Tossicità letale causata dall'espressione di shrna nello striato di topo: implicazioni per la progettazione terapeutica | terapia genetica

Tossicità letale causata dall'espressione di shrna nello striato di topo: implicazioni per la progettazione terapeutica | terapia genetica

Anonim

Soggetti

  • Espressione genica
  • Sindromi da neurotossicità
  • RNAi

Astratto

L'interferenza terapeutica dell'RNA (RNAi) è emersa come un approccio promettente per il trattamento di molte malattie incurabili, tra cui il cancro, le malattie infettive o i disturbi neurodegenerativi. È necessario dimostrare l'efficacia e la sicurezza nei modelli animali prima di pianificare l'applicazione umana. Il nostro gruppo e altri hanno precedentemente dimostrato il potenziale di questo approccio per la distonia DYT1 della malattia neurologica ereditaria dominante ottenendo un potente silenziamento mediato da RNA (shRNA) della proteina della malattia, torsina A, nelle cellule in coltura. Per stabilire la fattibilità di questo approccio in vivo , abbiamo perseguito la consegna virale di shRNA in due diversi modelli di topo. Sorprendentemente, le iniezioni intrastriatali di vettori sierotipo 2/1 del virus adeno-associati (AAV2 / 1) che esprimono shRNA diversi, sia per quanto riguarda l'espressione della torsina A sia per i controlli non corrispondenti, hanno provocato una tossicità significativa con perdita progressiva di peso, disfunzione motoria e morte degli animali. L'analisi istologica ha mostrato neurodegenerazione indotta da shRNA. La tossicità non è stata osservata negli animali che hanno ricevuto il controllo AAV2 / 1 senza codifica shRNA ed era indipendente dal genotipo, verificandosi sia in DYT1 che in animali selvatici. È interessante notare che il diverso background genetico di entrambi i modelli di topo ha influenzato la tossicità, essendo precedente e più grave in 129 / SvEv rispetto ai topi C57BL / 6. In conclusione, i nostri studi dimostrano che l'espressione di shRNA nel cervello dei mammiferi può portare a tossicità letale. Inoltre, il background genetico dei roditori modifica la loro sensibilità a questa forma di tossicità, un fattore che dovrebbe essere preso in considerazione nella progettazione di studi preclinici terapeutici sull'RNAi.

introduzione

La terapia di interferenza dell'RNA (RNAi) sta emergendo come una potente strategia per mettere a tacere gli alleli che causano malattie, fornendo potenziali trattamenti per malattie precedentemente incurabili. Numerosi laboratori hanno applicato l'RNAi terapeutico nei modelli di roditori della malattia neurodegenerativa, come la malattia di Huntington o la malattia di Alzheimer, con un efficace silenziamento del gene legato alla malattia, portando a miglioramenti nei fenotipi della malattia. 1 Tuttavia, nonostante la promessa di questi primi studi preclinici, recenti rapporti hanno sollevato importanti preoccupazioni sulla sicurezza di questa modalità terapeutica. Gli effetti avversi osservati in vivo derivano dalla saturazione della via endogena del microRNA (miRNA), soprattutto quando RNA ad alta sovraespressione (shRNA). La morte degli animali è stata osservata quando si applicano gli shRNA ai tessuti non neurali, mentre nel cervello dei mammiferi è stata descritta una tossicità meno drammatica, probabilmente dovuta a effetti off-targeting. 2, 3, 4, 5

DYT1, una malattia neurologica ereditaria dominante senza cura, è la forma più comune di distonia ereditaria ad esordio precoce. 6 Quasi tutti i pazienti con DYT1 presentano una mutazione nel gene TOR1A , che provoca una delezione dell'acido glutammico nella proteina torsina A (torA (ΔE)). 7 L'attuale ipotesi della patogenesi DYT1 ipotizza che torA (ΔE) agisca attraverso un effetto negativo dominante su torA (wt), portando a una perdita totale della funzione torA. 8, 9, 10 Studi completati in cellule coltivate dal nostro gruppo e altri hanno dimostrato che il silenziamento allele-specifico del torA (ΔE) mediato dall'RNAi previene e inverte i fenotipi associati al DYT1, fornendo così una potenziale efficacia terapeutica. 8, 10, 11 Inoltre, il silenziamento non specifico di entrambi gli alleli torA è dannoso 10 e, di conseguenza, potrebbe essere usato per innescare o peggiorare il fenotipo dei topi DYT1. Qui, abbiamo progettato esperimenti per stabilire l'efficacia terapeutica e la sicurezza del silenziamento allele-specifico di torA (ΔE) mediato dall'RNAi in un modello murino transgenico di distonia DYT1. Parallelamente, miravamo a innescare un fenotipo motorio nei topi knock-in (KI) DYT1 attraverso il silenziamento non specifico di torA.

