Gemma e cuore (lbh) funziona come un soppressore tumorale del carcinoma rinofaringeo inducendo l'arresto del ciclo cellulare g1 / s | rapporti scientifici

Gemma e cuore (lbh) funziona come un soppressore tumorale del carcinoma rinofaringeo inducendo l'arresto del ciclo cellulare g1 / s | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Segnalazione del fattore di crescita
  • Cancro orale

Astratto

La proteina-1 latente codificata con virus Epstein – Barr (LMP1) svolge un ruolo fondamentale nella trasformazione maligna del carcinoma rinofaringeo (NPC), sebbene il meccanismo non sia ben compreso. Qui, abbiamo dimostrato che Limb-bud e Heart (LBH) sono notevolmente sottoregolati nei tessuti NPC dei pazienti. È stata anche analizzata l'espressione di LBH nelle biopsie di 40 pazienti consecutivi di NPC privi di metastasi distanti iniziali e trattate secondo linee guida coerenti, e abbiamo scoperto che il livello di espressione di LBH era correlato con alcune caratteristiche clinicopatologiche, sopravvivenza specifica della malattia (DSS), distante sopravvivenza libera da metastasi (DMFS). Abbiamo inoltre determinato che LBH induce normalmente l'arresto del ciclo cellulare NPC alla transizione G1 / S, e LBH può sopprimere la crescita dei tumori NPC trapiantati in vivo sottoregolando l'attività trascrizionale NF-κB mediata da LMP1. La trasformazione del fattore di crescita beta 1 (TGF-β1) normalmente protegge dallo sviluppo del tumore sopprimendo la proliferazione cellulare, ma le cellule NPC acquisiscono resistenza all'inibizione mediata dal TGF-β1. Abbiamo scoperto che TGF-β1 inibisce l'attività trascrizionale NF-κB e la proliferazione delle cellule epiteliali rinofaringee attraverso l'espressione di LBH in eccesso. Questi dati rivelano un meccanismo di trasformazione di NPC precedentemente sconosciuto e forniscono un nuovo concetto e una strategia di trattamento per l'oncogenesi basata su LMP1 in NPC.

introduzione

Il carcinoma rinofaringeo (NPC) è prevalente nelle popolazioni del sud-est asiatico. La predisposizione genetica, l'infezione da virus di Epstein-Barr (EBV) e le condizioni ambientali sono i principali fattori che contribuiscono alla trasformazione maligna 1, ma i meccanismi precisi non sono chiari. L'NPC non è associato a mutazioni puntiformi nei geni noti soppressori tumorali (TSG) 2, 3, sebbene la downregulation P16 e Rb2 possa svolgere un ruolo nel polimorfismo del gene soppressore tumorale WAF-1 / CIP-1 / p21 nel carcinoma rinofaringeo (NPC ): il polimorfismo distingue i caucasici dai cinesi. Cancer Epidemiol Biomarkers Indietro 4, 261–267 (1995). "Href =" / articoli / srep07626 # ref4 "aria-label =" Riferimento 4 "> 4, 5 . I polimorfismi del recettore Toll-like 9 sono associati alla suscettibilità al carcinoma rinofaringeo 6. Il polimorfismo interleuchina-8 -251A / T 7 e la ciclina D1 G870A 8 sono associati a un rischio significativamente maggiore di NPC.

Diversi fattori influenzano la tumorigenesi degli NPC. L'infezione da EBV svolge un ruolo cruciale attraverso i geni latenti codificati da EBV, come LMP1, che agiscono come oncogeni influenzando le normali funzioni cellulari come la progressione del ciclo cellulare 1, 9 . Anche la trasformazione del fattore di crescita beta (TGF-β) è implicata in 10, 11, poiché le cellule NPC acquisiscono resistenza all'inibizione mediata da TGF-β1 della crescita cellulare 10, 12, simile ad altri tumori 13 . È interessante notare che LMP1 con codifica EBV conferisce resistenza all'inibizione mediata da TGF-β sovraregolando la ciclina D1 e sottoregolando P15, che normalmente funzionano per mantenere l'arresto del ciclo cellulare nella fase G1. Tuttavia, il meccanismo molecolare alla base di come questi regolatori del ciclo cellulare conducono alla trasformazione di NPC non è chiaro.

In precedenza, abbiamo identificato che l'espressione di un nuovo tag di sequenza espressa (EST) NP9 (Genbank n. BF718797) era considerevolmente sottoregolata in entrambe le linee cellulari NPC e nei tessuti biopsici rispetto al normale tessuto epiteliale rinofaringeo 14, 15, 16, implicandolo come candidato TSG per NPC. L'analisi dell'esplosione di sequenza ha mostrato l'omologia completa tra NP9 e il gene degli arti inferiori e del cuore ( Lbh ) (Genbank No. NM_030915). LBH è un cofattore di trascrizione altamente conservato, specifico del tessuto nei vertebrati normalmente implicato nello sviluppo embrionale 17, 18, sebbene il suo ruolo nei tessuti adulti non sia chiaro. Strutturalmente, LBH mostra un alto grado di disturbo, suggerendo che la plasticità conformazionale può influenzare l'attività trascrizionale dipendente da LBH. L'aumento della funzione di Aberrant LBH durante lo sviluppo del cuore può portare a cardiopatie congenite, simile a quella osservata nei pazienti con trisomia parziale 2p e vari altri difetti di crescita 19 . La LBH è anche sovraespressa in alcuni tumori al seno simili a quelli basali, in cui la segnalazione Wnt può regolare direttamente la LBH durante lo sviluppo e la progressione del cancro 20, 21 . Nonostante questa associazione con la tumorigenesi del carcinoma mammario, non è noto come la downregulation LBH osservata nei tessuti NPC possa essere correlata alla tumorigenesi NPC.

