Studio del ruolo funzionale degli aplotipi del gene interleuchina-8 nell'uomo attraverso l'editing genomico mediato da crispr / cas9 | rapporti scientifici

Studio del ruolo funzionale degli aplotipi del gene interleuchina-8 nell'uomo attraverso l'editing genomico mediato da crispr / cas9 | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Infiammazione cronica
  • aplotipi

Astratto

I polimorfismi del gene dell'interleuchina-8 ( IL-8 ) sono stati considerati fattori di suscettibilità nella malattia parodontale. Tuttavia, i ruoli funzionali degli aplotipi del gene IL-8 non sono stati studiati. Qui, dimostriamo per la prima volta l'uso del sistema CRISPR / Cas9 per progettare il gene IL-8 e testato la funzionalità di diversi aplotipi. Due vettori di sgRNA rivolti al gene IL-8 e al DNA di riparazione omologa nuda che trasportava diversi aplotipi sono stati usati per generare con successo cellule HEK293T che trasportavano il genotipo AT al primo SNP - rs4073 (alias -251), genotipo TT al secondo SNP - rs2227307 ( alias +396), genotipi TC o CC al terzo SNP - rs2227306 (alias +781) nel locus IL-8 . Quando stimolate con poli I: C, aplotipo ATC / TTC, le cellule hanno regolato in modo significativo l' IL-8 sia a livello trascrizionale che traslazionale. Per verificare se l'aplotipo ATC / TTC è funzionale, abbiamo usato un saggio trans-well per misurare la trasmigrazione dei neutrofili primari incubati con surnatanti dall'esperimento di stimolazione Poly I: C. Le cellule di aplotipo ATC / TTC hanno aumentato significativamente la trasmigrazione dei neutrofili confermando il ruolo funzionale di questo aplotipo IL-8 . Nel loro insieme, i nostri dati forniscono la prova che il trasporto dell'aplotipo ATC / TTC in sé può aumentare l'afflusso di neutrofili nelle lesioni infiammatorie e influenzare la suscettibilità alle malattie.

introduzione

L'interleuchina-8 ( IL-8 ) è una chemochina pro-infiammatoria prodotta da cellule come cellule epiteliali, fibroblasti, cellule endoteliali, macrofagi, linfociti e mastociti in seguito all'esposizione all'ambiente infiammatorio 1 . La secrezione di IL-8 porta all'attivazione e alla migrazione dei neutrofili dal sangue periferico verso i siti di infezione che si manifestano nella clearance dei patogeni. L'induzione controllata di IL-8 è cruciale per il mantenimento dell'equilibrio omeostatico. Ad esempio, un'elevata induzione di IL-8 può portare a un'infiammazione esacerbata nelle malattie infiammatorie croniche 2, 3 . Al contrario, l'inibizione della secrezione di IL-8 può ritardare l'afflusso di neutrofili creando un vantaggio per la sopravvivenza dei patogeni che porta a un'infezione cronica.

Un'espressione elevata di IL-8 è stata attribuita a una serie di malattie come la broncopneumopatia cronica ostruttiva 4, 5, l'ipertensione 6, la carcinogenesi 7, 8, la fibrosi polmonare idiopatica 9, 10, 11 e la parodontite cronica 12 . Precedenti studi hanno studiato l'associazione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) con il livello di espressione del gene IL-8 . Il SNP rs4073 (alias -251) nel gene IL-8 è stato considerato funzionale, poiché l'allele -251A era correlato a livelli più elevati di produzione di IL-8 in vitro , dopo stimolazione con lipopolisaccaride e citochine 13 . Ciò concorda con la scoperta che il genotipo AA di -251 SNP nel gene IL-8 era associato a una maggiore espressione di mRNA di IL-8 14 . Tuttavia, un altro studio ha dimostrato che il genotipo TA in questo SNP -251 era associato ad un aumento dei livelli di mRNA di IL-8 15 .

I polimorfismi genetici sono prevalenti in ogni data popolazione e sono spesso segnalati differire tra salute e malattia 16, 17 . L'associazione tra SNP e parodontite è ben documentata 17, 18, 19 . In particolare, polimorfismi −251 (T / A), +396 (T / G) e +781 (C / T) nel gene IL-8 , che formano l'aplotipo ATC / TTC, sono associati alla malattia parodontale e portatori di questo aplotipo aveva una suscettibilità alla malattia 2 volte superiore rispetto agli altri aplotipi, come ATT / TTC, che non era associato alla suscettibilità alla malattia parodontale 20 . Numerose segnalazioni hanno studiato se i polimorfismi di questo gene influenzano i livelli di periodontopatogeni e la produzione di IL-8 confrontando gli esiti tra i pazienti con diversi aplotipi 21, 22, 23 . Nonostante l'importanza dell'IL-8 nella suscettibilità alle malattie, la spiegazione biologica del ruolo specifico dell'aplotipo IL-8 nella regolazione dell'espressione genica e se la capacità e l'attività dei neutrofili modulati dal trasporto dell'aplotipo IL-8 hanno non è stato affrontato in precedenza. Quindi, per determinare il ruolo dei diversi aplotipi IL-8 nell'attività trascrizionale e traslazionale del gene IL-8 e per testare se influenza la migrazione dei neutrofili, abbiamo usato nucleasi Cas9 guidate da RNA guidate da RNA brevemente intervallate raggruppate modificare il gene IL-8 con facilità, velocità e precisione che ci hanno permesso di studiare gli aspetti funzionali degli aplotipi IL-8 . Il sistema CRISPR / Cas9 è stato recentemente utilizzato nell'ingegneria dei genomi 24, 25, 26 . Questo studio rappresenta un nuovo mezzo per eseguire l'editing del genoma utilizzando un DNA a doppio filamento nudo come modello di riparazione omologa per scoprire il ruolo funzionale dei geni e in questo rapporto ci concentriamo sugli effetti funzionali correlati agli aplotipi IL-8 .

