Identificazione di una nuova mutazione senza senso nel dominio della verga di gfap associata alla malattia di alexander | rivista europea di genetica umana

Identificazione di una nuova mutazione senza senso nel dominio della verga di gfap associata alla malattia di alexander | rivista europea di genetica umana

Anonim

Soggetti

  • Genetica delle malattie
  • Mutazione
  • Malattie neurodegenerative

Astratto

La malattia di Alexander (AxD) è un'astrogliopatia che colpisce principalmente la sostanza bianca del sistema nervoso centrale (SNC). AxD è causato da mutazioni in un gene che codifica GFAP (proteina acida fibrillare gliale). È stato riportato che le mutazioni GFAP in AxD agiscono in modo da guadagno di funzione in parte perché le mutazioni identificate generano GFAP praticamente a lunghezza intera. Abbiamo trovato una nuova mutazione senza senso (c.1000 G> T, p. (Glu312Ter); anche chiamata p. (E312 *)) all'interno di un dominio rod di GFAP in un uomo coreano di 67 anni con una storia di compromissione della memoria e leucoencefalopatia. Questa mutazione, GFAP p. (E312 *), rimuove parte del dominio dell'asta 2B e l'intero dominio della coda dal GFAP. Abbiamo caratterizzato GFAP p. (E312 *) utilizzando Western Blotting, test di assemblaggio e sedimentazione in vitro e trasfezione transitoria delle cellule SW13 (Vim + ) del carcinoma della corteccia surrenale umana con plasmidi che codificano GFAP p. (E312 *). La proteina GFAP p. (E312 *), da sola o in combinazione con GFAP di tipo selvaggio, ha suscitato l'autoaggregazione. Inoltre, il GFAP p. (E312 *) assemblato aggregato in strutture simili a paracristalli e il GFAP p. (E312 *) hanno suscitato più aggregazione GFAP rispetto al GFAP di tipo selvatico nelle cellule SW13 (Vim + ) del carcinoma della corteccia surrenale umana. I nostri risultati sono il primo rapporto, per quanto a nostra conoscenza, su questa nuova mutazione senza senso di GFAP che è associata all'AxD e alla formazione di paracristalli.

introduzione

Malattia di Alexander (AxD; Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) # 203450), una malattia neurodegenerativa, è un'astrogliopatia che provoca principalmente la sostanza bianca del sistema nervoso centrale (SNC). 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Una caratteristica patologica di AxD è la presenza di fibre di Rosenthal che sono inclusioni eosinofiliche omogenee colorate con ematossilina ed eosina. È stato riportato che le fibre di rosenthal possiedono GFAP (proteina acida fibrillare gliare), α -B-cristallina e proteina da shock termico 27 ​​(HSP-27). Tuttavia, la composizione completa delle fibre di Rosenthal rimane indefinita. 2, 6 Messing e colleghi 8 hanno riferito nel 2001 che l'AxD era causato da mutazioni nel GFAP che codifica per un filamento intermedio di tipo III (IF) trovato principalmente negli astrociti con il sistema nervoso centrale. Il GFAP è costituito da una testa N-terminale, un'asta α-elicoidale centrale e un dominio di coda del terminale C 9 (Figura 1) e ha diverse isoforme tra cui α , δ , κ , Δ 135, Δ 164 e Δ exon6. 10 Inoltre, Messing e colleghi 8 hanno suggerito che le mutazioni di GFAP in AxD agiscono in modo funzionale poiché il fenotipo del topo null Gfap non era simile ai segni dei pazienti con AxD. La maggior parte delle mutazioni GFAP identificate nell'AxD sono mutazioni eterozigoti, sporadiche e missenso. 6, 11, 12

