Segnalazione di insulina intestinale codifica due diversi meccanismi molecolari per la longevità ridotta indotta dall'ossido di grafene nella caenorhabditis elegans | rapporti scientifici

Segnalazione di insulina intestinale codifica due diversi meccanismi molecolari per la longevità ridotta indotta dall'ossido di grafene nella caenorhabditis elegans | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Ecotossicologia
  • Tossicologia medica

Astratto

L'ossido di grafene (GO) ha dimostrato di causare tossicità multiple in vari organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti per la longevità ridotta indotta da GO non sono ancora chiari. Abbiamo impiegato Caenorhabditis elegans per studiare il possibile coinvolgimento della via di segnalazione dell'insulina nel controllo della tossicità GO e dei suoi meccanismi molecolari sottostanti. La mutazione del gene daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 ha indotto una proprietà resistente dei nematodi alla tossicità GO, mentre la mutazione del gene daf-16 ha portato a una proprietà sensibile dei nematodi alla tossicità GO, suggerendo che GO può disregolare le funzioni del recettore DAF-2 / IGF-1, la cascata di chinasi mediata da AGE-1, AKT-1 e AKT-2 e il fattore di trascrizione DAF-16 / FOXO. L'analisi delle interazioni genetiche ha suggerito il coinvolgimento della cascata di segnali di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 nel controllo della tossicità GO sulla longevità. Inoltre, l'analisi dell'interferenza dell'RNA intestinale (RNAi) ha dimostrato che GO ha ridotto la longevità influenzando le funzioni di segnalazione in cascata di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 nell'intestino. DAF-16 potrebbe anche regolare la tossicità GO sulla longevità funzionando a monte di SOD-3, che codifica un sistema antiossidante che impedisce l'accumulo di stress ossidativo. Pertanto, la segnalazione intestinale di insulina può codificare due diversi meccanismi molecolari responsabili della tossicità GO nell'indurre la longevità ridotta. I nostri risultati evidenziano il ruolo chiave della via di segnalazione dell'insulina nel controllo della tossicità GO negli organismi.

introduzione

I nanomateriali al carbonio sono una famiglia di importanti nanomateriali ingegnerizzati (ENM) con molte proprietà uniche e potenziali applicazioni 1, 2 . L'ossido di grafene (GO) è un membro degli ENM di carbonio bidimensionali con un singolo strato di atomi di carbonio con sp 2 di carbonio. Grazie alla sua stabilità chimica, all'alto coefficiente di conduzione termica, all'anfipatia, all'ampia superficie e alla facilità di funzionalizzazione, GO ha un grande potenziale per l'uso nella somministrazione di farmaci, bioimmagini, ingegneria dei tessuti e agenti di biotest 1, 2 .

Data l'eccezionale promessa delle applicazioni GO, sono stati condotti numerosi studi incentrati sulla tossicità GO 4 . Alcuni studi hanno suggerito la citotossicità e diversi aspetti degli effetti avversi sugli animali come la tossicità polmonare e l'immunotossicità da esposizione a GO 4, 5, 6, 7, 8 . Più recentemente, alcuni rapporti sono stati pubblicati con l'obiettivo di chiarire ulteriormente i meccanismi molecolari della tossicità GO 9, 10, 11, 12 . Uno studio ha dimostrato che l'attivazione della segnalazione del recettore toll-like 4 (TLR4) e la successiva produzione autocrina di TNF-α potrebbero essere coinvolte nel controllo della tossicità GO nei macrofagi 10 . Inoltre, mRNA disregolati, proteine ​​e microRNA (miRNA) sono stati identificati in cellule HepG2 umane esposte al GO o cellule GLC-82 9, 11, 12 .

Caenorhabditis elegans è un modello animale classico che offre un sistema di analisi per studiare i meccanismi tossicologici in vivo dei tossici, inclusi gli ENM 13 . C. elegans condivide le proprietà conservate per i processi fisiologici di base, la risposta allo stress e le vie di segnalazione molecolare con l'uomo 14 . Usando C. elegans , studi precedenti hanno suggerito la tossicità del GO sulle funzioni di organi bersaglio sia primari (come l'intestino) sia secondari (come i neuroni e gli organi riproduttivi) 15, 16, 17, 18 . Per quanto riguarda i meccanismi cellulari della tossicità del GO, i dati pubblicati hanno suggerito che la tossicità del GO potrebbe essere conseguente alla biodisponibilità, all'induzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), all'aumentata permeabilità intestinale, alla risposta immunitaria innata interrotta e alla durata del ciclo di defecazione prolungata nei nematodi 16, 17, 19, 20 . Precedenti studi hanno anche implicato il ruolo cruciale della barriera biologica intestinale contro la tossicità GO nei nematodi 17, 21 . È stato anche riferito che l'induzione dello stress ossidativo potrebbe svolgere un ruolo chiave nel meccanismo chimico della longevità accorciata indotta dal GO nei nematodi esposti 15 . Tuttavia, i meccanismi molecolari per la longevità ridotta indotta dalla tossicità GO sono ancora in gran parte sconosciuti.

