Aumento della rigidità arteriosa e riorganizzazione della matrice extracellulare in pecore fetali con limitazione della crescita intrauterina | ricerca pediatrica

Aumento della rigidità arteriosa e riorganizzazione della matrice extracellulare in pecore fetali con limitazione della crescita intrauterina | ricerca pediatrica

Anonim

Soggetti

  • Irrigidimento arterioso
  • Disturbi della crescita
  • Pediatria

Astratto

Sfondo:

La restrizione della crescita fetale intrauterina (IUGR) determina un aumento della resistenza placentare al flusso sanguigno, ipertensione fetale e aumento degli stress da pulsatilità che portano al rimodellamento vascolare. Abbiamo testato la nostra ipotesi che lo IUGR causi una riduzione della compliance nelle arterie carotidea e ombelicale a causa della composizione e struttura della matrice extracellulare (ECM) alterate.

metodi:

Un modello di IUGR indotto da insufficienza placentare (PI-IUGR) è stato creato dall'esposizione della pecora incinta a temperature ambiente elevate. Le arterie ombelicali e carotidi di feti a breve termine sono state testate con misurazioni del diametro della pressione per confrontare la compliance passiva nei tessuti di controllo e PI-IUGR. La composizione dell'ECM è stata misurata mediante saggio biochimico e l'organizzazione è stata determinata utilizzando l'istologia e la generazione di immagini di seconda armonica.

risultati:

Abbiamo scoperto che PI-IUGR ha aumentato la rigidità arteriosa con un aumento del coinvolgimento del collagene o allungamento della transizione. Le arterie carotidi PI-IUGR hanno mostrato un aumento della quantità di collagene ed elastina e le arterie ombelicali PI-IUGR hanno mostrato un aumento dei glicosaminoglicani solfati. L'istomorfologia ha mostrato rapporti alterati tra collagene-elastina e proliferazione cellulare alterata. Una maggiore rigidità indica un rapporto collagene-elastina alterato con un minor contributo di elastina che porta ad un aumento dell'impegno del collagene.

Conclusione:

Poiché la rigidità della nave è un fattore predittivo significativo nello sviluppo dell'ipertensione, l'interruzione della deposizione di ECM in IUGR fornisce un potenziale collegamento tra IUGR e ipertensione adulta.

Principale

Negli adolescenti e negli adulti, l'aumento della rigidità nelle grandi arterie elastiche contribuisce in modo significativo alla progressione delle malattie cardiovascolari (CVD) (1, 2, 3). La matrice extracellulare (ECM) che definisce la rigidità arteriosa si forma rapidamente durante la gestazione tardiva e nel neonato. Le cellule muscolari lisce regolano lo sviluppo dell'ECM per soddisfare le esigenze biomeccaniche delle arterie sistemiche segnalando cambiamenti rispetto agli aumenti della pressione sanguigna e dei flussi emodinamici all'interno di un vaso (4). È stato dimostrato che l'elastina, il componente ECM che fornisce elasticità e resistenza alla bassa pressione nei vasi sanguigni, si accumula rapidamente durante la gestazione tardiva e all'inizio del periodo neonatale e si degrada lentamente con l'età (5, 6, 7). Il collagene, un componente ECM molto più rigido, viene depositato per adattarsi all'aumento del carico biomeccanico all'aumentare della pressione sanguigna o sotto un aumento dello stress da taglio, come con l'invecchiamento o la malattia (4, 5, 6, 7). I proteoglicani sono una piccola ma importante parte dell'ECM che consistono in una proteina di base a cui catene multiple di glicosaminoglicano (GAG) sono attaccate covalentemente e hanno la capacità di incorporare acqua e viscosità nei tessuti. Gli adattamenti nella formazione vascolare alle complicazioni a breve termine dello stress materno, come la restrizione della crescita intrauterina (IUGR), in utero potrebbero influire direttamente sulla salute cardiovascolare dell'adulto attraverso una crescita vascolare alterata e il rimodellamento di uno qualsiasi di questi componenti dell'ECM.