Inaspettatamente, abbiamo rilevato tossicità letale causata dall'espressione striatale di U6shRNA in entrambi i modelli di topo DYT1, un risultato indipendente dalla mutazione DYT1 come è stato osservato anche nei topi selvatici. È interessante notare che il background genetico ha influenzato la sensibilità dei topi a questa tossicità, sottolineando l'importanza della selezione del modello per gli studi terapeutici.

risultati

L'iniezione striatale di shRNA AAV2 / 1 provoca tossicità letale nei modelli di topo DYT1

Per i nostri studi abbiamo usato due diversi modelli di mouse DYT1. Il primo è un modello transgenico recentemente sviluppato che esprime un topo umano torA (ΔE) (D9.hTorA (ΔE)) o un torA (WT) (D9.hTorA (WT)) sotto il controllo di uno specifico DARPP striatale 32 (D9) promotore 12 e mantenuto su uno sfondo C57BL / 6. Usando questi topi, abbiamo mirato a dimostrare un potente silenziamento allele specifico del torA umano (ΔE). Per innescare un fenotipo motorio attraverso il silenziamento non specifico di torA, abbiamo selezionato topi in cui la mutazione DYT1 umana è stata colpita nel gene murino tor1A (topi DYT1 KI). Questo modello è stato mantenuto su uno sfondo 129 / SvEv. Come veicolo di consegna, abbiamo usato il sierotipo 2/1 (AAV2 / 1) ricombinante del virus associato adeno con un gene reporter di proteina fluorescente verde (GFP) per fornire diversi U6shRNA allo striato di entrambi i topi DYT1 KI, D9.hTorA (WT o ΔE ) topi e i loro compagni di lettiera selvatici (figure 1a e b).

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Conseguenze letali dell'espressione di U6shRNA nello striato di topo. ( a ) Diagramma del vettore AAV2 / 1 che esprime una cassetta GFP guidata da CMV e sequenze shRNA guidate da U6 precedentemente pubblicate. 8 ( b ) Immagini rappresentative di campo chiaro e autofluorescenza GFP di una sezione cerebrale knock-in DYT1 che mostra trasduzione striatale di AAV2 / 1.eGFP (senza shRNA) (scala = 100 μm). ( c e d ) Curve di sopravvivenza Kaplan – Meier post-iniezione di knock-in DYT1 (pannello c ) e topi transgenici D9.hTorA (pannello d ) che dimostrano la mortalità U6shRNA-dipendente, incluse significative differenze ceppo-dipendenti (vedere controlli per entrambi i modelli ).

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Per studiare se la soppressione non selettiva della torsina A nello striato causerebbe disfunzione motoria nei topi adulti, abbiamo eseguito iniezioni intrastriatali di un U6shRNA che sopprime efficacemente l'espressione della torsina murina sia di tipo selvaggio che mutante (AAV2 / 1.GFP.U6shTorA) in Topi DYT1 KI di 2, 5–6 mesi e nei loro compagni di cucciolata selvatici. I vettori di controllo includevano AAV2 / 1.GFP senza shRNA, una forcina missense (U6shMis) o U6shHtorA (ΔE), che si rivolge alla torA umana (ma non murina) (ΔE), agendo così come un secondo controllo missenso. Inaspettatamente, 2-5 settimane dopo l'iniezione, abbiamo riscontrato una progressiva perdita di peso e una significativa letalità di shRNA sia sperimentali che di controllo, mentre non è stata osservata morte nei topi che ricevono virus che non esprimono shRNA (Figura 1c). gli shRNA hanno mostrato livelli variabili di tossicità, con topi iniettati con la forcina U6shTorA che mostra tassi di mortalità notevolmente inferiori rispetto a U6shHtorA (ΔE) o U6shMis. La presenza della mutazione DYT1 non ha influenzato questo effetto.

In una serie parallela di esperimenti, topi transgenici D9.hTorA (WT) sono stati usati per testare l'efficacia dello shRNA terapeutico, U6shHtorA (ΔE), per ottenere il silenziamento allele specifico del torA umano (ΔE) in vivo . Sebbene la piena caratterizzazione di questi topi sarà pubblicata altrove (Ehrlich et al. , Manoscritto in preparazione), abbiamo rilevato l'espressione striatale del transgene mediante analisi Western Blot e immunocolorazione che ci permetterebbe di misurare il silenziamento (dati non mostrati). I topi sono stati iniettati nello striato con AAV2 / 1.GFP codificando il costrutto terapeutico (U6shHtorA (ΔE)), uno shRNA di controllo missenso (U6shMis) o un virus che non esprimeva shRNA. La mortalità nelle prime 5 settimane dopo l'iniezione era significativamente inferiore rispetto ai topi DYT1 KI, anche se hanno ricevuto le stesse preparazioni virali. Abbiamo osservato una mortalità ritardata in D9.hTorA (WT o ΔE) e in coinquilini non transgenici iniettati con U6shhTorA (ΔE) o U6shMis, senza tossicità nei topi iniettati con AAV2 / 1.GFP (Figura 1d). Sono state osservate le differenze nell'entità e nei tempi della mortalità tra DYT1 KI e topi transgenici indipendentemente dal genotipo, indicando che sono una conseguenza del background genetico dei topi. Per eliminare il potenziale fattore di confondimento introdotto dalla mutazione DYT1 e dall'espressione del transgene, abbiamo esaminato specificamente i topi di controllo (cioè non transgenici, non-KI), rilevando differenze significative nella mortalità tra i topi 129 / SvEv e C57BL / 6 che hanno ricevuto gli stessi preparati virali U6shHtorA (ΔE) e U6shMis (vedi topi di controllo nelle Figure 1c ed d).