La via di segnalazione del fattore di crescita insulino-insulino-simile (IGF) è stata implicata come meccanismo molecolare chiave per il controllo della longevità nei nematodi 22, 23 . È stato anche dimostrato che questo percorso di segnalazione gioca ruoli chiave nella regolazione di altri importanti processi biologici, tra cui la conservazione del grasso, l'immunità innata e la risposta allo stress 24, 25, 26 . Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che la segnalazione di insulina regola la tossicità delle particelle di particelle di traffico (PM 2.5 ) in C. elegans 26 . In C. elegans , i ligandi dell'insulina si legano al recettore DAF-2 / IGF-1 (InR), attivano l'attività della tirosina chinasi e avviano la cascata di diverse chinasi: AGE-1 / fosfatidiilinositolo 3-chinasi (PI3K), PDK-1 / Chinasi 1 3-fosfoinositide-dipendente, AKT-1/2 / serina / treonina chinasi Akt / PKB e SGK-1 / serina o treonina-proteina chinasi 23 . AKT e SGK-1 ulteriormente fosforilano e inattivano il fattore di trascrizione DAF-16 / FOXO, bloccando così la trascrizione di geni target come il gene sod-3 23, 27, 28, 29, 30 . DAF-18 / fosfatidilinositolo 3, 4, 5-trifosfato 3-fosfatasi (PTEN) defosforilati AGE-1, che previene la fosforilazione di DAF-16 da parte delle chinasi a valle 23, 27, 29 . Il saggio di attività specifica del tessuto ha dimostrato le importanti funzioni del DAF-16 nella regolazione della longevità nell'intestino e nei neuroni dei nematodi 30 . È interessante notare che il nostro precedente studio ha suggerito che la mutazione del gene sod-3 ha portato a una proprietà suscettibile dei nematodi alla tossicità GO sulla durata della vita, alla riproduzione e al comportamento della locomozione, e ha indotto un'induzione più grave della produzione di ROS nei nematodi esposti a GO 19, 21 . Nel presente studio, abbiamo impiegato un sistema di test in vivo di C. elegans per studiare il possibile coinvolgimento della via di segnalazione dell'insulina nel controllo della tossicità GO e dei suoi potenziali meccanismi molecolari. I nostri risultati suggeriscono che la via di segnalazione dell'insulina può codificare due diversi meccanismi molecolari per la durata abbreviata indotta da GO nei nematodi. L'esame di questi meccanismi molecolari della regolazione della tossicità del GO attraverso la via di segnalazione dell'insulina fornisce una base importante per l'ulteriore chiarimento delle reti molecolari coinvolte nel controllo della tossicità del GO negli organismi.

risultati

Proprietà fisico-chimiche di GO

La distribuzione dimensionale di GO nel mezzo K è mostrata in Fig. S1a. La maggior parte del GO in K-medium era nell'intervallo di 40-50 nm (Fig. S1a). La dimensione dell'aggregazione GO era di 386 ± 75 nm (Fig. S1a). GO appariva simile a un foglio, con uno spessore di circa 1, 0 nm in altezza topografica, che corrisponde a circa uno strato (Fig. S1b). Il potenziale zeta del GO (100 mg / L) nel mezzo K era di -22, 5 ± 1, 7 mV. La misurazione della spettroscopia Raman ha dimostrato un segnale in banda D di GO dopo il trattamento con acido solforico e KMnO 4, indicando un'introduzione del disturbo nello strato di grafite (Fig. S1c). Una banda AG e una banda D sono state trovate rispettivamente a 1589 cm −1 e 1336 cm −1 (Fig. S1c).

L'esposizione al GO ha influenzato i modelli di espressione dei geni che codificano la via di segnalazione dell'insulina nei nematodi

Tra i geni che codificano la via di segnalazione dell'insulina in C. elegans , l'esposizione a GO (100 mg / L) ha determinato un aumento significativo dei livelli di espressione dei geni daf-2, age-1, akt-1 e akt-2 , e una diminuzione dei livelli di espressione dei geni daf-18 e daf-16 nei nematodi wild-type (Fig. 1a). Inoltre, considerando il fatto che la via di segnalazione dell'insulina può regolare alcuni processi biologici, come la longevità, attraverso la limitazione della localizzazione nucleare DAF-16 29, abbiamo ipotizzato che l'esposizione a GO potrebbe influenzare anche la localizzazione nucleare DAF-16 nei nematodi. Con l'aiuto del ceppo transgenico di zIs356, abbiamo osservato un aumento significativo dell'espressione di DAF-16: GFP nei nuclei di nematodi esposti a GO (100 mg / L) rispetto al controllo (Fig. 1b). Pertanto, l'esposizione al GO può non solo influenzare le attività trascrizionali dei geni che codificano la via di segnalazione dell'insulina, ma anche influenzare la traslocazione nucleo-citoplasma di DAF-16 nei nematodi.

Image

( a ) L'esposizione del GO ha alterato i livelli di espressione di alcuni geni che codificano la via di segnalazione dell'insulina nei nematodi di tipo selvaggio. ( b ) L'esposizione al GO ha influenzato la traslocazione del nucleo di DAF-16 :: GFP. Le punte di freccia indicano l'espressione DAF-16 nell'intestino. La concentrazione di esposizione al GO era di 100 mg / L. L'esposizione prolungata è stata eseguita dalle larve L1 ai giovani adulti. Le barre rappresentano i mezzi ± SEM. ** P <0, 01 vs. controllo.