Per affrontare la potenziale relazione funzionale tra LBH e NPC, abbiamo testato l'effetto della sovraespressione di LBH sulla proliferazione e sulla progressione del ciclo cellulare nella linea cellulare NPC CNE1. Inoltre, abbiamo testato l'effetto del knockdown dell'RNA (siRNA) di piccola interferenza dell'LBH nella normale linea cellulare epiteliale nasofaringea, NP69. Poiché EBV e TGF-β svolgono un ruolo cruciale nella trasformazione di NPC, abbiamo anche studiato le relazioni tra infezione da EBV, TGF-β e espressione di LBH in normali cellule NPPC o CNE1 di NPC. Collettivamente, i nostri risultati forniscono ulteriori approfondimenti sulla funzione di LBH nella trasformazione degli NPC.

risultati

LBH è downregolata nel tessuto NPC e la sovraespressione di LBH inibisce la crescita di tumori xPC innestati nei topi e in vitro

Per confermare la downregulation dell'espressione della proteina LBH nei tessuti NPC, la colorazione immunoistochimica (IHC) ha mostrato che mentre il 100% delle normali cellule epidermiche nel tessuto nasofaringeo esprimeva fortemente LBH, un'espressione LBH molto più bassa è stata osservata in quasi tutti i tessuti NPC, specialmente nel carcinoma rinofaringeo indifferenziato ( Fig. 1a). Questi risultati hanno indicato che l'LBH era significativamente sotto-regolato nei tessuti NPC. Determinando le conseguenze funzionali dell'espressione di LBH in vitro, abbiamo scoperto che la sovraespressione di LBH ha inibito la proliferazione di CNE1-LBH del 24% rispetto alle cellule CNE1 non trasfettate o CNE1-NC trasfettate dal controllo il giorno 6 mediante saggio MTT (* p <0, 05, Fig. 1b). Risultati simili sono stati ottenuti in vivo in topi nudi BALB / c, poiché il tasso di tumorigenicità e il peso medio del tumore nei topi trapiantati con cellule CNE1-LBH erano significativamente inferiori rispetto ai topi trapiantati con una delle cellule di controllo (* p <0, 05, Fig. 1c, d). L'imaging bioluminescente in vivo ha anche monitorato la crescita del tumore nei topi nudi nel tempo. Mentre le cellule tumorali trapiantate SUNE1-LBH contenenti luciferasi (fianco sinistro) hanno mostrato una diminuzione della densità del segnale nel tempo, la densità del segnale è aumentata gradualmente nel controllo dei tumori trapiantati SUNE1-NC (fianco destro) a partire da 2 giorni dopo l'iniezione (pi) (Fig. 1e ). Confermando questo risultato, i segnali dei fotoni (fotoni / i) dai tumori SUNE1-LBH sono diminuiti del 53, 9% rispetto a quelli osservati nei tumori di controllo il giorno 13 pi (* p <0, 05, Fig. 1f) e anche la dimensione del tumore SUNE1-LBH ( * p <0, 05, Fig. 1g). I precedenti risultati in vitro e in vivo suggeriscono che la riespressione dell'LBH nelle cellule NPC può inibire la crescita dell'NPC.

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(a) Il controllo negativo (nessun anticorpo primario) del tessuto epidermico rinofaringeo non ha mostrato colorazione positiva nell'IHC. Quasi tutte le normali cellule epidermiche nel normale tessuto epidermico nasofaringeo presentavano una colorazione LBH positiva. Le cellule parzialmente cancerose del tipo di tessuto NPC a cellule squamose presentavano una colorazione LBH moderatamente positiva. Quasi tutte le cellule tumorali del tipo di tessuto NPC indifferenziato rinofaringeo erano negative per la colorazione LBH. (b) Il saggio MTT ha mostrato che l'espressione di LBH ha inibito la proliferazione delle cellule CNE1 (* P <0, 05 rispetto al gruppo CNE1 o CNE1-NC). (c) Il tasso di formazione del tumore dopo l'iniezione di cellule CNE1, CNE1-NC o CNE1-LBH (5 × 10 6 ) nell'ascella di topi nudi BALB / c è stato rispettivamente del 72%, 68% e 42% (* P < 0, 05 rispetto al gruppo CNE1 o CNE1-NC). (d) Il peso medio del tumore trapiantato in topi nudi iniettati con cellule CNE1, CNE1-NC e CNE1-LBH era rispettivamente di 1, 67 g, 1, 59 ge 0, 92 g. (* P <0, 05 rispetto al gruppo CNE1 o CNE1-NC) (e) Immagine rappresentativa dell'effetto di inibizione sulla crescita di xenotrapianto tumorale SUNE1 mediante espressione di LBH rilevata mediante imaging bioluminescente. Le cellule SUNE1-NC e SUNE1-LBH sono state iniettate per via sottocutanea nelle ascelle sinistra e destra, rispettivamente, nei topi nudi. (f) L'analisi dei fotoni / sec ha mostrato che la crescita dei tumori xenotrapiati SUNE1-LBH era più lenta dei tumori di controllo SUNE1-NC (* P <0, 05). (g) Il volume dei tumori trapiantati nei topi nudi ha anche mostrato che il SUNE1-LBH è cresciuto più lentamente rispetto ai tumori di controllo SUNE1-NC (# P <0, 01).

