Guidare il destino osteogenico del topo e delle cellule staminali mesenchimali umane attraverso il controllo del sistema di feedback | rapporti scientifici

Guidare il destino osteogenico del topo e delle cellule staminali mesenchimali umane attraverso il controllo del sistema di feedback | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Bioinformatica
  • Screening ad alto rendimento
  • Cellule staminali mesenchimali
  • Ricerca sulle cellule staminali

Astratto

La modellizzazione delle malattie basate sulle cellule staminali offre opportunità uniche per chiarimenti meccanicistici e targeting terapeutico. L'induzione stabile della differenziazione specifica del destino è un prerequisito essenziale per la strategia basata sulle cellule staminali. La proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2) avvia la fosforilazione di Smad regolata dai recettori, portando alla differenziazione osteogenica delle cellule mesenchimali stromali / staminali (MSC) in vitro ; tuttavia, richiede concentrazioni sopra-fisiologiche, presentando un problema di strozzature per lo screening dei farmaci su larga scala. Qui, segnaliamo l'uso di un controllo del sistema di feedback a doppio obiettivo (FSC) con un algoritmo di evoluzione differenziale (DE) per identificare cocktail osteogenici di fattori estrinseci. I cocktail contenenti dosi significativamente ridotte di BMP-2 in combinazione con dosi fisiologicamente rilevanti di desametasone, acido ascorbico, beta-glicerofosfato, eparina, acido retinoico e vitamina D hanno ottenuto una mineralizzazione in vitro accelerata di topo e MSC umana. Questi risultati forniscono informazioni sugli approcci costruttivi dell'FSC per determinare l'ambiente funzionale e fisiologico applicabile per MSC nella modellizzazione delle malattie, screening dei farmaci e ingegneria dei tessuti.

introduzione

Con il recente avvento di rapidi progressi nell'ingegneria delle cellule staminali, la modellizzazione personalizzata delle malattie basate sulle cellule in vitro svolge un ruolo importante per il chiarimento meccanicistico della patologia della malattia e il potenziale screening dei farmaci 1 . Il mesenchimale stromale / cellule staminali (MSC) è un modello prototipico di cellule staminali che esibisce una vasta capacità proliferativa in uno stato senza impegno e una capacità di differenziazione multi-potente 2 . Le MSC sono state utilizzate per la modellizzazione della malattia 3, 4, l'ingegneria dei tessuti 5, 6 o lo screening di farmaci ad alto rendimento 7, 8, in cui la determinazione prevedibile del destino della differenziazione delle cellule staminali attraverso manipolazioni in vitro presenta una strategia chiave. Ad oggi, i cosiddetti "fattori osteogenici convenzionali" 9 sono stati formulati empiricamente, contenenti acido ascorbico e beta-glicerofosfato con / senza desametasone. Inoltre, a questo scopo sono stati esaminati vari fattori di crescita e fattori estrinseci 10, 11, 12, 13 .

L'applicazione della proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2) è stata esplorata per la differenziazione osteogenica in vitro specifica del destino delle cellule staminali. Tuttavia, BMP-2 ha anche dimostrato di differenziare MSC da altri lignaggi, come gli adipociti 14, 15 . La BMP si lega ai recettori putativi e avvia la fosforilazione di Smad regolata dai recettori. Questo evento a valle immediato è stato attivato in modo simile durante il differenziamento osteogenico 16, 17 e adipogenico 18 . I BMP sono fattori di crescita multifunzionali nella super famiglia del fattore di crescita trasformante 19 . È stato dimostrato che l'effetto di BMP-2 può essere modulato attraverso diverse vie di segnalazione, come il sistema Ras / MARK, Hedgehog, cAMP, Notch e Wnt 20, 21 . Pertanto, più cofattori potrebbero interagire con la via di segnalazione BMP-2, contribuendo collettivamente alla differenziazione specifica del destino. Tuttavia, non sono stati determinati i fattori estrinseci che mediano in modo efficace e specifico la differenziazione dell'MSC.

L'obiettivo di questo progetto era esplorare un approccio sistematico e computazionale per la progettazione di un cocktail di fattori estrinseci per raggiungere stabilmente la determinazione del destino osteogenico di MSC. Abbiamo applicato un metodo di controllo del sistema di feedback (FSC), utilizzando un algoritmo di evoluzione differenziale (DE), per derivare cocktail osteogenici senza predisporre ipotesi. I risultati hanno mostrato che FSC ha rapidamente sollecitato soluzioni ottimizzate da numerosi cocktail candidati. Le combinazioni identificate di fattori estrinseci specifici alla concentrazione hanno indotto la differenziazione osteogenica di MSC con grande efficienza. Sorprendentemente, uno dei cocktail efficaci conteneva solo 0, 39 ng / ml BMP-2, rispetto alla concentrazione BMP-2 frequentemente riportata di 100 ng / ml 12, 22, 23, e tuttavia era in grado di attivare la fosforilazione di Smad, con conseguente accelerazione mineralizzazione in vitro di topo clonale e MSC umana primaria.