Funzione motoria anormale causata dall'espressione striatale di U6shRNA

L'analisi del comportamento basale della funzione motoria è stata eseguita in entrambi i topi DYT1 KI e D9.hTorA (WT o ΔE) prima dell'iniezione. Un confronto tra i risultati sia del comportamento in campo aperto sia dell'analisi del rotarod non ha rivelato cambiamenti significativi nelle prestazioni tra topi wild-type e KI (non mostrati). A causa degli alti livelli di mortalità osservati nei topi DYT1 KI, non è stato possibile completare l'analisi del comportamento post-iniezione.

A causa della mortalità più bassa e ritardata osservata nei topi D9.hTorA, il comportamento post-iniezione potrebbe essere completato negli animali sopravvissuti. Abbiamo registrato le loro prestazioni su un rotarod e campo aperto prima e in due momenti (6–8 e 14–16 settimane) dopo l'iniezione. Disfunzione motoria è stata osservata nei topi iniettati con U6shHtorA (ΔE) o U6shMis, indipendentemente dall'espressione del transgene, con aumento della locomozione in campo aperto (Figura 2a) e peggiori prestazioni sul rotarod (Figura 2b) rispetto ai topi che ricevono AAV2 / 1 Codifica .GFP senza shRNA.

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Disfunzione striatale nei topi iniettati con U6shRNAs. Confronto tra attività motoria e funzione prima, 6–8 settimane e 14–16 settimane dopo l'iniezione. ( a ) Distanza totale percorsa per 1 ora in un apparecchio a campo aperto (media ± sem) ( * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001). In tutti e tre i genotipi, i topi iniettati con U6shMis o U6shHtorA (ΔE) hanno mostrato una maggiore attività motoria sia a 6-8 settimane che a 14-16 settimane dopo l'iniezione che non è stata osservata nei topi a cui è stato iniettato shRNA. ( b ) Coordinazione motoria misurata usando un apparato rotarod per 3 giorni mostrando latenza in calo (media ± sem per prove 1-3 per ogni gruppo al giorno) ( * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P < 0, 001). In tutti e tre i genotipi, i topi iniettati con shMis o shHtorA (ΔE) hanno mostrato una coordinazione motoria ridotta a 6-8 settimane e 14-16 settimane dopo l'iniezione rispetto a nessun controllo shRNA. giri / min, giri al minuto.

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U6shRNA induce tossicità striatale

Per determinare gli effetti di questi U6shRNA tossici a livello dei tessuti, abbiamo raccolto il cervello da D9.hTorA e abbiamo controllato i topi 6-9 mesi dopo l'iniezione. Un sondaggio sulle sezioni striatali ha rivelato che più cervelli di topo iniettati con U6shRNA esibivano ventricoli allargati (Figura 3a), indicando un'atrofia striatale. L'analisi immunoistochimica è stata completata per rilevare l'espressione di DARPP-32, un marker di neuroni spinosi medi striatali. Abbiamo osservato una perdita del segnale DARPP-32 e una riduzione del segnale GFP nello striato trasdotto di topi iniettati con uno degli U6shRNA, ma non nei cervelli che hanno ricevuto il virus di controllo (Figura 3b), suggerendo la perdita di neuroni trasdotti. Lo studio dei livelli di DARPP-32 nei topi DYT1 KI ha rivelato un modello simile che suggerisce la perdita neuronale (non mostrato). Le regioni trasdotte dai vettori che codificano shRNA, ma non con il virus di controllo, hanno anche dimostrato una ridotta colorazione del viola cresilico, suggerendo ulteriormente la neurodegenerazione (Figura 3c). Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che l'espressione di U6shRNA ha causato la perdita di neuroni spinosi mediali striatali. Inoltre, la colorazione immunoistochimica per un marcatore gliale, proteina acida fibrillare glia, ha dimostrato l'attivazione astrogliale in aree trasdotte dall'U6shRNA tossico, ma non con il controllo AAV2 / 1 (Figura 1 supplementare). Come descritto per la colorazione DARPP-32, è stato osservato un segnale GFP ridotto insieme a una colorazione delle proteine ​​acide fibrillari gliali migliorata, suggerendo la perdita di neuroni trasdotti e la sostituzione con cellule astrogliali. Tuttavia, non abbiamo osservato differenze nell'espressione Iba-1 (non mostrata), un marker di attivazione microgliale. 4