Lo IUGR è una complicanza comune delle gravidanze umane e provoca complicanze sia a breve che a lungo termine. A breve termine, IUGR è associato ad emodinamica alterata a causa di una maggiore resistenza placentare al flusso sanguigno e di aumento della pressione arteriosa fetale (8, 9), mentre le complicanze a lungo termine includono una predisposizione allo sviluppo di CVD (10, 11). Tuttavia, i meccanismi che collegano IUGR con CVD ad insorgenza adulta rimangono compresi in modo incompleto e sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere la patogenesi dello sviluppo vascolare fetale anormale IUGR.

Nell'uomo, Burkhardt et al. (5) hanno mostrato che i neonati IUGR hanno ridotto la compliance dell'arteria ombelicale. Inoltre, Burkhardt ha sostenuto che, come estensione del sistema cardiovascolare fetale e l'unica nave prontamente disponibile per lo studio in vitro sull'uomo, le arterie ombelicali hanno fornito un'istantanea dello sviluppo vascolare fetale (5). Ma se ciò è vero in IUGR rimane non testato.

Abbiamo ipotizzato che i feti a breve termine IUGR abbiano aumentato la rigidità arteriosa carotidea e ombelicale a causa dell'alterata composizione e organizzazione dell'ECM causate da maggiori stress emodinamici rispetto a quello dei normali feti. Per questo studio, abbiamo utilizzato un modello di insufficienza placentare delle pecore che provoca feti IUGR caratterizzati da alterazioni emodinamiche e molte altre complicazioni osservate in IUGR umano grave (8, 9, 12). Questo modello di pecore di insufficienza placentare-IUGR (PI-IUGR ) replica un fenomeno naturale in cui la gestazione a temperature ambiente elevate riduce le dimensioni e la funzione del trasporto placentare, segno distintivo di IUGR (12). Sono state osservate somiglianze di crescita ridotta, metabolismo interrotto e alterazione dell'emodinamica tra la pecora PI-IUGR e IUGR umana (8). Questo modello di PI-IUGR è caratterizzato da elevata pressione sanguigna fetale, aumento della pulsatilità nelle arterie dell'aorta ombelicale fetale e discendente e aumento della resistenza placentare al flusso sanguigno ombelicale fetale (9). In questo studio, abbiamo misurato la rigidità arteriosa nel cordone ombelicale isolato e nelle arterie carotidi fetali, nonché la composizione e l'organizzazione dell'ECM per chiarire il contributo di IUGR allo sviluppo vascolare.

risultati

Morfologia animale

I feti PI-IUGR presentavano una significativa limitazione della crescita, con peso fetale inferiore, peso placentare e lunghezza da corona a groppa ( Tabella 1 ). Il peso ventricolare sinistro normalizzato (grammi per chilogrammo di peso fetale) era superiore del 18% nei feti PI-IUGR. Le arterie carotidi PI-IUGR non depressurizzate e non stirate hanno mostrato un aumento del 23% del diametro interno e una diminuzione dello spessore della parete del 28% rispetto ai controlli. L'arteria ombelicale non pressurizzata e non stirata non ha mostrato alcun cambiamento nel diametro interno e nello spessore della parete, nonostante le dimensioni fetali ridotte e l'insufficienza placentare ( Tabella 1 ).

Tabella a grandezza naturale

Pentacrome di Movat

La colorazione pentacromatica iniziale di Movat ( Figura 1 ) ha mostrato qualitativamente che il mezzo PI-IUGR ha più sostanza macinata: GAG solfati idrofili e quantità cellulare alterata rispetto al controllo. Le arterie PI-IUGR hanno mostrato più collagene nell'avventizia. Dati questi cambiamenti qualitativi e la natura qualitativa di questa analisi, abbiamo successivamente eseguito saggi quantitativi biomeccanici, morfologici e biochimici.

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Istologia pentacrotica di Movat. Le sezioni trasversali macchiate di pentacrome di Movat per arterie carotidee rappresentative ( a ) lato sinistro: pannello di controllo e lato destro: pannello di restrizione della crescita intrauterina indotta da insufficienza placentare (PI-IUGR); bar = 100 μm) e ( b ) arterie ombelicali ( lato sinistro: pannello di controllo e lato destro: pannello PI-IUGR; barra = 200 μm). L'analisi qualitativa ha mostrato che le arterie PI-IUGR avevano mezzi con un aumento della sostanza fondamentale (GAG) e l'avventizia ha mostrato un aumento del collagene che ha interrotto il rapporto collagene-elastina, indicando un irrigidimento arterioso. GAG, glicosaminoglicani.