risultati

Metodo di controllo del sistema di feedback (FSC) che utilizza un algoritmo di evoluzione differenziale (DE)

FSC sollecita rapidamente soluzioni ottimizzate da numerosi candidati con grande efficienza. Contrariamente ai metodi empirici di prova ed errore, la FSC guidata dagli obiettivi prevede quattro passaggi: (1) fissare gli obiettivi fisiologicamente appropriati; (2) selezionare con cautela i fattori variabili; (3) utilizzare un approccio algoritmico stocastico ad alta integrità per ottenere in modo efficiente un'armonizzazione ottimizzata da numerosi candidati; e (4) formulare una discussione comparativa tra i risultati e gli obiettivi fisiologici. Le iterazioni dell'FSC vengono eseguite utilizzando un loop ripetuto dei componenti interdipendenti: la valutazione sperimentale della risposta del sistema biologico sotto stimolazione e un algoritmo di ricerca numerica per prevedere una migliore combinazione farmaco-dosaggio per il successivo test di feedback sperimentale (Figura 1a).

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(a) Controllo del sistema di feedback (FSC) applicato per l'identificazione di molteplici fattori estrinseci combinatori per determinare il destino di differenziazione di MSC. (b) Evoluzione differenziale (DE) utilizzata come algoritmo di ricerca in questo progetto. Ogni colore rappresenta la concentrazione di ciascuno dei sette fattori estrinseci, scelti da una scala che varia da 1 a 10 o da 0 a 12. La combinazione di questi fattori ha portato a 10 7 (10 milioni) o 13 7 (62, 7 milioni) combinazioni teoriche in il presente studio.

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Nel presente studio sono stati determinati due obiettivi fisiologicamente appropriati, o funzioni oggettive: facilitare la differenziazione osteogenica in vitro della MSC e ridurre il dosaggio di BMP-2. Pertanto, abbiamo applicato un metodo FSC a doppio obiettivo per semplificare la ricerca di cocktail appropriati.

Da studi precedenti riguardanti le linee cellulari MSC del midollo osseo di topo, tra cui C3H10T1 / 2, MC3T3-E1, C2C12 o cellule ST2 10, 11, 12, 13 (riferimenti supplementari dei fattori osteogenici), abbiamo selezionato i seguenti fattori estrinseci: BMP-2, glucocorticoide sintetico (desametasone; Dex), acido ascorbico (AA o suo acido ascorbico-2-fosfato derivato; AA2P), beta-glicerofosfato (beta-GP), eparina (Hep), acido retinoico (RA) e 1, 25 ( OH) 2 D 3 (VD3). Alcuni derivati ​​sintetici, invece delle biomolecole intrinseche, sono stati utilizzati in coincidenza con le condizioni di coltura osteogenica convenzionali. Le dosi riportate di ciascun fattore estrinseco variavano in modo significativo (Tabella supplementare S1).

Il mouse MSC (D1 ORL UVA [D1] o cella D1, numero ATCC®: CRL-12424 ™) è stato selezionato come piattaforma MSC multipotente con la capacità di una rapida determinazione del destino osteogenico in vitro 10, 11, 24 . Mezzo di coltura cellulare contenente 2% o 10% di FBS e 1% di antibiotici è stato utilizzato come mezzo di controllo (controllo negativo). Il mezzo di controllo contenente un cocktail di fattori osteogenici tradizionali (AA2P: 50 μM, beta-GP: 10 mM e Dex: 100 nM) con BMP-2 (100 ng / ml) è stato usato come controllo positivo (di seguito indicato come cocktail TB ). Per identificare i fattori combinatori ottimali, le dosi di incremento logaritmico all'interno dell'intervallo di dosi precedentemente pubblicato di ciascun fattore estrinseco sono state determinate e descritte come codice (Tabella 1). Di conseguenza, questi 7 fattori e livelli di dose da 1 a 10 o livelli di dose da 0 a 12 hanno generato combinazioni teoriche da 10 7 (10, 0 milioni) a 13 7 (62, 7 milioni).