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Profili radiologici e genetici del probando. ( a, b ) Le immagini di risonanza magnetica assiale del fluido assiale attenuato (FLAIR)-risonanza cerebrale mostrano ampie lesioni bilaterali, iperintense in capsule esterne, periventricolare ( a ) e sostanze bianche cerebrali profonde ( b ). ( c ) Un'immagine FLAIR sagittale non mostra alterazioni atrofiche o anomalie del segnale nel midollo allungato e nel midollo cervicale superiore. ( d ) Un'immagine FLAIR assiale mostra intensità di segnale simili a ghirlande lungo il rivestimento del bordo esterno dei ventricoli laterali (frecce). ( e, f ) analisi della sequenza del DNA del GFAP . Le frecce indicano c.1000G. ( e ) L'elettroferogramma del probando rivela una sostituzione G-to-T eterozigote precedentemente non segnalata nella posizione 934 del GFAP ( c. 1000G> T, p. E312Ter; Ter rappresenta un codone Stop). ( f ) Elettroferogramma rappresentativo del GFAP in 200 soggetti di controllo. ( g ) Illustrazione schematica del GFAP umano. I numeri dei residui di amminoacidi sono conformi a BC013596 (numero di accessi NCBI). L'asterisco indica la mutazione p. (E312 *). Non disegnato in scala. ( h ) Analisi Western blotting della proteina GFAP p. (E312 *). Le cellule HEK293T sono state trasfettate con plasmide codificante GFAP p. (E312 *) ed elaborate per WB con tre diversi anticorpi anti-GFAP. L'anticorpo 1 è stato aumentato contro l'intero GFAP e gli anticorpi 2 e 3 sono stati aumentati contro la metà C-terminale di GFAP. C, E312 * e WT indicano rispettivamente cellule non trasfettate, GFAP p. (E312 *) e WT GFAP. β -Actin è stato usato come controllo di caricamento. L'asterisco rappresenta il prodotto di degradazione di GFAP. I numeri a destra sono il peso molecolare degli standard proteici in kDa.

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Sulla base dell'analisi statistica di 215 casi di AxD, Vanderver e colleghi 13 hanno proposto nel 2011 un nuovo sistema di classificazione per questa malattia. Nel nuovo sistema, l'AxD di tipo I presenta esordio precoce (AAO), convulsioni, macrocefalia, encefalopatia, deterioramento parossistico, ritardo della crescita, ritardo dello sviluppo e tipiche immagini di risonanza magnetica cerebrale (MRI). L'AxD di tipo II, d'altra parte, mostra un ampio AAO, disfunzione autonomica, sintomi bulbari, anomalie del movimento oculare, mioclono palatale e reperti di risonanza magnetica atipica ed è spesso negativo per deficit neurocognitivi o dello sviluppo. 13

I workup diagnostici di AxD includono la rilevazione della storia, l'esame fisico, la risonanza magnetica cerebrale, il sequenziamento della GFAP e una biopsia cerebrale. Di questi workup, il sequenziamento GFAP e la biopsia cerebrale sono più conclusivi. 2, 12

Abbiamo visto un paziente che presentava una compromissione della memoria, estese iperintensità della sostanza bianca cerebrale con anomalie del segnale periventricolare simili a ghirlande sulle immagini RM cerebrali e una mutazione senza senso in un dominio di asta 2B del GFAP (c.1000 G> T, p (Glu312Ter); anche chiamato p. (E312 *)). Per verificare se la mutazione sta causando la malattia, abbiamo deciso di determinare se la proteina GFAP p. (E312 *) ha causato l'aggregazione.

risultati

Risultati clinici

Abbiamo cercato di diagnosticare definitivamente la malattia nel probando con una diagnosi provvisoria di leucoencefalopatia acquisita. Tra le leucoencefalopatie, sono state escluse le malattie demielinizzanti del SNC acquisite, tra cui sclerosi multipla, leucoencefalopatia tossica, leucoencefalopatia multifocale progressiva e leucoencefalopatia ipertensiva, dato il decorso clinico stabile della probanda, caratteristiche di risonanza magnetica irreversibili e non storia di ipertensione, ingestione di sostanze tossiche o tossiche da avvelenamento. Inoltre, tra le leucoencefalopatie ereditarie, sia l'adrenoleucodistrofia che la leucodistrofia metacromatica sono state escluse anche a causa di test sierologici negativi per acidi grassi a catena molto lunga e arilsolfatasi A, rispettivamente.

Un'altra leucoencefalopatia ereditaria, CADASIL (arteriopatia cerebrale autosomica dominante con infarti subcorticali e leucoencefalopatia), è stata inizialmente considerata come una diagnosi a causa della storia di proband di mal di testa cronico e il coinvolgimento di entrambe le capsule esterne sull'immagine MR del cervello (Figura 1a). Tuttavia, l'accumulo di Notch3 nella parete del vaso, una delle caratteristiche diagnostiche tipiche di CADASIL, non era evidente in seguito all'immunocolorazione della biopsia cutanea con l'anticorpo monoclonale Notch3. 20, 21 Inoltre, anche l'analisi delle mutazioni di tutti e 33 gli esoni codificanti e i confini esone-introne di Notch 3 era negativa, escludendo così CADASIL come diagnosi.

