Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti umane | protocolli di natura

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti umane | protocolli di natura

Anonim

Soggetti

  • Sviluppo del sistema nervoso
  • neurogenesi
  • Modelli neurologici
  • Differenziazione delle cellule staminali

Astratto

Lo sviluppo del cervello umano presenta diversi aspetti unici, come la maggiore complessità e l'espansione dell'output neuronale, che si sono rivelati difficili da studiare negli organismi modello. Di conseguenza, gli approcci in vitro per modellare lo sviluppo e la malattia del cervello umano sono un'area di ricerca intensa. Qui descriviamo un protocollo recentemente stabilito per la generazione di tessuto cerebrale 3D, i cosiddetti organoidi cerebrali, che imita da vicino il programma di sviluppo endogeno. Questo metodo può essere facilmente implementato in una camera di coltura tissutale standard e può dare origine allo sviluppo di corteccia cerebrale, telencefalo ventrale, plesso coroideo e identità retinica, tra l'altro, entro 1-2 mesi. Questo semplice protocollo può essere applicato a studi sullo sviluppo e allo studio di una varietà di malattie del cervello umano. Inoltre, poiché gli organoidi possono essere mantenuti per più di 1 anno nella cultura a lungo termine, hanno anche il potenziale per modellare eventi successivi come la maturazione neuronale e la sopravvivenza.

introduzione

I metodi in vitro per modellare lo sviluppo umano e le malattie fanno parte di un campo in rapida espansione della biologia delle cellule staminali con importanti implicazioni terapeutiche 1 . I protocolli organoidi sono all'avanguardia di queste tecnologie, poiché questi approcci 3D riproducono in modo più accurato eventi di sviluppo in vivo che portano a modelli in vitro più precisi 2, 3 . Gli organoidi sono già stati sviluppati per diversi sistemi di organi, tra cui retina 4, intestino 5, tiroide 6, fegato 7, ipofisi 8, orecchio interno 9, rene 10, 11, 12 e cervello 13 . Tuttavia, esistono solo pochi metodi per generare tali tessuti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) 13, 14, 15, 16, 17 . In questo protocollo, descriviamo la metodologia che è stata recentemente pubblicata per la generazione di tessuti organoidi cerebrali da hPSC 13 .

Sviluppo del protocollo

Il metodo qui descritto si basa su una vasta base di protocolli per la differenziazione neurale, la coltura di tessuti 3D e l'ingegneria dei tessuti. Gli organoidi cerebrali si sviluppano attraverso processi intrinsecamente auto-organizzati su applicazione tempestiva di componenti e ambienti di coltura precedentemente descritti individualmente. Pertanto, il metodo è una fusione di metodi precedenti, combinati in modo specifico per raggiungere due obiettivi principali: (i) la creazione di identità e differenziazione neurali e (ii) la ricapitolazione dell'organizzazione strutturale 3D.

Istituzione dell'identità cerebrale

Il primo obiettivo del protocollo è l'induzione e la differenziazione del tessuto neurale. Ciò comporta l'identificazione delle formulazioni dei media e degli additivi per guidare l'identità neurale e stimolare lo sviluppo del cervello in vitro . Per raggiungere questo obiettivo, una serie di formulazioni medie sono state testate in vari punti temporali. Piuttosto che descrivere la moltitudine di combinazioni testate, ci concentriamo qui sul risultato positivo.

Il tessuto neurale si sviluppa in vivo da uno strato germinale chiamato ectoderma 18 . Allo stesso modo, i PSC in vitro possono essere stimolati a sviluppare strati germinali, incluso l'ectoderma, all'interno di aggregati chiamati corpi embrionali (EB) 19 . Numerosi studi precedenti hanno descritto con successo la differenziazione degli EB nel mezzo di cellule staminali embrionali (ESC) con un fattore di crescita dei fibroblasti di base ridotto (bFGF) 20 e un inibitore della proteina chinasi (ROCK) associato ad alte dosi di rho per limitare la morte cellulare 21 . Allo stesso modo, gli organoidi cerebrali si sviluppano da EB cresciuti inizialmente in mezzo ESC con basso bFGF e inibitore ROCK.

La successiva induzione neurale di EB segue una formulazione media minima molto simile a quella stabilita da Zhang et al . 22, 23 per l'induzione di rosette neurali, un'organizzazione polarizzata 2D di cellule neuroepiteliali. Tuttavia, per la generazione di organoidi cerebrali, gli EB vengono tenuti in sospensione, portando a una formazione uniforme di ectodermi neurali lungo la superficie esterna degli EB, mentre i tessuti mesendodermici interni non neuronali non si sviluppano.

L'ectoderma neuronale in vivo stabilisce neuroepiteli organizzati radialmente che si espandono per formare varie strutture cerebrali. Allo stesso modo, gli organoidi collocati in un mezzo di differenziazione che supporta sia i progenitori neurali che la loro progenie mostrano questa progressione dello sviluppo in vitro . La formulazione media in questa fase è influenzata da un ampio corpus di protocolli di cellule staminali neuronali (NSC) 24, 25 e da metodi di rosetta neurale 26, 27 . Questi metodi hanno dimostrato l'importanza del mezzo neurobasale e del supplemento B27 per la differenziazione e la sopravvivenza neuronale 28 . Test empirici di formulazioni medie da vari protocolli di rosetta hanno portato all'inclusione di integratori aggiuntivi come il 2-mercaptoetanolo 27 e l'insulina 29, che sembrano avere un effetto positivo nel mantenimento dei NSC.

Infine, in precedenza è stato descritto che l'acido retinoico viene secreto dalle meningi cerebrali e promuove la differenziazione neurale 30 . Tuttavia, l'acido retinoico è un potente fattore caudalizzante in vivo 31 . Pertanto, poiché abbiamo cercato di limitare l'applicazione di fattori di patterning esogeni, questo componente non è incluso nelle fasi iniziali ed è incluso solo nel mezzo di differenziazione nelle fasi successive sotto forma di vitamina A fornita nel supplemento B27.

Istituzione dell'organizzazione spaziale 3D

Il secondo obiettivo del metodo era raggiungere un'organizzazione spaziale 3D che potesse ricapitolare lo sviluppo di varie regioni del cervello. Numerosi studi recenti hanno dimostrato l'enorme capacità di auto-organizzazione dei tessuti sviluppati dai PSC, inclusi alcuni tessuti neurali 32 . Pertanto, ci siamo concentrati sulla fornitura di un ambiente permissivo per l'auto-organizzazione 3D.

L'ectoderma neurale in vitro può acquisire spontaneamente un'organizzazione radiale che ricorda il neuroepitelio, come nel caso delle rosette neurali. Allo stesso modo, l'ectoderma neurale degli EB stabilisce spontaneamente la polarità apicobasale per formare il neuroepitelio. Tuttavia, in assenza della membrana basale normalmente presente in vivo , questo epitelio manca di un corretto orientamento e non riesce a formare un epitelio continuo 33 . Abbiamo quindi testato l'effetto di fornire un supporto strutturale per promuovere la continuità e il corretto orientamento.

Vari studi hanno dimostrato la formazione di epiteli organizzati complessi all'interno di idrogel composti da proteine ​​della matrice extracellulare 34 . In particolare, è stato recentemente dimostrato che le cellule staminali intestinali incorporate in Matrigel generano grandi tessuti epiteliali 3D intestinali, chiamati organoidi intestinali 5 . Allo stesso modo, abbiamo testato l'applicazione di questo approccio agli EB indotti dall'ectoderma neurale. Poco dopo l'incorporamento, grandi gemme di neuroepitelio continuo sporgono dagli EB più grandi e contengono cavità piene di liquido che ricordano i ventricoli cerebrali indicando un corretto orientamento apicobasale.

