Analisi funzionale delle varianti missense nel canale tresk (kcnk18) k + | rapporti scientifici

Analisi funzionale delle varianti missense nel canale tresk (kcnk18) k + | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Biofisica
  • Neuroscienze cellulari
  • Canali ionici
  • Mutazione

Astratto

Una perdita di mutazione della funzione nel canale del potassio TRESK K2P ( KCNK18 ), è stata recentemente collegata alla tipica emicrania familiare con aura. Riportiamo ora la caratterizzazione funzionale di ulteriori varianti missenso del canale TRESK identificate in pazienti non correlati. Diverse varianti o non hanno avuto alcun effetto funzionale apparente o hanno causato una riduzione dell'attività del canale. Tuttavia, è stato scoperto che la variante C110R causa una perdita completa della funzione TRESK, ma è presente sia nell'emicrania sporadica che nelle coorti di controllo e non è stata trovata alcuna variazione nel numero di copie KCNK18 . Pertanto, nonostante l'associazione precedentemente identificata tra perdita di attività del canale TRESK ed emicrania in un grande pedigree multigenerazionale, questa scoperta indica che una singola variante TRESK non funzionale non è da sola sufficiente a causare emicrania tipica ed evidenzia la complessità genetica di questo disturbo.

introduzione

L'emicrania è un disturbo neurologico comune e disabilitante con una componente genetica, ambientale e in alcuni casi ormonale. È caratterizzato da attacchi di mal di testa grave, generalmente unilaterale e pulsante, può essere accompagnato da nausea, vomito e fotofobia ed è clinicamente diviso in due sottotipi principali, l'emicrania con aura (MA) quando un'emicrania è accompagnata da sintomi neurologici focali transitori e reversibili ed emicrania senza aura (MO) 1 . L'eterogeneità multifattoriale e clinica del disturbo ha notevolmente ostacolato l'identificazione dei comuni geni di suscettibilità all'emicrania e la maggior parte della nostra attuale comprensione deriva dagli studi sull'emicrania emiplegica familiare (FHM), una rara forma monogena autosomica dominante di MA 2 .

Finora, i tre geni di suscettibilità identificati in modo convincente nelle famiglie FHM codificano tutti i canali ionici o i trasportatori: CACNA1A che codifica la subunità α1 del canale di calcio Cav2.1 3, SCN1A che codifica il canale 4 di sodio Nav1.1 e ATP1A2 che codifica l'α2 subunità della pompa Na + / K + 5 . Si ritiene che le mutazioni di questi geni possano portare ad un aumento dell'efflusso di glutammato e potassio nella sinapsi e quindi causare emicrania rendendo il cervello più suscettibile alla depressione da diffusione corticale (CSD) 6 che si ritiene abbia un ruolo nell'iniziare un attacco di emicrania 7, 8 . Tuttavia, questi geni non sono stati finora implicati nelle forme comuni di emicrania 9 .

Tuttavia, l'attuale opinione suggerisce che l'emicrania tipica, come l'FHM, è anche un disturbo dell'eccitabilità neuronale, l'omeostasi ionica e il rilascio di neurotrasmettitori 10, 11, 12 . Le mutazioni nel gene SLC4A4 che codifica per il trasportatore di sodio-bicarbonato NBCe1, sono state recentemente implicate in diverse forme di emicrania 13 e in una varietà di geni coinvolti nell'omeostasi del glutammato ( PGCP , MTDH 14 e LRP1 15 ) e in un canale cationico ( TRPM8 ) Di recente, 15 sono stati anche implicati nell'emicrania attraverso studi di associazione su tutto il genoma. Pertanto, è molto probabile che i canali ionici svolgano un ruolo importante nella patogenesi dell'emicrania tipica.

TRESK ( KCNK18 ), è un membro della famiglia dei canali del potassio a dominio dei due pori (K2P) coinvolti nel controllo dell'eccitabilità elettrica cellulare 16 . La regolazione dell'attività di TRESK da parte della calcineurina 17 fosfatasi calcio-dipendente, nonché la sua espressione nei gangli della radice dorsale (DRG) 18 e nei gangli del trigemino (TG) 19, 20 ha portato a un ruolo proposto per questo canale in una varietà di vie del dolore . In uno studio recente, una mutazione del frame-shift (F139Wfsx24) in TRESK è stata identificata in un grande pedigree multigenerazionale in cui si separava perfettamente con MA tipico e un significativo punteggio LOD di collegamento a livello del genoma di 3, 0. Inoltre, l'analisi funzionale ha rivelato che questa mutazione ha causato una perdita completa della funzione TRESK e che la subunità troncata era anche in grado di ridurre la funzione del canale wild-type. Ciò ha quindi evidenziato KCNK18 come gene candidato potenzialmente importante e ha suggerito che la disfunzione di TRESK potrebbe svolgere un possibile ruolo nella patogenesi dell'emicrania familiare con aura visiva 20 .