risultati

Clonazione e validazione di CRISPR / Cas9 per l'editing del genoma di IL-8

Per verificare se il sistema CRISPR / Cas9 guidato dall'RNA potesse essere applicato per il doppio nicking genico, le sequenze a singolo filamento di sgRNA1 e sgRNA2 sono state clonate nel vettore pX330 come descritto nella sezione metodi (Fig. 1). I costrutti sono stati verificati mediante sequenziamento del DNA usando il primer di sequenziamento del DNA promotore U6 (5′-CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA-3 ′). Il sequenziamento del DNA e l'allineamento multiplo della regione con oligos a singolo filamento senso e antisenso hanno mostrato la sequenza del promotore U6 a monte e la sequenza di targeting inserita di sgRNA1 e sgRNA2 sul vettore pX330 (Fig. 2A, B).

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La vista espansa illustra la sequenza nucleotidica di IL-8 che abbraccia una porzione del sito di inserimento della sequenza guida con siti Bbsl indicati per l'inserimento della "sequenza guida" (sgRNA) del protospacere.

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Convalidazioni di sequenza dell'inserzione della sequenza di targeting di sgRNA1 (A) e sgRNA2 (B) con sequenza promotore U6 a monte sul vettore pX330. Gli inserti sono stati confermati sequenziando sia i fili in avanti che quelli invertiti.

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Generazione di linee cellulari HEK293T con aplotipi IL-8

Le cellule HEK293T sono state trasfettate con i plasmidi pX330-sgRNA1 e 2 oltre a modelli di riparazione omologhi con diversi aplotipi IL-8 separatamente. I cloni positivi sono stati selezionati come descritto nella sezione dei metodi. I risultati hanno mostrato la generazione di tre condizioni di linee cellulari modificate e non modificate (Fig. 3): 1) Genotipo AT nel primo SNP - rs4073 (alias -251), genotipo TT nel secondo SNP - rs2227307 (alias +396), Genotipo TC al terzo SNP - rs2227306 (alias +781); 2) AT genotipo al primo SNP, genotipo TT al secondo SNP, genotipo CC al terzo SNP; 3) genotipo AA in posizione nucleotidica 1231, genotipo GG in posizione nucleotidica 1877, genotipo TT in posizione nucleotidica 2262. Il metodo CRISPR / cas9 ci ha permesso di creare linee cellulari che trasportavano aplotipi IL-8 . Ricerche recenti suggeriscono che ci sono effetti fuori bersaglio della nucleasi cas9 che creano mutazioni indesiderate 27, 28, 29, 30, 31 . Quindi abbiamo ulteriormente studiato l'effetto off-target di aplotipo sgRNA nel nostro genoma modificato cellule HEK293T usando l'analisi RNA-seq. Affermiamo che i trascrittomi di ATC / TTC e ATT / TTC sono simili ai controlli rispetto alle vie immunologiche. Per testare questa ipotesi abbiamo generato dati di sequenziamento dell'RNA, due replicati ciascuno di ATC / TTC, ATT / TTC e controllo. Con due replicati per condizione siamo limitati nell'analisi dell'espressione differenziale con precisione; quindi abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento informativo nel modo seguente. Abbiamo confrontato i dati permutati in cui combiniamo un aplotipo ATC / TTC e un controllo in un gruppo e l'altro aplotipo ATC / TTC e l'altro controllo in un secondo gruppo. Abbiamo quindi confrontato lo spettro di T-Statistics in questi dati permutati, mediati su tutte le possibili permutazioni, a quello dei dati non calcolati, per ottenere un insieme putativo di 986 geni arricchiti per i geni espressi in modo differenziato a livello di False Discovery Rate (FDR) di 0, 5. Pertanto prevediamo che il 50% dei geni presenti nell'elenco sarà espresso in modo differenziale. Poiché questi saranno un campione casuale di tutti i geni espressi in modo differenziato, se eventuali percorsi sono arricchiti tra i geni espressi in modo differenziato, saranno anche arricchiti nell'insieme putativo e come tali produrranno significativi valori p in un'analisi di arricchimento. Se i geni immunologici fossero influenzati in modo diverso tra aplotipi e controllo, questo elenco arricchito dovrebbe mostrare un arricchimento significativo della via per i geni correlati alla via immunologica. Abbiamo esaminato l'elenco tramite Ingenuity Pathway Analysis (IPA) producendo nove percorsi significativamente arricchiti, il più significativo dei quali ha un valore p di arricchimento di 6, 89E-05. I percorsi notevolmente arricchiti sono: rimodellamento delle giunzioni epiteliali degli aderenti, riparazione del disadattamento, segnalazione ILK, segnalazione del cancro al seno ereditario, segnalazione della giunzione epiteliale degli aderenti, segnalazione EIFT, glicolisi I, regolazione della poliammina nel carcinoma del colon e segnalazione degli androgeni, nessuna delle quali è correlata all'immunologia percorsi. Allo stesso modo abbiamo studiato l'aplotipo ATT / TTC producendo un elenco di 217 geni a livello 0, 5 FDR. In questo caso i percorsi significativamente arricchiti sono stati la segnalazione EIF2, la regolazione della poliammina nel cancro al colon e la fermentazione del piruvato. Non ci sono stati percorsi immunologici arricchiti per aplotipo ATT / TTC. Il raggruppamento heirarchico con la distanza euclidea di geni espressi in modo differenziale mostrava strette somiglianze tra aplotipi (Fig. 4A). Abbiamo generato il diagramma di Venn che rappresenta il numero di geni significativamente diversi tra gli aplotipi e il controllo (Fig. 4B).