L'elemento chiave finale del protocollo è l'applicazione dell'agitazione. È diventato chiaro che, sebbene Matrigel abbia promosso l'espansione del germoglio neuroepiteliale, gli organoidi sono cresciuti rapidamente oltre i limiti della diffusione stazionaria di ossigeno e nutrienti, come evidenziato dal tessuto necrotico scuro al centro degli organoidi. Poiché i bioreattori agitanti si sono dimostrati utili in una serie di applicazioni di ingegneria dei tessuti 2, 3, 35, abbiamo testato l'effetto di un bioreattore rotante per promuovere meglio la diffusione. Ciò ha notevolmente migliorato la sopravvivenza dei tessuti e un ulteriore sviluppo. Sono accettabili anche altri tipi di agitazione e il metodo qui descritto descrive in dettaglio l'uso di uno shaker orbitale in alternativa al bioreattore rotante.

Confronto con metodi alternativi

Esistono numerosi metodi per la crescita e la differenziazione dei NSC, la maggior parte dei quali viene eseguita nella cultura monostrato. Per decenni, le linee NSC sono state utilizzate per generare particolari tipi di cellule neurali e non neurali per potenziali applicazioni terapeutiche 36, 37 . Tuttavia, queste linee mancano di importanti segni distintivi delle cellule staminali del cervello in via di sviluppo, come l'orientamento apico-basale.

Più recentemente, rosette neurali sono state derivate da PSC che ricapitolano correttamente questa organizzazione apicobasale, formando così un modello radialmente organizzato in 2D, proprio come l'epitelio del tubo neurale 13, 14, 15, 16, 17, 22, 26 . Le rosette neurali ricapitolano molti aspetti dello sviluppo del cervello, tra cui la corretta progressione della discendenza 13, 38 e le specifiche neuronali temporizzate 18, 27 ; tuttavia, mancano della complessa organizzazione generata utilizzando un approccio 3D come il metodo organoide cerebrale. Gli organoidi sono più eterogenei delle rosette in 2D, ma i neuroepiteli 3D sono più continui, si espandono per formare zone progenitrici definite e sviluppano diverse identità di regione del cervello; quindi, ricapitolano meglio l'interazione complessa di diverse regioni e strutture.

I metodi di generazione del tessuto neurale in 3D diversi dal metodo qui descritto sono piuttosto limitati. Le neurosfere sono aggregati 3D di progenitori neurali spesso usati come test per valutare la capacità proliferativa dei progenitori neurali 19, 37 . Tuttavia, mancano di un'organizzazione chiara e quindi soffrono di molti dei limiti delle linee NSC sviluppate in 2D. L'approccio più simile al metodo qui descritto è il metodo SFEBq (coltura fluttuante priva di siero di aggregati simili a corpi embrionali con riattivazione rapida) metodo 20, 21 . Questo metodo è stato applicato con successo alla derivazione di un numero di singole regioni cerebrali, tra cui la retina 4, 21, la corteccia cerebrale 21, 22, 23 e l'ipofisi 8, 24, 25 .

Ci sono alcune somiglianze tra i metodi SFEBq e organoidi cerebrali, in particolare la struttura dei tessuti telencefalici dorsali ha generato 21, 26, 27, ma le formulazioni medie differiscono considerevolmente e la progressione dello sviluppo e quindi la tempistica è abbastanza distinta. In particolare, il metodo SFEBq utilizza i fattori di crescita per stimolare la differenziazione neurale e la successiva differenziazione in regioni specifiche. Gli organoidi cerebrali acquisiscono invece spontaneamente varie identità di tessuto cerebrale e quindi stabiliscono più regioni all'interno di un singolo organoide.

Il metodo SFEBq è stato descritto per mostrare una limitata continuità ed espansione del tessuto neuroepiteliale 21, 28, 33 . Invece, il metodo qui descritto genera organoidi cerebrali con grande neuroepitelio continuo che si presenta quando incorporato in Matrigel, che, insieme all'agitazione, distingue il metodo organoide. Questo problema è stato recentemente risolto con il metodo SFEBq e, in modo interessante, la soluzione sembra essere un'aggiunta di proteine ​​della matrice extracellulare, sotto forma di Matrigel disciolto a bassa concentrazione 27, 39 o proteine ​​laminina / entactina 29, 33. Altre modifiche sono state recentemente pubblicate, inclusa la crescita in un ambiente ad alto contenuto di ossigeno e l'aggiunta di siero, lipidi ed eparina 30, 39, quest'ultima delle quali è anche un componente importante del metodo organoide.

Applicazioni e limitazioni del protocollo

Il seguente protocollo può essere utilizzato per una varietà di studi sullo sviluppo e sulla malattia. È particolarmente adatto all'esame di domande biologiche che trarrebbero beneficio da un sistema modello umano. Ad esempio, abbiamo usato organoidi cerebrali per esaminare l'orientamento della divisione cellulare nelle cellule staminali gliali radiali umane 13, 31, un processo che si ritiene sia regolato in modo univoco nell'uomo rispetto ai topi 32, 40 . Allo stesso modo, gli organoidi cerebrali possono essere utilizzati per esaminare la determinazione del destino degli NSC o la loro progenie intermedia. Più in generale, gli organoidi possono essere utilizzati per esaminare la morfogenesi dei tessuti, la determinazione del destino ectodermico embrionale precoce e la determinazione della polarità neuroepiteliale.

Gli organoidi cerebrali rappresentano un nuovo sistema per interrogare i meccanismi delle condizioni neurologiche umane che sono state difficili o impossibili da esaminare nei topi e in altri organismi modello. Abbiamo usato organoidi cerebrali per esaminare le basi biologiche delle cellule di una forma di microcefalia, un disturbo che coinvolge piccole dimensioni del cervello 13, 33, 41 . Allo stesso modo, una varietà di disturbi neurologici potrebbe essere esaminata negli organoidi cerebrali. In linea di massima, questo sistema è forse il più adatto all'esame dei disturbi dello sviluppo neurologico, poiché riassume meglio il cervello in fase di sviluppo precoce (primo trimestre, sulla base di confronti istologici). Questi includono disturbi con chiare anomalie morfologiche ma anche disturbi più comuni come autismo, disabilità intellettiva ed epilessia 34, 42 .

Infine, è importante tenere presente i limiti dell'utilizzo di tale sistema per esaminare lo sviluppo e la malattia del cervello. Come in tutti i sistemi in vitro , il metodo manca di tessuti embrionali circostanti che sono importanti per l'interazione del cross-talk dei tessuti neurali e non neurali. In particolare, la mancanza delle meningi sovrastanti e del sistema vascolare che fornisce limita fortemente il potenziale di crescita degli organoidi. Ciò contribuisce a determinati modelli di crescita stocastica a seconda della disponibilità di nutrienti e della mancanza di assi del corpo per modellare il tessuto neurale. Pertanto, gli organoidi mostrano una marcata variabilità, in particolare tra i preparati. Pertanto, per rilevare costantemente i fenotipi, ad esempio, nel caso di mutazioni genetiche, i difetti devono essere abbastanza robusti da non rientrare nell'intervallo normale. Inoltre, devono essere inclusi controlli adeguati per questa variabilità, come gli organoidi di controllo preparati contemporaneamente e cresciuti nello stesso mezzo e, se possibile, il confronto dei fenotipi cellulari all'interno dei singoli organoidi.

Design sperimentale

Sebbene in precedenza abbiamo generato organoidi cerebrali sia da topo che da hPSC 13, il metodo qui descritto è specifico per gli hPSC. Abbiamo testato con successo sia ESC che PSC indotti (iPSC), nonché linee cellulari dipendenti dall'alimentatore e indipendenti dall'alimentatore. I PSC vengono prima dissociati in singole cellule e lasciati riunire nuovamente per formare EB (Fig. 1). Precedenti studi hanno dimostrato il successo della generazione di EB in piastre a fondo a 96 pozzetti rivestite con composti non adesivi 43 . Tali piastre rivestite sono disponibili in commercio e possono essere utilizzate per generare in modo affidabile EB di dimensioni e morfologia omogenee.