Le immagini RM del cervello della probanda all'età di 67 anni mostravano estese iperintensità bilaterali nella sostanza bianca periventricolare e profonda (Figura 1a eb) che non presentavano variazioni significative dell'intervallo rispetto ai risultati della risonanza magnetica rilevati all'età di 57 anni. L'atrofia e le anomalie del segnale nel midollo allungato e nel cordone cervicale superiore, le caratteristiche diagnostiche dell'AsD ad insorgenza nell'adulto, 22 non sono state osservate (Figura 1c). Curiosamente, sono state osservate anomalie del segnale simili a ghirlande lungo il rivestimento dei ventricoli laterali (Figura 1d, frecce). Come un recente rapporto ha suggerito che i cambiamenti del segnale a ghirlanda, simili a ghirlande sul cervello, le immagini di RM "costituiscono un nuovo segno" di AxD a insorgenza successiva, 23 sospettavamo che AxD fosse una diagnosi, una leucoencefalopatia causata dalla mutazione GFAP .

Analisi di mutazione del GFAP

L'analisi del GFAP della probanda ha rivelato una sostituzione eterozigote da G a T nell'esone 6 (un riferimento per la numerazione dell'esone: GenBank RefSeqGene NG_008401.1) nella posizione 934, causando un cambiamento di amminoacidi nel codone 312 (Glutamic acid to Stop, c.1000 G > T (sequenza cDNA di riferimento: GenBank NM_002055.4), p. (Glu312Ter) (p. (E312 *)) (sequenza proteica di riferimento: GenBank NP_002046.1)) (Figura 1e). Questa mutazione non è stata trovata in nessuno dei nostri 200 soggetti di controllo coreani normali (Figura 1f) e l'analisi PolyPhen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) ha predetto che p. (E312 *) sarebbe probabilmente dannoso, suggerendo così la natura patogena di questa mutazione. La figlia maggiore asintomatica del probando aveva la stessa mutazione GFAP p. (E312 *), ma altri membri della famiglia non erano d'accordo a sottoporsi ad analisi genetica o risonanza magnetica cerebrale. Dato che i genitori della probanda sono deceduti, non siamo riusciti a determinare se la mutazione p. (E312 *) fosse de novo o ereditaria.

Espressione di GFAP mutante nelle cellule HEK293T

E312 si trova nel dominio dell'asta 2B del GFAP (Figura 1g). Per verificare se la mutazione p. (E312 *) nel GFAP tronca e / o altera la stabilità della proteina, abbiamo prima trasfettato plasmidi che codificano WT GFAP o GFAP p. (E312 *) in cellule HEK293 che non esprimono GFAP endogeno. Abbiamo quindi analizzato la proteina GFAP mediante western blotting (WB) con tre diversi anticorpi contro GFAP: l'anticorpo 1 è stato aumentato contro l'intero GFAP, mentre gli anticorpi 2 e 3 sono stati aumentati contro la metà C-terminale del GFAP. Il WB con l'anticorpo 1 ha rilevato sia WT GFAP che GFAP p. (E312 *) con il rispettivo peso molecolare atteso, tuttavia l'intensità di banda di GFAP p. (E312 *) era inferiore a quella di WT GFAP (Figura 1h, pannello superiore). Come previsto, gli anticorpi 2 e 3 non hanno rilevato GFAP p. (E312 *) poiché questi anticorpi riconoscono il frammento C-terminale di GFAP 24 che è assente in GFAP p. (E312 *) (Figura 1h, pannelli centrale e inferiore). Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che la mutazione p. (E312 *) tronca il GFAP e abbassa i livelli di espressione di GFAP.