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( A ) cellule HEK293T con aptlotipo ATT / TTC IL-8 ; ( B ) cellule HEK293T con aplotipo IL-8 ATC / TTC; ( C ) Cellule HEK293T senza IL-8 Haplotype (tipo selvaggio). I prodotti Genomic PCR (gPCR) sono stati amplificati da cellule HEK293T trasfettate con plasmidi pX330-sgRNA oltre a modelli omologhi di riparazione che presentano diversi aplotipi IL-8 (frecce e sfondo scuro sul cromatogramma e sequenze che mostrano rispettivamente nucleotidi corrispondenti).

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L'RNA-seq è stato eseguito su campioni duplicati (due esperimenti indipendenti) per determinare l'espressione della trascrizione differenziale delle cellule HEK293T modificate dal genoma. ( A) Mostra il raggruppamento gerarchico con la distanza euclidea (Non trattato: vettore vuoto, H1: Haplotype 1 e H2: Haplotype 2. ( B) Diagramma di Venn che mostra il numero di trascrizioni che sono significativamente differenti in H1 e H2 rispetto alle celle wild type.

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Aplotipo ATC / TTC up-regola il gene IL-8 a livello trascrizionale e traslazionale

Per identificare la regolazione delle citochine nelle cellule modificate dal gene e di tipo selvaggio, abbiamo stimolato con la stimolazione con un agonista TLR3 poli I: C per determinare se il trasporto dell'aplotipo influisce o meno sui livelli trascrizionali. Dopo 24 ore di stimolazione, i livelli di IL-8 messenger RNA (mRNA) sono stati misurati mediante PCR quantitativa in tempo reale. L'analisi ha rivelato che lo stimolo Poly I: C ha migliorato l'espressione dell'mRNA di IL-8 rispetto al controllo negativo non stimolato come previsto (Fig. 5A). È interessante notare che i livelli di mRNA di IL-8 indotti da cellule portatrici di aplotipo ATC / TTC erano significativamente più alti rispetto ai livelli di mRNA di IL-8 indotti da aplotipo ATT / TTC sotto lo stimolo poli I: C (Fig. 5A).

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( A) I livelli di mRNA di IL-8 in CRISPR / Cas9 hanno modificato le cellule HEK293T. PCR quantitativa in tempo reale che mostra l'espressione dell'mRNA di IL-8 in cellule HEK293T modificate e selvagge sfidate con Poly I: C per 24 ore. Le cellule non stimolate servivano da controllo negativo. L'aplotipo ATC / TTC ha significativamente aumentato i livelli di mRNA di IL-8 su trattamento Poly I: C. I valori rappresentano la media ± DS di almeno tre esperimenti indipendenti (* valore p <0, 05). ( B) Espressione della proteina IL-8 nelle cellule HEK293T a cura di CRISPR / Cas9. ELISA è stato eseguito da cellule modificate e di tipo selvatico stimolate con Poly I: C per 24 ore. Le cellule non stimolate servivano da controllo negativo. L'aplotipo ATC / TTC ha significativamente aumentato i livelli di proteina IL-8 al trattamento con Poly I: C. I valori rappresentano la media ± DS di almeno tre esperimenti indipendenti (* valore p <0, 05).

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L'aumento dei livelli di mRNA nelle cellule ci ha spinto a testare i livelli di proteina IL-8 nei supernatanti. Le cellule di tipo genetico modificato e selvaggio sono state stimolate con Poly I: C per 24 ore come descritto sopra. L' IL-8 secreto è stato misurato nel surnatante dall'ELISA. Come previsto, i campioni stimolati con poli I: C presentavano livelli più elevati di IL-8 rispetto ai campioni non stimolati (Fig. 5B). Simile ai livelli di mRNA, i livelli di proteina IL-8 indotti dall'aplotipo ATC / TTC erano significativamente più alti rispetto ai livelli di proteina IL-8 indotti dall'aplotipo ATT / TTC su stimolazione poli I: C (Fig. 5B).