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Rigidità arteriosa

In PI-IUGR, sia le arterie carotidi che quelle ombelicali erano significativamente meno conformi rispetto ai controlli a pressioni equivalenti come indicato dallo spostamento a sinistra nell'impegno del collagene ( Figura 2 ). A pressioni equivalenti, lo stiramento circonferenziale è inferiore nelle arterie carotidi PI-IUGR per pressioni 70-200 mm Hg e nelle arterie ombelicali per pressioni 40-200 mm Hg ( P <0, 05). Il tratto di transizione (tratto λ), che descrive il contributo di elastina e l'inizio dell'impegno del collagene nella compliance, era significativamente più basso sia nelle arterie carotidi-ombelicali PI-IUGR sia rispetto al controllo ( Figura 2c, d ).

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( a - b ) Campioni di pressione vs. allungamento circonferenziale per il controllo (cerchi neri) e restrizione della crescita intrauterina indotta da insufficienza placentare (PI-IUGR) (cerchi bianchi). * Differenza significativa tra i gruppi ( P <0, 05). ( a ) L'arteria carotidea è significativamente diversa a pressioni comprese tra 70 e 200 mm Hg ( P <0, 05). ( b ) L'arteria ombelicale è significativamente diversa a pressioni comprese tra 40 e 200 mm Hg ( P <0, 05). Ricerche precedenti hanno dimostrato che le pressioni sanguigne sistemiche medie in questa razza di animali sono 44, 5 e 50, 2 mm Hg, rispettivamente per gli animali di controllo e PI-IUGR (9). ( c - d ) Allungamento circonferenziale di transizione che quantifica la meccanica di aggancio dell'elastina e del collagene per il controllo (quadrati neri) e PI-IUGR (quadrati bianchi). ( c ) Le arterie carotidi e ( d ) presentano un allungamento della transizione inferiore.

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Composizione ECM

L'arteria carotide PI-IUGR aveva più contenuto di collagene ed elastina. L'arteria ombelicale PI-IUGR non ha avuto variazioni nel contenuto di collagene o elastina ma aveva un contenuto di GAG meno solfato ( Tabella 2 ). La quantificazione delle immagini colorate di ematossilina ed eosina ( Figura 3 ) ha mostrato un numero di cellule più elevato nell'arteria carotide (controllo (CON) = 0, 28 ± 0, 04; IUGR = 0, 40 ± 0, 02 nuclei cellulari / 100 μm 2 ; P <0, 05) e cellula inferiore numero nell'arteria ombelicale (CON = 0, 28 ± 0, 02; IUGR = 0, 19 ± 0, 02 nuclei cellulari / 100 μm 2 ; P <0, 05) in PI-IUGR. La quantificazione della frazione di area dell'elastina nelle immagini di Verhoeff-van Gieson ( Figura 4 ) ha mostrato una percentuale inferiore di elastina rispetto alla parete arteriosa nella carotide (CON = 27, 4 ± 2, 1%; IUGR = 19, 2 ± 2, 2%; P <0, 05) e arterie ombelicali (CON = 10, 8 ± 0, 9%; IUGR = 7, 2 ± 1, 2%; P <0, 05) in PI-IUGR ( Figura 4 ). Tuttavia, l'area totale assoluta di elastina è rimasta la stessa tra i gruppi.

Tabella a grandezza naturale

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Istologia e analisi di ematossilina ed eosina (H&E). Sezioni colorate con H e E per arterie carotidi rappresentative (lato sinistro: pannello di controllo e lato destro: pannello di restrizione della crescita intrauterina indotta da insufficienza placentare (PI-IUGR); barra = 100 μm) e ( b ) arterie ombelicali (sinistra lato: pannello di controllo e lato destro: pannello PI-IUGR; barra = 200 μm). La quantificazione del numero di nuclei per 100 μm 2 per ( c ) le arterie carotidi in gran parte elastiche mostrano un aumento dei nuclei cellulari per area (* P <0, 05), ma ( d ) le arterie ombelicali in gran parte muscolari mostrano una riduzione dei nuclei cellulari per area (* P < 0.05).