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Abbiamo usato il metodo standard per costruire un vettore di espressione ricombinante per creare il plasmide pEGFP-C1-LBH che codifica una proteina di fusione GFP-LBH. Quarantotto ore dopo la trasfezione di pEGFP-C1-LBH o del plasmide di controllo pEGFP-C1 (solo GFP) in cellule CNE1, abbiamo osservato mediante microscopia confocale che la proteina di fusione GFP-LBH localizzata prevalentemente all'interno del nucleo delle cellule CNE1 (Fig. SI 1a ), mentre i segnali dal solo GFP erano diffusi in tutta la cellula (Fig. SI1b).

LBH inibisce la progressione del ciclo cellulare e l'espressione di alcuni geni correlati al ciclo cellulare

Abbiamo confermato l'upregulation LBH nelle cellule CNE1-LBH o la downregulation LBH nelle cellule NP69 trattate con siRNA mediante qRT-PCR. Il livello relativo di mRNA di LBH nelle cellule CNE1-LBH era circa 8 volte più alto 24 e 48 ore dopo il passaggio cellulare rispetto a quello nelle cellule di controllo CNE1-NC (Fig. SI2a). Inoltre, l'espressione dell'mRNA di LBH nelle cellule NP69 trasfettate con LBH-siRNA è diminuita a circa il 30% e il 10% delle cellule NP69 trasfettate da controllo NC-siRNA rispettivamente 24 e 48 ore dopo la trasfezione (Fig. SI2b).

Determinando l'effetto di LBH sulla progressione del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, le cellule CNE1-LBH avevano un rapporto più basso di cellule in fase S ma un rapporto più elevato di cellule in fase G1 rispetto alle cellule di controllo CNE1-NC (S: 29, 7% vs. 36, 6%; G1: 44, 1% vs. 29, 7%, rispettivamente) (Fig. 2a, b), in correlazione con un'espressione della proteina LBH significativamente aumentata 24 e 48 h dopo il passaggio cellulare (Fig. 2c). Le cellule CNE1-LBH hanno mostrato un'espressione proteica più bassa delle proteine ​​c-Myc correlate al ciclo cellulare, nonché la ciclina E1 ed E2, ma non cdc25A, rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2d, e). Di conseguenza, l'espressione di c-Myc e della ciclina E1 ed E2, ma non di cdc25, è aumentata dopo il knockdown LBH mediato dal siRNA nelle cellule NP69 (Fig. 2d, e), correlando con una riduzione del 50% dell'espressione della proteina LBH 48 h dopo Trasfezione LBH-siRNA (Fig. 2c). Risultati simili sono stati ottenuti per l'espressione di Cyclin D1 (* p <0, 05, Fig. 2f, g). Questi risultati suggeriscono che LBH funzioni per inibire la progressione del ciclo cellulare nelle cellule NPC.

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Il test del ciclo cellulare mediante citometria a flusso ha mostrato che (a) cellule CNE1-LBH, ma non (b) cellule CNE1-NC di controllo trasfettate con pRC / CMV2, sono state arrestate alla transizione G1 / S. (c) Western blot ha mostrato un aumento significativo nell'espressione della proteina LBH in CNE1-LBH dopo subcolturazione. Nelle cellule NP69 trasfettate con LBH-siRNA (NP69-LBH-siRNA), l'espressione della proteina LBH era circa il 50% di quella nelle cellule NP69 e le cellule NP69 trasfettate con NC-siRNA (NP69-NC-siRNA) 48 ore dopo la trasfezione. (d, e) l'espressione di c-Myc e Cyclin E1 / E2 è stata regolata verso il basso dopo la riespressione di LBH nelle cellule CNE1. L'espressione di c-Myc e Cyclin E1 / E2 erano entrambe aumentate nelle cellule NP69 dopo il knockdown di LBH. Al contrario, i livelli di cdc-25A sono rimasti gli stessi indipendentemente dall'espressione di LBH. (f) L'attività trascrizionale della ciclina D1 è diminuita nelle cellule CNE1-LBH (* p <0, 05 rispetto al gruppo CNE1-NC). (g) L'attività trascrizionale della ciclina D1 è aumentata dopo il knockdown di LBH nelle cellule NP69 (* p <0, 05 rispetto al gruppo NP69-NC-siRNA).