L'aplotipo IL-8 ATC / TTC aumenta la trasmigrazione di PMN

Per testare la funzionalità di diversi aplotipi sul gene IL-8 , abbiamo selezionato cellule modificate e di tipo selvaggio per determinare se uno qualsiasi degli aplotipi è alterato nella loro capacità di promuovere la trasmigrazione di PMN. Come previsto, la capacità di indurre la trasmigrazione di PMN nel surnatante di cellule non stimolate era inferiore rispetto alle cellule stimolate con poli I: C. La risposta al controllo negativo (media DMEM) era minima contraria all'IL-8 umano ricombinante, che viene usato come controllo positivo, era il più alto rispetto ad altre condizioni. È stato anche osservato che le cellule che trasportavano aplotipo ATC / TTC aumentavano notevolmente la sua capacità di indurre la trasmigrazione di PMN rispetto a aplotipo ATT / TTC con stimolazione poli I: C (Fig. 6). Questo aumento della migrazione potrebbe essere dipendente dalla concentrazione poiché il tipo di cellula ATC / TTC ha indotto una maggiore induzione di IL-8 .

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Le cellule del genoma modificate e di tipo selvaggio sono state stimolate con Poly I: C e il supernatante è stato utilizzato nel sistema di transwell per monitorare se le cellule sono alterate o meno nella loro capacità di promuovere la trasmigrazione di PMN. Dopo il test di migrazione, il numero medio di cellule PMN migrate viene analizzato da FACS (A) e tracciato in un diagramma a barre in cui i risultati sono espressi come media ± SD ottenuta da 6 campi / gruppo con il controllo negativo e positivo (B) . Supernatant di aplotipo ATT / TTC ha reclutato neutrofili significativamente più alti rispetto a quello di tipo selvaggio. I confronti statistici provengono da tre esperimenti indipendenti (* valore p <0, 05).

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Discussione

L'interleuchina-8 ( IL-8 ) è considerata un'importante chemochina nella malattia parodontale. Questa citochina è prodotta da una varietà di cellule e può funzionare in concerto con altri membri della famiglia delle citochine per regolare le risposte innate dell'ospite 2, 32, 33, 34 . In particolare, questa citochina attira i leucociti dalla periferia ai siti di infezione e li attiva per diventare fagociti. La somministrazione intra-cutanea di IL-8 ha indotto essudazione locale e accumulo duraturo di neutrofili 35 . Sebbene ci siano altre chemochine coinvolte nel reclutamento dei neutrofili nel sito di infezione, i topi knock-out del recettore IL-8 hanno mostrato un afflusso ritardato di neutrofili nei reni e nella vescica e non sono stati in grado di eliminare i batteri dai tessuti 36, 37 . Ciò suggerisce che IL-8 è indispensabile per la migrazione e la funzione dei neutrofili. La funzione dei neutrofili non è importante solo nelle infezioni acute, ma svolge anche un ruolo importante nei disturbi infiammatori cronici come parodontite, aterosclerosi, psoriasi, artrite reumatoide, malattie infiammatorie intestinali, diabete e cancro 38, 39 .

Le recenti meta-analisi hanno mostrato un'associazione positiva di polimorfismo -251 (T / A) sul gene IL-8 alla parodontite cronica 40, T / + 3954C> T Polimorfismi e parodontite aggressiva Suscettibilità: evidenze da una meta-analisi. Med Sci Monit 21, 1617–1624 (2015). "Href = / articles / srep31180 # ref41 aria-label =" Riferimento 41 "traccia-dati = clic etichetta-traccia-dati = collegamento> 41. Pochi studi caso-controllo hanno hanno studiato diversi aplotipi nel gene IL-8 che sono stati trovati associati alla parodontite 20, 42, 43, come l'aplotipo ATC / TTC i cui portatori di questo particolare aplotipo presentavano una suscettibilità alla malattia due volte superiore 20 . I livelli di proteina IL-8 nel GCF dei pazienti non erano correlati al trasporto di aplotipo ATC / TTC 22. Questa assenza di correlazione potrebbe essere attribuita alla dimensione limitata del campione in quello studio, oltre a quelli con parodontite cronica arruolati in quello studio erano non influenzato dalle forme di malattia gravi e generalizzate.

Di fronte alla mancanza di saggi funzionali, abbiamo ipotizzato che uno studio in vitro con condizioni più controllate potrebbe essere in grado di rilevare la potenziale influenza di diversi aplotipi nell'mRNA di IL-8 e nei livelli di proteine. Questo presente studio ha dimostrato che la presenza di aplotipo ATC / TTC può sovraregolare l' IL-8 sia nei livelli di mRNA che di proteine. Questi livelli più elevati di mRNA e proteina IL-8 associati alla migrazione dei neutrofili potrebbero spiegare i livelli più bassi di periodontopatogeni riscontrati in pazienti con aplotipo ATC / TTC 21, 44 . Inoltre, alti livelli di IL-8 possono aumentare la risposta infiammatoria e immunitaria e il conseguente danno all'integrità del parodonto. Riteniamo che le presenti scoperte potrebbero spiegare perché la distruzione parodontale può verificarsi in pazienti considerati geneticamente sensibili alla parodontite cronica con una sfida microbica inferiore a causa della presenza dell'aplotipo IL-8 ATC / TTC rispetto ai pazienti senza di essa 21, 44 .