Test in vitro per l'aggregazione di GFAP mutante

Per determinare se la proteina GFAP p. (E312 *) è soggetta ad aggregazione, WT ricombinante e GFAP mutante sono stati purificati da E. coli , sottoposti a un test di assemblaggio in vitro a base di dialisi, colorato in negativo con acetato di uranile e quindi ripreso con microscopio elettronico. Considerando che WT GFAP assemblato in filamenti tipici da 10 nm di lunghezza di diversi μm (Figura 2a), GFAP p. (E312 *) non è riuscito a formare filamenti estesi. Invece, le proteine ​​assemblate si sono aggregate in strutture simili a paracristalli 25 (Figura 2b, pannelli sinistro e destro) che esibivano uno schema di bande alternate chiaro / scuro alternato con una ripetizione assiale di ∼ 22 nm comprendente una banda di colorazione scura ∼ 2 nm di larghezza e un ∼ Banda leggermente macchiata larga 20 nm (Figura 2b '). Questa fascia ricorda i paracristalli formati da lamine, 26 filamenti intermedi di classe V. Queste strutture simili a paracristalli erano spesso rastremate su entrambe le estremità (Figura 2b '') e occasionalmente presentavano una struttura fibrillica chiara in un sito perturbato nell'organizzazione paracristallina (Figura 2b '' '). Inoltre, poiché il probando aveva una mutazione eterozigote p (E312 *) in GFAP , abbiamo successivamente valutato il comportamento di assemblaggio della miscela 1: 1 di WT GFAP e GFAP p. (E312 *). La miscela 1: 1 formava filamenti più corti e meno uniformi di quelli del solo assemblaggio di WT GFAP e tendeva ad aggregarsi marcatamente (Figura 2c, pannelli sinistro e centrale). Inoltre, poiché i livelli di espressione di GFAP p. (E312 *) erano inferiori a quelli di WT GFAP nelle cellule di mammifero coltivate, abbiamo testato se la miscela 3: 1 di WT GFAP e GFAP p. (E312 *) formasse anche l'aggregazione GFAP. In effetti, ha aggregato marcatamente GFAP (Figura 2c, pannello di destra).

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GFAP p. (E312 *) è soggetto ad aggregazione. ( a - d ) WT GFAP e GFAP ricombinanti p. (E312 *) sono stati purificati da E. coli , assemblati in vitro da soli (( a ) WT GFAP da soli; ( b ) GFAP p. (E312 *) da soli) o in combinazione (( c ) WT GFAP: GFAP p. (E312 *) (1: 1); ( d ) (3: 1)), colorato in negativo con acetato di uranile e quindi ripreso mediante microscopia elettronica. GFAP p. (E312 *) formava strutture simili a paracristalli con distintive ripetizioni assiali da 22 nm con motivo a bande alternate (∼ 20 nm) e scuro (∼ 2 nm) ( b '). I paracristalli erano spesso rastremati su entrambe le estremità ( b '', freccia). I dettagli strutturali dell'aggregato erano talvolta visti in materiale meno aggregato, dove una chiara struttura fibrillica era evidente nel sito perturbato dell'organizzazione paracristallina ( b '' ', freccia). ( e, f ) I GFAP assemblati sono stati sottoposti a centrifugazione a bassa velocità ( e ) e ad alta velocità ( f ) e le risultanti frazioni di surnatante (S) e pellet (P) sono state visualizzate mediante colorazione SDS-PAGE e Coomassie Brilliant Blue .

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Per valutare la misura in cui i filamenti interagiscono tra loro nell'intera popolazione di filamenti, abbiamo eseguito un test di centrifugazione a bassa velocità con WT GFAP o GFAP p. (E312 *) da solo o in combinazione. Quando assemblato da solo, circa un settimo del WF GFAP è stato trovato nella frazione di pellet (Figura 2e, corsie 1 e 2). Al contrario, quasi tutto il GFAP p. (E312 *) è stato notato nella frazione di pellet quando assemblato da solo (Figura 2e, corsie 5 e 6). La percentuale di GFAP sedimentato nella miscela 1: 1 di WT GFAP e GFAP p. (E312 *) era tra quella trovata per ciascuna di queste sole proteine ​​(Figura 2e, corsie 3 e 4), indicando che WT GFAP e GFAP p. (E312 *) copolimerizza e questo copolimero non si aggrega in una certa misura. Ciò è coerente con il nostro precedente rapporto secondo cui i filamenti GFAP possono incorporare una piccola parte di GFAP compromessa dall'assemblaggio. 27 Infine, per determinare l'efficienza dell'assemblaggio in vitro di GFAP, abbiamo eseguito un test di centrifugazione ad alta velocità con WT GFAP o GFAP p. (E312 *) da solo o in combinazione. Il GFAP ha formato complessi ad alto peso molecolare in tutte queste condizioni, come dimostrato dalla presenza di quasi il 90% del GFAP totale nella frazione di pellet (Figura 2f). Collettivamente, questi dati suggeriscono che il GFAP p. (E312 *) promuove le interazioni di interfilamento che è dominante sul GFAP del WT.