Lo screening aggiuntivo per le mutazioni KCNK18 nell'emicrania sporadica non correlata e nelle coorti di controllo ha anche identificato una serie di altre varianti missenso; R10G, A34V, C110R, S231P e A233V 20 . La variante A233V è stata trovata solo nella coorte di controllo, mentre A34V è stato identificato in un unico probando di emicrania australiano per il quale non erano disponibili campioni di famiglia, ma non è stato rilevato nei controlli. Al contrario, le varianti R10G, C110R e S231P sono state trovate sia in emicrania che in controlli in entrambe le coorti. In questo studio, abbiamo studiato l'effetto funzionale di queste varianti per sondare ulteriormente la potenziale associazione della disfunzione di TRESK con l'emicrania tipica.

risultati

Posizione delle varianti missense nel canale TRESK

La posizione prevista di queste varianti nel canale TRESK è mostrata nella Figura 1; R10G si trova all'interno del N-terminale, A34V nel primo dominio transmembrana (TM1) e C110R vicino al filtro di selettività nel primo dominio dei pori (P1). Le varianti S231P e A233V si trovano entrambe all'interno del circuito intracellulare tra TM2 e TM4. Questo dominio funge da sito per la regolazione da parte della calcineurina e entrambe le varianti S231P e A233V si verificano direttamente tra due motivi coinvolti in questo processo; il fattore nucleare del motivo di aggancio a cellule T attivato (NFAT), PQIIIS, e il motivo di legame 14-3-3, RSNSCP 17, 21, 22 .

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(A) Topologia schematica della subunità umana K2P TRESK che mostra la posizione delle varianti missense identificate. (B) Vista laterale del modello di omologia dei domini TM / pori di TRESK con i residui A34 e C110 mostrati rispettivamente in blu e rosso. Per chiarezza viene mostrato solo il dominio P1. (C) Correnti rappresentative di cellule intere da un ovocita che esprime WT TRESK o le varianti. Gli ovociti sono stati immersi in una soluzione a basso K, il potenziale di membrana mantenuto a -80 mV e gli incrementi di tensione da −120 a +60 mV sono stati applicati per 1 secondo con incrementi di 20 mV. (D) Correnti basali normalizzate per le varianti TRESK. Le correnti allo stato stazionario sono state misurate alla fine dell'impulso 1s a +60 mV dalle correnti dell'intera cellula (come mostrato in C). Per ogni lotto di ovociti, le correnti sono state normalizzate alla media del gruppo di controllo. I dati sono stati raggruppati da 2 a 4 lotti. Gli ovociti sono stati iniettati con 0, 9 ng di RNA ad eccezione del mutante C110R dove sono stati iniettati 4, 5 ng. I numeri N sono indicati sopra le barre.

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Al momento non ci sono strutture cristalline disponibili per i canali K2P e quindi abbiamo mappato la posizione di queste varianti usando un modello di omologia del poro del canale TRESK (Figura 1B). Solo i residui A34 e C110 sono inclusi in questa struttura perché non ci sono modelli per il dominio intracellulare. È interessante notare che il modello prevede che A34 in TM1 sia in contatto con C110 nell'elica dei pori e che entrambi i residui siano adiacenti al filtro di selettività che è stato recentemente implicato nel controllo del gate del canale K2P 23 .

Proprietà funzionali delle varianti missense

Successivamente abbiamo esaminato l'effetto di queste diverse varianti sulle proprietà funzionali di TRESK. La Figura 1C mostra correnti basali rappresentative di cellule intere registrate da ovociti che esprimono TRESK di tipo selvaggio (WT) o mutante. WT TRESK ha mostrato grandi correnti K + di cella intera raddrizzanti verso l'esterno simili a quelle precedentemente riportate 24, 25 . Le correnti registrate dalle varianti R10G, S231P e A233V sembravano quasi indistinguibili dalle correnti WT ed erano simili per grandezza (Figura 1D). Al contrario, il mutante A34V ha espresso correnti notevolmente ridotte rispetto al WT TRESK, mentre le correnti registrate dagli ovociti che esprimono il canale mutante C110R erano indistinguibili da quelle dei controlli non iniettati (Figura 1D).