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Istologia e analisi di Verhoeff-van Gieson (VVG). Sezioni colorate VVG per arterie carotidee rappresentative ( a ) lato sinistro: pannello di controllo e lato destro: pannello di restrizione della crescita intrauterina indotta da insufficienza placentare (PI-IUGR); barra = 100 μm) e ( b ) arterie ombelicali (sinistra lato: pannello di controllo e lato destro: pannello PI-IUGR; barra = 200 μm). La frazione di area di elastina misura il rapporto collagene-elastina. Le arterie ( c ) carotidea e ( d ) ombelicale hanno mostrato un'area ridotta di elastina rispetto alla superficie totale della parete arteriosa (* P <0, 05), dimostrando una riorganizzazione del collagene e dell'elastina.

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Immagini ad alta risoluzione di generazione della seconda armonica (SHG) di arterie carotidee PI-IUGR rappresentative esibivano qualitativamente una avventitia riorganizzata che conteneva un aumento di elastina e un aumento di collagene ( Figura 5a ). I media delle arterie carotidi PI-IUGR ( Figura 5a ) mostravano meno lamelle elastiche, o bande di elastina, per area rispetto alle navi di controllo ed erano anche più sottili delle arterie carotidi di controllo. Le arterie ombelicali SHG PI-IUGR ( Figura 5b ), che contenevano meno area di elastina rispetto alla carotide, mostravano una lamina elastica interna più sottile e meno fasciata. I media PI-IUGR avevano elastina meno organizzata, più frammentata rispetto alle arterie ombelicali di controllo ( Figura 5b ).

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Generazione di seconda armonica. Sezioni arteriose mostrate nel piano assiale per arterie carotidee rappresentative (in alto: pannello di controllo e in basso: pannello di restrizione della crescita intrauterina indotta da insufficienza placentare (PI-IUGR); bar = 100 μm) con autofluorescenza di collagene (rosso) ed elastina (verde). Le immagini qualitative mostrano che, rispetto alle navi di controllo (1) (bar = 100 μm), le arterie PI-IUGR (2) hanno mostrato un'organizzazione a matrice extracellulare (ECM) interrotta con mezzi con un minor numero di lamelle elastiche o bande di elastina, per area. Rispetto alle arterie di controllo (3) (bar = 100 μm), la lamina elastica esterna e l'avventizia delle arterie PI-IUGR (4) mostravano più elastina che era meno organizzata e più frammentata e aumentava il collagene. Rappresentante ( b ) arterie ombelicali (in alto: pannello di controllo e in basso: pannello PI-IUGR; barra = 200 μm) mostrano che, rispetto ai vasi di controllo (1) (barra = 100 μm), arterie PI-IUGR (2) esibito organizzazione ECM interrotta con supporti con meno lamelle elastiche per area. Rispetto alle arterie di controllo (3) (bar = 100 μm), i media esterni delle arterie PI-IUGR (4) mostravano più elastina che era meno organizzata e più frammentata e aumentava il collagene.

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Discussione

Lo scopo del nostro studio era di determinare le differenze nella crescita e nel rimodellamento delle arterie sistemiche al termine della gestazione tra controllo e feti PI-IUGR testando la conformità passiva e i componenti strutturali dell'ECM. L'ECM risponde all'ambiente biomeccanico, fornendo un'istantanea dei cambiamenti emodinamici che si verificano durante lo sviluppo. I risultati importanti del nostro studio sono i seguenti: (i) arterie carotidi e ombelicali meno conformi nei feti PI-IUGR e tratto di transizione inferiore, dimostrando la ridotta elastina e un maggiore contributo di collagene alla meccanica arteriosa; (ii) la carotide PI-IUGR presentava quantità biochimiche di collagene ed elastina significativamente più elevate rispetto ai controlli, mentre i vasi ombelicali avevano un contenuto di GAG solfatato più basso; (iii) le arterie carotidi PI-IUGR hanno mostrato un cambiamento nella morfologia, esibendo un diametro interno maggiore e pareti più sottili mentre le arterie ombelicali PI-IUGR non hanno mostrato alcun cambiamento, nonostante una diminuzione delle dimensioni del feto; e (iv) l'organizzazione dell'ECM è cambiata, come dimostrato dalla minore area di elastina e dalle fibre di elastina che sono apparse più frammentate e disorganizzate nei vasi PI-IUGR, con più cellularità nella carotide e meno cellularità nell'arteria ombelicale.