GFAP p. (E312 *) causa l'aggregazione di GFAP nelle cellule SW13 (Vim + ) del carcinoma della corteccia surrenale umana

Per verificare se GFAP p. (E312 *) ha causato anche l'aggregazione GFAP in vivo , abbiamo trasfettato cellule SW13 (Vim + ) con plasmidi che codificano WT GFAP o GFAP p. (E312 *) o entrambi. Questa linea cellulare è stata derivata dal carcinoma della corteccia surrenale umana, presenta una rete di filamenti di vimentina, non esprime GFAP endogeno ed è adatta per valutare le proprietà GFAP mutanti. 17, 24 L' efficienza di trasfezione delle cellule SW13 (Vim + ) era ∼ 26% nelle nostre mani (dati non mostrati). GFAP WT espresso assemblato nell'80% delle cellule trasfettate in reti filamentose che si sono parzialmente coalizzate con le reti IF di vimentina (Figura 3a e d) in linea con le precedenti osservazioni. 17, 24 Al contrario, la maggior parte delle cellule (73%) che esprimono GFAP p. (E312 *) formavano aggregati ricchi di GFAP che spesso collassavano le reti IF di vimentina (Figura 3c e d). La cotrasfezione con rapporto equimolare di plasmidi codificanti individualmente WT GFAP e GFAP p. (E312 *) ha comportato l'aggregazione GFAP con una frequenza più vicina a quella osservata per le cellule trasfettate con GFAP p. (E312 *) da solo (Figura 3b e d). Questi risultati suggeriscono che GFAP p. (E312 *) non solo ha compromesso la capacità di GFAP di formare normali reti IF, ma ha anche esercitato un effetto dominante sulle reti endogene di vimentina IF.

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GFAP p. (E312 *) provoca l'aggregazione di GFAP nelle cellule SW13 (Vim + ) del carcinoma della corteccia surrenale. ( a - c ) Le cellule SW13 (Vim + ) sono state transfettate in modo transitorio con WT GFAP ( a ) o GFAP p. (E312 *) ( c ), singolarmente o in combinazione in un rapporto 1: 1 ( b ). A 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state immunocolorate con anticorpi anti-GFAP (canale verde) e anti-vimentina (canale rosso) e rappresentate al microscopio confocale. Le immagini unite vengono visualizzate nei pannelli giusti. Le frecce indicano il coalignment delle reti GFAP e vimentin IF. Le punte di freccia rappresentano l'aggregazione GFAP colocalizzata con reti di vimentina endogena crollate. L'asterisco indica la coesistenza di reti di filamenti e aggregazione. Barra della scala = 10 μ m. ( d ) Le cellule trasfettate sono state classificate per i loro schemi di colorazione (filamento, filamento + aggregato e aggregato) e mostrate come media ± DS. ( e ) Le cellule SW13 (Vim + ) sono state trasfettate con plasmidi codificanti WT GFAP o GFAP p. (E312 *) o entrambi (rapporto plasmide 1: 1). La quantità totale di plasmide utilizzata era di 8 μ g in tutti i casi. Le cellule non trasfette (corsie 1, 5 e 9) sono state usate come controllo. Le cellule sono state quindi lisate utilizzando un protocollo di estrazione lieve senza desossicolato e sottoposte a centrifugazione. Il supernatante, il pellet e il lisato totale risultanti sono stati analizzati da WB con anticorpi anti-GFAP. L'anticorpo anti-actina è stato usato come controllo del carico. Le punte di freccia indicano frammenti di degradazione di GFAP. La versione a colori di questa figura è disponibile online presso l' European Journal of Human Genetics .