Lo stesso aplotipo ATC / TTC ha anche dimostrato di essere associato con l'asma bronchiale, mentre il rs4073T> A SNP quando testato da solo non ha mostrato un'associazione significativa 45 . Altri studi hanno riportato una simile mancanza di associazione con la parodontite cronica quando un SNP è stato analizzato individualmente, ma quando l'aplotipo è stato considerato nell'analisi, l'associazione con la malattia è stata rivelata 43, 46 . Pertanto, questi studi confermano l'idea che gli aplotipi sono più potenti per il rilevamento dell'associazione della malattia rispetto ai singoli polimorfismi e possono fornire maggiori informazioni sulla base della malattia 43, 47 . Nonostante il ruolo funzionale precedentemente riportato di rs4073T> A SNP 13, uno studio di Hacking et al. 48 non ha confermato questa associazione 48 . Hacking et al. e altri hanno suggerito che l'esistenza di un altro SNP (più vicino a rs4073T> A) potrebbe svolgere un ruolo nel modulare l'espressione genica di IL-8 20, 48, 49, 50 . Quindi, abbiamo notato nel nostro studio che l'SNP +781 (C / T) rs2227306 nel gene IL-8 sembra influenzare l' IL-8 sia a livello di mRNA che di proteine, considerando che la differenza negli aplotipi analizzati qui era correlata a gli alleli in quella posizione.

Uno studio di Ahn et al. , in pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF) hanno mostrato livelli aumentati di IL-8 in pazienti che trasportano l'allele A in rs4073T> Un SNP A nell'allele comune del gene interleuchina 8 è associato allo sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica attraverso l'IL -8 modalità di potenziamento delle proteine. Respir Res 12, 73 (2011). "Href = / articles / srep31180 # ref51 aria-label =" Riferimento 51 "data-track = click data-track-label = link> 51. Gli autori hanno usato un saggio luciferase per misurare il attività e ha determinato il livello di IL-8 in presenza o in assenza del promotore SNP. Hanno trovato una maggiore attività della luciferasi in presenza di rs4073T> Un SNP sul promotore del gene IL-8 . Gli autori hanno concluso che il promotore IL-8 SNP potrebbe aumentare la suscettibilità allo sviluppo dell'IPF attraverso l'up-regolazione dell'IL-8 A nell'allele comune del gene interleuchina 8 è associata allo sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica attraverso la modalità di potenziamento della proteina IL-8. Respir Res 12, 73 ( 2011)." href = / articles / srep31180 # ref51 aria-label = "Riferimento 51" data-track = clicca data-track-label = link> 51 . Utilizzando un simile sistema vettoriale reporter, Meade et al. , ha studiato gli aplotipi di promotore IL-8 bovino in vitro . Gli autori hanno scoperto che il promotore della luciferasi che trasportava uno degli aplotipi IL-8 -h2 (C – GTAC) attività luciferasi altamente up-regolata su stimolazione LPS e TNF confermando la funzionalità SNP e suggerendo un fattore trascrizionale differenziale che si lega al promotore IL-8 -h2 (come C / EBP, 1-ott, NFκB e NFAT) 52 . Hacking et al. 48 hanno osservato che C / EBPb (CCAAT / proteina beta-legante del potenziatore) legato al complesso trascrizionale in presenza di rs4073T> Un allele nelle cellule epiteliali respiratorie ma non nelle cellule linfocitarie primarie che suggerisce la specificità del tipo cellulare nella regolazione trascrizionale 48 . Sebbene i saggi sui reporter di luciferase siano una tecnica accettata che può essere utilizzata per testare la funzionalità di SNP, riteniamo che sia un sistema artificiale che non contiene elementi regolatori complessi presenti sulla cromatina. Per ovviare a questa lacuna nell'analisi funzionale degli aplotipi e testare la nostra ipotesi, abbiamo adottato una nuova tecnica chiamata sistema di nucleasi Cas9 53 guidato da RNA guidato da RNA (CRISPR) raggruppato regolarmente intervallato per modificare il gene IL-8 nella linea cellulare renale embrionale umana (HEK293T). Questa tecnologia è attualmente un argomento ardente nel campo dell'editing del genoma e uno strumento prezioso per ingegnerizzare i genomi di scelta 54 . Per generare linee cellulari di editing IL-8 , scegliamo le celle HEK293T come sistema modello in quanto questa linea cellulare è comunemente usata con la tecnologia CRISPR / Cas9, rendendole un sistema modello consolidato per testare l'efficacia delle endonucleasi guidate dall'RNA nella modifica genica 55, 56 . Con questa tecnica, siamo stati in grado di modificare con successo il gene IL-8 all'interno del genoma HEK293T per trasportare diversi aplotipi con precisione e facilità senza precedenti. Inoltre, siamo stati in grado di testare l'effetto di diversi aplotipi nella trascrizione del gene IL-8 , proteine ​​e anche valutare funzionalmente la loro capacità nel modulare la trasmigrazione dei neutrofili. La metodologia utilizzata a questo scopo offre un framework semplice e applicabile per la generazione di linee cellulari modificate convalidate. Il nostro flusso di lavoro è adattato da metodi precedentemente pubblicati e / o protocolli sviluppati internamente, in particolare utilizzando DNA a doppio filamento nudo per l'editing del genoma che può essere diviso in quattro fasi: 1) design del target sgRNA 30 ; 2) costruzione di vettore di espressione sgRNA 57 ; 3) Modelli di riparazione omologhi alla riparazione diretta dall'omologia (HDR); 4) Colture cellulari e trasfezioni. Questa metodologia che utilizza il sistema CRISR / Cas9 ha dimostrato che la presenza di aplotipo ATC / TTC può sovraregolare l' IL-8 nelle cellule HEK293T su stimolazione Poly I: C. Roy et al. , ha generato due linee cellulari clonali destinate all'esone 1 del gene WNK1 usando una tecnica simile in un breve periodo di tempo 55 . Poiché il sistema CRISPR / Cas9 è ancora nuovo e in fase di convalida, abbiamo trovato meno pubblicazioni relative al SNP e alla modifica dell'aplotipo in generale. Sebbene, negli ultimi due anni, ci sia stato un enorme sviluppo e utilizzo di questa tecnica, sfortunatamente, nucleasi programmabili come nucleasi del dito dello zinco, nucleasi dell'effettore della trascrizione, nucleasi ingegnerizzate guidate dall'RNA (RGEN) e il sistema CRISPR / Cas9 possono indurre off- mutazioni bersaglio all'interno del genoma 27, 28, 29, 30, 31 . Varie piattaforme tecnologiche sono ancora in fase di sviluppo per affrontare gli effetti off-target di queste nucleasi 58, 59 per essere in grado di modificare o alterare le sequenze di sgRNA per minimizzare o eliminare la scissione indesiderata da nucleasi guidate. A questo proposito, abbiamo usato l'analisi dell'RNA-seq su tutto il genoma per determinare l'espressione differenziale delle trascrizioni nelle nostre cellule modificate dal genoma. Tuttavia, abbiamo trovato trascrizioni espresse in modo diverso nell'aplotipo ATC / TTC rispetto al controllo, ma ciò rappresentava circa il 2, 8% della differenza del trascrittoma (986 su 34.917 trascrizioni). Tuttavia, non abbiamo trovato alcun arricchimento per i percorsi immunologici nelle cellule modificate dal genoma. Tuttavia, siamo d'accordo sul fatto che si deve essere estremamente attenti nel progettare sgRNA per alterare il genoma di interesse.