Per il feto e il successivo neonato, i vasi più rigidi provocano una ridotta funzione arteriosa. Irrigidimento arterioso significa meno effetto Windkessel, o serbatoio elastico, disponibile per immagazzinare l'energia potenziale richiesta per un flusso costante verso i letti degli organi. Il cuore funziona come una pompa intermittente, che scarica il flusso sanguigno solo durante la sistole. Pertanto, l'elasticità arteriosa è fondamentale nel promuovere il flusso emodinamico laminare in avanti, meno pulsatile in queste grandi arterie del condotto elastico e ridurre il postcarico del ventricolo sinistro (3). Le arterie PI-IUGR avevano un contenuto di collagene più elevato, alterando il rapporto collagene-elastina come si vede nell'istomorfologia di Verhoeff-van Gieson. Un maggiore contenuto di collagene nell'arteria carotidea PI-IUGR interrompe il normale rapporto collagene-elastina, irrigidendo la compliance arteriosa e riducendo la frazione dell'area di elastina. Nell'arteria ombelicale, i GAG meno solfati nell'arteria PI-IUGR creano energia di dissipazione meno viscosa oltre a ridurre la conformità. La riduzione dei GAG sembra avere un ruolo importante nella poromeccanica (13), con i vasi ombelicali PI-IUGR che mostrano rigidità rispetto ai vasi di controllo. La Figura 1 mostra un rimodellamento qualitativo con una diminuzione delle cellule muscolari lisce (rosso) e un aumento della sostanza macinata (blu) sulla base di analisi colorimetriche osservazionali. Tuttavia, sono state utilizzate metriche più tradizionali di istomorfologia e analisi biochimiche per comprendere i cambiamenti rispetto alla colorazione pentacromatica Movat meno affidabile e ampiamente variabile. Il rimodellamento nelle arterie PI-IUGR porta ad una maggiore rigidità, che ha dimostrato di causare emodinamica alterata e resistenza al flusso, producendo ipertrofia del ventricolo sinistro (14, 15).

La crescita e lo sviluppo arterioso sono fondamentali durante i periodi fetale e neonatale, con la maggior parte della deposizione di collagene ed elastina che si verificano in questo momento (6, 7). Nel modello PI-IUGR, lo sviluppo vascolare sembra essere influenzato dall'aumento della resistenza placentare, della pressione sanguigna e dell'emodinamica. IUGR aumenta il flusso di sangue relativo al cervello per "risparmiare" questo organo vitale (8), portando al cambiamento osservato nella morfologia dell'arteria carotide non sollecitata nel nostro studio. Le dimensioni dell'arteria ombelicale non sollecitate nel modello PI-IUGR sono rimaste normali.

La conformità passiva è definita principalmente dai componenti strutturali ECM collagene ed elastina. Questi componenti passivi forniscono i principali elementi strutturali per la biomeccanica arteriosa e sono depositati e orientati in base alla pressione e al flusso (16, 17, 18, 19). I GAG funzionano per aumentare la dissipazione di energia viscosa, che riduce la rigidità, in risposta al carico biomeccanico (20). Insieme, questi componenti strutturali ECM sono ben documentati per contribuire alle curve funzionali pressione-diametro. La salute arteriosa dipende dall'avere il corretto rapporto collagene-elastina, dato che la carenza di elastina porta ad un aumento della pressione sanguigna e della pulsatilità (21). Gli studi sulle arterie ombelicali umane nell'IUGR mediante colorazione istologica non hanno rivelato alcun cambiamento nel contenuto di elastina biochimica, ma hanno ridotto la percentuale percentuale di area di elastina, contribuendo a pareti arteriose più rigide (5). Studi recenti hanno dimostrato una ridotta area di elastina e una maggiore area di collagene nell'aorta del feto di pecora ipossico (22) e un maggiore contenuto di collagene con una maggiore rigidità nella cavia PI-IUGR (23) adulta (23). I ricercatori hanno ipotizzato che nei feti la cui crescita è compromessa, la sintesi di elastina nelle pareti dell'aorta e delle grandi arterie possa essere carente, portando quindi a cambiamenti permanenti nelle proprietà di conformità di questi vasi e predisponendo un individuo a CVD (24, 25, 26, 27). I nostri risultati mostrano che le arterie carotidi e ombelicali hanno un serbatoio meno elastico, un minor contributo di elastina apparente e un contenuto e un impegno di collagene più evidenti. Le immagini di istomorfologia e SHG mostrano la riorganizzazione dell'ECM in PI-IUGR, con conseguente riduzione della conformità. La maggiore rigidità della nave rappresenta una complessa interazione di contributi funzionali e strutturali che determinano la conformità della nave. Pertanto, sia la concentrazione che l'organizzazione dell'ECM contribuiscono alla funzione biomeccanica arteriosa e sono sensibili alle malattie.