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Abbiamo dimostrato nelle cellule HEK293 GFAP-negative che i livelli di espressione di GFAP p. (E312 *) erano inferiori a quelli di WT GFAP (Figura 1h). Per valutare ulteriormente i livelli di espressione e la solubilità di GFAP p. (E312 *), abbiamo trasfettato cellule SW13 (Vim + ) con plasmidi che codificano WT GFAP o GFAP p. (E312 *) o entrambi, e le cellule trasfettate sono state quindi lisate usando un leggero protocollo di estrazione senza desossicolato e sottoposto a centrifugazione. Il lisato totale e il risultante frazioni di surnatante e pellet sono stati analizzati da WB con anticorpo anti-GFAP. Ancora una volta, la quantità di GFAP p. (E312 *) è risultata inferiore alla quantità di GFAP WT nei lisati totali (corsia 3, Figura 3e), confermando che la mutazione p. (E312 *) ha abbassato i livelli di espressione di GFAP. Circa il 92% del WF GFAP è stato rilevato nella frazione di pellet mentre una piccola percentuale (∼ 8%) è rimasta solubile. Al contrario, GFAP p. (E312 *) è stato trovato quasi esclusivamente nella frazione di pellet (corsia 6 vs corsia 12, figura 3e), coerente con la formazione di aggregati citoplasmatici. Nelle frazioni di surnatante, i livelli di proteina WT nelle cellule co-trasfettate erano inferiori rispetto a quelli nelle sole cellule trasfettate da GTAP WT (corsia 7 vs corsia 6, Figura 3e), suggerendo un effetto dominante di GFAP p. (E312 *) sopra WT GFAP.

Discussione

Qui, mostriamo che un coreano di 67 anni con estese iperintensità nelle regioni periventricolari e profonde della sostanza bianca nelle risonanze magnetiche ospita una mutazione senza senso p. (E312 *) nel GFAP , portando alla cancellazione di parte del dominio dell'asta e dell'intero dominio di coda nel GFAP. Inoltre, dimostriamo che la mutazione p. (E312 *) abbassa i livelli di espressione del GFAP mutante e ne promuove l'aggregazione.

Le mutazioni GFAP riportate fino ad oggi per AxD sono (1) mutazioni missenso nella regione di codifica, (2) piccoli inserimenti o eliminazioni, (3) una mutazione del sito di splicing che cancella l'esone 4 e (4) mutazioni di spostamento dei frame all'estremità del terminale C estremo . 3, 13, 28 Prima del presente studio, una mutazione senza senso in GFAP non è stata segnalata per AxD, per quanto ne sappiamo. La mutazione p. (E312 *) che abbiamo riportato qui rimuove parte del dominio dell'asta 2B e l'intero dominio della coda dal GFAP. Qual è quindi il meccanismo con cui questo GFAP troncato induce l'aggregazione di GFAP? Herrmann e colleghi hanno dimostrato che un dominio di coda di vimentina, un altro IF di tipo III, è determinante per la specifica del diametro IF. 29 Inoltre, Chen e Liem 30 hanno dimostrato che la sovraespressione di GFAP mancante di un intero dominio di coda nelle linee cellulari SW13 derivate dall'adenocarcinoma della corteccia surrenale umana provoca la formazione di aggregati polimorfici, indipendentemente dalla presenza o assenza di vimentina, indicando un ruolo importante per la coda dominio nell'autoassemblaggio corretto di GFAP. Collettivamente, questi rapporti suggeriscono che, poiché il dominio di coda è fondamentale per il corretto assemblaggio di GFAP, il mutante GFAP p. (E312 *) non potrebbe formare reti GFAP appropriate, portando quindi alla formazione di aggregati. Tuttavia, l'esatto meccanismo con cui il dominio di coda facilita il corretto assemblaggio di GFAP richiede ulteriori studi.

Esistono solidi criteri di risonanza magnetica per AxD infantile e giovanile, 31 ma i modelli di risonanza magnetica per AxD ad insorgenza adulta sono variabili, riflettendo la sua variabilità clinica. 23 Farina et al. 22 hanno riferito che l'atrofia nel midollo allungato e nel midollo cervicale superiore era presente nelle immagini RM del 100% (11/11) dei pazienti con AxD ad insorgenza adulta adulta confermata geneticamente (tutti tranne uno). Le immagini MR del probando, tuttavia, non mostravano l'atrofia nel midollo allungato e nel midollo cervicale superiore. Invece, le immagini mostravano estese iperintensità della sostanza bianca. Questa discrepanza può derivare dalla differenza nella natura delle mutazioni GFAP . Sebbene le mutazioni GFAP riscontrate finora in AxD non cambino in modo significativo la dimensione proteica di GFAP, la GFAP del probando ha una mutazione senza senso che elimina parte del dominio dell'asta 2B e del dominio della coda C-terminale. Questa discrepanza può spiegare l'assenza di sintomi caratteristici del tronco encefalico di AxD ad insorgenza nell'adulto nel probando.