In sintesi, i nostri dati dimostrano che l'ATC / TTC nel gene IL-8 può avere un esito positivo sui livelli trascrizionale e traslazionale del gene IL-8 e quindi modulare il reclutamento dei neutrofili nel sito di infezione. Nel loro insieme, a causa del ruolo fondamentale che i neutrofili hanno nella malattia parodontale, è plausibile che il trasporto di un particolare aplotipo IL-8 ATC / TTC possa contribuire alla suscettibilità alla malattia parodontale.

Materiale e metodi

Costruzione vettoriale CRISPR-Cas9

Il vettore bicistronico pX330 è stato ottenuto da Addgene (pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 era un regalo di Feng Zhang (Addgene plasmid # 42230)). Questo vettore costruito con cDNA codificante Streptococcus pyogenes Cas9 (hSpCas9) ottimizzato per il codone umano che si lega e scinde il DNA e una CRISPR RNA adattabile (crRNA) / chimera di crRNA transattivante contenente siti di clonazione BbsI adiacenti per protospacer “sequenza guida” (sgRNA ) inserimento (Fig. 1). Il plasmide è stato trasformato in cellule competenti per DH5α (Life Technologies, US) ed è stato selezionato su piastre LB da 100 μg / mL di ampicillina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Una singola + + colonia batterica è stata inoculata in 1 ml di terreno LB e lasciata crescere su uno shaker a 37 ° C. Dopo una coltura durante la notte, il plasmide è stato isolato utilizzando un kit PureLink Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen, Carlsbad, CA).

sgRNA Target Design

Al fine di migliorare la specificità degli off-target, è stato utilizzato il programma Target Finder del laboratorio Feng Zhang per progettare sgRNA 30 specifico. La scissione del DNA richiede l'interazione sinergica di due moduli indipendenti di legame del DNA che codificano la specificità. Questo ci ha permesso di definire i parametri per la selezione di coppie sgRNA che facilitano l'effettivo doppio nicking in cui gRNA1 doveva essere a valle del primo SNP (-251) e gRNA2 a monte del terzo SNP (+781) dell'IL-8 gene. Pertanto, sono state selezionate sequenze guida da 28 bp e 27 bp rivolte al DNA in base al protospacer previsto ad alta specificità adiacente ai siti target motif (PAM) sul gene IL-8 . Due oligo complementari contenenti sequenza guida, inclusi gli adattatori di legatura BbsI, sono stati sintetizzati dalle tecnologie IdtDNA per ciascuna sequenza.