Tabella a grandezza naturale

In questo progetto è stato utilizzato un algoritmo DE stocastico ad alta integrità. L'algoritmo DE ottimizza i problemi attraverso miglioramenti iterativi nelle soluzioni candidate per quanto riguarda una determinata misura della qualità. Inoltre, questo algoritmo imita l'evoluzione biologica naturale. Nel presente studio, è stato eseguito il seguente processo: Inizialmente, sono stati generati N (= 10-14) cocktail arbitrari di droga (fase 1). Per ogni cocktail di droga, è stato generato un cocktail di droga mutato secondo una serie di formule matematiche (passaggio 2). Successivamente, il cocktail di droga iniziale e il cocktail di droga mutato sono stati incrociati per produrre un cocktail di crossover (passaggio 3), qui indicato come "cocktail di test di droga" per enfatizzare il suo ruolo nella competizione con il cocktail di droga originale. Su un confronto sperimentale tra il cocktail di droga originale e di prova, il cocktail che ha prodotto risultati di sistema migliori (ad es. Attività ALP o indice di mineralizzazione; vedi sotto) è stato selezionato e utilizzato nella successiva iterazione (passaggio 4). Dopo che tutti i cocktail di droga iniziali sono stati sottoposti a mutazione (passaggio 2), crossover (passaggio 3) e selezione (passaggio 4), la prima iterazione è stata completata. I passaggi da 2 a 4 sono stati ripetuti fino all'identificazione dei cocktail di droga desiderati (Figura 1b). Inoltre, tra le iterazioni, è stato aggiunto l'algoritmo di "selezione" per preferire il cocktail candidato contenente concentrazioni inferiori di BMP-2 (Figura 1b).

FSC con dosaggio di fosfatasi alcalina

Abbiamo prima selezionato l'espressione della fosfatasi alcalina (ALP), un noto biomarcatore osteogenico, come una delle funzioni oggettive dell'FSC. Abbiamo costruito il seguente circuito di feedback: 1) generare il cocktail iniziale con una raccolta di fattori estrinseci a dosaggi arbitrariamente selezionati; 2) applicare il cocktail a MSC in vitro per 3 giorni; 3) eseguire il test di espressione ALP; e 4) generare una serie di nuove combinazioni migliorate attraverso un algoritmo di ricerca DE per stimolare il sistema biologico nella prossima iterazione.

Dopo 9 iterazioni con 20 cocktail testati in ciascuna iterazione, 8 cocktail tra i 180 cocktail differiti (90 cocktail effettivi) hanno aumentato significativamente l'espressione di ALP nelle cellule D1 dopo 3 giorni, nonostante un dosaggio BMP-2 inferiore. Tuttavia, quando testato per la mineralizzazione in vitro , nessuno di questi 8 cocktail ha prodotto una notevole precipitazione di Ca 2+ (Figura 2a), indicando che i cocktail identificati non hanno indotto la differenziazione osteogenica dell'MSC. Le variazioni della dose lungo il corso di iterazione dell'FSC indicavano che l'espressione di ALP era associata ad un aumento delle concentrazioni di RA (Figura supplementare S1a). Infatti, il 70% dei cocktail generati durante l'FSC, usando l'espressione ALP come funzione obiettivo, conteneva le prime 2 concentrazioni massime di RA (Figura 2b). È stato anche mostrato che la linea cellulare fibroblastica di topo adulto, L929 (cellula NCTC clone 929, numero ATCC®: CCL-1 ™), induce l'espressione di ALP con uno dei cocktail candidati rappresentativi.

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(a) Effetto di potenziali cocktail di farmaci identificati con FSC-DE con dosaggio ALP da 10 milioni di potenziali candidati per l'osteoblastogenesi delle cellule D1. I potenziali cocktail non hanno indotto la mineralizzazione in vitro , nonostante l'alta attività di ALP. (b) Correlazione tra dosi di fattori estrinseci in ciascun cocktail di farmaco suscitato e utilizzato in FSC-DE con dosaggio ALP contro l'espressione di ALP nelle cellule D1. Punti: ogni cocktail di droga. Tutti i dati rappresentano i valori di misurazione effettivi nel processo FSC-DE. I codici di concentrazione più alta 9 e 10 di RA sono stati coinvolti nel 70% di tutti i cocktail generati da FSC. Le cellule D1 sono state seminate a 3125 / cm 2 e l'attività ALP è stata misurata il giorno 3. Si noti che i potenziali cocktail di droga nella Figura 2a sono stati ristretti utilizzando gate con i seguenti criteri: codice BMP-2 inferiore a 9 e attività ALP sopra 1.5. (a, b) I grafici a barre e i punti mostrano la media con / senza sd di tre determinazioni indipendenti. Ogni concentrazione di fattori estrinseci rappresenta quella contenuta nei cocktail di droga e non include quella nell'FBS.

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Quando l'AR è stata rimossa dal cocktail, l'espressione di ALP nelle cellule D1 e L929 è stata completamente abolita, mentre la rimozione di BMP-2 o VD3 non ha avuto alcun effetto (Figura complementare S1b). Pertanto, la maggiore espressione di ALP in MSC e fibroblasti rifletteva un'alta dose di RA nei cocktail identificati, che ovviamente non riusciva a dirigere la differenziazione osteogenica. In particolare, questo esperimento ha dimostrato un'osservazione non intenzionale che FSC era in effetti in grado di identificare rapidamente il cocktail ottimale per la funzione obiettiva dell'espressione di ALP, in cui le dosi di RA si avvicinavano a dosi elevate solo dopo diverse iterazioni. Tuttavia, i cocktail FSC identificati non hanno raggiunto l'obiettivo fisiologico di indurre la differenziazione osteogenica MSC.