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Neurotossicità striatale nei topi iniettati con U6shRNAs. ( a ) Le immagini in campo chiaro di topi di controllo C57BL / 6 (non transgenici) hanno rivelato ventricoli laterali allargati (indicati da punte di freccia) in topi iniettati con shRNA, suggerendo un'atrofia striatale. ( b ) L'analisi immunoistologica ha rivelato una perdita significativa del segnale DARPP-32 nei topi iniettati con U6shRNA in una regione che si sovrapponeva con trasduzione virale (indicata da GFP), ma non sotto controllo (cioè senza U6shRNA). ( c ) Microfotografie rappresentative che mostrano la colorazione viola cresilico del tessuto striatale trasdotto, dimostrando pallore (diminuzione della colorazione) in aree trasdotte con espressione di shRNA ma non con vettori di controllo.

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Analisi della via endogena dei miRNA

Per determinare se una variazione significativa nell'espressione o nell'elaborazione dei miRNA sia alla base della diversa suscettibilità di entrambi i ceppi alla tossicità indotta da U6shRNA, abbiamo analizzato l'espressione di due miRNA candidati e componenti chiave della via del miRNA nel tessuto striatale ottenuto da animali di controllo di entrambi i ceppi di topo . L'espressione e l'elaborazione di un ubiquitario (miR30a) e di un miRNA neuronale specifico (miR9) (Figura 4a) non differivano tra i due ceppi. Abbiamo quindi misurato i livelli di espressione dei componenti chiave della via del miRNA mediante analisi western blot, dimostrando livelli simili di Ago2 in entrambi i ceppi e una tendenza non significativa verso livelli più bassi di exportin5 2 nei topi 129 / SvEv (Figura 4b). Risultati simili sono stati ottenuti nel tessuto corticale ottenuto dagli stessi animali (non mostrato). Abbiamo quindi chiesto se l'espressione di shRNA tossici influenza i livelli di espressione e di elaborazione dei miRNA. Per questi esperimenti, abbiamo usato topi C57BL / 6 a causa della loro sopravvivenza migliorata dopo le iniezioni. Abbiamo scoperto che i livelli di pre-miRNA non trasformati non sono stati significativamente modificati dalla sovraespressione di shRNA, ma quelli del filamento maturo erano altamente variabili con una tendenza ad aumentare (Figura 5a). È interessante notare che, sebbene l'espressione di exportin5 sia rimasta per lo più invariata, i livelli di Ago2 sono stati inversamente correlati con l'aumento del miRNA maturo osservato dal blotting settentrionale per ciascun animale (Figura 5b). La trascrizione quantitativa inversa-PCR per miR9 maturo in una serie indipendente di animali ha confermato i risultati della macchia nordica (Figura 5c). I livelli di exportin5, Ago2, pre-miRNA non trasformato e miRNA maturo in aree corticali non trasdotte degli stessi animali non sono stati modificati (non mostrati). Queste osservazioni potrebbero derivare da un effetto di shRNA sulla via endogena del miRNA o semplicemente riflettere la morte cellulare variabile e la reazione astrogliale causata da shRNA tossici.

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Analisi della via microRNA nei topi 29 / SvEv e C57BL / 6. Tre topi maschi di 4 mesi 129 / SvEv e C57BL / 6 sono stati uccisi e il loro cervello è stato estratto, lo striato dissezionato e testato per l'espressione dei miRNA candidati e dei componenti delle macchine miRNA come descritto nella sezione "Materiali e metodi". ( a ) Analisi della macchia nordica che mostra l'espressione di miR9 e miR30a nello striato 129 / SvEv e C57BL / 6. U6 è servito come controllo di caricamento. ( b ) Analisi Western blot che mostra i livelli di espressione di exportin5 (exp5) e Argonaut 2 (Ago2). α-Tubulin (α-tub) è un controllo di caricamento. Ogni corsia rappresenta miRNA o proteine ​​ottenute da un animale diverso. Viene mostrata la quantificazione delle analisi delle macchie nordiche e occidentali (media ± sem). * P = 0, 07.

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Analisi della via del microRNA nello striato trasdotto. Sono stati estratti gli striati di animali iniettati con vettori che codificano shMis, shHtorA (ΔE) o virus di controllo. ( a ) Lo striato giusto è stato utilizzato per l'analisi della macchia nordica dell'espressione e dell'elaborazione di miR9 rilevando pre-miR9 e miR9 maturo. Va notato che entrambe le bande provengono dalla stessa macchia, ma con diversa esposizione. U6 viene mostrato come controllo di caricamento. ( b ) Lo striato sinistro dello stesso animale è stato utilizzato per l'analisi Western Blot per rilevare l'espressione di exportin5, Ago2 e α-tubulina come controllo del carico. I campioni per le analisi delle macchie nordiche e occidentali mostrate nei pannelli superiore e inferiore, rispettivamente, sono stati eseguiti nello stesso ordine. ( c ) Q-RT-PCR di miR9, normalizzato all'espressione U6, in striata che esprime AAV2 / 1.eGFP (riferimento), AAV2 / 1.eGFP.U6shMis o AAV2 / 1.eGFP.U6shHtorA (ΔE). Le differenze non erano significative.