Image

Il protocollo inizia con la generazione di EB da PSC umani in una piastra a U a 96 pozzetti. Il giorno in cui vengono realizzati gli EB è il giorno 0. La generazione di EB è descritta nel passaggio 1. L'alimentazione e il monitoraggio degli EB sono descritti nei passaggi 2–4. Tipicamente, il giorno 6, gli EB vengono trasferiti su una piastra a 24 pozzetti contenente un mezzo di induzione neurale, come descritto nel passaggio 5. L'alimentazione e il monitoraggio dell'induzione neurale sono descritti nei passaggi 6 e 7. Il giorno 11, i tessuti neuroectodermici vengono quindi trasferiti a goccioline di Matrigel su un foglio di parafilm increspato, come descritto nei passaggi 8–17, e poi cresciuto in un piatto da 60 mm. Il monitoraggio di questi tessuti è descritto nei passaggi 18 e 19. Infine, le goccioline di Matrigel vengono trasferite al bioreattore rotante il giorno 15, come descritto nel passaggio 20, e ulteriormente mantenuto come descritto nel passaggio 21.

Immagine a dimensione intera

Gli EB sono quindi sottoposti all'induzione neurale in un mezzo minimo che non supporta la crescita di endoderma e mesoderma e consente invece solo lo sviluppo del neuroectoderma. I tessuti neuroectodermici vengono quindi trasferiti in una gocciolina galleggiante di Matrigel, che favorisce la crescita dei germogli neuroepiteliali che si espandono e contengono lumi pieni di liquido. Infine, i tessuti vengono trasferiti in un bioreattore rotante o, in alternativa, in una piastra vibrante orbitale, che promuove un migliore scambio di nutrienti e ossigeno per consentire una crescita più estesa e un ulteriore sviluppo in regioni cerebrali definite.

materiale

REAGENTI

cellule

  • hPSC o iPSC. Abbiamo utilizzato con successo ESC umani H9 (hESC), dipendenti dall'alimentatore o indipendenti dall'alimentatore (Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bank, Wicell Research Institute, cellule WA09) e riprogrammato iPSC dipendenti dall'alimentatore (Systems Biosciences, cat. SC101A -1)

    Attenzione

    L'uso di tessuti umani e cellule staminali umane deve rispettare le norme istituzionali e di finanziamento del corpo, nonché le linee guida etiche pertinenti.

  • Cellule alimentatrici di fibroblasti embrionali di topo irradiati con arresto della crescita, se si usano cellule staminali dipendenti dall'alimentatore (fibroblasti embrionali di topo (MEF); GlobalStem, numero di cat. GSC-6001G)

Mezzi di crescita e integratori

  • mTeSR1 medium (Stem Cell Technologies, n. cat. 05850)

  • DMEM-F12 (Invitrogen, cat. N. 11330-032 o 31330-038, a seconda della posizione)

  • Sostituzione del siero knockout (KOSR; Invitrogen, cat. N. 10828-028)

  • FBS di qualità hESC (deve essere testato per la compatibilità con gli hESC; Gibco, cat. n. 10270-106)

  • GlutaMAX (Invitrogen, cat. N. 35050-038)

  • Amminoacidi non essenziali MEM (MEM-NEAA; Sigma, cat. No. M7145)

  • 2-mercaptoethanol (Merck, cat. N. 8057400005)

  • bFGF (FGF2; Peprotech, cat. no. 100-18B)

    critico

    • Non abbiamo testato bFGF da altri fornitori per questo protocollo.

  • BSA (AppliChem, cat. No. 9048-46-8)

  • Acqua sterile

  • Eparina (Sigma, cat. No. H3149)

  • Inibitore ROCK Y27632 (Millipore, cat. No. SCM075)

  • Supplemento N2 (Invitrogen, cat. N. 17502048)

  • B27 - integratore di vitamina A (Invitrogen, cat. No. 12587010)

  • B27 + integratore di vitamina A (Invitrogen, cat. No. 17504044)

  • Penicillina-streptomicina (Sigma, cat. No. P0781)

  • Terreno neurobasale (Invitrogen, cat. No. 21103049)

  • Soluzione di insulina (Sigma, cat. No. I9278-5ML)

Enzimi e altri reagenti

  • Fattore di crescita ridotto Matrigel (BD Biosciences, cat. No. 356230)

  • Gelatina (Sigma, cat. No. G1890-100G)

  • Collagenasi IV (Invitrogen, cat. No. 17104-019)

  • PBS sterile (Invitrogen, cat. N. 14040-091)

  • EDTA (Sigma-Aldrich, cat. No. E6758)

  • D-PBS sterile senza calcio e magnesio (Invitrogen, cat. N. 14190-094)

  • Matrigel (BD Biosciences, cat. N. 356234)

  • Dispase (Invitrogen, cat. N. 17105-0412q)

  • Flacone spray contenente etanolo al 70% (vol / vol)

  • Soluzione di tripsina / EDTA, 0, 05% (peso / volume) (Gibco, n. Cat. 25300-054)

  • Inibitore di tripsina (Sigma-Aldrich, cat. No. T6414-100ML)

  • Accutase (Sigma-Aldrich, cat. No. A6964)

  • Trypan blue (Bio-Rad, cat. No. 145-0021)

  • Paraformaldeide (PFA; Sigma-Aldrich, cat. N. 158127)

  • Saccarosio (Sigma-Aldrich, cat. No. S7903)

ATTREZZATURE

  • Incubatori di CO 2 (Thermo Scientific, n. Cat. 51026280)

  • Armadio di sicurezza biologico (Thermo Scientific, n. Cat. 51022482)

  • Piatti per coltura tissutale a 6 pozzetti (Corning, cat. N. 353046)

  • Sollevatore di cellule (Corning, cat. N. 3008)

  • Rainin Pipet Plus (P1000, P200 e P10)

  • Puntali per pipette con filtro sterili (1 ml, 200 e 10 μl; Sigma-Aldrich, cat. N. A3348, A3098 e A2473, rispettivamente)

  • Provette per microcentrifuga sterili (dimensione 1, 5 ml; Fisher Scientific, numero cat. 05-408-129)

  • Siringa sterile da 10 ml senza ago (Sigma, numero di cat. Z248029)

  • Filtro per siringa, 0, 2 μm (Sigma-Aldrich, numero di cat. Z259969)

  • Unità filtro Stericup 0, 2-μm (500 e 250 ml; Millipore, nn cat. SCGVU02RE SCGVU05RE, rispettivamente)

  • Piastre di fissaggio U-bottom ultralow, 96 pozzetti (Corning, cat. No. CLS7007)

  • Provette coniche, 15 ml (Fisher Scientific, n. Cat. 05-527-90)

  • Piastre di fissaggio Ultralow, 24 pozzetti (Corning, cat. No. CLS3473)

  • Parafilm (Sigma-Aldrich, cat. No. P7793)

  • Piatto per coltura tissutale, 60 mm (Sigma-Aldrich, cat. No. CLS430589)

  • Pallone da spinner, 125 ml (Corning, cat. No. 4500-125)

  • Agitare la piastra (2mag, bioMIXdrive e bioMIXcontrol)

  • Agitatore orbitale (IKA, cat. N. 0009019200)

  • Pipetboy (Integra Biosciences, n. Cat. 155000)

  • Pipette sierologiche, 10 ml (BD Falcon, n. Cat. 357551)

  • Forbici sterilizzate

  • Bagnomaria, 37 ° C (Fisher Scientific, bagnomaria Isotemp)

  • Stereomicroscopio (Zeiss, Stemi 2000)

  • Microscopio per coltura tissutale a contrasto inverso (Leica, DMIL)

  • Contatore di cellule automatizzato (Bio-Rad, TC10)

  • Centrifuga da banco (Thermo Scientific, Heraeus Multifuge 1s)