Sebbene GFAP p. (E312 *) sia stato determinato essere incline all'aggregazione in vitro e nelle cellule SW13 (Vim + ), non possiamo escludere completamente la possibilità che il probando non abbia AxD a causa della mancanza di segni clinici tipici e di risultati della risonanza magnetica. Postuliamo, tuttavia, che ciò è meno probabile a causa dei seguenti motivi. In primo luogo, ci sono state segnalazioni su individui che sono venuti in clinica a causa di sintomi non correlati all'AxD e che in seguito sono stati trovati per ospitare mutazioni nel GFAP. 32, 33, 34, 35 In secondo luogo, anche in questi individui, i loro risultati di risonanza magnetica variavano. Ad esempio, la risonanza magnetica dei pazienti 5 e 9 nello studio di Farina et al 22, 34 ha rivelato gravi atrofie e cambiamenti del segnale nel tronco encefalico e nel midollo spinale cervicale, mentre la risonanza magnetica dei pazienti no. 3 in Wada et al. 35 e in Okamoto et al. 33 non hanno mostrato tali risultati caratteristici. Collettivamente, questi rapporti suggeriscono che AxD presenta diversi sintomi clinici e risultati di risonanza magnetica. Inoltre, questo rapporto su GFAP p. (E312 *) amplierà ulteriormente il repertorio clinico di AxD.

Diverse proteine ​​fibrose a spirale arrotolata, come la verga di miosina, 36 paramyosin 37 e tropomiosina, 38 tendono a formare paracristalli. Inoltre, Quinlan et al 25 hanno dimostrato che il topo GFAP privo del dominio di coda C-terminale, che ha ancora l'asta α- elica centrale intatta, forma i paracristalli in vitro . Pertanto, non è sorprendente che delle mutazioni GFAP riportate finora nei pazienti con AxD, GFAP p. (E312 *) priva di parte del dominio dell'asta 2B e il dominio della coda C-terminale sia il primo GFAP mutante che ha formato i paracristalli in vitro . Sebbene i paracristalli descritti nel presente studio e in quello di Quinlan et al. 25 sono stati formati dal GFAP, ci sono diverse differenze tra loro. Ad esempio, la lunghezza di una ripetizione assiale nei paracristalli di questo rapporto era molto più breve di quella di Quinlan et al 25 : 22 nm contro 57 nm. Questa differenza può essere il risultato della differenza nella dimensione dei GFAP studiati (GFAP privo di parte dell'asta 2B e dei domini di coda C-terminale vs GFAP privo della testa N-terminale e dei domini coda C-terminale) e della differenza in la condizione in cui sono stati assemblati i GFAP (tampone di assemblaggio standard a pH 7, 0 rispetto a tampone di assemblaggio standard con cationi bivalenti e agenti caotropici). Saranno necessari ulteriori studi per determinare se GFAP p. (E312 *) forma anche paracristalli in vivo e se questa formazione di paracristalli è associata alla patogenesi di AxD.

La scoperta che il GFAP senza coda fa precipitare l'aggregazione favorisce la nostra comprensione del meccanismo alla base dell'aggregazione di GFAP e della patogenesi di AxD.

adesioni

GenBank / EMBL / DDBJ

  • BC013596
  • NM_002055.4

Informazione supplementare

Documenti Word

  1. 1.

    Tabella Supplementare

  2. 2.

    Materiale supplementare

    Contributi dell'autore

    Tai-Seung Nam, Jin Hee Kim, Chi-Hsuan Chang e Yoon Seok Jung hanno eseguito gli esperimenti. Tai-Seung Nam, Sa-Yoon Kang, Woong Yoon, Boo Ahn Shin, Ming-Der Perng, Seok-Yong Choi e Myeong-Kyu Kim hanno analizzato e interpretato i dati. Tai-Seung Nam, Ming-Der Perng, Seok-Yong Choi e Myeong-Kyu Kim hanno redatto e rivisto il manoscritto.

    Informazioni supplementari accompagnano questo documento sul sito Web dell'European Journal of Human Genetics (//www.nature.com/ejhg)