FSC con test di mineralizzazione in vitro

Abbiamo selezionato la mineralizzazione in vitro come funzione obiettivo nel secondo esperimento, in base alla misurazione del livello di precipitazione di Ca 2+ nei pozzetti del giorno 7. In questa ricerca, abbiamo esaminato 24 cocktail di farmaci per iterazione. Attraverso 9 iterazioni, FSC ha generato un totale differito di 216 cocktail (100 cocktail effettivi). Quattordici cocktail hanno dimostrato precipitazione di Ca 2+ in vitro entro 7 giorni, raggiungendo oltre il 50% dell'indice di mineralizzazione (precipitazione di Ca 2+ nella coltura cellulare D1 contenente un dato cocktail per quello con TB) (Figura 3a e Figura S2 supplementare). Quattro di questi cocktail di droga contenevano un dosaggio BMP-2 del 12, 5% o inferiore rispetto a quello della TB, ma questi cocktail erano in grado di indurre la mineralizzazione in vitro , anche in condizioni di semina cellulare diluite (Figura 3b).

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(a) Disposizione dei cocktail di droga nell'ordine di ciascun indice di mineralizzazione. La linea di interruzione rappresenta l'indice di mineralizzazione soglia di 0, 5. Le cellule D1 sono state seminate a 45.000 / cm 2 ; una volta che le cellule erano confluenti, i media sono stati cambiati in media basali e successivamente cambiati in media contenenti ciascun cocktail di droga. Il contenuto di Ca 2+ è stato misurato il giorno 7. (b) Test di mineralizzazione usando i potenziali cocktail all'interno della porta successiva e la condizione di semina cellulare diluita. Le cellule D1 sono state seminate a 3125 / cm 2 ; i media sono stati cambiati in media contenenti ciascun cocktail di droghe il giorno 1 e il contenuto di Ca 2+ nel pozzo è stato misurato il giorno 15. Cancello: codice BMP-2 inferiore a 8 e indice di mineralizzazione superiore a 0, 5. (c) Correlazione tra le dosi dei fattori estrinseci in ciascun cocktail di farmaci con l'indice di mineralizzazione. Punti: ogni cocktail di droga suscitato e utilizzato in FSC-DE con saggio di mineralizzazione. Tutti i dati rappresentano i valori di misurazione effettivi nel processo FSC-DE. I punti mostrano la media di tre determinazioni indipendenti. R: coefficiente di correlazione. Linea: correlazione lineare. (d) L'effetto delle modifiche di VD3 in m8T11. Grafico a barre: saggio di mineralizzazione quantitativa con m8T11 originale (codice VD3 2) e m8T11 modificato (codice VD3 5 e 7). Le cellule D1 sono state seminate a 45.000 / cm 2 ; una volta che le cellule erano confluenti, i media sono stati cambiati in media basali e successivamente cambiati in media contenenti ciascun cocktail di droga. L'area mineralizzata è stata misurata il giorno 7. **: P <0, 01 (ANOVA con test di Dunnett). Immagini rappresentative Alizarin macchiate di rosso. (a, b, d) I grafici a barre mostrano la media con / senza sd di tre determinazioni indipendenti. Ogni concentrazione di fattori estrinseci rappresenta quella contenuta nei cocktail di droga e non include quella nell'FBS.

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L'indice di mineralizzazione era positivamente correlato all'aumento delle concentrazioni di AA2P e beta-GP e inversamente correlato con RA, Hep e VD3. Tuttavia, BMP-2 e Dex, potenti fattori osteogenici, non hanno mostrato correlazioni evidenti (Figura 3c). Quando sono state introdotte piccole variazioni delle dosi di VD3, la capacità osteogena di uno dei cocktail FSC, m8T11, è stata compromessa (Figura 3d), suggerendo che le dosi identificate di ciascun fattore potrebbero svolgere un ruolo unico nella differenziazione osteogenica di MSC.

Caratterizzazione dei cocktail identificati

I cocktail rappresentativi m8T11 e m4T5 (Tabella 2) sono stati selezionati per ulteriori approfondimenti. La reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa in tempo reale basata su Taqman (RT-PCR) ha mostrato che sia TB che m8T11 hanno indotto l'espressione precoce di Runx2 e Osx (Giorno 1) e l'espressione ritardata di osteocalcina ( Ocn ) (Giorno 7) (Figura 4a ). Il cocktail m4T5 ha anche indotto Runx2 e Osx , sebbene con un diverso schema di espressione. L'espressione di ALP sovraregolata (Figura 4b) e la mancanza di effetto sui fibroblasti L929 (Figura complementare S3) hanno inoltre suggerito che questi cocktail hanno raggiunto la determinazione del destino osteogenico di MSC.