Anche se i mutanti S231P e A233V non hanno avuto effetti evidenti sull'entità dei livelli di corrente basale, la loro stretta vicinanza a importanti siti regolatori suggerisce che potrebbero interferire con la regolazione TRESK dipendente dalla calcineurina. Allo stesso modo, anche se le varianti A34V e C110R esprimevano correnti basali scarse o assenti, potrebbero comunque essere in grado di rispondere all'attivazione della calcineurina. È stato dimostrato che un aumento del calcio intracellulare prodotto dalla ionomicina calcio ionoforo, può produrre l'attivazione di TRESK dipendente dalla calcineurina espressa negli ovociti di Xenopus 17 . Abbiamo quindi determinato l'effetto della ionomicina su queste diverse varianti di TRESK (Figura 2). Come mostrato in precedenza, la ionomicina 500 nM ha indotto un'attivazione ampia, robusta e reversibile di WT TRESK 17 . La Ionomicina ha anche attivato le varianti R10G, S231P e A233V e l'estensione di questa attivazione non differiva significativamente da quella del canale WT (Figura 2B). Al contrario, la risposta delle varianti A34V e C110R alla ionomicina era sostanzialmente non rilevabile e simile alle correnti di fondo attivate dalla ionomicina negli ovociti di controllo 26 .

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(A) Risposta corrente rappresentativa alla ionomicina 500 nM. I valori di corrente tracciati rappresentano le misurazioni effettuate alla fine dei passi di tensione di 300 ms a -100 mV applicati ogni 3 s da un potenziale di mantenimento di 0 mV. Come mostrato sopra la traccia, gli ovociti sono stati passati dalla soluzione lowK a highK prima dell'applicazione della ionomicina. (B) Risposte normalizzate alla ionomicina. La corrente misurata dopo l'attivazione della ionomicina è stata normalizzata alla corrente misurata prima dell'attivazione in ciascun ovocita. Gli ovociti sono stati iniettati con 0, 13 ng di RNA. I numeri N sono indicati all'interno delle barre.

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Perdita della funzione TRESK nelle varianti A34V e C110R

Sebbene molto piccola, è stata rilevata una certa corrente residua per la variante A34V (Figura 1) e abbiamo scoperto che quando venivano iniettate maggiori quantità di mRNA (4, 5 ng), correnti più grandi potevano essere registrate in modo molto simile nel profilo a WT TRESK (Figura 3A) . Abbiamo anche scoperto che nonostante l'assenza dell'attivazione della calcineurina vista nella Figura 1, quando sono state registrate queste correnti basali più grandi, la ionomicina ha indotto un'attivazione reversibile simile a quella del WT TRESK (Figura 3B). Ciò suggerisce che la variante A34V può ancora produrre canali funzionali e che i meccanismi alla base dell'attivazione della calcineurina devono pertanto rimanere intatti. Al contrario, nessuna corrente basale o qualsiasi risposta alla ionomicina potrebbe essere registrata dalla variante C110R anche quando sono state iniettate quantità maggiori di mRNA (4, 5 ng) (Figura 3C).

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(A) Correnti rappresentative di cellule intere da un ovocita che esprime una maggiore quantità di mRNA di A34V (4, 5 ng). (B) Risposte di corrente rappresentative alla ionomicina 500 nM di un ovocita che esprime una quantità maggiore di mRNA A34V (4, 5 ng). (C) Correnti di picco normalizzate misurate a +20 mV per WT TRESK coespresse con le varianti A34V o C110R. I rapporti molari, indicati sopra le barre, sono 1 ∶ 1 = 0, 45 ng: 0, 45 ng; 5 ∶ 5 = 2, 5 ng: 2, 5 ng; 1 ∶ 5 = 0, 45 ng: 2, 5 ng. I numeri N sono indicati all'interno delle barre.