Immagine a dimensione intera

La mutazione del gene daf-16 ha indotto una proprietà suscettibile dei nematodi alla tossicità GO

In C. elegans , il gene daf-16 codifica un fattore trascrizionale FOXO, che regola diversi processi biologici influenzando le funzioni dei suoi geni bersaglio 23 . Precedenti studi hanno suggerito che il comportamento della locomozione è un endpoint molto sensibile per la valutazione degli effetti avversi degli ENM nei nematodi 31, 32 . Il comportamento della locomozione è stato valutato dal colpo di testa e dalla curva del corpo nei nematodi 31, 32 . Dopo un'esposizione prolungata, abbiamo scoperto che la mutazione della perdita di funzione del gene daf-16 ha provocato una riduzione più grave del colpo di testa o della curvatura del corpo nei nematodi esposti a GO rispetto ai nematodi di tipo selvaggio esposti a GO (Fig. 2a). Usando la durata della vita come endpoint, abbiamo inoltre osservato che i mutanti daf-16 ( mu86 ) esposti a GO hanno mostrato una durata di vita più gravemente ridotta rispetto ai nematodi di tipo selvaggio esposti a GO (Fig. 2b, Tabella S1). Questi risultati suggeriscono che la mutazione del gene daf-16 induce una maggiore suscettibilità alla tossicità GO in C. elegans .

Image

( a ) Effetti della mutazione del gene daf-16 o daf-2 sul comportamento della locomozione nei nematodi esposti a GO. ( b ) Effetti della mutazione del gene daf-16 o daf-2 sulla durata della vita nei nematodi esposti a GO. ( c ) Le mutazioni del gene età-1, akt-1, akt-2 o daf-18 hanno influenzato la tossicità GO sul comportamento della locomozione nei nematodi. ( d ) Le mutazioni del gene età-1, akt-1, akt-2 o daf-18 hanno influenzato la tossicità GO durante la durata della vita nei nematodi. Il comportamento della locomozione dei nematodi è stato valutato in base agli endpoint del colpo alla testa e alla curva del corpo. La concentrazione di esposizione al GO era di 100 mg / L. L'esposizione prolungata è stata eseguita dalle larve L1 ai giovani adulti. Le barre rappresentano i mezzi ± SEM. ** P <0, 01 vs. controllo (se non appositamente indicato).

Immagine a dimensione intera

La mutazione del gene daf-2 ha indotto una proprietà resistente dei nematodi alla tossicità GO

In C. elegans , il gene daf-2 codifica un recettore dell'insulina, che è responsabile della ricezione dei segnali dai peptidi dell'insulina 23 . Usando il comportamento della locomozione come endpoint, abbiamo scoperto che i mutanti daf-2 ( e1370 ) erano resistenti alla tossicità GO sia sul colpo di testa che sulla piega del corpo rispetto ai nematodi di tipo selvaggio esposti a GO (Fig. 2a). Inoltre, i mutanti daf-2 ( e1370 ) esposti al GO hanno mostrato una durata della vita significativamente maggiore rispetto ai nematodi di tipo selvaggio esposti al GO (Fig. 2b, Tabella S1). Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che la mutazione daf-2 ( e1370 ) induce resistenza alla tossicità GO.

geni di età 1, akt-1, akt-2 o daf-18 sono stati coinvolti nel controllo della tossicità GO nei nematodi

In C. elegans , i geni age-1, akt-1 e akt-2 codificano la cascata di chinasi tra DAF-2 e DAF-16, e DAF-18 agisce come un soppressore dell'AGE-1 nell'insulina via di segnalazione 23 . Usando il comportamento della locomozione e la durata della vita come endpoint, abbiamo scoperto che i mutanti age-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) e akt-2 ( ok393 ) erano resistenti alla tossicità GO sul comportamento della locomozione o durata della vita (Fig. 2c, d, Tabella S2). Al contrario, i mutanti daf-18 ( ok480 ) erano sensibili alla tossicità GO sul comportamento della locomozione o sulla durata della vita (Fig. 2c, d, Tabella S2). Questi risultati suggeriscono che AGE-1, AKT-1 e AKT-2 costituiscono una cascata di chinasi per la via di segnalazione dell'insulina, che è coinvolta nel controllo della tossicità GO nei nematodi.

Interazioni genetiche del gene nella via di segnalazione dell'insulina nella regolazione della tossicità GO sulla longevità nei nematodi

Successivamente abbiamo studiato le interazioni genetiche del gene daf-16 con altri geni nella via di segnalazione dell'insulina nella regolazione della tossicità GO sulla longevità nei nematodi. Abbiamo scoperto che la mutazione del gene daf-16 potrebbe effettivamente ridurre la durata della vita nei mutanti daf-2 ( e1370 ) esposti a GO, età 1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) o akt-2 ( ok393 ) (Fig 3, Tabella S3). Questi risultati implicano che DAF-16 può agire a valle di DAF-2, AGE-1, AKT-1 e AKT-2 per regolare la tossicità GO sulla longevità nei nematodi.

Image

La concentrazione di esposizione al GO era di 100 mg / L. L'esposizione prolungata è stata eseguita dalle larve L1 ai giovani adulti.

Immagine a dimensione intera

Abbiamo inoltre scoperto che la mutazione del gene daf-18 potrebbe effettivamente ridurre la durata della vita nei mutanti esposti all'età GO ( hx546 ) (Fig. 3, Tabella S3), che conferma il ruolo di soppressore del DAF-18 su AGE-1 nel controllo di tossicità GO nei nematodi.