  • Pinza standard sterile (Fine Science Tools, cat. No. 11000)

  • Piastra di coltura tissutale standard a 24 pozzetti (Sigma-Aldrich, cat. No. CLS3527)

  • Piatti per pesare (Sigma-Aldrich, cat. No. Z154873)

  • Lama per bisturi (Sigma-Aldrich, cat. No. S2771)

  • Isopentano (2-metilbutano; Sigma-Aldrich, numero di cat. M32631)

  • Ghiaccio secco

  • Termometro a bassa temperatura (Sigma-Aldrich, cat. No. Z257400)

  • Spatola da laboratorio (Sigma-Aldrich, cat. No. S3897)

  • Criostato (Leica)

IMPOSTAZIONE DEL REAGENTE

Linee hPSC dipendenti dall'alimentatore

  • HPSC di coltura che utilizzano procedure standard in un incubatore di CO 2 al 5% a 37 ° C. In breve, mantenere hESC o hiPSC dipendenti dall'alimentatore su MEF arrestati per la crescita secondo un protocollo modificato dai protocolli della banca WISC (//www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx) . Piastra di MEF irradiati con g su piastre di Falcon BD a 6 pozzetti rivestite con gelatina (0, 1% (peso / vol)) a 6 pozzetti Falcon ad una densità di 1, 87 × 10 5 cellule per pozzetto il giorno prima della scissione o dello scongelamento di HESC o hiPSC. PSC dipendenti dall'alimentatore di passaggio che utilizzano collagenasi IV allo 0, 1% (peso / volume) IV in terreno DMEM-F12 per 5-10 minuti, seguito da raschiatura con un sollevatore di cellule per rimuovere colonie intatte e triturare con una punta di pipetta da 1 ml per ottenere colonie più piccole prima della placcatura. Mantenere PSC dipendenti dall'alimentatore in terreno hESC con una concentrazione finale di 20 ng ml −1 di bFGF.

HESC senza alimentatore

  • Mantenere hESC senza alimentatore nel mezzo mTeSR1 e coltivarli su piastre rivestite con Matrigel secondo i protocolli WISC Bank. In breve, sciogliere Matrigel a basso fattore di crescita in DMEM-F12 e utilizzare un volume contenente 0, 5 mg di Matrigel per rivestire un'intera piastra Falcon BD a sei pozzetti. HESC indipendenti dall'alimentatore di passaggio che utilizzano 0, 5 mM di EDTA in D-PBS sterile senza calcio e magnesio.

Ricostituzione e conservazione dei fattori di crescita e di altri additivi

  • Preparare una soluzione al 10% (p / vol) di BSA sciogliendo 1 g in 10 ml di acqua sterile. Questo può essere conservato a -20 ° C per 1-2 anni. Ricostituire 50 μg di bFGF in 5 ml di PBS sterile + 0, 1% (p / vol) concentrazione finale di BSA per ottenere una soluzione di 10 μg ml--1. Preparare aliquote da 25 μl e conservarle a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Ricostituire l'eparina in PBS sterile ad una concentrazione di brodo finale di 1 mg ml −1 e conservarla a 2–8 ° C per un massimo di 2 anni. Ricostituire 5 mg di inibitore ROCK in 2, 96 ml di acqua sterile per ottenere una concentrazione finale di 5 mM. Preparare aliquote da 150 μl e conservarle a -20 ° C per un massimo di 1 anno. Aliquotare e conservare gli integratori N2 e B27 a -20 ° C per un massimo di 1 anno.

Aliquotting Matrigel per goccioline Matrigel

  • Scongelare il Matrigel su ghiaccio a 4 ° C durante la notte. Precoolare puntali per pipetta da 1 ml e dieci provette per microcentrifuga a -20 ° C per 10-15 min. Utilizzando punte di pipette fredde, pipettare Matrigel su e giù su ghiaccio e in una cappa sterile prima di trasferire 500 μl in ciascuna provetta. Conservare le aliquote a -20 ° C per un massimo di 1 anno. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti.

    critico

    • Matrigel si solidificherà a temperatura ambiente (22–25 ° C), quindi è importante che tutti i materiali a contatto con la soluzione siano mantenuti freddi e che l'aliquotazione venga eseguita rapidamente per ridurre al minimo il tempo a temperatura ambiente.

Spazza via la soluzione

  • Sciogliere 5 mg di dispasi in 5 ml di DMEM-F12 e filtrarlo usando una siringa e un filtro per siringa da 0, 2 μm. Questa soluzione è stabile a 2-8 ° C per un massimo di 2 settimane, oppure possono essere prodotte quantità maggiori e le aliquote possono essere conservate a -20 ° C per un massimo di 4 mesi.

hESC medium

  • Per ∼ 500 ml di terreno, unire 400 ml di DMEM-F12, 100 ml di KOSR, 15 ml di FBS di qualità ESC, 5 ml di GlutaMAX, 5 ml di MEM-NEAA e 3, 5 ml di 2-mercaptoetanolo. Filtralo usando un filtro Stericup da 0, 2 μm guidato dal vuoto. Questo può essere conservato per un massimo di 2 settimane a 2-8 ° C. Aggiungere bFGF a una concentrazione finale di 20 ng ml −1 per hESC standard o coltura dipendente dall'alimentatore hiPSC, o per terreno a basso bFGF hESC, aggiungere bFGF a una concentrazione finale di 4 ng ml −1 .

    critico

    • Aggiungi bFGF immediatamente prima dell'uso solo al volume necessario.

Mezzo di induzione neurale

  • Combina DMEM-F12 con integratore di N2 all'1% (vol / vol), integratore di GlutaMAX all'1% (vol / vol) e MEM-NEAA all'1% (vol / vol). Aggiungere eparina (concentrazione finale di 1 μg ml −1 ) e filtrarla usando un'unità filtro 0, 2-μm sotto vuoto. Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 2 settimane.

Terreno di differenziazione organoide cerebrale

  • Per ∼ 250 ml di terreno, unire 125 ml di DMEM-F12, 125 ml di mezzo neurobasale, 1, 25 ml di integratore N2, 62, 5 μl di insulina, 2, 5 ml di integratore GlutaMAX, 1, 25 ml di MEM-NEAA e 2, 5 ml di penicillina- streptomicina. Preparare una diluizione 1: 100 di 2-mercaptoetanolo in DMEM-F12 e aggiungere 87, 5 ml di questo al terreno. Aggiungere 2, 5 ml di integratore B27.

    critico

    • B27 non deve contenere vitamina A (acido retinoico) durante le fasi iniziali della crescita di Matrigel. Tuttavia, una volta trasferite le goccioline nell'agitatore orbitale o nel matraccio, la B27 dovrebbe includere la vitamina A. Filtrare il terreno utilizzando un'unità filtro da 0, 2 μm sotto vuoto e conservarlo a 2-8 ° C per un massimo di 2 settimane.

Reagenti per analisi organoide e cryosectioning

  • Preparare una soluzione PFA al 4% (p / vol) sciogliendo 4 g di PFA in 80 ml di PBS a 60 ° C aggiungendo alcune gocce di NaOH 1 N fino a quando la polvere si dissolve. Regola il pH su 7, 4 e porta il volume finale a 100 ml. Dividilo in aliquote e conservalo a -20 ° C. Preparare una soluzione di saccarosio al 30% (peso / vol) sciogliendo 30 g di saccarosio in un volume finale di 100 ml di PBS a 37 ° C. Preparare la soluzione di inclusione di gelatina / saccarosio sciogliendo prima 100 g di saccarosio in 1 litro di PBS a 37 ° C per preparare una soluzione di saccarosio al 10% (peso / vol). Conservare le soluzioni di saccarosio a 4 ° C. Sciogliere 7, 5 g di gelatina in 100 ml di soluzione di saccarosio al 10% (p / vol) a 37 ° C per ottenere una soluzione di inclusione di gelatina al 7, 5% / saccarosio al 10% (p / vol). Dividi la soluzione in aliquote e conservala a -20 ° C.