costruzione di vettore di espressione sgRNA

Il DNA a singolo filamento senso e antisenso di ciascuna coppia di oligo (100 mM) sono stati ricotti usando 0, 5 μL di polinucleotide chinasi T4 (New England Biolabs, MA) e 1 μL 10X T4 Tampone di legatura in un volume totale di 10 μL incubando la miscela di oligo a 37 ° C per 30 minuti, quindi 95 ° C per 5 minuti, seguito da una rampa a 25 ° C a 5 ° C / min 60 . Gli oligo ricotti (gRNA1 e gRNA2) sono stati legati nel vettore pX330 digerito con BbsI usando 2 μL 10x Fast Digest Buffer (Life Technologies, Paisley, UK) e 0, 5 μL di T7 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA) 57 . La miscela di legatura è stata trattata con esonucleasi Plasmid Safe e trasformata in cellule DH5α chimicamente competenti One-Shot (Life Technologies, Paisley, Regno Unito). I cloni trasformati sono stati selezionati su piastre LB da 100 μg / mL di ampicillina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Dopo l'estrazione del DNA plasmidico (Qiagen, CA), la sequenza del costrutto è stata verificata mediante analisi automatizzata della sequenza del DNA eseguita presso il centro di sequenziamento del DNA dell'Università della Pennsylvania.

Modello di riparazione omologa

La generazione di una rottura mirata del DNA a doppio filamento (DSB) crea molteplici scelte di riparazione 53 . Un DSB può essere riparato mediante riparazione diretta dall'omologia (HDR) utilizzando DNA omologa come modello. Per il nostro scopo sperimentale, i modelli di riparazione omologhi sono stati costruiti in due fasi. Innanzitutto, abbiamo sequenziato il DNA di soggetti umani non identificati dal precedente studio 20 per confermare e selezionare il campione di DNA che rappresentava l'aplotipo ATT / TTC e un campione che rappresentava l'aplotipo ATC / TTC. In secondo luogo, abbiamo amplificato mediante PCR il frammento corrispondente alla stessa regione che è stata eliminata dal complesso CRISPR / Cas9 con l'inserto di sequenza guida 1 e l'inserto di sequenza guida 2 (Tabella 1). I prodotti delle reazioni sono stati verificati su gel di agarosio all'1%. I frammenti di interesse sono stati eliminati dal gel per la purificazione utilizzando il kit di purificazione PureLink (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguendo le istruzioni del produttore e verificato mediante sequenziamento del DNA.

Tabella a grandezza naturale

Coltura cellulare e trasfezione

Le cellule HEK293T sono state coltivate in piastre da sei pozzetti al 50-60% di confluenza con terreno affamato pre-riscaldato (DMEM integrato con siero bovino fetale dializzato al 10% e penicillina / streptomicina all'1%) e incubato in un incubatore di CO 2 al 5% a 37 ° C. Le trasfezioni sono state eseguite in quattro diverse condizioni: 1. Trasfezione con due specifici costrutti plasmidici CRISPR / Cas9 oltre al modello di riparazione omologa con aplotipo ATT / TTC; 2. Trasfezione con due specifici costrutti CRISPR / Cas9 oltre al modello di riparazione omologa contenente aplotipo ATC / TTC; 3. Trasfezione con due costrutti specifici CRISPR / Cas9; 4. Controllo negativo (cellule trasfettate con TE (1X) e reagente per trasfezione. Un totale di 2, 5 × 10 5 cellule sono state trasfettate con 0, 5 μg di ciascun plasmide sgRNA e 0, 2 μg di DNA template usando il reagente GenMute (SignaGen Laboratories, MD) secondo secondo le istruzioni del produttore. Il mezzo è stato sostituito con un mezzo fresco il giorno seguente e 48 ore dopo la trasfezione. Settantadue ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte, la bassa densità delle cellule è stata contata, diluita a 1 × 10 4 cellule / ml e 2 μl / pozzetto sono stati trasferiti in piastre da 96 pozzetti per la selezione clonale. Il DNA genomico è stato estratto utilizzando il mini kit QIAmp DNA (Qiagen, CA). Una reazione PCR è stata eseguita utilizzando l'inserto sequenza 1 guida in avanti e l'inserto sequenza sequenza 2 inneschi inversi (Tabella 1) Gli omologhi inserti del modello di riparazione con gli SNP sono stati confermati dall'analisi della sequenza del DNA eseguita presso la struttura centrale di sequenziamento del DNA dell'Università della Pennsylvania. Su 10 cloni ciascuno, 4 cloni da aplotipo ATT / TTC e 1 clone f l'aplotipo ATC / TTC è risultato positivo.

Analisi di RNA-seq

Le letture di sequenze non elaborate ottenute da Illumina HiSeq 2500 V4 100bp sequenziamento a lettura singola sono state filtrate per conservare solo letture di alta qualità. I dati sono stati allineati al genoma con STAR 61 . L'elaborazione a basso livello è stata eseguita con la pipeline PORT (github.com/itmat/Normalization). PORT rimuove l'RNA ribosomiale mediante l'allineamento BLAST con l'RRNA di riferimento. PORT quindi equalizza il segnale dell'esone su tutti i campioni campionando casualmente le letture per produrre file SAM con un numero uguale di mappatori di esoni in tutti i campioni. PORT si normalizza per diversi altri fattori, inclusi elementi altamente variabili altamente espressi. I dati sono stati quindi quantificati a livello genico usando l'annotazione genica ENSEMBL. I geni espressi in modo differenziale tra controllo e campioni di aplotipo derivati ​​da CRISPR / cas9 sono stati determinati usando il controllo FDR di PaGE 62 . L'analisi del percorso è stata eseguita da Ingenuity IPA (www.ingenuity.com/products/ipa). Tutti i percorsi con valore p inferiore a 1.0E-4 sono stati considerati significativi, che in pratica nell'analisi dei percorsi è un criterio liberale. È stato richiesto un criterio liberale per l'argomento secondo cui nessuna via immunologica era interessata.