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Discussione

In questo studio, dimostriamo tossicità letale causata dall'applicazione di vettori terapeutici di mediazione dell'RNAi ai modelli murini di malattia neurologica. I nostri studi dimostrano che gli shRNA trascritti con pol-III applicati allo striato murino possono causare perdita neuronale, disfunzione comportamentale e morte degli animali. Inoltre, il background genetico degli animali utilizzati modifica la suscettibilità a questo effetto avverso, indicando che questo fattore deve essere considerato e controllato quando si progettano studi RNAi. Questo studio aggiunge alla nostra attuale conoscenza del silenziamento genico terapeutico.

La terapia con RNAi ha mostrato grandi promesse per il trattamento dei disturbi neurologici. Sono stati completati o sono in corso studi terapeutici per il trattamento di diverse malattie non neurologiche e sono stati riportati studi preclinici su diversi modelli animali di varie malattie neurologiche. 1 Le caratteristiche cliniche, genetiche e biologiche della distonia DYT1 ne fanno un modello patologico ottimale per esplorare il potenziale dell'RNAi terapeutico. Diversi studi su modelli cellulari di DYT1 hanno spianato la strada per prove in vivo . 8, 10, 11, 13 Gli shRNA utilizzati per questo studio sono stati precedentemente testati su neuroni di mammifero in coltura che dimostravano efficacia e, soprattutto, nessuna evidenza di tossicità. 8 Pertanto, i risultati di questo studio indicano che la mancanza di morte cellulare o di risposte infiammatorie nelle cellule in coltura non si traduce in sicurezza della sequenza bersaglio in vivo , sottolineando la necessità di valutare la presenza di effetti avversi nel modello appropriato.

Uno studio di riferimento di Kay e colleghi, 2 in cui hanno riscontrato la morte di animali quando hanno preso di mira geni negli epatociti di topo, ha portato l'attenzione generale sulla potenziale tossicità degli shRNA nei tessuti non nervosi. Simile al nostro studio, ciò si è verificato nei topi wild-type. La maggior parte degli studi condotti su modelli murini di malattia neurologica hanno utilizzato la consegna virale di shRNA e si sono concentrati principalmente sulla dimostrazione dell'efficacia. 1 Tuttavia, sono già stati osservati suggerimenti di potenziale tossicità da parte degli shRNA. Ad esempio, quando si prendono di mira i mutanti huntingtina nei topi transgenici della malattia di Huntington, Rodriguez-Lebron et al. 14 hanno rilevato tossicità utilizzando uno shRNA precedentemente dimostrato di essere efficace nelle cellule in coltura. Inoltre, Davidson e colleghi 15 hanno scoperto che topi selvatici iniettati con uno dei loro shRNA terapeutici per la malattia di Huntington hanno mostrato un peggioramento fenotipico lieve e transitorio. Lo stesso gruppo ha dimostrato tossicità con l'attivazione microgliale al momento della consegna intrastriatale di shRNA in un modello murino di malattia di Huntington, che si ritiene derivi da effetti off-targeting. 4 Più recentemente, è stato dimostrato che l'espressione di shRNA mediata da AAV causa la morte neuronale. 16 Il nostro studio estende ulteriormente questi rapporti dimostrando atrofia striatale con disfunzione comportamentale associata e morte. È importante sottolineare che abbiamo riscontrato gli stessi livelli di tossicità nei topi selvatici rispetto ai topi DYT1. Ciò ha importanti implicazioni per gli studi preclinici di tollerabilità per l'ottimizzazione degli shRNA per minimizzare la tossicità indotta, indipendentemente dal modello. Inoltre, poiché questi costrutti tossici hanno causato la perdita cellulare nei topi non affetti da malattia, è possibile che alcune malattie caratterizzate da neurodegenerazione possano essere accelerate dall'applicazione di questi vettori. Collettivamente, questi studi suggeriscono fortemente che la prima generazione di vettori, basata su shRNA guidati da pol-III altamente espressi, non sono ottimali per lo sviluppo terapeutico e dovrebbero essere ottimizzati e attentamente valutati per la potenziale tossicità. Sono state sviluppate diverse strategie per abolire gli effetti collaterali tossici degli shRNA altamente espressi, come la riduzione dei livelli di espressione ponendo lo shRNA sotto un promotore pol-III diverso come H1 o un promotore pol-II o migliorando l'efficienza di elaborazione del targeting sequenza incorporandola in una spina dorsale di miRNA. 4, 5, 17 Modifiche simili dovrebbero essere adattate per avanzare nello sviluppo di costrutti terapeutici a base di RNAi per la distonia DYT1 e altre malattie neurologiche.