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Nel nostro precedente studio abbiamo dimostrato che 1 ∶ 1 coespressione del mutante F139Wfsx24 con WT TRESK (ovvero una situazione che imita lo stato eterozigote) ha ridotto l'attività del canale WT 20 . Abbiamo quindi esaminato se il rapporto di perdita di ∶ 1 riduceva le correnti delle cellule intere di circa il 40% e si osservava un'ulteriore riduzione quando si aumentava il rapporto di mRNA di C110R (Figura 3C). Ciò suggerisce che la variante C110R produce una subunità completamente non funzionale, simile alla mutazione F139Wfsx24 che mostra un forte legame genetico all'emicrania con aura. Risultati simili sono stati ottenuti anche sulla coespressione di mRNA WT e A34V (Figura 3C). Ma l'effetto è stato ridotto quando è stata aumentata la quantità relativa di mRNA di A34V, molto probabilmente perché la variante A34V non produce una perdita completa di funzione e può probabilmente formare canali eteromerici funzionali.

A34V forma canali eteromerici funzionali

Per esplorare ulteriormente le proprietà di una popolazione di canali eteromerici WT-A34V, abbiamo creato un dimero collegato in tandem. La concatenazione di subunità è stata impiegata con successo per controllare la stechiometria delle subunità in una varietà di diversi tipi di canali K +, inclusi diversi canali K2P 27, 28 . Come controllo, abbiamo prima creato un dimero WT-WT e abbiamo scoperto che le correnti basali e l'attivazione della ionomicina di questo costrutto tandem WT-WT erano praticamente indistinguibili da quelle dell'OMT WES TRESK (Figura 4). L'espressione del costrutto tandem WT-A34V ha anche portato a correnti simili a TRESK che potevano ancora essere attivate dalla ionomicina, ma avevano un'ampiezza significativamente inferiore rispetto al dimero WT-WT. Ciò indica che la variante A34V è anche in grado di regolare l'attività del WES TRESK attraverso il coassemblaggio come canale eteromerico disfunzionale.

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(A) Corrente basale rappresentativa e (B) Risposta rappresentativa a 1 μM per il canale tandem WT-WT. (C) Corrente basale rappresentativa e (D) Risposta rappresentativa a 1 μM per il canale tandem WT-A34V.

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Numero di copia del gene KCNK18

Entrambe le varianti A34V e C110R comportano una grave perdita della funzione TRESK. Tuttavia, mentre la variante A34V è stata finora trovata solo in un paziente con emicrania, la variante C110R non mostra alcuna associazione genetica con MA. In una coorte caso-controllo australiana, la variante C110R era presente in 12 soggetti non affetti per un totale di 496, rispetto a 8 soggetti affetti per un totale di 479 20 . Variazioni nel numero di copie geniche sono state implicate in diverse malattie genetiche e condizioni patologiche, tra cui diversi geni del canale K2P 29 . Abbiamo quindi valutato la variazione del numero di copie KCNK18 (CNV) in soggetti con e senza emicrania. Tuttavia, abbiamo scoperto che tutti gli individui con la variante C110R hanno le due copie previste di KCNK18 indipendentemente dal loro stato di emicrania (Figura 5).

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Tutti i campioni hanno mostrato un valore normale del numero di copie previsto pari a 2. Non sono state osservate differenze tra gli emicranici C110R (barre rosse) e i non emicranici C110R (barre blu). Le barre di errore rappresentano i limiti massimo e minimo in base alle repliche tecniche per ciascun campione.

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Discussione

Questa analisi funzionale delle varianti missenso nel gene KCNK18 fornisce un'importante visione della patogenesi dell'emicrania tipica. Mentre il nostro rapporto precedente supporta un ruolo causale per la perdita della mutazione della funzione F139Wfsx24 nel gene KCNK18 nell'emicrania familiare MA 20, i dati qui presentati suggeriscono un'associazione più complessa di altre varianti di perdita di funzione con l'emicrania tipica.

Le varianti R10G, S231P e A233V non hanno avuto effetti evidenti sull'attività di TRESK in linea con la loro identificazione in entrambe le coorti di controllo ed emicrania. In effetti, la variante A233V è già stata riportata nel database dei polimorfismi a singolo nucleotide (rs363360) ed è stata dimostrata essere comune (frequenza allelica minore = 0, 15) nelle popolazioni africane. Tuttavia, per i due mutanti (A34V e C110R) che hanno mostrato una perdita della funzione TRESK, la loro associazione con l'emicrania tipica non è chiara. La variante A34V è stata infatti trovata in un probando non correlato diagnosticato con emicrania tipica ed era assente in tutti i controlli testati 20 . Tuttavia, la variante C110R sembra non mostrare alcuna associazione genetica con l'emicrania tipica.