Stimolazione delle cellule HEK293T

La via TLR3 induce l'espressione di IL-8 quando stimolata da poli I: C, un agonista TLR3 63 . Per eseguire l'analisi funzionale, le cellule HEK293T che sono state modificate dal genoma per trasportare aplotipi e insieme alle cellule di controllo sono state coltivate in piatti da sei pozzetti fino al 70-80% di confluenza con terreno affamato pre-riscaldato (DMEM integrato con siero bovino fetale dializzato al 10% e Penicillina / streptomicina all'1%) e incubate in terreno fresco affamato in un incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C. Un totale di 0, 5 × 10 6 cellule sono state stimolate con Poly I: C di 5 μg / mL per le 24 ore. Vi erano sei condizioni: 1) cellule HEK293T con aplotipo ATT / TTC stimolate con agonista TLR3 poli I: C; 2) cellule HEK293T con aplotipo ATC / TTC stimolate con agonista TLR3 poli I: C; 3) Cellule HEK293T stimolate con agonista TLR3 poli I: C; 4) cellule HEK293T con aplotipo ATT / TTC non stimolato; 5) cellule HEK293T con aplotipo ATC / TTC non stimolato; 6) Cellule HEK293T non stimolate. Successivamente, sono stati condotti esperimenti per la valutazione dell'espressione genica dell'IL-8 , la quantificazione della proteina IL-8 e la migrazione dei neutrofili.

Isolamento dei neutrofili

Cinque millilitri di sangue intero sono stati ottenuti mediante venipuntura in provette contenenti eparina di sodio (BD Biosciences, CA). I neutrofili sono stati isolati secondo Nauseef 64 . I neutrofili sono stati lavati più volte e risospesi in mezzo DMEM preriscaldato. I neutrofili umani sono stati isolati da volontari sani con il consenso informato firmato approvato dall'Institute Review Board (IRB) dell'Università della Pennsylvania. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'IRB dell'Università della Pennsylvania. L'indagine è stata condotta in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki.

Saggio di trasmigrazione PMN

Abbiamo adattato un protocollo di test di trasmigrazione dei neutrofili come precedentemente descritto 65 . Il test è stato condotto in una camera modificata a 24 pozzetti (dimensione dei pori di 3, 0 μM) (Corning Incorporated, NLD). Ottocento microlitri del surnatante descritto nel passaggio sopra sono stati collocati in ciascun pozzetto. L' IL-8 umano ricombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) è stato usato come controllo positivo e solo il mezzo DMEM è stato usato come controllo negativo. Successivamente i PMN (1 × 10 6 ) sono stati aggiunti alla camera superiore (basolaterale) e incubati a 37 ° C per 2 ore. I PMN migrati attraverso la camera inferiore (apicale) sono stati quantificati mediante selezione delle cellule attivata per fluorescenza (FACS) utilizzando il citometro a flusso BD Accuri ™ C6.

RT-PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale di ciascuna condizione è stato isolato utilizzando il kit RNeasy (Qiagen, CA) secondo le istruzioni del produttore. L'integrità e la quantità di RNA sono state controllate mediante spettrometria con uno spettrofotometro NanoDrop ND1000. Cinque microgrammi di RNA totale sono stati usati per la sintesi di cDNA con il kit di archivio cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, CA). La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando il cDNA (50 ng) con IL-8 come primer e sonda e GAPDH come controllo endogeno sul sistema ABI 7500 Fast (Applied Biosystems, CA) in presenza di TaqMan DNA polimerasi secondo Benakankakere et al. 66 I dati sono stati analizzati con il metodo DDCT 67 normalizzando il livello di mRNA in mRNA AGT / TTC con stimolo poli I: C.

ELISA

Sono stati usati duecento microlitri di supernatante di coltura descritto nel passaggio "Stimolazione delle cellule HEK293T con poli I: C". Il livello di IL-8 è stato misurato mediante test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) utilizzando un kit disponibile in commercio (BD Biosciences, CA) secondo le istruzioni del produttore. L'assorbanza è stata letta a 450 nm. Le concentrazioni sono state espresse in pg / ml.

Analisi statistica

I dati visualizzati per ogni figura provengono da almeno tre esperimenti indipendenti con una media (deviazione standard) di almeno tre punti / condizioni di dati indipendenti. Ogni esperimento è stato ripetuto più volte dando risultati simili. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). I dati sono stati analizzati con ANOVA a senso unico seguito dai test di confronto multipli di Tukey. Le differenze statistiche sono state considerate significative a livello di p <0, 05 e indicate da un asterisco (p <0, 05 (*)).

Informazioni aggiuntive

Come citare questo articolo : Benakanakere, MR et al. Studio del ruolo funzionale degli aplotipi del gene umano Interleuchina-8 mediante editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9. Sci. Rep. 6, 31180; doi: 10.1038 / srep31180 (2016).

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