeno muscolare sulle prestazioni muscolari è stata dimostrata in una varietà di studi, inclusi i nostri studi precedenti. 2, 41, 42 L' esaurimento del glicogeno è uno dei principali fattori associati all'insorgenza dell'affaticamento e la maggior parte degli atleti cerca metodi per aumentare le riserve muscolari di glicogeno negli sport di resistenza. 43 Abbiamo scoperto che la somministrazione di ORM ha aumentato significativamente il contenuto di glicogeno muscolare nei topi. 2 Le donne allenate mostrano una ridotta capacità di immagazzinare i livelli di glicogeno muscolare sopranormale in risposta a una dieta ricca di carboidrati e la somministrazione di 17β-estradiolo negli uomini riduce significativamente la concentrazione di glicogeno nei muscoli basali. 44 L' ORM può anche mediare l'effetto degli estrogeni sul contenuto di glicogeno nei muscoli scheletrici umani, ma questo effetto richiede ulteriori approfondimenti.

Le tensioni isometriche di contrazione del muscolo scheletrico sono significativamente più elevate nei ratti ovariectomizzati rispetto ai ratti operati con sham o nei ratti ovariectomizzati che ricevono estradiolo, 45 indicando un ruolo negativo dell'estrogeno a lungo termine nell'affaticamento muscolare. In particolare, il trattamento acuto del 17β-estradiolo del muscolo scheletrico di rana in vitro ha facilitato la risposta alla fatica agli stimoli ripetitivi del tetano con alta frequenza e questo effetto diretto e rapido può essere correlato ad un aumento dello squilibrio del turnover di Ca 2+ nel citoplasma. 46 L' estrogeno influenza anche l'assorbimento del glucosio attraverso la regolazione dell'espressione di GLUT4 nei muscoli. 47 topi con deficienza di GLUT4 mostrano un accelerato affaticamento muscolare. 48 Questi risultati indicano una diversa regolazione degli estrogeni nella resistenza muscolare oltre la regolazione ORM.

In particolare, l'estrogeno regola anche la glicosilazione ORM. Wells et al. 49 hanno riferito che una diminuzione della porzione di carboidrati di ORM era associata a un aumento dei livelli di ormoni sessuali femminili. Brinkman-Van der Linden e altri. 50 hanno riferito che il trattamento con estrogeni orali ha aumentato il grado di ramificazione e diminuito la fucosilazione e l'espressione di Lewis X sialyl rispetto agli individui di controllo. I cambiamenti nella composizione dei carboidrati di ORM possono alterarne la funzione poiché l'interazione di ORM e CCR5 dipende parzialmente dalla glicosilazione di ORM. 51 Se i cambiamenti nella glicosilazione indotta dagli estrogeni alterano l'effetto dell'ORM nella resistenza muscolare, dovrebbe essere ulteriormente esaminato.

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