La completa perdita di funzione osservata nella variante C110R non è forse sorprendente poiché questo residuo si trova adiacente al filtro di selettività in cui la sostituzione con un'arginina può interferire con la funzione del canale. È interessante notare che sia i residui A34 che C110 sono situati l'uno vicino all'altro e il filtro di selettività è stato recentemente implicato nel controllo del gate del canale K2P 30 . Se queste mutazioni portano a una perdita intrinseca della funzione e / o compromettono il traffico di canali, le conseguenze funzionali appaiono uguali, cioè una riduzione dell'attività del canale TRESK. Inoltre, entrambe le varianti A34V e C110R, come la variante F139Wfsx24, sembrano avere la capacità di interagire e ridurre l'attività di WT TRESK coespresso. Pertanto, nello stato eterozigote, oltre a qualsiasi perdita intrinseca di funzione, entrambe le varianti potrebbero ridurre ulteriormente l'attività di TRESK attraverso il coassemblaggio con subunità WT. In altre canalopatie K +, ad esempio l' atassia episodica di tipo 1, anche le subunità mutanti non funzionali riducono l'attività del canale attraverso il coassemblaggio "dominante negativo" con le subunità WT e spesso provocano una soppressione> 90% dell'attività del canale 31, 32, 33 . Tuttavia, a differenza dei canali tetramericani, l'assemblaggio dei canali K2P come un dimero di dimeri significa che qualsiasi effetto negativo dominante sarà sempre molto meno grave, perché anche se la subunità mutante può riunirsi con subunità WT almeno il 25% di canali WT omomerici rimangono. Di conseguenza, in particolare per i canali K2P, qualsiasi potenziale relazione tra un modello di ereditarietà dominante e un effetto negativo dominante sulla funzione del canale può essere difficile da interpretare.

La nostra osservazione che alcuni individui non affetti sembrano portare mutazioni abbastanza deletanti mette ovviamente in discussione un semplice legame causale diretto tra la funzione TRESK difettosa e l'emicrania tipica. Le differenze nella variazione del numero di copie di KCNK18 non possono giustificare la nostra osservazione originale, poiché tutti gli individui con la mutazione C110R hanno le due copie previste di KCNK18 indipendentemente dal loro stato di emicrania. Anche l'imprinting genomico è improbabile poiché si osserva la trasmissione sia materna che paterna 20 . Forse la spiegazione più probabile è che l'emicrania è ora ampiamente accettata come un disordine poligenico complesso, anche nel caso della segregazione apparentemente mendeliana 34, e quindi è senza dubbio dipendente dall'interazione di più geni e dalle interazioni gene-ambiente 9 . In altri disturbi complessi dell'eccitabilità neuronale, ad esempio l'epilessia, un recente rapporto ha suggerito che anche le mutazioni deleteri del canale ionico conferivano un rischio incerto a un individuo e questo rischio dipendeva fortemente da altre varianti con cui sono combinate 35 . Tali considerazioni stanno diventando tipiche delle sfide richieste per collegare un ruolo patogeno a una variante ereditaria in un singolo canale ionico, nonostante le prove schiaccianti che molti disordini neurologici comuni siano associati alla disfunzione del canale ionico 36, 37 .

In conclusione, se l'influenza di TRESK sull'eccitabilità neuronale del TG gioca davvero un ruolo nella patogenesi dell'emicrania, i suoi effetti sono senza dubbio complessi. Questi risultati dimostrano che, nonostante il significativo legame genetico della variante F139Wfsx24 in una famiglia allargata di MA, la presenza di una singola variante non funzionale non è probabilmente da sola sufficiente per determinare se un individuo sviluppa emicrania. Ciò evidenzia ulteriormente l'importanza di comprendere il più ampio background genetico di ogni individuo affetto.

metodi

Biologia molecolare

Il TRESK umano è stato clonato tra UTR 5 'e 3' del gene β-globina di Xenopus nel vettore di espressione degli ovociti, pBF. I mutanti R10G, A34V, C110R, S231P e A233V sono stati prodotti mediante mutagenesi diretta al sito e confermati dal sequenziamento automatizzato. Dimeri wild-type e mutanti collegati in tandem di TRESK sono stati realizzati usando la PCR a sovrapposizione di estensioni che ha eliminato il codone di arresto della prima subunità e introdotto un linker Gly (Gln) 10Gly immediatamente prima della prima metionina della seconda subunità TRESK. L'mRNA per i canali dimerici wild-type, mutanti e collegati in tandem è stato sintetizzato usando il kit SPM mMESSAGE mMACHINE (Ambion) e le concentrazioni di mRNA sono state quantificate mediante analisi spettrofotometrica prima dell'iniezione.