Attività specifica del tessuto di DAF-16 nella regolazione della tossicità GO nei nematodi

In C. elegans , il gene daf-16 è espresso in quasi tutti i tessuti tra cui l'intestino, i neuroni, i muscoli e la faringe 23 . Usando il comportamento della locomozione e la durata della vita come endpoint, abbiamo scoperto che l'espressione del gene daf-16 nei neuroni, nel muscolo o nella faringe non ha influenzato significativamente il comportamento della locomozione o la durata della vita nei mutanti del daf-16 ( mu86 ) esposti al GO (Fig. 4, Tabella S4). Al contrario, abbiamo osservato che l'espressione del gene daf-16 nell'intestino ha aumentato efficacemente il ridotto comportamento della locomozione o la durata della vita nei mutanti daf-16 ( mu96 ) esposti al GO (Fig. 4, Tabella S4). Questi risultati suggeriscono che il gene daf-16 può agire principalmente nell'intestino per regolare la tossicità GO nei nematodi.

Image

( a ) Attività specifica del tessuto di DAF-16 nella regolazione della tossicità GO sul comportamento della locomozione nei nematodi. Il comportamento della locomozione dei nematodi è stato valutato in base agli endpoint del colpo alla testa e alla curva del corpo. ( b ) Attività specifica del tessuto di DAF-16 nella regolazione della tossicità GO sulla durata della vita nei nematodi. La concentrazione di esposizione al GO era di 100 mg / L. L'esposizione prolungata è stata eseguita dalle larve L1 ai giovani adulti. Le barre rappresentano i mezzi ± SEM. ** P <0, 01 vs. wild-type.

Immagine a dimensione intera

Le interferenze RNA specifiche dell'intestino (RNAi) dei geni che codificano la via di segnalazione dell'insulina hanno influenzato la tossicità GO sulla longevità nei nematodi

Per esaminare ulteriormente l'attività specifica dei tessuti di altri geni nella via di segnalazione dell'insulina nella regolazione della tossicità GO, abbiamo eseguito RNAi specifici dell'intestino sul ceppo VP303 33 . Nei nematodi, abbiamo scoperto che l'RNAi specifico dell'intestino del gene daf-2, età-1, akt-1 o akt-2 ha provocato una durata della vita prolungata, mentre l'RNAi specifico dell'intestino del gene daf-16 o daf-18 ha portato a durata ridotta (Fig. 5, Tabella S5). Inoltre, dopo un'esposizione prolungata, è stata osservata una proprietà resistente alla tossicità GO nei nematodi con RNAi specifico dell'intestino del gene daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 , mentre una proprietà suscettibile alla tossicità GO osservato nei nematodi sottoposti a RNAi specifici dell'intestino del gene daf-16 o daf-18 (Fig. 5, Tabella S5). Questi risultati suggeriscono che la via di segnalazione dell'insulina può agire nell'intestino per regolare la tossicità del GO nei nematodi. Poiché il ceppo VP303 presenta deficit nel comportamento della locomozione, non abbiamo esaminato gli effetti dell'RNAi specifico dell'intestino di geni che codificano la via di segnalazione dell'insulina sul comportamento della locomozione nei nematodi esposti a GO.

Image

La concentrazione di esposizione al GO era di 100 mg / L. L'esposizione prolungata è stata eseguita dalle larve L1 ai giovani adulti.

Immagine a dimensione intera

Regolazione della tossicità GO dall'obiettivo DAF-16 SOD-3

In C. elegans, la sod-3 è un importante gene bersaglio del gene daf-16 e codifica una supermide dismutasi mitocondriale di ferro / manganese necessaria per difendersi dallo stress ossidativo 23 . SOD-3 è espresso nella faringe nella testa, nell'intestino, nei muscoli, nella vulva e nella coda 34 . In generale, si prevede una debole espressione di SOD-3 nell'intestino 34 . Dopo un'esposizione prolungata, tuttavia, abbiamo osservato che GO potrebbe aumentare significativamente l'espressione di SOD-3 nell'intestino dei nematodi rispetto a quella del controllo (Fig. 6a).

Image

( a ) Effetti dell'esposizione GO sull'espressione SOD-3 :: GFP. La sinistra mostra le immagini per l'espressione SOD-3 :: GFP e la destra mostra il confronto dell'intestino relativo di fluorescenza di SOD-3 :: GFP nell'intestino dei nematodi. Gli asterischi indicano l'intestino dei nematodi. ( b ) Effetti dell'RNAi specifico dell'intestino del gene sod-3 sulla durata della vita nei nematodi esposti a GO. ( c ) Effetti della sovraespressione intestinale del gene daf-16 sulla tossicità GO sulla durata della vita nei nematodi. ( d ) Effetti della mutazione sod-3 sulla durata della vita nei nematodi esposti a GO che sovraesprimono il gene daf-16 nell'intestino nei nematodi. La concentrazione di esposizione al GO era di 100 mg / L. L'esposizione prolungata è stata eseguita dalle larve L1 ai giovani adulti. Le barre rappresentano i mezzi ± SEM. ** P <0, 01 vs. wild-type.