Tabella a grandezza naturale

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(a) reazione a catena della polimerasi per trascrizione inversa in tempo reale basata su Taqman per Runx2, Osx e Ocn. **: p <0, 01 rispetto al controllo (ANOVA con un test di Dunnett). (b) Espressione ALP nel pozzo misurata il giorno 7. *: p <0, 05 e **: p <0, 01 rispetto al controllo (ANOVA con un test di Dunnett). (c) Colorazione rosso alizarina delle cellule D1 trattate con cocktail di droga con / senza i seguenti inibitori: 500 ng / ml di Noggin e 5 μM di Dorsomorfina (Dorso). La matrice mineralizzata è stata colorata con Alizarin rosso S il giorno 7. (d) Saggio di mineralizzazione quantitativa con inibitori della via BMP-SMAD. **: p <0, 01 rispetto a ciascun inibitore (-) (ANOVA con test di Dunnett). (e) Effetto dei cocktail di droga sull'espressione di mRNA di Bmp2, Bmpr2 e Bmpr1A. *: p <0, 05 e **: p <0, 01 rispetto al controllo (ANOVA con un test di Dunnett). In tutti gli esperimenti, le cellule D1 sono state seminate a 45.000 / cm 2 ; una volta che le cellule sono diventate confluenti, i media sono stati cambiati in media basali e successivamente cambiati in media contenenti ciascun cocktail di droga. I grafici a barre mostrano la media con sd di tre determinazioni indipendenti.

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I BMP sono fattori estrinseci che si legano ai loro recettori putativi e avviano la fosforilazione degli Smads 16 regolati dal recettore, che è fondamentale per la differenziazione osteogenica delle cellule staminali 25, 26 . La dose di BMP-2 (codice 2, 0, 39 ng / ml) nel cocktail m8T11 era solo 1/256 di quella in TB (100 ng / ml). Pertanto, abbiamo esaminato se i media contenenti cocktail m4T5 e m8T11 hanno avviato la via di segnalazione BMP-Smad utilizzando molecole antagoniste: Noggin, che interferisce con l'associazione dei recettori dei ligandi della famiglia TGF-beta, inclusi i BMP; e Dorsomorphin (Dorso), che blocca l'attivazione di Smad mediata da BMP 27 .

Qualitativamente, il trattamento con Noggin ha ridotto selettivamente le piccole aree rosso-positive di Alizarin, rivelando schemi trabecolari (Figura 4c). Entrambi i trattamenti Noggin e Dorso hanno ridotto significativamente la mineralizzazione in vitro dei media contenenti cocktail TB e m4T5 (Figura 4c, d). Tuttavia, i comportamenti MSC con supporto m8T11 erano diversi. La significativa attenuazione della mineralizzazione in vitro indotta da m8T11 è stata ottenuta solo con Dorso, ma non con Noggin (Figura 4c, d). BMP-2 si lega al recettore ad alta affinità, recettore BMP di tipo I (BMPR1), e successivamente recluta BMPR2, con conseguente formazione di un eterodimero del recettore o oligomero 16 . RT-PCR ha rivelato l'aumento precoce e l'espressione prolungata di Bmp-2 endogeno e dei suoi recettori, Bmpr1A e Bmpr2 , con terreno m8T11. I media TB e m4T5 hanno mostrato un aumento tardivo dell'espressione di Bmp-2 e dei suoi recettori (Figura 4e).

Differenziazione del destino osteogenico della MSC umana primaria con m8T11

Abbiamo studiato se i cocktail m4T5 e m8T11 erano anche efficaci per la differenziazione osteogenica della MSC umana primaria (hMSC) (Figura 5). Coerentemente con i risultati ottenuti con le cellule D1 MSC di topo, abbiamo osservato che il cocktail m8T11 induceva efficacemente la mineralizzazione in vitro nell'hMSC primario, mentre il cocktail m4T5 non lo faceva (Figura 5a, 5b). Il mezzo osteogenico convenzionale rappresentativo contenente 250 μM di AA2P, 10 mM beta-GP e 10 o 100 nM Dex (Conv-OM) è stato meno efficace del cocktail m8T11 nell'indurre la mineralizzazione in vitro dell'hMSC.