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LBH inibisce l'attività trascrizionale di NF-κB

Successivamente abbiamo valutato l'effetto di LBH sui regolatori del ciclo cellulare NF-κB e Cyclin D1. L'unità luciferasi relativa NF-κB (RLU) nelle cellule CNE1-LBH trasfettate NF-κB-Luc è significativamente diminuita rispetto alle cellule CNE1-NC a 24 e 48 h post-trasfezione (* p <0, 05, Fig. 3a). Coerentemente con questo risultato, l'RLU NF-κB nelle cellule NP69 trattate con LBH-siRNA è aumentata significativamente rispetto alle cellule di controllo 24 e 48 h dopo il knockdown (* p <0, 05, Fig. 3b). Inoltre, l'espressione di LBH ha aumentato la fosforilazione dell'inibitore NF-κB IκBα e ha diminuito la fosforilazione della subunità P65 NF-κB (Fig. 3c, d). Insieme, questi risultati suggeriscono che l'espressione di LBH può inibire l'attivazione di NF-κB e Cyclin D1 e implicare ulteriormente LBH nella regolazione della transizione G1 / S.

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(a) Il plasmide reporter NF-κB-Luc è stato co-trasfettato con il plasmide pRL-SV40 in cellule di controllo CNE1-LBH e CNE1-NC. L'unità relativa della luciferasi (RLU) nei punti temporali indicati post-trasfezione ha mostrato che l'attività trascrizionale NF-κB è diminuita nelle cellule CNE1-LBH (* P <0, 05 vs. gruppo CNE1-NC). (b) L'attività trascrizionale di NF-κB è aumentata significativamente dopo il knockdown di LBH nelle cellule NP69 (* P <0, 05 vs. gruppo NP69-NC-siRNA). (c) la fosforilazione di IκB è stata aumentata in CNE1-LBH rispetto a CNE1-NC, e (d) la fosforilazione di P65 è stata di conseguenza ridimensionata.

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L'infezione da EBV sottoregola l'espressione di LBH nelle cellule epiteliali rinofaringee

Testando se l'infezione da EBV regola l'espressione di LBH, le normali cellule NP69 rinofaringee infette da EBV presentavano un mRNA EBER 8 volte maggiore rispetto alle cellule di controllo non infette, confermando l'infezione da EBV, ma avevano una diminuzione> 60% dell'mRNA di LBH (# p <0, 01, Fig 4a). Specificamente testando se LBH1 codificato con EBV regolava LBH, la trasfezione pCDNA3-LMP1 inibiva notevolmente l'mRNA LBH> 60% sulla trasfezione plasmide-controllo 48 h post-trasfezione (* p <0, 05, # p <0, 01, Fig. 4b, c). Un sistema a doppio reporter ha mostrato che mentre l'attività trascrizionale NF-κB è aumentata del 40% nelle cellule CNE1 sovraespresse di LMP1, la sovraespressione simultanea di LBH ha inibito significativamente questo NF-κB indotto da LMP1 (Fig. 4d), probabilmente diminuendo la fosforilazione di P65 (Fig. 4e). Pertanto, LMP1 con codifica EBV può downregolare l'espressione LBH in NPC.

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(a) i livelli di mRNA EBER nelle cellule NP69 sono aumentati di circa 8 volte dopo l'infezione da EBV e l'espressione di LBH è diminuita di conseguenza; I livelli di mRNA di LBH erano circa 1/3 di quelli nelle cellule NP69 (# P <0, 01 vs. gruppo NP69). (b) I livelli di mRNA di LMP1 sono aumentati significativamente dopo che il PCDNA3-LMP1 è stato trasfettato in cellule NP69. (# P <0, 01 vs. NP69-LMP1 (-) gruppo). (c) I livelli di mRNA di LBH sono diminuiti di circa il 66% 48 ore dopo l'espressione di LMP1 (* P <0, 05 vs. NP69-LMP1 (-) gruppo). (d) LBH ha inibito l'attività trascrizionale NF-κB indotta da LMP1 nelle cellule CNE1. (e) LBH ha inibito la fosforilazione mediata da LMP1 NF-κB-P65 nelle cellule CNE1.

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TGF-β1 inibisce la crescita delle cellule NP69 attraverso la regolazione dell'espressione di LBH

Come gene regolato da NF-κB, C-Myc è stato selezionato per il rilevamento dell'espressione genica con qRT-PCR. Dopo il trattamento con TGF-β1, il livello di mRNA e proteina C-Myc è diminuito significativamente (Fig. SI3).

Testando la relazione tra la normale soppressione mediata da TGF-β1 della crescita cellulare e il trattamento LBH, il trattamento TGF-β1 ha aumentato significativamente i livelli di mRNA LBH (> 4 volte a 24 ore;> 2 volte a 48 ore) in cellule NP69 coltivate (# p <0, 01, Fig. 5a). Sebbene TGF-β1 potrebbe inibire l'attività trascrizionale di NF-κB da sola o in sinergia con la sovraespressione di LBH (* P <0, 05, gruppo LBH (+) vs. gruppo LBH (-); ** P <0, 05, LBH (+) - TGFβ1 gruppo vs. gruppo LBH (+), Fig. 5b), TGF-β1 non ha potuto ridurre in modo significativo l'attività trascrizionale NF-κB nelle cellule NP69 trattate con LBH-siRNA (* p <0, 05, Fig. 5c), suggerendo che TGF-β1 l'inibizione di NF-κB è stata mediata tramite LBH. Infine, abbiamo analizzato l'effetto del TGF-β1 sulla proliferazione di NP69 in presenza o assenza dell'espressione di LBH. TGF-β1 ha perso la capacità di inibire la proliferazione di NP69 dopo il knockdown di LBH (* p <0, 05, Fig. 5d, e), indicando che la normale espressione di LBH è un fattore importante nella soppressione mediata da TGF-β1 della crescita cellulare NP69.