Mentre diversi meccanismi possono potenzialmente causare effetti avversi derivati ​​dallo shRNA, l'evidenza emergente suggerisce che la disfunzione della via endogena del miRNA dovuta alla saturazione da costrutti esogeni è il meccanismo più probabile. 2, 18 Complessivamente, questi studi suggeriscono che una sovraespressione molto elevata di shRNA dal promotore U6 altamente attivo potrebbe causare tossicità saturando la via del miRNA. I nostri diversi costrutti di shRNA sono stati espressi dal promotore U6 e, almeno nelle cellule in coltura, silenziano i loro obiettivi in ​​modo molto potente, suggerendo alti livelli di sovraespressione. Qui, mostriamo che la consegna AAV2 / 1 di U6shRNA allo striato può indurre tossicità letale nei topi, con la perdita di neuroni trasdotta da diversi vettori U6shRNA. Sebbene la morte animale per insufficienza epatica fulminante sia prevedibile, la morte causata dalla perdita di una regione limitata dello striato non è così intuitiva. Tuttavia, McManus e colleghi 19 hanno recentemente dimostrato che la disfunzione del percorso del miRNA causata dalla delezione condizionale del dicer nei neuroni spinosi medi postnatali murini striatali provoca disfunzione motoria progressiva, riduzione delle dimensioni del cervello, deperimento e morte a 10-12 settimane di età. Pertanto, la disfunzione della via del miRNA nei neuroni striatali può causare progressiva disfunzione motoria e morte. Perché gli shRNA tossici hanno portato ad un aumento dell'attività locomotoria non è chiaro, ma forse potrebbe essere dovuto alle differenze nell'efficienza di trasduzione o alla suscettibilità a questa tossicità tra neuroni spinosi medi che partecipano al percorso diretto o indiretto.

Un risultato interessante e inaspettato dei nostri studi è la diversa suscettibilità agli effetti collaterali indotti dallo shRNA tra due background genetici di topo comunemente usati, che mostrano differenze significative a livello di espressione genica nel tessuto cerebrale. 20 Abbiamo ipotizzato che la base di questa scoperta potrebbe essere la diversa efficienza nell'elaborazione del miRNA tra i neuroni striatali di entrambi i ceppi e studi completati che mostrano una tendenza verso livelli più bassi di espressione dell'esportazione5 nel ceppo più sensibile, sebbene il significato di questa scoperta non sia chiaro . L'espressione di shRNA tossici non ha alterato i livelli di exportin5, ma ha portato a variabilità nell'espressione endogena di Ago2 e miR9. È interessante notare che i livelli di Ago2 sono inversamente correlati con l'accumulo di miRNA maturi. Nel loro rapporto iniziale di tossicità epatica, Grimm et al. 2 ha esplorato la causa sottostante, giungendo alla conclusione che la saturazione della fase putativa di limitazione della velocità di questo percorso, l'esportazione nucleare di pre-miRNA per esportazione5, era l'evento responsabile. Tuttavia, lo stesso gruppo ha recentemente identificato Ago2 come un fattore determinante per la limitazione dell'efficacia, della tossicità e della persistenza dell'RNAi. 18 Alla luce di questo rapporto, si è tentati di ipotizzare che le variazioni dei livelli di Ago2 portino a un trattamento alterato dei miRNA endogeni e siano implicati nella tossicità dello shRNA nei neuroni. Perché i livelli di Ago2 sono variabili sull'espressione di shRNA tossici e perché questo si correla con livelli più alti di miR9 non è chiaro e potrebbe semplicemente riflettere i cambiamenti nell'architettura dei tessuti causati dalla degenerazione neuronale e dalla reazione gliale. Inoltre, non è chiaro in che modo l'espressione ridotta di Ago2 influirebbe sui livelli di miR9. Resta da dimostrare se le differenze nell'espressione o nella funzione di exportin5 e / o Ago2 tra i topi 129 / SvEv e C57BL / 6 siano responsabili della loro diversa suscettibilità agli effetti tossici degli shRNA. La manipolazione dell'espressione exportin5 e Ago2 sull'applicazione neuronale di shRNA tossici aiuterebbe a verificare questa ipotesi, indipendentemente da quale sia la causa finale di queste differenze, anche se i ricercatori dovrebbero considerare attentamente lo sfondo del modello animale utilizzato per gli studi preclinici sulla terapia con RNAi. I topi 129 / SvEv potrebbero essere uno sforzo ottimale quando si mira ad escludere la tossicità indotta da shRNA negli studi preclinici.