Questo primo rapporto di rimodellamento di elastina e collagene in grandi arterie elastiche in un modello di pecora PI-IUGR contribuisce a comprendere l'impatto a lungo termine di IUGR sulla CVD. Burkhardt et al. (5) ha suggerito che l'arteria ombelicale IUGR umana potrebbe fornire informazioni sulla vascolarizzazione fetale. L'uso di un modello di pecora ben consolidato di PI-IUGR ha permesso un confronto diretto dei vasi sistemici neonatali con l'arteria ombelicale. I nostri dati supportano questa idea di usare l'arteria ombelicale come un'istantanea del rimodellamento arterioso sistemico in assenza di un modello animale, poiché abbiamo riscontrato una ridotta compliance nell'arteria carotide e nell'arteria ombelicale. Tuttavia, abbiamo anche trovato differenze tra gli effetti dell'insufficienza placentare sulle arterie carotidee e ombelicali (composizione dell'ECM, morfologia e cellularità). Questo modello di cambiamenti fisici dimostra la continua necessità di utilizzare modelli animali di IUGR per comprendere appieno lo sviluppo vascolare in IUGR. Lo sviluppo cardiovascolare in un grande modello animale di salute e malattia fornisce informazioni sul ruolo dell'irrigidimento arterioso, che si è dimostrato critico nella patogenesi della CVD (28, 29, 30, 31). In particolare, i nostri dati forniscono prove convincenti su animali per spiegare parzialmente gli studi epidemiologici e osservazionali sull'uomo che collegano IUGR e origini evolutive di CVD (10, 11, 32, 33).

Studi futuri determineranno l'estensione della crescita arteriosa sistemica anormale e il rimodellamento nel feto IUGR e il ruolo dello stress emodinamico come meccanismo di segnalazione. Inoltre, riportiamo i risultati per il feto a breve termine. Non è ancora chiaro quando inizi la crescita arteriosa anormale e il rimodellamento e anche le conseguenze a lungo termine dell'irrigidimento dei vasi in questo modello di PI-IUGR sono sconosciute. Tuttavia, i nostri dati forniscono una base iniziale per lo sviluppo di un modello costitutivo per mettere in relazione i cambiamenti nella microstruttura arteriosa con la funzione biomeccanica nei feti IUGR. Tali modelli costitutivi hanno la capacità di aiutare la nostra comprensione della relazione tra irrigidimento dei vasi e caratteristiche alterate del flusso sanguigno. Sono inoltre necessari studi futuri per comprendere i ruoli dello stress meccanico e della segnalazione biochimica, i percorsi biochimico-meccanici che portano alla crescita arteriosa e al rimodellamento nel feto IUGR.

In conclusione, il PI provoca IUGR e riduce la compliance arteriosa sia carotidea che ombelicale. La ridotta compliance è associata all'aumento della pressione arteriosa fetale precedentemente misurata, alla resistenza placentare e alla pulsatilità arteriosa. Abbiamo anche scoperto che il rimodellamento arterioso si verifica in PI-IUGR principalmente attraverso un aumento del contenuto di collagene ed elastina nell'arteria carotide e una diminuzione dei GAG solfatati nell'arteria ombelicale con un rapporto collagene-elastina alterato. Nel complesso, questi dati forniscono un potenziale meccanismo tra IUGR e CVD per adulti.