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(a) Culture MSC umane colorate con alizarina trattate con TB (contenente 100 ng / mL BMP-2), cocktail FSC m4T5 o m8T11 o mezzi osteogenici convenzionali (Conv-OM: contenente 10 nM o 100 nM Dex). Il giorno della cultura 15, il cocktail m8T11 ha indotto noduli mineralizzati rosso-positivi alizarina, mentre m4T5 no. (b) La misurazione dell'area rossa positiva alizarina (escluso l'anello periferico) ha suggerito che l'effetto di m8T11 sulla differenziazione osteogenica della MSC umana era circa il 50% di quello con TB e maggiore del 300% con Conv-OM.

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Discussione

Questo studio ha dimostrato l'uso di una tecnica FSC a doppio obiettivo per la rapida identificazione di combinazioni di integratori che mostrano la versatile differenziazione osteogena di MSC. La strategia FSC è stata precedentemente utilizzata per sradicare le infezioni virali 28, controllare la riattivazione del virus dell'herpes 29 e mantenere le cellule ES umane 30 . Questo metodo facilita l'identificazione di combinazioni farmacologiche ottimali senza ipotesi predisponenti. Un recente studio ha riportato la selezione involontaria di cocktail di farmaci mediati da FSC contenenti principalmente ribavirina ad alte dosi usando fibroblasti NIH3T3 infetti da HSV-1 come modello di test biologico. Allo stesso modo abbiamo sperimentato che le iterazioni di FSC usando l'espressione di ALP come modello di dosaggio biologico convergono l'AR ad alto dosaggio come singolo fattore efficace. Tuttavia, nel presente studio, questi cocktail di FSC non hanno indotto l'esito fisiologico previsto della differenziazione osteogena di MSC. Questi risultati sottolineano la solida efficacia dell'FSC ma indicano i limiti di questa strategia a causa della sensibilità e della dipendenza sproporzionata dal disegno del dosaggio biologico.

Usando la mineralizzazione in vitro come funzione obiettivo alternativa, abbiamo identificato con successo due combinazioni di fattori estrinseci, m4T5 e m8T11. La formula di FSC sviluppata per il presente studio includeva il comando con il "codice 0" o esclusione del fattore putativo. Questo meccanismo incorporato ha facilitato l'eliminazione di componenti che non hanno contribuito al risultato biologico. In effetti, i cocktail FSC identificati, m4T5 e m8T11, non contenevano RA (Tabella 2), che induceva un'espressione artificiale di ALP. In particolare, sia m4T5 che m8T11 hanno indotto l'espressione di ALP senza RA (Figura 4b), indicando la differenziazione osteogena di MSC.

Topi mutanti privi di Runx2 31, 32 o osterix ( Osx ) 33 hanno dimostrato di mostrare l'arresto completo della formazione ossea, suggerendo che questi fattori intrinseci determinano il destino osteogenico. Inoltre, la trascrizione genica della molecola specifica dell'osteoblast, l'osteocalcina ( Ocn ), è regolata attraverso Runx2 e Osx 34 . L' upregolazione precoce di Runx2 e Osx è stata utilizzata come indicatore di differenziazione osteogenica. Il cocktail m8T11 ha dimostrato un modello sequenziale di espressione genica associato alla differenziazione osteogena, mentre m4T5 ha ritardato l'espressione genica attesa (Figura 4a).

In particolare, m4T5 e m8T11 contenevano rispettivamente 12, 5 e 0, 39 ng / mL di BMP-2, rispetto alla concentrazione di BMP-2 da 100 ng / mL comunemente riportata per gli studi in vitro 12, 22, 23 (Tabella 2). Considerando livelli sierici di BMP-2 di 1, 0 ng / mL o 0, 09 ng / mL nei topi e nell'uomo, rispettivamente, i cocktail FSC utilizzati nel presente studio rappresentano un ambiente più fisiologico rispetto alle condizioni osteogeniche precedentemente riportate. BMP-2 e BMP-7 sono stati accettati per la commercializzazione a supporto della formazione ossea ectopica e della riparazione ossea 35 . Gli studi hanno dimostrato che la dose sopra-fisiologica di BMP-2 (1, 5 mg / mL) richiesta per ottenere un effetto terapeutico è stata associata, in parte, a costi sanitari elevati e possibili effetti collaterali gravi che potrebbero limitare un più ampio uso clinico 36 . L'attuale iterazione dell'FSC ha dimostrato che si è verificata una mineralizzazione in vitro , indipendentemente dalla concentrazione di BMP-2 (Figura 3c). Ulteriore caratterizzazione di m4T5 e m8T11 ha dimostrato l'attivazione della cascata Smad regolata dal recettore BMP-2 (Figura 4c e 4d), suggerendo che BMP-2 ha suscitato gli effetti attesi, nonostante basse concentrazioni.