Immagine a dimensione intera

Usando VP303 come strumento RNAi intestinale, abbiamo scoperto che l'RNAi intestinale del gene sod-3 ha indotto una proprietà suscettibile dei nematodi alla tossicità GO sulla longevità dei nematodi (Fig. 6b, Tabella S6). L'RNAi intestinale del gene sod-3 , tuttavia, non ha influenzato la durata della vita dei nematodi in assenza di esposizione a GO (Fig. 6b, Tabella S6). Pertanto, SOD-3 può anche essere in grado di agire nell'intestino per regolare la tossicità del GO sulla longevità nei nematodi.

Interazione genetica tra DAF-16 e SOD-3 nella regolazione della tossicità GO sulla longevità nei nematodi

Per esaminare ulteriormente l'interazione tra il gene daf-16 e il gene sod-3 nella regolazione della tossicità GO, abbiamo costruito il ceppo transgenico di Ex ( Pges-1-daf-16 ), in cui il gene daf-16 era sovraespresso nel intestino di nematodi. La sovraespressione intestinale del gene daf-16 ha indotto una proprietà resistente degli animali alla tossicità GO sulla longevità (Fig. 6c, Tabella S7). Al contrario, abbiamo osservato che la proprietà resistente del ceppo transgenico di Ex ( Pges-1-daf-16 ) per la tossicità GO sulla longevità potrebbe essere notevolmente inibita dalla mutazione sod-3 nei nematodi (Fig. 6d, Tabella S7). In condizioni normali, il mutante sod-2 ( gk235 ) aveva una durata di vita simile a quella del N2 di tipo selvaggio, mentre la mutazione del gene sod-2 non influenzava ovviamente il fenotipo a lungo termine dei nematodi che sovraesprimeva il gene daf-16 nell'intestino (Fig. S2, Tabella S7). Questi risultati suggeriscono che DAF-16 potrebbe ulteriormente funzionare a monte di SOD-3 per regolare la tossicità GO sulla longevità nei nematodi.

Interazione genetica tra DAF-16 e SOD-3 nella regolazione della tossicità GO nell'indurre la produzione di ROS

Infine, abbiamo studiato l'interazione tra DAF-16 e SOD-3 nel regolare la tossicità GO nell'indurre la produzione di ROS intestinale nei nematodi. La mutazione del gene sod-3 o la sovraespressione del gene daf-16 nell'intestino non hanno indotto una significativa produzione di ROS nei nematodi in assenza di esposizione a GO (Fig. S3). Tuttavia, dopo l'esposizione al GO, abbiamo osservato che la sovraespressione del gene daf-16 nell'intestino ha significativamente soppresso l'induzione della produzione di ROS intestinale nei nematodi (Fig. S3). Al contrario, dopo l'esposizione a GO, la mutazione del gene sod-3 ha rafforzato l'induzione della produzione di ROS intestinale nei nematodi (Fig. S3). Inoltre, dopo l'esposizione al GO, la mutazione del gene sod-3 ha ulteriormente indotto una significativa induzione della produzione di ROS intestinale nei nematodi che sovraesprimono il gene daf-16 nell'intestino (Fig. S3).

Discussione

Precedenti studi hanno suggerito che la via di segnalazione dell'insulina è coinvolta nel controllo di processi biologici come l'immunità innata e la risposta allo stress nei nematodi 25, 26 . Nel presente studio, abbiamo inoltre fornito prove a supporto del coinvolgimento della via di segnalazione dell'insulina nel controllo della tossicità di ENM specifici come GO. Nei nematodi, l'esposizione a GO alla concentrazione di 100 mg / L ha aumentato i livelli di espressione dei geni daf-2, age-1, akt-1 e akt-2 , mentre ha diminuito i livelli di espressione di daf-18 e daf- 16 geni (Fig. 1a). Questi risultati implicano che, almeno alla concentrazione esaminata, l'esposizione a GO può disregolare le funzioni del recettore DAF-2 / IGF-1, la cascata di chinasi mediata da AGE-1, AKT-1 e AKT-2 e DAF-16 / FOXO fattore di trascrizione (Fig. 7). Ancora più interessante, abbiamo anche scoperto che GO è in grado di influenzare la funzione di AGE-1 attraverso la downregulation dell'espressione di DAF-18 nei nematodi (Fig. 7).

Image

Immagine a dimensione intera

Le prove dei mutanti genetici hanno ulteriormente confermato i ruoli di DAF-2, AGE-1, AKT-1, AKT-2, DAF-18 e DAF-16 nella regolazione della tossicità GO. La mutazione del gene daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 ha indotto una proprietà resistente dei nematodi alla tossicità GO; tuttavia, la mutazione del gene daf-18 o daf-16 ha indotto una proprietà sensibile dei nematodi alla tossicità GO (Fig. 2, Tabella S1 e S2). In C. elegans, è stato riportato che i mutanti daf-2, age-1, akt-1 e akt-2 erano resistenti all'infezione di Pseudomonas aeruginosa ; tuttavia, il mutante daf-18 o daf-16 infetto da P. aeruginosa ha mostrato una durata di vita simile a quella dei nematodi di tipo selvaggio 25 infettati da P. aeruginosa . È stato inoltre riferito che il PM 2.5 ha aumentato significativamente i livelli di espressione dei geni daf-2 e akt-1 , mentre ha diminuito i livelli di espressione dei geni daf-18 e daf-16 26 . Questi risultati implicano che la via di segnalazione dell'insulina può regolare diversi processi biologici attraverso una diversa cascata di segnalazione nei nematodi.