Registrazioni elettrofisiologiche

Salvo diversa indicazione, uguali quantità di mRNA di tipo selvaggio o mutante sono state microiniettate in ovociti di Xenopus defollicolati secondo i protocolli standard. Le correnti a cellule intere sono state registrate 18-24 ore dopo l'iniezione, a temperatura ambiente (20-22 ° C), utilizzando il metodo del morsetto di tensione a due elettrodi (Geneclamp 500B, Axon Instruments). Gli ovociti sono stati tenuti in una piccola camera di registrazione e sono stati continuamente perfusi con soluzione extracellulare di controllo, lowK (in mM: 95, 4 NaCl, 2 KCl, 1, 8 CaCl2, 5 HEPES pH 7, 5 con NaOH) utilizzando un sistema di perfusione azionato dalla pompa. Gli elettrodi di registrazione sono stati riempiti di nuovo con 3M KCl e le loro resistenze variavano da 0, 3 a 1 MΩ. Le correnti sono state filtrate a 100 Hz e digitalizzate a 1 kHz per l'analisi. Gli ovociti erano mantenuti a -80 mV, venivano applicati i comandi di tensione e le correnti venivano registrate usando il software pClamp 9 (Axon Instruments). Le correnti TRESK venivano solitamente misurate in soluzione a basso K, alla fine di intervalli di 1 secondo di tensione da un potenziale di mantenimento di −80 mV erogato con incrementi di 20 mV da −120 mV a +60 mV. Per gli esperimenti con la ionomicina, le correnti TRESK sono state misurate in soluzione highK (in mM: 17, 4 NaCl, 80 KCl, 1, 8 CaCl2, 5 HEPES, pH 7, 5 con NaOH) alla fine di 300 ms di tensione da 0 mV a −100 mV. Il giorno dell'esperimento è stata prodotta la Ionomicina (forma di acido libero) come soluzione madre di 5 mM in dimetil solfossido e diluita nella soluzione highK alla concentrazione di prova appropriata (0, 5 μM o 1 µM per l'attivazione dei dimeri tandem). I dati sono stati analizzati con pCLAMP9 (strumenti Axon).

Modellazione di omologia

Per costruire una struttura del poro del canale TRESK, gli anelli extracellulari e intracellulari sono stati omessi a causa della mancanza di omologia con qualsiasi modello strutturale noto. La struttura secondaria e la topologia transmembrana per TRESK (Q7Z418) sono state previste utilizzando il server PSI-Prediction (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/). KvAP (PDB 1ORQ) è stato scelto come modello strutturale principale per i modelli di omologia TRESK e ClustalX ha usato per allineare due copie della sequenza KvAP modificata per assomigliare a un dimero. Sono stati generati allineamenti conservando le caratteristiche chiave come il filtro di selettività, la cerniera di glicina (in M2 e M4) e i residui di glutammato nella parte superiore delle eliche M1 e M3. I modelli di omologia di TRESK sono stati creati utilizzando Modeller 9v8. Per ogni serie di dieci modelli TRESK generati, è stato selezionato il modello a energia più bassa.

Copia i valori numerici per KCNK18

Una variazione nota del numero di copie (CNV) identificata in una coorte di controllo micronesiana si sovrappone al secondo esone e al primo e al secondo introne di KCNK18 (Gusev et al. 2009 Genome Res. 19: 318–26). La presenza di questo CNV è stata analizzata nel DNA genomico di 20 soggetti con e senza emicrania con la variante C110R della coorte caso-controllo australiana utilizzando un dosaggio del numero di copie TaqMan di Applied Biosystems. Il test CNV KCNK18 (ID test: Hs00964672_cn) è stato eseguito insieme al test di controllo raccomandato prelevato da una regione priva di CNV (RnaseP). I saggi triplici sono stati eseguiti sul sistema AB 7900HT in condizioni standard secondo il protocollo del produttore. I dati sono stati analizzati utilizzando il software CopyCaller (v1.0 Applied Biosystems).

statistica

I dati sono dati come valori medi ± errore standard della media (SEM), dove n rappresenta il numero di ovociti. I risultati erano riproducibili in almeno 2-3 lotti diversi di ovociti. Il significato statistico è stato determinato utilizzando il test t di uno studente. Quando le barre di errore non vengono visualizzate, sono più piccole della dimensione del simbolo.

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