Materiali e metodi

Modello animale

Questo studio è stato condotto su pecore in stato di gravidanza Columbia-Rambouillet presso il Centro di ricerca perinatale presso la School of Medicine dell'Università del Colorado e approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Il Centro di ricerca perinatale è accreditato dal National Institutes of Health, dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti e dall'American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. PI-IUGR ( n = 9) è stato creato dall'esposizione di pecore in gravidanza a temperature ambiente elevate (40 ° C per 12 ore; 35 ° per 12 ore) per ~ 80 d (da 35 a 112 d età gestazionale; termine = 148 d età gestazionale) come precedentemente descritto (8, 12, 34, 35). A seguito di questa esposizione, le pecore sono state alloggiate in un ambiente normotermico (20 ° C) per il resto dello studio. Le pecore CON) ( n = 12) sono state alloggiate in un ambiente normotermico per la durata dello studio.

Test meccanici

La pecora e il feto sono stati anestetizzati con ketamina (1.000 mg) e diazepam (10 mg) somministrati alla madre. Il feto è stato rimosso, asciugato e pesato. Il feto è stato quindi ucciso con sodio pentobarbital (2 ml, ~ 250 mg / kg). Sono stati registrati pesi cardiaci fetali, placentare e sezionati. Le arterie carotidi destra e sinistra comuni sono state sezionate dalla base del ramo carotideo alla base del cranio (CON, n = 10; PI-IUGR, n = 8). Le arterie ombelicali sono state sezionate dal cordone ombelicale tra il sito di inserimento fetale e i rami della placenta (CON, n = 12; PI-IUGR, n = 9). Le arterie sono state conservate in soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio a 4 ° C fino al test. Campioni preliminari di controllo e carotidi PI-IUGR e arterie ombelicali sono stati elaborati per istologia. Questi campioni istologici preliminari sono stati fissati utilizzando formalina tamponata neutra al 10%, disidratata con etanolo e incorporata in paraffina. Le arterie sono state sezionate a 5 μm con ciascuna arteria macchiata con pentacromo di Movat per sostanza macinata o contenuto di GAG solfatato, fibrina, muscoli, collagene ed elastina.

Una porzione ad anello lunga 2 mm delle arterie dissezionate è stata misurata otticamente per spessore e diametro interno. L'arteria dissezionata è stata quindi cannulata e suturata. Le arterie sono state quindi testate per la conformità passiva in una camera per arteriografia personalizzata che ha permesso di allungare i vasi di grandi dimensioni fino alla lunghezza in vivo , pressurizzati e imaging. I trasduttori di pressione calibrati (Living Systems Instruments, LSI; Burlington, VT) sono stati posizionati sui lati a monte e a valle della nave e sono stati registrati utilizzando il software di acquisizione dati WinDaq (Dataq Instruments; Akron, OH). I vasi sono stati pressurizzati staticamente con una soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio utilizzando una pompa Cole-Parmer Masterflex (Vernon Hills, IL) da 5 a 10-200 mm Hg con incrementi di 10 mm Hg, trattenuta per consentire il rilassamento dello stress e ripresa con imaging usando una fotocamera digitale Canon Rebel XSi con una risoluzione di 14, 5 μm (Lake Success, NY). La pressione transmurale e il diametro esterno sono stati registrati usando uno script di elaborazione delle immagini Matlab (MathWorks, Natick, MA) scritto su misura. A seguito di test meccanici, i segmenti arteriosi sono stati congelati per analisi biochimiche e i segmenti sono stati riparati per l'esame istologico come descritto di seguito.

Saggi biochimici in vitro

Una porzione di ~ 20 mg per campione arterioso è stata liofilizzata e pesata per la massa secca. Il tessuto essiccato è stato idrolizzato in 200 ml di 6 mol / l di HCl ed essiccato usando uno speedvac. Le quantità di elastina e collagene incorporate nelle pareti arteriose delle pecore PI-IUGR sono state quantificate utilizzando rispettivamente misurazioni standard del contenuto di desmosina e idrossiprolina tissutale (36, 37). Una porzione aggiuntiva di ~ 20 mg per campione arterioso è stata essiccata e pesata per la massa secca. Il contenuto di GAG solfato è stato misurato usando un dosaggio dimetilmetilenico standard con condroitin-6-solfato (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) come standard (38).