Gli studi che hanno valutato l'efficacia di BMP e Dex hanno dimostrato che i roditori e la MSC umana hanno risposto in modo diverso agli ambienti di differenziazione osteogena in vitro 37, 38 . Nel presente studio, abbiamo anche osservato l'efficacia differenziale dei cocktail FSC sulla differenziazione osteogena della MSC umana. Mentre sia m4T5 che m8T11 contenevano BMP-2, solo m8T11 ha indotto la mineralizzazione in vitro della MSC umana (Figura 5). Il cocktail m8T11 conteneva le molecole extracellulari, Hep e VD3 (Tabella 2). Hep potrebbe proteggere BMP-2 da Noggin e supportare la differenziazione osteogenica 13 derivata da BMP-2, che potrebbe spiegare parzialmente l'inefficacia di Noggin in m8T11. Il solo VD3 39 o la combinazione di VD3 e BMP-2 40 hanno dimostrato di aumentare l' espressione di Ocn , mentre un'analisi di microarray di immunoprecipitazione della cromatina di MSC ha rivelato che il rimodellamento della cromatina derivata dal VDR potrebbe sopprimere la trascrizione del gene 41, 42 . È altamente ipotizzabile che l'effetto del VD3 sulla differenziazione osteogenica possa essere sensibile alla dose.

La dose di fattori estrinseci nel mezzo contenente cocktail m8T11 con FBS era vicina all'intervallo di concentrazioni fisiologiche osservate nel siero di topo e umano (Tabella 2). Considerando che i cocktail identificati contengono derivati ​​anziché biomolecole e mancano di vari altri fattori estrinseci, potrebbe essere possibile ricostruire in vivo questo fenomeno osteogenico biologico intatto. Tuttavia, i cocktail appena identificati potrebbero fornire una nuova opportunità per chiarire i meccanismi molecolari della differenziazione osteogenica di MSC in un contesto fisiologicamente rilevante.

Il recente sviluppo del potenziale uso di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) dovrebbe ampliare l'applicazione della modellizzazione della malattia basata sulle cellule staminali 43, 44, 45 . Ad esempio, è stato dimostrato che la BMP induce l'ossificazione ectopica che porta all'aterosclerosi 46 . Le dosi significativamente ridotte di BMP-2 nei cocktail identificati e nell'ambiente quasi fisiologico potrebbero contribuire alla modellizzazione della calcificazione delle cellule vascolari senza confondere potenzialmente la reazione proinfiammatoria derivata dal BMP-2 47 .

In conclusione, nel presente studio, abbiamo dimostrato l'uso di un FSC per la rapida identificazione delle combinazioni di integratori di colture cellulari che presentano differenziazione osteogenica indotta da BMP attraverso fattori estrinseci. Il risultato di questo studio potrebbe fornire una base per la modellizzazione della malattia basata sulle cellule staminali e lo sviluppo di farmaci putativi usando uno screening ad alto rendimento.

metodi

Manutenzione delle celle

La linea MSC del mouse (D1 ORL UVA [D1], cellula D1, CRL-12424), derivata dal midollo osseo, e la linea cellulare fibroblastica del topo (cellula NCTC clone 929, cellula L-929, CCL-1), derivata da sottocutanea tessuto connettivo, sono stati acquistati dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Le cellule D1 presentano marcatori di superficie MSC specifici e sono in grado di sviluppare differenziazione osteogena, condrogenica e adipogenica 24 . Le linee cellulari sono state mantenute alla subconfluenza nel mezzo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 1% di antibiotici in un incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C. Le cellule sono state utilizzate per i test nei passaggi da 3 a 6. Gli hMSC primari, ottenuti dal normale midollo osseo umano, sono stati acquistati commercialmente da Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville, MD, USA, n. Di prodotto PT-2501). Le cellule sono state mantenute alla subconfluenza nel terreno di crescita MSCGMTM (Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD, USA) in un incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C. Secondo le istruzioni del produttore, le celle al passaggio 3 (non superiore al passaggio 5) sono state utilizzate per i test.

Preparazione di cocktail di droga

Acido ascorbico (AA) o acido ascorbico 2 fosfato (AA2P), beta-glicerofosfato (beta-GP), desametasone (Dex), acido retinoico (RA) ed eparina (Hep) sono stati acquistati presso Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, STATI UNITI D'AMERICA). 1, 25 (OH) 2 D 3 (VD3) è stato ottenuto da EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ, USA). Il BMP-2 umano ricombinante è stato ottenuto da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) e PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). BMP-2 e gli altri sei ingredienti a varie concentrazioni sono stati miscelati in DMEM contenente 1% di antibiotici e FBS (2% per cellule D1 e L929, 10% per hMSC) e queste miscele sono state utilizzate come prototipi per i media contenenti cocktail di droga . Il codice degli ingredienti rappresenta la concentrazione di ciascun reagente nei cocktail di droga (Tabella 1).