IMPOSTAZIONE DELL'APPARECCHIATURA

Bioreattore rotante

  • Installare una piastra di agitazione a bassa velocità adatta per l'uso in un incubatore a CO 2 spruzzandolo prima con etanolo per sterilizzare, quindi posizionandolo sul ripiano inferiore di un incubatore per coltura tissutale standard. Accertarsi che i ripiani sopra siano posizionati con spazio sufficiente per adattare comodamente il pallone rotante sulla piastra di agitazione. Spostare il cavo di alimentazione o il cavo del controller di lato in modo che possa uscire dall'incubatrice senza appenderlo davanti ai piatti di coltura tissutale. Tenerlo in posizione con un pezzo di nastro e verificare che le porte dell'incubatrice possano ancora chiudersi saldamente.

Agitatore orbitale

  • Spruzza un agitatore orbitale standard con etanolo e posizionalo su uno scaffale nell'incubatore per coltura di tessuti, assicurandoti che il ripiano sopra sia posizionato con spazio sufficiente per i piatti di coltura di tessuto da posizionare sull'agitatore. Spostare il cavo di alimentazione lateralmente in modo che possa uscire dall'incubatrice senza appenderlo davanti ai piatti di coltura tissutale. Tenerlo in posizione con un pezzo di nastro e verificare che le porte dell'incubatrice possano ancora chiudersi saldamente.

Procedura

Fare EB

Tempistica: 1–2 h

  1. Coltiva le colonie hESC o iPSC in un pozzetto di una piastra da sei pozzetti fino a quando non sono confluenti al 70-80%. Tutto o parte del pozzo può essere utilizzato per creare EB. Tipicamente, un pozzetto produrrà circa un intero piatto di 96 pozzetti di EB. Seguire l'opzione A per generare EB da PSC dipendenti dall'alimentatore e l'opzione B per la generazione di EB da hESC indipendenti dall'alimentatore. Non abbiamo osservato una differenza negli organoidi generati da PSC dipendenti dall'alimentatore o indipendenti dall'alimentatore.

    Passaggio critico

    • La morfologia delle colonie di cellule staminali è cruciale per il successo della formazione del tessuto cerebrale. Le colonie non dovrebbero avere evidenza di differenziazione e dovrebbero mostrare caratteristiche ottimali di pluripotenza (Fig. 2).

    1. Da PSC dipendenti dall'alimentatore

      1. Lavare le cellule rimuovendo il terreno di hESC e sostituendolo con 1 ml di D-PBS senza calcio e magnesio. Rimuovere D-PBS e aggiungere 1 ml di soluzione di dispasi in ciascun pozzetto di una piastra da sei pozzetti, quindi rimettere le cellule nell'incubatrice per 20-30 minuti. I bordi della colonia dovrebbero arricciarsi sul piatto, essendo attaccato solo al centro della colonia. Questa operazione può richiedere fino a 40 minuti.

      2. Rimuovere la soluzione di dispasi e aggiungere 1 ml di terreno hESC a basso contenuto di bFGF. Toccare il piatto rigorosamente per rimuovere le colonie dal piatto senza rimuovere MEF e cellule differenziate. Trasferire il terreno contenente colonie intatte in una provetta conica da 15 ml, facendo attenzione a limitare l'interruzione delle colonie. Lasciare che le colonie si depositino sul fondo della provetta per ∼ 1 min.

      3. Aspirare delicatamente il surnatante contenente singole cellule e MEF, facendo attenzione a non disturbare le colonie stabilizzate. Aggiungere altri 1 ml di terreno hESC a basso contenuto di bFGF e consentire nuovamente alle colonie di depositarsi; rimuovere il surnatante.

      4. Risospendere le colonie in 1 ml di tripsina / EDTA e incubare la provetta per 2 minuti a 37 ° C. Aggiungere 1 ml di inibitore della tripsina e triturare la miscela usando una punta di pipetta da 1 ml fino a quando la soluzione diventa torbida con singole cellule. Prendi due replicati da 5 μl per il conteggio delle cellule, quindi aggiungi 8 ml di terreno hESC a basso contenuto di bFGF.

      5. Centrifugare le cellule a 270 g per 5 minuti a temperatura ambiente e nel frattempo contare le cellule vive aggiungendo un uguale volume di tripan blu per contrassegnare le cellule morte. Conta le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Utilizzare la media dei due replicati per calcolare i passaggi successivi.

      6. Risospendere le cellule prima in 1 ml di terreno hESC a basso contenuto di bFGF con inibitore ROCK (1: 100, concentrazione finale 50 μM). Pipettare su e giù per garantire una sospensione a cella singola. Quindi aggiungere un ulteriore volume appropriato di terreno hESC a basso contenuto di bFGF con inibitore ROCK per ottenere 9000 cellule vive per 150 μl.

      7. Piastra 150 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra inferiore a 96 pozzetti a 96 pozzetti e rimetterla nell'incubatrice.

    2. Da hESC indipendenti dall'alimentatore

      1. Lavare le cellule con 1 ml di D-PBS senza calcio e magnesio e aggiungere 600 μl di soluzione EDTA 0, 5 mM in D-PBS senza calcio e magnesio per ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Riposizionare le cellule nell'incubatrice per 4 minuti.

      2. Aspirare delicatamente la soluzione EDTA senza disturbare le colonie e aggiungere 1 ml di Accutase. Riposizionare le cellule nell'incubatrice per altri 4 minuti.

      3. Utilizzare una punta di pipetta da 1 ml per spruzzare le colonie con 1 ml di terreno mTeSR1 per staccarle dal piatto. Trasferire 2 ml in una provetta conica da 15 ml e triturare la miscela usando un puntale da pipetta da 1 ml fino a quando la soluzione diventa torbida con singole cellule. Prendi due ripetizioni di 5 μl per il conteggio delle cellule, quindi aggiungi altri 3 ml di terreno mTeSR1 e mescola.

      4. Centrifugare le cellule a 270 g per 5 minuti a temperatura ambiente e nel frattempo contare le cellule vive aggiungendo un uguale volume di tripan blu per contrassegnare le cellule morte. Conta le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Utilizzare la media dei due replicati per calcolare i passaggi successivi.

      5. Risospendere le cellule prima con 1 ml di terreno hESC a basso contenuto di bFGF con inibitore ROCK (1: 100, concentrazione finale 50 μM). Pipettare su e giù per garantire una sospensione a cella singola. Quindi, aggiungere un volume appropriato aggiuntivo di mezzo hESC a basso contenuto di bFGF con inibitore ROCK per ottenere 9000 cellule vive per 150 μl.

      6. Piastra 150 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra inferiore a 96 pozzetti a 96 pozzetti e rimetterla nell'incubatrice.

Image

( a ) Una colonia di ESC umani dipendenti dall'alimentatore che mostrano una morfologia tipica pluripotente con confini chiari e una trama uniforme. ( b ) Un EB al giorno 5 che mostra evidenza di differenziazione ectodermica, come indicato dalla presenza di tessuto superficiale illuminato, mentre il centro è piuttosto scuro con tessuto denso non ectodermico. L'EB ha anche una superficie liscia, che indica un tessuto sano. ( c ) Un organoide precoce al giorno 10 che mostra bordi lisci e tessuto superficiale otticamente traslucido coerente con il neuroectoderma (freccia). Questo organoide contiene anche piccoli germogli di tessuto ectodermico che non è organizzato radialmente (punta di freccia). ( d ) Immagine dei tessuti neuroectodermici incorporati nelle goccioline di Matrigel su un foglio di Parafilm increspato. I tessuti sono visibili come piccoli granelli bianchi all'interno della gocciolina (freccia). ( e ) Un organoide al giorno 14, dopo l'incorporazione in Matrigel, che mostra la prova della crescita del germoglio neuroepiteliale (frecce) che sono otticamente chiari e in molti casi circondano un lume visibile. Sono visibili anche altre escrescenze e cellule migratrici (punte di freccia) che non sono neuroepiteliali. ( f ) Impostazione del bioreattore rotante nell'incubatore per coltura di tessuti. Gli organoidi sono visibili all'interno del bioreattore come piccoli granelli bianchi galleggianti. ( g ) Un organoide al giorno 28 del protocollo, che rivela molti grandi tessuti neurali (frecce) che si sono notevolmente espansi una volta incorporati nel Matrigel. Barre di scala, 200 μm ( a - c, e, g ) e 5 mm ( d ).