In sintesi, questo studio dimostra la presenza di tossicità letale causata dall'espressione striatale degli shRNA e illustra le differenze derivate dal background genetico del modello utilizzato per gli studi terapeutici sul silenziamento. Questi risultati hanno importanti implicazioni per la progettazione di studi preclinici terapeutici sull'RNAi in modelli di malattie neurologiche umane.

Materiali e metodi

Animali

I topi DYT1 KI, generati da Dauer e colleghi, 21 sono stati mantenuti su uno sfondo 129 / SvEv. Topi transgenici D9 che esprimono una copia di topi TorA (ΔE) (D9.hTorA (E)) o TorA (WT) (D9.hTorA (WT) umani sotto il controllo di un promotore DARPP-32 sono stati mantenuti su un Sfondo C57BL / 6. La generazione e la caratterizzazione di questo modello saranno descritte altrove (Ehrlich et al , manoscritto in preparazione). I topi sono stati alloggiati in stanze a temperatura controllata con cicli di luce e buio di 12 ore. Cibo e acqua venivano forniti ad libitum . Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa.

Vettori di espressione virale

I vettori ricombinanti AAV2 / 1 che esprimono shRNA sono stati generati come descritto in precedenza 4 dal Gene Transfer Core dell'Università dello Iowa. In breve, le cassette di espressione di U6shRNA sono state clonate in plasmidi a navetta AAV2 / 1 e il virus ricombinante AAV2 / 1 è stato generato utilizzando un metodo di trasfezione di fosfato di calcio ben consolidato. 22 La trascrizione inversa-PCR è stata utilizzata per determinare titoli virali con concentrazioni comprese tra 5 × 10 12 e 2, 5 × 10 13 vg per ml. Le sequenze di targeting utilizzate in questo studio sono state precedentemente riportate da Gonzalez-Alegre et al. , 8 sebbene i loro nomi identificativi siano stati modificati per semplicità come segue: U6shTorA in questo studio corrisponde a shTAcom in Gonzalez-Alegre et al. , 8 U6shHtorA (ΔE) a shTAmut5 e U6shMis a shTAmis.

Iniezioni striatali

Topi di 3-6 mesi sono stati anestetizzati con ketamina / xilazina e collocati in una cornice stereotassica di David Kopf (Modello 900, David Kopf Instruments, Tujunga, California, USA). Dopo una tecnica sterile, le iniezioni striatali bilaterali di 2 μl (100 nl min--1) di AAV2 / 1 sono state eseguite attraverso un foro di sbavatura, usando una siringa Hamilton e UltraMicroPumpII programmabile (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) al seguente coordinate rispetto al bregma: 0, 9 mm anteriore, 1, 8 mm laterale alla linea mediana, 2, 8 mm ventrale alla dura. Una volta completato, l'ago è stato sollevato di 0, 3 mm e quindi lasciato in posa per altri 5 minuti per consentire la diffusione ed evitare la diffusione della soluzione lungo il binario della pipetta.

Analisi comportamentale

Prestazioni di Rotarod. In breve, i topi sono stati prima acclimatati al rotarod (modello 47 600 Ugo Basile, Milano, Italia) per 3 minuti a una velocità costante di 4 giri / min (giri al minuto) e poi ad una velocità accelerata da 4 a 16 giri / min in 2 minuti . I topi sono stati testati per 3 giorni con 3 prove al giorno su un set di rotarod per accelerare da 4 a 40 rpm per un periodo di 5 minuti. La latenza a cadere è stata registrata ogni giorno con un limite massimo a 500 s. I topi che hanno guidato l'asta rotante per tre giri completi senza spostarsi in avanti sono stati rimossi a causa dell'inattività. I topi che non sono stati in grado di rimanere sull'apparato per almeno 120 s non sono stati inseriti in gruppi di iniezione.

Campo aperto. Dopo l'acclimatazione, quattro topi sono stati registrati simultaneamente collocandoli in un'arena a campo aperto con quattro campi separati di 25 cm × 25 cm. Abbiamo utilizzato un sistema di tracciamento automatizzato (Viewpoint, Videotrak, Lione, Francia) per raccogliere e analizzare i dati (distanza percorsa) in contenitori da 5 minuti per 60 minuti.