L'analisi dell'interazione genetica ha suggerito che la cascata di segnalazione di base di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 potrebbe svolgere un ruolo nel controllo della tossicità GO sulla longevità nei nematodi (Figg 3 e 7, Tabella S3) . La cascata di segnalazione di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 ha anche dimostrato di essere coinvolta nel controllo della risposta immunitaria dei nematodi nel contesto dell'infezione da P. aeruginosa 25 . Questi risultati suggeriscono che DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 può essere una cascata di segnalazione conservata per la via di segnalazione dell'insulina nella regolazione di eventi biologici associati a immunità innata, risposta allo stress e nanotossicità nei nematodi.

Precedenti studi hanno suggerito che l'espressione intestinale di DAF-16 spiega in gran parte la sua funzione nel regolare la longevità nei nematodi 22, 23, 30 . Tuttavia, l'attività specifica del tessuto di DAF-16 nella regolazione della risposta allo stress o della nanotossicità rimane poco chiara. Inoltre, uno studio precedente ha dimostrato che la segnalazione dell'insulina è coinvolta nel controllo della tossicità del PM 2, 5 sullo sviluppo e sulla funzione dell'intestino nei nematodi 26 . In questo studio, abbiamo scoperto che l'attività specifica dell'intestino di DAF-16 era necessaria per la sua funzione nel regolare la tossicità del GO sulla longevità nei nematodi (Fig. 4, Tabella S4). È interessante notare che abbiamo osservato che l'RNAi intestinale di geni che codificano la cascata di segnalazione di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 influenzava anche la tossicità GO sulla longevità nei nematodi (Fig. 5, Tabella S5). Questi risultati implicano che l'esposizione a GO può ridurre la longevità disregolando le funzioni della cascata di segnalazione di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16, una cascata di segnalazione conservata necessaria per il controllo della longevità, nell'intestino dei nematodi 22, 23 . In altre parole, la segnalazione di insulina intestinale è probabilmente coinvolta nella regolazione della tossicità GO sulla longevità nei nematodi. Ipotizziamo che la segnalazione di insulina alterata potrebbe essere uno dei meccanismi molecolari della tossicità GO sulla longevità nei nematodi (Fig. 7).

In questo studio, abbiamo scoperto che la segnalazione di insulina potrebbe potenzialmente contribuire a un altro meccanismo molecolare per la tossicità GO sulla longevità. I nostri risultati suggeriscono che il DAF-16 ha funzionato a monte di SOD-3 per regolare la tossicità GO sulla longevità (Fig. 6d, Tabella S7). Nei nematodi, il gene sod-3 codifica il sistema antiossidante contro l'induzione dello stress ossidativo. Nei nematodi esposti a GO, la funzione di SOD-3 contro lo stress ossidativo è stata ulteriormente confermata dal test di produzione di ROS nel mutante sod-3 (Fig. S3). È interessante notare che abbiamo scoperto che la mutazione del gene sod-3 potrebbe ulteriormente indurre una significativa induzione della produzione di ROS nei nematodi esposti a GO che sovraesprimono il gene daf-16 nell'intestino (Fig. S3). Questi risultati implicano che l'esposizione a GO può anche ridurre la longevità influenzando le funzioni del sistema antiossidante contro l'induzione di stress ossidativo. Ipotizziamo che questo sia un altro meccanismo molecolare per la tossicità GO sulla longevità, che dipende dalla segnalazione dell'insulina e dal suo importante gene bersaglio sod-3 nei nematodi (Fig. 7). Questo meccanismo proposto fornisce anche la base per il ruolo dello stress ossidativo nell'indurre tossicità GO nei nematodi come descritto in precedenza in altri rapporti 15 .

In C. elegans , il DAF-16 agisce come un fattore di trascrizione per attivare l'attività dei suoi geni bersaglio quando il DAF-16 viene traslocato nel nucleo 22, 23 . È interessante notare che abbiamo osservato che, insieme all'espressione gravemente ridotta di DAF-16, si è scoperto che una certa quantità di DAF-16 veniva traslocata nel nucleo (Fig. 1b). Questi risultati implicano che almeno una certa quantità di DAF-16 traslocata nel nucleo può anche indurre un circuito di feedback positivo tra DAF-16 e altri componenti della via di segnalazione nei nematodi.

In conclusione, abbiamo studiato il coinvolgimento della via di segnalazione dell'insulina nel controllo della tossicità del GO sulla longevità e dei meccanismi sottostanti nei nematodi. Abbiamo identificato una cascata di segnalazione di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 nella via di segnalazione dell'insulina che è coinvolta nel controllo della tossicità GO sulla longevità. Inoltre, abbiamo scoperto che questa cascata di segnalazione ha agito principalmente nell'intestino per regolare la tossicità del GO sulla longevità. Sulla base dei nostri risultati, ipotizziamo che uno dei meccanismi molecolari per la tossicità di GO sia che GO potrebbe disregolare la cascata di segnalazione di DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 nella via di segnalazione dell'insulina. Inoltre, abbiamo scoperto che la via di segnalazione dell'insulina potrebbe codificare un altro meccanismo molecolare per la ridotta longevità indotta da GO. L'esposizione al GO potrebbe sopprimere la funzione del DAF-16 all'interno della segnalazione dell'insulina e, di conseguenza, portare a un'ulteriore inibizione della funzione del SOD-3, che svolge un ruolo importante nella difesa dallo stress ossidativo nei nematodi esposti al GO. I chiariti meccanismi molecolari codificati per la segnalazione dell'insulina per la ridotta longevità indotta da GO evidenziano il ruolo potenziale della via di segnalazione dell'insulina nel controllo della tossicità GO negli organismi.