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Alimentazione di EB e inizio della differenziazione dello strato germinale

Tempi: 5-7 d

  1. Osservare la piastra sotto il microscopio per coltura di tessuti 24 ore dopo. Dovrebbero essere visibili piccoli EB con bordi chiari, anche se molte cellule morte decoreranno l'area intorno all'EB. Questo è del tutto normale e non disturberà la formazione dell'EB al centro. Continuare a coltivare gli EB nell'incubatore per colture di tessuti a 37 ° C e 5% di CO 2 .

  2. Nutri gli EB a giorni alterni aspirando delicatamente circa la metà del mezzo senza disturbare l'EB nella parte inferiore del pozzo. Aggiungere altri 150 μl di terreno fresco (il volume finale sarà> 150 μl, ma la quantità esatta non è importante). Includere inibitore ROCK (1: 100) e terreno a basso contenuto di bFGF (4 ng ml −1 ) fino a quando gli EB iniziano a schiarirsi o hanno un diametro> 350–400 μm. Le misure delle dimensioni possono essere eseguite utilizzando un microscopio invertito dotato di una fotocamera e un software di misurazione. In genere, l'inibitore ROCK e il mezzo a basso contenuto di bFGF sono inclusi solo per i primi 4 giorni.

  3. Mentre gli EB hanno un diametro di 350–600 μm, alimentare gli EB a giorni alterni, come descritto al passaggio 3 utilizzando il mezzo hESC, ma non includere l'inibitore ROCK o bFGF.

Induzione della neuroepitelia primitiva

Tempistica: 4–5 d

  1. Quando gli EB hanno un diametro di ∼ 500–600 μm e iniziano a schiarire e hanno bordi lisci (in genere giorno 6; Fig. 2b e 3), trasferire ciascun EB con una punta di pipetta da 200 μl tagliata in un pozzetto di un attacco basso 24 -piastra contenente 500 ml di mezzo di induzione neurale (Fig. 1), facendo attenzione a non interrompere l'EB. Continua a coltivare gli EB.

    Passaggio critico

    • Tagliare una punta di pipetta da 200 μl con le forbici sterili per ottenere un'apertura di 1–1, 5 mm di diametro. Assicurarsi che l'apertura non sia troppo piccola, poiché ciò interromperà l'EB, ma anche non troppo grande, poiché ciò renderà difficile aspirare l'EB nella punta della pipetta. Non tentare di estrarre l'EB dal pozzo con una spatola o altri strumenti, poiché ciò danneggerebbe l'EB.

    Risoluzione dei problemi

  2. Alimentare gli EB aggiungendo altri 500 ml di mezzo di induzione neurale per 48 ore dopo averli trasferiti sulla piastra a 24 pozzetti.

  3. Osservare gli EB sul microscopio per coltura tissutale dopo altri 2 giorni. Gli EB dovrebbero essere più luminosi all'esterno, indicando una differenziazione neuroectodermica. Una volta che queste regioni iniziano a mostrare l'organizzazione radiale di un epitelio pseudostratificato coerente con la formazione di neuroepitelio (Fig. 2c), che dovrebbe avvenire dopo 4-5 d nel mezzo di induzione neurale, procedere al Passaggio 8 per trasferire gli aggregati in goccioline di Matrigel (Fig. 1 ).

    Passaggio critico

    • Gli aggregati cellulari sani dovrebbero avere bordi lisci. Il neuroepitelio si sviluppa sulla superficie esterna ed è abbastanza otticamente traslucido (Figg. 2c e 3c, d). Occasionalmente, i tessuti possono presentare escrescenze o gemme di tessuto otticamente traslucido che non è organizzato radialmente (Figg. 2c e 3d). Sebbene non sia l'ideale, non abbiamo notato un effetto a lungo termine sulla formazione di organoidi quando questi germogli appaiono finché l'organizzazione radiale è presente in altre regioni del tessuto. È importante sottolineare che queste regioni non radiali possono diventare radiali se lasciate nell'induzione neurale per 1-2 giorni in più, ma con il rischio che altre regioni già radiali possano iniziare a ridursi e perdere la capacità di formare gemme neuroepiteliali se non trasferite a Matrigel (Passaggio 8) in modo tempestivo.

    Passaggio critico

    • Assicurati di passare al punto 8 per trasferire i tessuti a Matrigel quando appare il neuroepitelio. Non trasferire i tessuti troppo tardi, poiché ciò può influire sulla morfologia successiva dei tessuti cerebrali.

    Risoluzione dei problemi

Image

( a ) Un esempio di EB ottimale al giorno 5 che mostra schiariture e schiariture intorno alla superficie e con bordi lisci. ( b ) Un esempio di EB inadatto privo di compensazione ottica e con grandi quantità di detriti cellulari, nonostante le sue grandi dimensioni. ( c ) Un organoide nel mezzo di induzione neurale che mostra un neuroectoderma otticamente traslucido organizzato radialmente (freccia). ( d ) Un esempio di organoide accettabile che mostra anche evidenza di neuroectoderma otticamente chiaro (freccia) ma anche un grande bocciolo di ectoderma traslucido che non è organizzato radialmente (punta di freccia). Questo germoglio, sebbene non ideale, non influenzerà lo sviluppo del tessuto neuroectodermico adiacente. ( e ) Un esempio di induzione neurale fallita. Gli EB sono troppo grandi e mancano di neuroectoderma otticamente traslucido, organizzato radialmente. ( f ) Un organoide ideale subito dopo l'incorporazione di Matrigel, che mostra molti germogli di cellule neuroepiteliali (frecce) e non neuroepiteliali, che sono migrate nel Matrigel (punta di freccia). ( g ) Un organoide che non è riuscito a produrre gemme neuroepiteliali, mostrando invece processi cellulari estesi (punta di freccia) coerenti con la differenziazione neurale diretta. ( h ) Un esempio di organoide fallito dopo diverse settimane di differenziazione che mostra grandi cisti piene di liquido prive di un neuroepitelio addensato (punta di freccia). Barre di scala, 200 micron.

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Trasferimento di tessuti neuroepiteliali in goccioline di Matrigel

Tempistica: 1–2 h

  1. Scongelare Matrigel su ghiaccio a 4 ° C per 1–2 ore. Scopriamo che una provetta per microcentrifuga contenente 500 ml di Matrigel si scongelerà in questo lasso di tempo se viene mantenuta galleggiante in un bagno di ghiaccio e acqua.

  2. Preparare il substrato Parafilm increspato per la generazione di goccioline Matrigel stratificando un quadrato di Parafilm su un vassoio vuoto per puntali da 200 μl. Premere il dito guantato nel Parafilm su ciascun foro del vassoio della punta per creare piccole fossette nel Parafilm.

    Attenzione

    Il parafilm non può essere adeguatamente sterilizzato, in quanto non può essere sterilizzato in autoclave. Pertanto, assicurarsi di utilizzare Parafilm in un ambiente pulito e spruzzare i guanti e il Parafilm con etanolo al 70% (vol / vol) prima di preparare le fossette. Gli antibiotici sono anche inclusi nel mezzo in questa fase per prevenire la contaminazione.

  3. Crea una griglia di 4 × 4 fossette (16 in totale) e ritaglia il Parafilm con le forbici sterili su un quadratino contenente questa griglia. Posiziona il quadrato di Parafilm in un piatto da coltura per tessuti da 60 mm.