Analisi immunoistochimiche

I topi sono stati uccisi 6-9 mesi dopo l'iniezione, perfusi per via transcardiale con NaCl 0, 9% ghiacciato e quindi fissati con paraformaldeide al 4%. I cervelli sono stati escissi, postfissati durante la notte e quindi conservati in una soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C fino al momento dell'uso. L'analisi immunoistochimica è stata eseguita come precedentemente descritto. 5 In breve, sezioni coronali fluttuanti del cervello (40 μm) sono state incubate con anticorpi per rilevare DARPP-32 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) o Iba-1 (Wako Chemicals USA, Richmond, VA, USA) per 24 ore a temperatura ambiente. Le sezioni cerebrali sono state successivamente incubate in un anticorpo secondario biotinilato (1: 200) per 1 ora, poste in reagente ABC (entrambi da Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e sviluppate in una soluzione di diaminobenzidina 3-3 '. Infine, le sezioni sono state montate su diapositive SuperFrost Plus e coperte con Permount (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). L'autofluorescenza GFP delle regioni trasdotte è stata acquisita prima della colorazione e delle immagini DARPP-32 dopo aver utilizzato uno stereoscopio fluorescente Olympus SZX12 con una fotocamera Olympus DP70 (Olympus America, Center Valley, PA, USA) utilizzando il software di accompagnamento. Per l'immunofluorescenza indiretta, le sezioni sono state incubate con anticorpi monoclonali di proteina acida fibrillare monoclonale coniugati con Cy3 (Sigma, St Louis, MO, USA) ed elaborate come descritto precedentemente 8 prima della visualizzazione. La colorazione di viola cresilica è stata completata seguendo i protocolli standard.

Studi molecolari

Isolamento dell'RNA. I topi sono stati perfusi per via transcardiale con NaCl allo 0, 9% ghiacciato, quindi i loro cervelli sono stati asportati e collocati in una matrice e tagliati in sezioni di 1 mm. Le regioni striatali trasdotte sono state rimosse chirurgicamente, pesate e quindi poste in RNA successivamente (Qiagen, Valencia, California, USA) e conservate a -80 ° C fino al momento dell'uso. L'RNA è stato isolato usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore e risospeso in acqua distillata senza Ultrapure DNase / RNase (Invitrogen). La qualità e la concentrazione dell'RNA sono state valutate usando uno spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (Thermo-Fisher Scientific).

Northern blotting. Le macchie del nord con trascrizione ridotta sono state eseguite come descritto in precedenza. 23 In breve, 5 μg di RNA totale sono stati eseguiti su un gel PAGE-UREA al 15%, trasferiti su una membrana di nylon Hybond NX (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) e quindi reticolati con 0, 16 M N - (3- dimetilaminopropil) - N- etilcarbodiimide cloridrato in 127 m M 1-metilimidazolo (pH 8) a 60 ° C per 1 ora. Le membrane sono state quindi ibridate con oligonucleotidi marcati con ATP γ [32P] a 35 ° C durante la notte, lavati in 2 × SSC, esposti a uno schermo per fosfoimager e quantificati su una molecola STORM PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Le sequenze di sonde utilizzate erano le seguenti: U6: 5′-CGTTCCAATTTTAGTATATGTGCTGCC-3 ′, miR9: 5′-TCATACAGCTAGATAACCAAAGA-3 ′, miR30a: 5′-CTTCCAGTCGAGGATGTTTACA-3 ′.

Trascrizione quantitativa inversa-PCR. Per l'espressione relativa di miRNA, l'RNA di 350 ng è stato trascritto inverso utilizzando il kit di trascrizione inversa mRNA TaqMan con il pool di roditori di primer Megaplex RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e quindi il prodotto diluito di trascrizione inversa (1:10) è stato utilizzato per determinare i livelli di miR9 maturo da TaqMan miRNA Assays (Applied Biosystems) utilizzando i protocolli del produttore e normalizzato a U6 piccolo RNA nucleare. Le variazioni di piega sono state determinate utilizzando il metodo ΔΔCT e calibrate sullo striato iniettato AAV2 / 1.eGFP.

Macchia occidentale. I topi sono stati perfusi per via transcardiale con NaCl allo 0, 9% ghiacciato, quindi lo striato trasdotto è stato asportato, pesato e congelato in azoto liquido e conservato a -80 ° C fino al momento dell'uso. I cervelli sono stati omogeneizzati e sospesi nel tampone di lisi RIPA. La western blotting è stata eseguita come precedentemente descritto. 13 In breve, i campioni di proteine ​​sono stati analizzati su un gel SDS-PAGE al 12%, trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e quindi analizzati con exportin5, Argonaut 2 (Abcam, Cambridge, UK) e anticorpi α-tubulina (Sigma). Le macchie sono state incubate utilizzando un kit Western Lighting Plus-ECL (PerkinElmer, Wellesley, MA, USA) e sono state sviluppate utilizzando Kodak BioMax MR Film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Quantificazione della macchia. Abbiamo quantificato i segnali di macchia occidentale e settentrionale come precedentemente descritto 13 usando i segnali U6 e α-tubulina come controlli di carico per la normalizzazione ed esprimendo i risultati come percentuale dei segnali risultanti rispetto alle corsie di controllo.

analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Le curve di sopravvivenza sono state stimate con il metodo Kaplan-Meier e le differenze tra i gruppi sono state valutate usando il test log-rank. È stato utilizzato un modello misto lineare per misure ripetute per analizzare i dati di campo aperto e rotarod. Un valore di probabilità <0, 05 è stato considerato statisticamente significativo.

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