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(a) L'analisi qRT-PCR ha mostrato che TGF-β1 ha indotto l'espressione di mRNA LBH nelle cellule NP69 (# P <0, 01 vs. gruppo di controllo). (b) Un test a doppio reporter ha mostrato che l'espressione di LBH o il trattamento TGF-β1 hanno downregolato l'attività trascrizionale di NF-κB nelle cellule NP69 e che l'espressione di LBH e TGF-β1 hanno dimostrato alcuni effetti sinergici sull'inibizione dell'attività trascrizionale di NF-κB (* P <0, 05, Gruppo LBH (+) vs. gruppo LBH (-); ** P <0, 05, gruppo LBH (+) - gruppo TGFβ1 vs. gruppo LBH (+)). (c) L'attività trascrizionale di NF-κB è stata inibita nelle cellule NP69 dopo il trattamento con TGF-β1, ma questo effetto di inibizione non era più significativo dopo il knockdown di LBH (* P <0, 05, NC-siRNA-TGF-β1 vs. NC- siRNA-con gruppo). (d) TGF-β1 alle dosi di 10 ng / mL e 12, 5 ng / mL hanno inibito la proliferazione cellulare NP69 (* P <0, 05 vs. gruppo NP69). (e) TGF-β1 non ha avuto effetti sulla proliferazione cellulare NP69 dopo il knockdown di LBH.

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L'espressione di LBH ripristina la capacità di TGF-β1 di inibire la crescita delle cellule NPC

Contrariamente alle cellule NP69, il TGF-β1 non ha avuto effetti significativi sull'attività trascrizionale di LBH mRNA e NF-κB nelle cellule NPC CNE1 (Fig. 6a, b). Dopo aver sovraregolato l'espressione di LBH, tuttavia, TGF-β1 riacquistò notevolmente la capacità di inibire significativamente l'attività trascrizionale di NF-κB sia a 24 che a 48 ore dopo il trattamento con TGF-β1 (* p <0, 05, Fig. 6c). Di conseguenza, risultati simili sono stati osservati per quanto riguarda l'effetto del TGF-β1 sulla proliferazione del CNE1 (* p <0, 05, Fig. 6d, e). Questi risultati suggeriscono non solo che la resistenza delle cellule CNE1 a TGF-β1 è correlata alla downregulation e disfunzione di LBH, ma anche che TGF-β1 riacquista la capacità di inibire la crescita delle cellule NPC ripristinando l'espressione di LBH.

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(a) TGF-β1 non ha avuto alcun effetto sull'espressione di LBH nelle cellule CNE1. (b) TGF-β1 non ha avuto alcun effetto sull'attività trascrizionale di NF-κB nelle cellule CNE1. (c) TGF-β1 ha inibito significativamente l'attività trascrizionale di NF-κB dopo la reinduzione di LBH nel gruppo CNE1-LBH-TGF-β1 (* P <0, 05 vs. gruppo CNE1-LBH-NC). (d) TGF-β1 non ha avuto effetti sulla proliferazione cellulare del CNE1. (e) TGF-β1 ha inibito la proliferazione cellulare CNE1 mediante reinduzione di LBH nel gruppo CNE1-LBH-TGF-β1 (* P <0, 05 vs. gruppo CNE1-LBH-NC).

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Espressione di LBH e sua associazione con fattori clinicopatologici nell'NPC

Come mostrato nella Tabella 1, l'immunoespressione di LBH è stata valutata con successo in tutti i 40 casi di NPC, costituiti da un carcinoma a cellule squamose cheratinizzanti, 17 carcinomi differenziati non cheratinizzanti e 22 carcinomi indifferenziati non cheratinizzanti. C'erano 30 uomini e 10 donne con un'età media di 50, 3 anni (intervallo, 22–84). Tre casi sono stati classificati come stadio I, 4 come stadio II, 17 come stadio III e 16 come stadio IV. La bassa espressione di LBH era presente in 26 (65%) dei casi ed era significativamente associata a casi di NPC con stato pT 3, 4 ( p = 0, 0096), stato N 2, 3 ( p = 0, 0313) e stadio AJCC 3, 4 ( p = 0, 0261). Tuttavia, non abbiamo trovato alcuna associazione tra espressione di LBH e altri fattori clinicopatologici.

Tabella a grandezza naturale

Significato prognostico dell'espressione LBH negli NPC

L'espressione bassa di LBH era correlata con un decorso clinico più aggressivo e un DSS significativamente più breve nei pazienti con NPC ( p = 0, 0380, Fig. 7a). Inoltre, la bassa espressione di LBH era fortemente predittiva di metastasi distali ( p = 0, 0414 per DMeFS) (Fig. 7b).