metodi

Reagenti e preparazione di GO

GO è stato preparato dalla polvere di grafite naturale usando un metodo Hummer modificato 35, 36 . La grafite (2 g) e il nitrato di sodio (1 g) sono stati aggiunti in un matraccio da 250 ml. Dopo l'aggiunta di H 2 SO 4 concentrato (50 mL) su ghiaccio, KMnO4 (7 g) è stato aggiunto alla miscela. E poi, 90 mL di H 2 O sono stati lentamente gocciolati nella pasta dopo che la temperatura della miscela è stata riscaldata a 35 ° C. Dopo agitazione della sospensione diluita a 70 ° C per altri 15 minuti, la sospensione è stata trattata con la miscela di 7 mL di H 2 O 2 al 30% e 55 mL di H 2 O. La sospensione calda risultante è stata filtrata per ottenere un filtro giallo-marrone torta, che è stata ulteriormente lavata con una soluzione di HCl al 3%, seguita da un'essiccazione a 40 ° C per 24 ore. GO è stato ottenuto mediante ultrasuoni dell'ossido di grafite prodotto in acqua per 1 ora.

GO è stato sottoposto a sonicazione per 30 minuti (40 kHz, 100 W) e disperso in mezzo K per preparare una soluzione madre (1 mg / L). La soluzione madre è stata diluita alla concentrazione usata (100 mg / L) con terreno K appena prima dell'esposizione. Uno studio precedente ha suggerito che GO alla concentrazione di 100 mg / L potrebbe ridurre la durata della vita nei nematodi 16 . Tutti gli altri prodotti chimici sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Caratterizzazione di GO

GO è stato caratterizzato da microscopia elettronica a trasmissione (TEM, JEM-200CX, JEOL, Giappone), microscopia a forza atomica (AFM, SPM-9600, Shimadzu, Giappone), spettroscopia Raman utilizzando l'eccitazione della lunghezza d'onda di 632 nm (Renishaw Invia Plus laser Raman spettrometro, Renishaw, Regno Unito) e potenziale zeta analizzati da Nano Zetasizer usando una tecnica di diffusione della luce dinamica. Per eseguire la misurazione AFM, la sospensione GO è stata pipettata su substrati Si e i substrati Si sono stati ulteriormente essiccati all'aria e posizionati sotto la punta AFM.

Preparazione del ceppo di C. elegans

I nematodi sono stati mantenuti su piastre di terreno di crescita nematode (NGM) seminate con Escherichia coli OP50 a 20 ° C come descritto in precedenza 37 . I nematodi utilizzati nel presente studio erano N2 wild-type, mutanti di daf-16 ( mu86 ), daf-2 ( e1370 ), età-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ), akt-2 ( ok393 ), daf -18 ( ok480 ), sod-3 ( gk235 ), daf-16 ( mu86 ); sod-3 ( gk235 ) e daf-16- ( mu86 ); daf-2 ( e1370 ) e ceppi transgenici di VP303 / kbIs7 [ nhx-2p :: rde-1 ], zIs356 [P daf-16 :: daf-16a / b :: GFP ], daf-16 ( mu86 ) Ex (P ges-1-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P unc-14-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo-3-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo-2-daf-16 ), Ex (P ges-1-daf-16 ) ed Ex (P ges-1-daf-16 ); sod-3 ( gk235 ). Alcuni dei ceppi usati sono stati originariamente ottenuti dal Centro di genetica di caenorhabditis (finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)). I nematodi gravidi sono stati lavati via dalle piastre in provette da centrifuga e lisati con una miscela sbiancante (0, 45 M NaOH, 2% HOCl). Popolazioni sincrone di età delle larve L1 sono state preparate come descritto precedentemente 38 . L'esposizione prolungata a GO è stata eseguita da larve di L1 a giovani adulti in piastre di coltura tissutale sterili da 12 pozzetti a 20 ° C in presenza di cibo (OP50). I nematodi esposti sono stati usati per la valutazione della tossicità usando la durata della vita, il comportamento della locomozione e la produzione di ROS come endpoint.

Reazione a catena della polimerasi inversa e quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

Gli RNA totali sono stati estratti utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen), quindi trascritti all'indietro utilizzando il kit di reagenti RT PrimeScript TM (Takara, Otsu, Shiga, Giappone). Dopo la sintesi di cDNA, la PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara) per l'amplificazione dei prodotti PCR. La PCR quantitativa a trascrizione inversa è stata eseguita alla temperatura di ricottura ottimizzata di 58 ° C. È stata determinata la quantificazione relativa dei geni bersaglio rispetto al gene tba-1 di riferimento che codifica per una proteina tubulina. I risultati finali sono stati espressi come rapporto di espressione relativa tra il gene bersaglio e il gene di riferimento. I primer progettati per i geni target e il gene tba-1 di riferimento sono stati mostrati nella Tabella S8. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplicato.