Istologia

Campioni di test meccanici di controllo e carotidi PI-IUGR e arterie ombelicali sono stati elaborati per istologia. I campioni istologici sono stati fissati utilizzando formalina tamponata al neutro al 10%, disidratata con etanolo e incorporata in paraffina. Le arterie sono state sezionate a 5 μm, con ciascuna arteria macchiata con Verhoeff-van Gieson per il contenuto di collagene ed elastina, ematossilina ed eosina per struttura generale e numero di cellule.

Inoltre, sono stati scelti campioni rappresentativi per le arterie carotidea (CON = 3 e IUGR = 3) e ombelicale (CON = 3 e IUGR = 3) per l'imaging SHG ad alta risoluzione. I campioni di SHG sono stati fissati utilizzando formalina tamponata neutra al 10%, disidratata con etanolo e incorporata in paraffina. Le arterie sono state sezionate nei piani assiale e circonferenziale a 10 μm. Il sistema di imaging SHG consisteva in uno strumento Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania) dotato di un laser a infrarossi a due fotoni a impulsi sintonizzabile (Chameleon di Coherent, Santa Clara, CA) e rilevatori di tubi foto moltiplicatori esterni non scanditi. I campioni arteriosi sono stati eccitati a 800 nm tramite un obiettivo di immersione in acqua 40 ×, 1, 4NA Plan-Apochromat (Carl Zeiss). Il segnale di risposta è stato diviso da uno specchio dicroico 425 DCLP (Chroma Technologies, Rockingham, VT). La fluorescenza del collagene SHG è stata misurata utilizzando un filtro passa banda stretto HQ400 / 20m-2p (Chroma Technologies) e la fluorescenza elastina con un filtro passa banda ampio HQ575 / 250m-2p (Chroma Technologies). Le immagini sono state esaminate in modo cieco per le differenze qualitative tra i gruppi di controllo e PI-IUGR.

Analisi dei dati

I dati biomeccanici sono presentati come media ± SEM per la pressione transmurale e l'estensione del diametro (λ = d / d o, dove d è il diametro corrente e d o è il diametro iniziale). Il tratto di transizione (λ trans ) descrive sia il contenuto di elastina e / o organizzazione dell'arteria sia il punto di impegno del collagene. Per le misure meccaniche, la pressione sperimentale ( p ) e gli allungamenti del diametro (λ) sono stati adattati usando un metodo esponenziale di minimi quadrati non lineari per dare un valore di r 2 ≥0, 90. Il λ trans dalla regione di elastina quasi lineare alla regione di impegno del collagene è stato trovato da una variazione del 5% della pendenza, come precedentemente riportato (39).

Le immagini di Verhoeff-van Gieson sono state utilizzate per quantificare la frazione dell'area di elastina in Matlab (MathWorks) di una soglia di intensità per trovare l'area della parete dell'arteria seguita da una soglia della parete dell'arteria per trovare le aree più scure della fascia di elastina. Le immagini di ematossilina ed eosina hanno quantificato il contenuto cellulare (numero di nuclei per area vascolare) usando uno script Matlab personalizzato per identificare il numero di nuclei cellulari usando una soglia nell'asse blu-giallo nello spazio colore L * a * b * per arteria area della parete usando una soglia di intensità.

Il significato statistico delle caratteristiche biomeccaniche è stato trovato usando un ANOVA a modello misto con termini per sesso, trattamento (CON vs. PI-IUGR) e un termine animale casuale per tenere conto delle ripetute misurazioni di pressione e diametro effettuate nello stesso vaso fetale. Altre misurazioni sono state esaminate utilizzando un test t di Student su due lati, ipotizzando una varianza diseguale per i dati parametrici e un test di Mann-Whitney per i dati non parametrici, come indicato. Un valore di P <0, 05 è stato considerato significativo.

Dichiarazione di sostegno finanziario

Questo progetto è stato finanziato in parte dall'American Heart Association Pacific Mountain Predoctoral Fellowship; Sovvenzioni Sigma Xi in aiuti; National Institutes of Health concede 1K08HD060688-1, 1R01DK088139-01A1 e 1K25 HL094749; Centro per la ricerca sulla salute delle donne; e il premio Junior University Faculty Research Development Award.