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Discussione

Sebbene la trasformazione maligna normalmente coinvolga oncogeni e perdita della funzione TSG, pochissimi di questi geni sono associati a NPC 2, polimorfismo arg del gene soppressore tumorale WAF-1 / CIP-1 / p21 nel carcinoma rinofaringeo (NPC): il polimorfismo distingue i caucasici dal cinese. Cancer Epidemiol Biomarkers Indietro 4, 261–267 (1995). "Href =" / articoli / srep07626 # ref4 "aria-label =" Riferimento 4 "> 4. In precedenza avevamo identificato che il gene LBH era sottoregolato nei tessuti NPC. studio corrente, abbiamo dimostrato che i livelli di proteina LBH erano significativamente sottoregolati nelle biopsie NPC rispetto alle normali cellule epiteliali nasofaringee; inoltre, quasi nessun LBH è stato rilevato nei tessuti NPC indifferenziati, suggerendo che LBH potrebbe inibire la normale trasformazione cellulare in NPC. e in vitro che la repressione di LBH in entrambe le linee cellulari NPC di CNE1 e SUNE1 ha inibito significativamente la proliferazione, la tumorigenesi e la crescita tumorale.

L'analisi del ciclo cellulare ha rivelato che l'espressione di LBH ha indotto l'arresto alla transizione G1 / S. Il meccanismo principale di regolazione del ciclo cellulare si basa sull'attivazione temporale della promozione della chinasi ciclina-dipendente (CDK) della progressione del ciclo cellulare 22 . Ciclina D1, fosforilazione di Rb e sottotipi di ciclina E (E1 ed E2) sono coinvolti nella progressione della fase G1 / S. La sovraespressione di ciclina D1 induce disregolazione della crescita cellulare e tumorigenesi 23, 24 . La ciclina E1 ed E2 sono fattori che contribuiscono all'arresto della fase G1 durante la differenziazione terminale e la loro sovraespressione è correlata alla tumorigenesi di diversi tumori 25, 26 ; mentre la ciclina E1 è espressa durante l'iperplasia della maggior parte delle cellule normali e di alcune cellule tumorali, la ciclina E2 è altamente espressa nelle cellule tumorali, ma non nelle cellule non trasformate 27 . Qui, l'espressione di LBH nelle cellule NPC ha ridotto l'attivazione trascrizionale del promotore di Cyclin D1 e l'espressione di Cyclin E1 ed E2 downregulated. Supportati dai risultati del knockdown di LBH nelle cellule NP69, i nostri dati suggeriscono collettivamente che la sottoregolazione di LBH promuove l'espressione di ciclina D1, E1 ed E2 nelle cellule epiteliali rinofaringee, che porta a un'eccessiva fosforilazione di Rb, che si traduce infine in rilascio dall'arresto del ciclo cellulare al G1 fase. Il preciso meccanismo molecolare a valle di come LBH regola i CDK per condurre all'arresto del ciclo cellulare, tuttavia, necessita di ulteriori approfondimenti.

Poiché Cyclin D1 è cruciale per la progressione attraverso G1 e NF-κB è un attivatore trascrizionale diretto di Cyclin D1, l'attivazione di Cyclin D1 mediata da NF-κB è necessaria per indurre la progressione da G1 a S fase 28 . Pertanto, l'arresto del ciclo cellulare osservato nelle cellule CNE1-LBH era probabilmente dovuto alla ridotta attività trascrizionale della ciclina D1 a valle dell'attività trascrizionale NF-κB downregolata; inoltre, ha implicato LBH come importante regolatore NF-κB. Coerentemente con la regolazione negativa NF-κB della differenziazione cellulare 29, i tumori trapiantati CNE1-LBH erano più differenziati rispetto ai tumori di controllo CNE1 30 . Ulteriori studi sono in corso per comprendere meglio la relazione tra differenziazione cellulare LBH e CNE1-NC.

Probabilmente la LBH svolge un ruolo funzionale oltre lo sviluppo nei tessuti adulti, poiché alcune malattie sono associate a mutazioni di guadagno di funzione nella LBH, sebbene il suo ruolo preciso non sia chiaro. I nostri dati ora rivelano che LBH limita la crescita e la proliferazione cellulare nei tessuti adulti inibendo i regolatori del ciclo cellulare durante la transizione G1 / S. È interessante notare che la LBH è già collegata a tumori mammari basali sottotipo aggressivi; a differenza di NPC, tuttavia, LBH è sovraespresso. Nonostante questa apparente contraddizione, la regolazione LBH del ciclo cellulare può anche contribuire alla carcinogenesi mammaria. Reiger et al. ha suggerito che LBH ha soppresso la differenziazione delle cellule mammarie, consentendo la carcinogenesi indotta da Wnt in queste cellule relativamente indifferenziate, sebbene ciò rimanga da testare formalmente 21 . Anche in questo studio precedente, la segnalazione Wnt regola direttamente LBH. È interessante notare che, poiché i tessuti NPC positivi per EBV hanno elevato il segnale Wnt 31, la nostra scoperta che l'LBH è sotto-regolato nei tessuti NPC positivi per EBV può contraddire la scoperta che Wnt regola l'LBH, sebbene rimanga possibile che l'LBH possa essere regolata in modo differenziato in cellule diverse. Ulteriori studi sui mediatori LBH a monte possono aiutare a risolvere questi risultati apparentemente opposti. Sulla base del nostro studio, sarebbe interessante determinare se i topi carenti di LBH descritti di recente, che mostrano solo un ritardo nello sviluppo della ghiandola mammaria postnatale, sono inclini a sviluppare tumori.