    Passaggio critico

    • Una griglia di 4 × 4, ma non più grande, si adatta alla parabola da 60 mm. Pertanto, un totale di 16 goccioline viene inserito in ogni piatto da 60 mm.

  4. Utilizzare una punta da 200 μl tagliata per trasferire i tessuti neuroepiteliali uno alla volta in ciascuna fossetta del Parafilm.

    Passaggio critico

    • Tagliare una punta di pipetta da 200 μl con le forbici sterili per ottenere un'apertura di 1, 5–2 mm di diametro. Assicurati che l'apertura non sia troppo piccola, poiché ciò interromperà i tessuti. Non tentare di raccogliere i tessuti neuroepiteliali dal pozzo con una spatola o altri strumenti, poiché ciò danneggerebbe il tessuto.

  5. Rimuovere il mezzo in eccesso da ciascun tessuto aspirando delicatamente il fluido con una punta non tagliata da 200 μl.

    Passaggio critico

    • Posizionare la punta con l'aggregato dietro l'apertura della punta per evitare di aspirare il tessuto nella punta, poiché ciò danneggerebbe l'aggregato.

  6. Aggiungere immediatamente goccioline di Matrigel a ciascun aggregato gocciolando ∼ 30 μl su ciascun tessuto in modo che la gocciolina riempia la fossetta di Parafilm.

    Passaggio critico

    • Aggiungi rapidamente il Matrigel per evitare che i tessuti si secchino. Generalmente eseguiamo l'incorporamento di 16 tessuti alla volta, un numero gestibile in un intervallo di tempo che non farà seccare gli aggregati.

  7. Posizionare ciascun aggregato al centro della goccia usando una punta di pipetta da 10 μl per spostare il tessuto all'interno della goccia (Fig. 2d).

    Passaggio critico

    • Questo deve essere fatto immediatamente dopo l'aggiunta della goccia, poiché Matrigel inizierà a solidificarsi una volta a temperatura ambiente.

  8. Riposizionare la parabola da 60 mm contenente goccioline su Parafilm nell'incubatore a 37 ° C e incubare per 20-30 minuti per consentire al Matrigel di polimerizzare.

  9. Aggiungere 5 ml di mezzo di differenziazione organoide cerebrale senza vitamina A nel piatto da 60 mm.

  10. Rimuovere le goccioline di Matrigel da Parafilm usando prima una pinza sterile per capovolgere il foglio di Parafilm e agitando la parabola fino a far cadere le goccioline dal foglio. Eventuali goccioline rimanenti possono essere rimosse usando una pinza per scuotere il foglio di Parafilm nel mezzo più vigorosamente. Continua a coltivare le goccioline di tessuto in un incubatore a CO 2 .

Cultura stazionaria di gemme neuroepiteliali in espansione

Tempistica: 4 d

  1. Osservare i tessuti incorporati 24 ore dopo al microscopio. I tessuti dovrebbero iniziare a formare gemme di neuroepitelio più espanso contenente cavità piene di liquido entro 1-3 d (Fig. 2e e 3f).

    Passaggio critico

    • Spesso, altri tipi di cellule migratorie si diffondono dalla massa principale del tessuto nel Matrigel (Fig. 2e). Si tratta in genere di cellule simili ai fibroblasti che molto probabilmente rappresentano una piccola popolazione di identità non neuronali che sfuggono all'induzione neurale. Tuttavia, queste cellule in genere non sopravvivono e la loro migrazione dal tessuto sembra favorire la crescita dei germogli neuroepiteliali.

    Risoluzione dei problemi

  2. Incubare le goccioline per altre 24 ore, quindi alimentare le goccioline contenenti tessuti neuroepiteliali con terreno di differenziazione organoide cerebrale senza vitamina A. Incubare per ulteriori 48 ore senza agitazione.

    Passaggio critico

    • Cambia il mezzo inclinando il piatto, facendo affondare le goccioline e aspirando accuratamente il mezzo. Aspirare il più medio possibile senza disturbare gli organoidi. Sostituirlo con 5 ml di terreno fresco.

Crescita del tessuto cerebrale

Tempistica: fino a 1 anno

  1. Dopo 4 giorni in coltura statica, trasferire gli organoidi incorporati in un bioreattore rotante da 125 ml (Fig. 1) usando un puntale da pipetta da 1 ml tagliato con un'apertura di ∼ 3 mm. Organoidi di coltura in 75–100 ml di terreno di differenziazione organoide cerebrale contenente vitamina A. Collocare il bioreattore su un'apposita piastra di agitazione magnetica installata nell'incubatrice (Fig. 2f). In alternativa, è possibile utilizzare uno shaker orbitale installato nell'incubatrice, agitando a 85 rpm. Sostituisci semplicemente il mezzo in ogni piatto da 60 mm con un mezzo di differenziazione organoide cerebrale contenente vitamina A e posiziona il piatto sullo shaker orbitale.

    Passaggio critico

    • Non trasferire più di due piastre da 60 mm di organoidi (32 organoidi), poiché il trasferimento di troppi organoidi in questo matraccio porta alla fusione di organoidi.

    Passaggio critico

    • Assicurarsi di utilizzare una piastra di agitazione a bassa velocità approvata per l'uso in un incubatore per colture di tessuti, poiché le piastre di agitazione normali possono riscaldarsi a causa del movimento di agitazione magnetica.

    Passaggio critico

    • L'uso di uno shaker orbitale consente l'analisi di molte condizioni di coltura, trattamenti o varianti genetiche in parallelo, mentre una tipica piastra di agitazione comprende solo 4-6 posti per boccette separate. Non abbiamo osservato differenze nella morfologia degli organoidi coltivati ​​nel bioreattore o nello shaker orbitale.

  2. Cambiare completamente il mezzo, come descritto al passaggio 9, ogni 3-4 giorni se gli organoidi si trovano sullo shaker o ogni settimana per il matraccio di spinner e monitorare la morfologia. Esegui ulteriori analisi sugli organoidi nei tuoi punti temporali preferiti, a seconda della fase di sviluppo desiderata. Vedere la sezione RISULTATI ANTICIPATI per ulteriori discussioni su quando vengono generalmente raggiunti determinati stadi di sviluppo. Se lo si desidera, il criosectioning e l'immunocolorazione possono essere eseguiti come descritto nel riquadro 1.

    Risoluzione dei problemi

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Risoluzione dei problemi

I consigli per la risoluzione dei problemi sono riportati nella Tabella 1.

Tabella a grandezza naturale

sincronizzazione

Step 1, fare EB: 1–2 h

Passaggi 2–4, alimentazione di EB e inizio della differenziazione dello strato germinale: 5–7 d

Passaggi 5–7, induzione della neuroepitelia primitiva: 4–5 d

Passaggi 8–17, trasferimento dei tessuti neuroepiteliali alle goccioline di Matrigel: 1–2 h

Passaggi 18 e 19, cultura stazionaria di gemme neuroepiteliali in espansione: 4 d

Passaggi 20 e 21, crescita del tessuto cerebrale: variabile; gli organoidi possono essere mantenuti per un massimo di 1 anno, anche se la crescita dei tessuti si interrompe di 2 mesi e le dimensioni dei tessuti diminuiscono costantemente dopo 5-6 mesi

Riquadro 1, preparazione dei tessuti per analisi e immunocolorazione: 3 d

Risultati previsti

Questo protocollo delinea la generazione della produzione di organoidi cerebrali 3D da hPSC e la loro successiva analisi. Il metodo è facile da implementare in una tipica camera di coltura tissutale utilizzando apparecchiature standard. Inoltre, gli organoidi possono essere esaminati in vari momenti per studiare una varietà di stadi di sviluppo. Entro 5-6 d (Fase 5), gli EB dovrebbero mostrare tessuto otticamente traslucido sulla superficie esterna dell'EB (Figg. 2b e 3a). Questo in genere non è variabile tra gli EB all'interno di una preparazione, sebbene diversi lotti di EB realizzati in momenti diversi possano presentare variabilità tra i lotti. Questa variabilità dipende molto dalla morfologia e dalla pluripotenza dei PSC iniziali. È importante che i PSC mostrino una morfologia ottimale delle colonie 1 (cioè non una differenziazione> 5-10% e colonie omogenee con bordi evidenti) prima di iniziare il protocollo.