Saggio di traslocazione nucleare DAF-16

La traslocazione nucleare DAF-16 è stata valutata dopo l'esposizione al ceppo transgenico di zIs356 a GO. DAF-16 intestinale :: GFP è stato valutato come localizzazione nucleare nella parte anteriore del corpo. Le immagini sono state scattate con un microscopio a fluorescenza Zeiss Imager A2. Sono stati esaminati tre esperimenti indipendenti con dieci nematodi per trattamento.

Valutazione della tossicità

Il saggio di durata della vita è stato eseguito a 20 ° C, sostanzialmente come descritto 39 . I nematodi ermafroditi sono stati trasferiti quotidianamente per i primi 4 giorni di età adulta. Successivamente, i nematodi venivano controllati ogni giorno. I nematodi verrebbero segnati come morti se non si muovessero anche dopo ripetuti tocchi con una scelta. Sono stati esaminati quaranta nematodi per trattamento e sono stati eseguiti tre replicati.

Il comportamento della locomozione dei nematodi è stato valutato in base agli endpoint del colpo di testa e alla piega del corpo come descritto 40 . Un colpo di testa è stato definito come un cambiamento nella direzione della flessione nella parte centrale del corpo. Una curva del corpo veniva considerata come un cambiamento nella direzione della parte dei nematodi corrispondente al bulbo posteriore della faringe lungo l'asse y , supponendo che il nematode stesse viaggiando lungo l'asse x . Sono stati esaminati venti nematodi per trattamento e sono stati eseguiti dieci replicati.

Il metodo per la produzione di ROS è stato eseguito come descritto precedentemente 41 . Dopo l'esposizione, i nematodi sono stati trasferiti in 1 μM 5 ′, 6′-clorometil-2 ′, 7′-diclorodiidro-fluoresceina diacetato (CM-H2DCFDA; Sonde molecolari) in piastre di coltura tissutale sterili da 12 pozzetti per incubare per 3 ore a 20 ° C al buio senza aggiunta di cibo. I nematodi sono stati montati su cuscinetti di agar 2% per esame a 488 nm di lunghezza d'onda di eccitazione e 510 nm di filtro di emissione con un microscopio confocale a scansione laser (Leica, TCS SP2, Bensheim, Germania). L'intensità di fluorescenza relativa dell'intestino era semi-quantificata. ROS semiquantificato è stato espresso come unità di fluorescenza relativa (RFU) e normalizzato all'autofluorescenza. Sono stati esaminati trenta nematodi per trattamento e sono stati eseguiti cinque replicati.

RNAi

L'RNAi è stato eseguito alimentando i nematodi con il ceppo di E. coli HT115 (DE3) che esprimeva RNA a doppio filamento che è omologa a un gene bersaglio come descritto 42 . E. coli HT115 (DE3) cresciuto in brodo LB contenente ampicillina (100 μg / mL) a 37 ° C durante la notte è stato placcato su NGM contenente ampicillina (100 μg / mL) e isopropil 1-tio-β-D-galactopiranoside (IPTG, 5 mM). Le larve L2 sono state poste su piastre RNAi per 2 giorni a 20 ° C fino a quando i nematodi sono diventati gravidi. Gli adulti gravidi sono stati trasferiti in prati batterici freschi che esprimono RNAi per deporre le uova per 2 ore in modo da ottenere la seconda generazione della popolazione di RNAi. Le uova sono state sviluppate a 20 ° C per i giovani adulti per i successivi test.

Costrutti di DNA e trasformazione germinale

Per generare una sequenza di promotori che trasporta vettore di entrata, sono state amplificate le regioni di promotore per il gene ges-1 espressamente espresse nell'intestino, il gene unc-14 espressamente espresse nei neuroni, il gene myo-3 espressamente espresse nei muscoli e il gene myo-2 espressamente espresso nella faringe mediante PCR da DNA genomico di tipo C. elegans selvaggio. I frammenti del promotore sono stati inseriti nel vettore pPD95_77 nell'orientamento dei sensi. il cDNA daf-16 è stato amplificato mediante PCR e inserito nel corrispondente vettore di entrata che trasportava la sequenza di promotori ges-1, unc-14, myo-3 o myo-2 . La trasformazione della linea germinale è stata eseguita come descritto iniettando il DNA del test ad una concentrazione di 10–40 μg / mL e il DNA marcatore di P lin-44 :: gfp o unc-119 (+) ad una concentrazione di 60 μg / mL nel gonade di nematodi 43 .

analisi statistica

Tutti i dati in questo articolo sono stati espressi come media ± errore standard della media (SEM). I grafici sono stati generati utilizzando Microsoft Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, USA). Le differenze tra i gruppi sono state determinate usando l'analisi della varianza (ANOVA). I livelli di probabilità di 0, 05 e 0, 01 sono stati considerati statisticamente significativi.

Informazioni aggiuntive

Come citare questo articolo : Zhao, Y. et al . La segnalazione intestinale di insulina codifica due diversi meccanismi molecolari per la longevità ridotta indotta dall'ossido di grafene in Caenorhabditis elegans. Sci. Rep. 6, 24024; doi: 10.1038 / srep24024 (2016).

Informazione supplementare

File PDF

  1. 1.

    Informazione supplementare

Commenti

Inviando un commento, accetti di rispettare i nostri Termini e le Norme della community. Se trovi qualcosa di offensivo o non conforme ai nostri termini o linee guida, segnalalo come inappropriato.