L'infezione da EBV e la patogenesi dell'NPC sono strettamente correlate e l'LMP1 con codifica EBV funziona come un oncogene 32 attivando diverse vie di segnalazione per indurre carcinogenesi, tra cui NF-κB, ciclo cellulare, proliferazione e apoptosi 33, 34 . I nostri dati ora rivelano il coinvolgimento di LBH in questo meccanismo a valle di LMP1 e suggeriscono fortemente che l'infezione da EBV onnipresente in NPC spiega la loro bassa espressione di LBH. Per quanto ne sappiamo, il nostro studio è il primo a collegare LBH all'attivazione mediata da LMP1 della via NF-κB, una rete di segnalazione oncogenica e di sviluppo essenziale.

Il TGF-β inibisce la crescita della maggior parte delle cellule epiteliali e lo sviluppo di resistenza a questa inibizione è considerato un passo importante verso la trasformazione maligna 35, 36 . LMP1 con codifica EBV in qualche modo consente alle cellule NPC CNE1 di acquisire questa resistenza e LMP1 derivato da NPC può indurre una resistenza completa nelle cellule CNE1 12, 37 . Qui, abbiamo identificato LBH come nuovo target nella via di segnalazione TGF-β1. Dopo aver confermato che TGF-β1 non ha avuto effetti sulla proliferazione delle cellule NPC o sulla progressione del ciclo cellulare, abbiamo mostrato che la reespressione di LBH nelle cellule CNE1 ha portato all'inibizione sinergica di TGF-β1 e LBH su attività trascrizionale, proliferazione e NF-κB progressione del ciclo. Questi risultati suggeriscono l'intrigante possibilità che gli epiteli rinofaringei possano iniziare una trasformazione maligna perdendo la protezione offerta dall'inibizione mediata da TGF-β1 della crescita cellulare attraverso un meccanismo che coinvolge la downregulation LBH mediata da EBV. Complessivamente (Fig. 8), questo studio non solo aiuta a comprendere ulteriormente la normale funzione LBH nelle cellule rinofaringee e il meccanismo alla base di come può essere regolato sulla trasformazione maligna, ma può anche fornire una nuova strategia per il trattamento di NPC attivando TGF-β1-mediata protezione attraverso il ripristino della funzione LBH.

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metodi

Pazienti e campioni di tumore

Blocchi di tessuto disponibili inclusi in paraffina sono stati recuperati da 40 pazienti consecutivi di NPC sottoposti a biopsie tra gennaio 2004 e dicembre 2010. Tutti questi pazienti erano privi di metastasi a distanza alla diagnosi iniziale. I sottotipi istologici sono stati rivalutati da due patologi, secondo l'attuale classificazione dell'OMS. La stadiazione dei tumori è stata rivalutata con il 7 ° sistema American Joint Committee on Cancer (AJCC). Tutte le persone che hanno partecipato a questo progetto hanno dato il consenso informato e lo studio è stato approvato dal Consiglio di etica medica del Centro per il cancro dell'Università Sun Yat-sen.

Trattamento e follow-up

Tutti i 40 casi hanno accettato un ciclo completo di radioterapia (RT), dose totale ≧ 7000 cGy e chemioterapia a base di cisplatino è stata eseguita in pazienti con malattia di stadio II-IV. Il metodo di RT era generalmente uniforme in questo periodo. Dopo RT, tutti i 40 pazienti sono stati regolarmente monitorati fino alla morte o al loro ultimo appuntamento, con una durata media di follow-up di 67, 9 mesi (range da 5 a 121).

Linee cellulari e plasmidi

NP69, una linea cellulare NPC umana immortalata (ATCC), è stata coltivata in terreno cheratinocitario-SFM (Invitrogen). Entrambe le linee cellulari CNE1 (precedentemente stabilite presso l'Università cinese di Hong Kong) e SUNE1 (un carcinoma squamoso nasofaringeo scarsamente differenziato istituito presso il Centro per il cancro dell'Università di Sun Yat-sen) sono state coltivate in RPMI-1640 contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) .

Il plasmide umano promotore Cyclin D1 (-1745-CD1-Luc), fornito da RG Pestell (Albert Einstein College of Medicine, USA), conteneva un reporter di luciferasi sotto il controllo del promotore umano Cyclin D1. Il plasmide NF-κB-Luc conteneva tre siti di legame in tandem NF-κB. Il plasmide di controllo pRL-sv40 è stato acquistato da Promega.

L'immunoistochimica

Il tessuto NPC di pazienti presso il Centro oncologico dell'Università di Sun Yat-sen è stato sottoposto a biopsia in rinofaringoscopia a fibre ottiche, congelato a scatto in LN 2 e incorporato in paraffina. Sono stati utilizzati tessuti nasofaringei normali di 20 soggetti di controllo e tumori di 40 pazienti con NPC (diagnosticati con patologia). Le sezioni di tessuto sono state incubate durante la notte a 4 ° C con un mAb anti-LBH (Sigma). Sezioni di controllo non specificatamente colorate sono state incubate in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) senza anticorpo primario. È stato aggiunto l'anticorpo secondario anti-coniglio biotinilato (40 min, temperatura ambiente), seguito dal complesso perossidasi avidin-biotinilato (40 min). Le sezioni sono state lavate con acqua distillata (10 min), trattate con DAB per visualizzare la colorazione positiva, controcolorate con hemalum di Mayer e montate.