Analisi quantitativa dell'attività ALP

L'attività ALP è stata determinata con un dosaggio colorimetrico biochimico. Le cellule sono state brevemente lavate con PBS e lisate con tampone RIPA. L'attività enzimatica di ALP nel lisato è stata analizzata misurando il p- nitrofenolo formato dall'idrolisi enzimatica del p- nitrofenilfosfato, come substrato, a 405 nm. In alcuni casi, i dati ALP sono stati normalizzati rispetto alla quantità totale di proteine ​​misurata utilizzando il kit di reagenti per il dosaggio delle proteine ​​BCA (Pierce, Rockford, IL, USA).

PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale proveniente da colture cellulari D1 è stato isolato utilizzando il mini kit RNeasy Plus (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). I livelli di mRNA allo stato stazionario sono stati determinati mediante PCR in tempo reale basata su TaqMan utilizzando il saggio Taqman Gene Expression con le seguenti combinazioni sonda / primer: Runx2 , Mm03003491_m1; Osx , Mm04209856_m1; proteina contenente acido gamma-carbossiglutammico osseo (osteocalcina: Ocn ), Mm03413826_mH; Bmp2 , Mm01340178_m1; Bmpr1A , Mm00477650_m1; e Bmpr2 , Mm00432134_m1, Gapdh , Mm99999915_g1. I livelli di espressione dell'mRNA sono stati normalizzati utilizzando il metodo CT comparativo.

Saggio quantitativo Ca 2+ e indice di mineralizzazione

L'accumulo di Ca 2+ in ciascun pozzetto è stato valutato come grado di mineralizzazione. Le cellule sono state lavate due volte con PBS e decalcificate con HCl 0, 5 N, e le piastre di coltura cellulare sono state ruotate per 4 ore a 4 ° C. Il contenuto di Ca 2+ nel surnatante è stato stimato rispetto allo standard fornito nel kit LiquiColor (Stanbio Laboratories, Boerne, Texas, USA). La reazione tra Ca 2+ e complesso orto-cresolftaleinico produce un complesso viola misurato a 550 nm e l'intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di calcio nel campione. DMEM basale con FBS e antibiotici sono stati utilizzati come mezzo di controllo (controllo negativo). TB: Mezzo di controllo contenente fattori osteogenici tradizionali (50 μM AA2P, 10 mM beta-GP e 100 nM Dex) con BMP-2 ad alte dosi (100 ng / ml) come riferimento. Gli indici di mineralizzazione sono stati calcolati utilizzando la quantità di accumulo di Ca 2+ indotta dai campioni per quelli di TB.

Colorazione rosso alizarina

Per valutare i noduli ossei mineralizzati, le cellule coltivate sono state colorate con rosso alizarina S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Gli strati cellulari sono stati fissati in etanolo assoluto per 10 minuti, lavati con ddH 2 O e colorati con 1% di rosso di alizarina S. Dopo 30 minuti, gli strati cellulari sono stati ripetutamente lavati con ddH 2 O. Le immagini sono state catturate con una Canon A495 telecamera. Le parti centrali prescritte dei pozzetti sono state scansionate e analizzate utilizzando il software Image J per quantificare la percentuale media di area di mineralizzazione rispetto alla superficie (ovvero, i bordi dei pozzi sono stati esclusi da questo calcolo).

Inibitori della via di segnalazione BMP / SMAD

Murine Noggin è stato acquistato da Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA). Dorsomorphin (Dorso) è stato ottenuto da Calbiochem (San Diego, CA, USA). Le cellule sono state trattate con cocktail di farmaci contenenti 500 ng / ml di noggin o 5 μM di Dorso per determinare se la via di segnalazione BMP-SMAD è coinvolta nell'osteoblastogenesi indotta attraverso i cocktail di farmaci.

Feedback system control (FSC) con algoritmo di evoluzione differenziale (DE)

L'FSC è stato eseguito come segue: le cellule D1 sono state stimolate con diversi cocktail di droga. Il livello di attività ALP o indice minerale è stato misurato e utilizzato come funzione obiettiva per osservare l'effetto osteogenico di ciascun cocktail di farmaci. I risultati sono stati inseriti nell'algoritmo di ricerca stocastica di DE, che ha suscitato la composizione dei nuovi candidati cocktail di farmaci per il prossimo biotest. Il software MATLAB (MathWorks Inc., Natick, MA, USA) è stato utilizzato per codificare l'algoritmo DE, in cui ogni cocktail di droga era rappresentato come un vettore. Abbiamo usato un dosaggio codificato invece della concentrazione assoluta. I nuovi cocktail di droga sono stati preparati manualmente e utilizzati per eseguire il successivo biotest e questo processo è stato ripetuto fino a quando non sono stati ottenuti i cocktail di droga ottimali.

analisi statistica

Il significato statistico è stato valutato utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza, seguita dal test comparativo multiplo di Dunnett. Per il calcolo è stato utilizzato il pacchetto statistico del software Microsoft Excel.

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