Se gli EB mostrano un'adeguata schiaritura e schiarimento della superficie (Fase 5), in genere il 60–80% di questi presenterà neuroectoderma quando posizionato nel mezzo di induzione neurale (Fase 7). Tuttavia, può verificarsi di nuovo una variabilità da lotto a lotto, sebbene i tessuti all'interno di un determinato lotto raramente mostrino molta variabilità in questa fase. Infine, i germogli neuroepiteliali si formano in genere nel 30-80% degli organoidi quando vengono inseriti nelle goccioline di Matrigel (Fase 18). Questi boccioli saranno abbastanza eterogenei da tessuto a tessuto e presenteranno dimensioni e gradi di continuità variabili. Tuttavia, su molti degli organoidi si formeranno tessuti neuroepiteliali ampi e continui se vengono prese le seguenti precauzioni per garantire un buon lotto di organoidi: i PSC devono esibire una morfologia ottimale delle colonie prima di iniziare (Figg. 2a); Gli EB devono essere trasferiti nel mezzo di induzione neurale al momento giusto in base alla morfologia e alle dimensioni (Figg. 2b e 3a); e i tessuti devono essere successivamente trasferiti nelle goccioline di Matrigel al momento giusto secondo la morfologia (Figg. 2c e 3c).

I tessuti cerebrali si espandono generalmente rapidamente una volta posizionati in Matrigel (Figg. 2e e 3f), e nei giorni 15-20 l'intero organoide sarà difficile da esaminare usando un microscopio standard per colture tissutali poiché i tessuti sono troppo grandi a questo punto. Invece, osservare i tessuti usando un microscopio da dissezione o uno stereomicroscopio per visualizzare la morfologia grossolana. Spesso si possono vedere cavità piene di liquido (Fig. 2g), anche se situate all'interno della massa tissutale sono difficili da identificare. Inoltre, le regioni retiniche possono essere riconosciute dalla presenza di regioni pigmentate che riflettono l'identità epiteliale pigmentata retinica 4 .

Le grandi dimensioni di organoidi dopo l'incorporazione di Matrigel richiedono analisi mediante sezionamento e colorazione immunoistochimica (Riquadro 1). Le criosezioni eseguite in una fase precoce (12-20 d) riveleranno un neuroepitelio in espansione contrassegnato dall'espressione di Sox2 o Pax6 (Tabella 2), mentre sono visibili solo neuroni occasionali 13 . Questi neuroepiteli si trovano adiacenti a cavità simili al ventricolo che sono spesso piene di liquido o contengono detriti cellulari. Occasionalmente, potrebbero esserci altri tessuti che presentano morfologie simili ai fibroblasti, sulla base della caratterizzazione istologica, e si ritiene che questi siano effetti collaterali dell'induzione neurale impura a causa della mancanza di fattori di crescita esogeni o morfogeni. Tuttavia, questi dovrebbero essere una popolazione minore e non dovrebbero influenzare la crescita e lo sviluppo dei tessuti neurali.

Tabella a grandezza naturale

Dopo 1 mese, gli organoidi dovrebbero iniziare a presentare una differenziazione neuronale, contrassegnata dall'espressione Tuj1 o DCX (Tabella 2), che porta ad una progressiva espansione e ispessimento dei tessuti cerebrali nei successivi 1-2 mesi (Fig. 4a). In questa fase, sono visibili diverse regioni del cervello (Tabella 2), incluso il cervello anteriore contrassegnato dalla colorazione Foxg1 (Fig. 4b) e il plesso coroideo contrassegnato dalla colorazione TTR (Fig. 4c), che presentano una struttura altamente contorta e morfologia epiteliale cuboidale, così come l'ippocampo contrassegnato dalla colorazione Prox1 e Fzd9 (Fig. 4d). Infine, il cervello anteriore ventrale si colora positivamente per il marker Nkx2.1 (Tabella 2), mentre la retina presenta stratificazione retinica ed epitelio pigmentato.

Image

( a ) Colorazione per neuroni (TUJ1, verde) e progenitori (SOX2, rosso) in un grande tessuto corticale continuo all'interno di un organoide. Nota la zona progenitrice apicale organizzata circondata da neuroni localizzati basalmente. ( b ) Una regione del cervello anteriore di una colorazione organoide positiva per il marker FOXG1 (rosso). ( c ) Il plesso coroideo si colora positivamente per il marker TTR (verde) e mostra epitelio cuboide contorto. ( d ) Le regioni dell'ippocampo si colorano positivamente per i marker PROX1 (verde) e FZD9 (rosso), anche se le cellule non riescono ad organizzarsi spazialmente in giro dentato riconoscibile e regioni CA. ( e ) La colorazione per glia radiale mitotica (P-vimentin (P-vim), verde) in una regione corticale rivela glia radiale interna in fase di mitosi nella membrana apicale (frecce), mentre la glia radiale esterna subisce mitosi al di fuori della zona ventricolare (punte di freccia ). Tutte le glia radiali sono contrassegnate da SOX2 (rosso). ( f ) Colorazione per identità dello strato corticale di organoidi avanzati (75 d). I neuroni di identità dello strato superficiale (SATB2, rosso) di nascita successiva popolano le regioni più superficiali dell'organoide, mentre i neuroni di identità dello strato profondo (CTIP2, verde) di nascita precoce popolano le regioni più profonde dell'organoide. DAPI in a - e etichetta nuclei (blu). I campioni in a - e sono 30–35 d dopo l'inizio del protocollo. Barre di scala, 100 micron ( a, b ) e 50 micron ( c - f ).

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Inoltre, le regioni corticali mostrano evidenza di zone progenitrici tipiche, mostrando una fitta zona ventricolare (VZ) popolata da Sox2 + glia radiale interna (Fig. 4e), mentre la glia radiale esterna, che è anche Sox2 +, risiede al di fuori della VZ. Entrambe le popolazioni si colorano positivamente per la fosfo-vimentina durante la mitosi (Fig. 4e) ma si dividono in diverse posizioni: la glia radiale interna si divide sulla superficie apicale, mentre la glia radiale esterna si divide all'esterno della VZ. I neuroni generati migrano verso l'esterno per formare una pre-piastra; il precursore della placca corticale, contrassegnato da Reelin e Tbr1 (Tabella 2), e progenitori intermedi, contrassegnati da Tbr2, sono visibili nella regione adiacente alla VZ.

Se permesso di svilupparsi ulteriormente, gli organoidi produrranno progressivamente più neuroni, mentre le zone progenitrici si ridurranno e alla fine scompariranno di 5-6 mesi. I tessuti successivi saranno composti principalmente da neuroni completamente differenziati, sebbene non siano state esaminate altre popolazioni come astrociti e oligodenderociti. Le popolazioni di neuroni presenti includono varie identità di strato della piastra corticale 13, 39 (Tabella 2), che mostreranno una separazione rudimentale in distribuzioni di strati profondi e superficiali (Fig. 4f). Tuttavia, i neuroni non mostreranno un'architettura a sei strati come quella vista in vivo . Gli organoidi possono essere ulteriormente mantenuti per oltre 1 anno. Abbiamo mantenuto organoidi per un massimo di 15 mesi. È importante sottolineare che, dopo 6-7 mesi, gli organoidi iniziano a ridursi di dimensioni, a causa della mancanza di progenitori e probabilmente di una progressiva perdita di cellule neuronali.

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