Costruzione di plasmidi ricombinanti e creazione di linee cellulari stabili

L'RNA totale è stato trascritto inverso con apice III RT (Invitrogen). Il prodotto LBH CDS PCR (forward: 5′-CCCGTGTCATCCTCACTCG-3 ′; reverse: 5′-CAGATGCTGGCTGGTATGACC-3 ′) è stato legato separatamente nei vettori pEGFP-C 1 e pRC / CMV2. Il plasmide ricombinante pRC / CMV2-LBH è stato trasfettato in cellule CNE1 da Lipofectamine2000 (Invitrogen). Le cellule trasfettate di CNE1 sono state sottoposte a screening con G418 (400 μg / mL) (Invitrogen) per ~ 2 settimane per ottenere un clone a singola cellula. RT-PCR ha identificato le linee cellulari CNE1-LBH stabili. Le cellule di controllo CNE1-NC sono state trasfettate con un vettore pRC / CMV2, schermate con G418 e identificate mediante PCR (avanti: 5′-TGACGCAAATGGGCGGTAG-3 ′; retromarcia: 5′-GCACCTTCCAGGGTCAAG-3 ′).

Saggio MTT

CNE1-LBH e CNE1-NC (5 × 10 3 cellule / pozzetto) sono stati coltivati ​​in 100 μL di RPMI-1640 contenente il 10% di FBS in piastre da 96 pozzetti. Dopo 24 ore, sono stati aggiunti 10 μL / pozzetto di MTT (5 mg / mL, Sigma) (37 ° C, 4 ore). Il supernatante è stato rimosso e il formazan è stato sciolto in DMSO (100 μL / pozzetto, 37 ° C, 10 min). L'assorbanza (570 nm) è stata letta da un lettore di micropiastre (Thermo Scientific) e monitorata a giorni alterni per 6 giorni.

Tumorigenicità nei topi nudi in BALB / c

Le cellule CNE1-LBH, CNE1-NC e CNE1 (5 × 10 6 ) in 100 ml di tampone di D-Hank sono state iniettate nell'ascella bilaterale di topi nudi BALB / c di 4 settimane. Dopo la comparsa dei tumori, la dimensione del tumore è stata misurata ogni 6 giorni. Trenta giorni dopo l'inoculazione, i topi sono stati sacrificati, i tumori sono stati rimossi e pesati e sono stati calcolati i tassi di tumorigenicità.

Sistema di imaging in vivo

Sono stati usati uguali numeri di topi BALB / c nu / nu di 4 settimane maschi e femmine (peso, 16 ± 2 g). Cellule NPC SUNE1-LBH-Luc (costruite mediante integrazione stabile di LBH e luciferasi in un sistema lentivirale) in fase logaritmica e controllo Le cellule SUNE1-NC-Luc sono state iniettate per via sottocutanea (100 μL; 2 × 10 7 cellule / mL) nella zampa anteriore di topi vicino all'ascella (n = 6). Il rilevamento di immagini in diretta è stato eseguito nei giorni 2, 5, 8 e 13. Dopo topi anestetizzanti, è stata iniettata per via intraperitoneale 150 mg / ml di luciferina per 150 mg / kg di peso. L'intensità del segnale è stata registrata 10 minuti più tardi (nel sistema di imaging Vivo, Berthold Corp.). Dopo la comparsa dei tumori, il volume del tumore veniva misurato ogni giorno usando un calibro a corsoio. I topi sono stati sacrificati 2 settimane dopo e i tumori sono stati analizzati per patologia.

Analisi del ciclo cellulare

Le cellule CNE1-LBH e CNE1-NC (5 × 10 5 ) sono state seminate in un matraccio da 25 cm 2, raccolte per tripsinizzazione 48 ore dopo la propagazione, lavate due volte con PBS ghiacciato, fissate con etanolo freddo al 70% e colorate con 50 μg / mL di ioduro di propidio (Sigma) contenente 5 mg / mL di RNasiA. Sono stati analizzati la sintesi del DNA e lo stato del ciclo cellulare (citometro a flusso Coulter Elite, Beckman-Coulter).

trasfezione siRNA e analisi qRT-PCR

I duplex LBH-siRNA e siRNA a controllo negativo sono stati progettati (//www.invitrogen.com/rnai) e sintetizzati (Shanghai GenePharma). Le cellule NP69 (5 × 10 5 ) coltivate in piatti triplicati da 10 cm 2 sono state trasfettate con siRNA (30 nM) il giorno seguente con lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen). L'RNA totale è stato isolato 1-2 giorni dopo con TRIzol (Invitrogen). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando PrimeScript RT (Takara). I primer per PCR sono stati progettati dal software DNA Club (Tabella S1). I livelli di mRNA sono stati analizzati con il metodo 2 ΔΔCt, normalizzato da GAPDH.

Macchia occidentale

Le cellule (1 × 106) sono state seminate in piatti da 25 cm2 in mezzo completo per 24–48 ore. I lisati sono stati centrifugati (10.000 g, 10 min, 4 ° C), sottoposti a SDS-PAGE, trasferiti su nitrocellulosa, bloccati con NFDM al 5% di blotting (60 min) e colorati con i seguenti anticorpi: coniglio anticiclina D1 ed E2 mAbs (1: 500; Cell Signaling Technology), coniglio anti-GAPDH mAb (1: 1000; Cell Signaling Technology), anticorpi secondari coniugati con IgG anti-coniglio IgP (1: 2000). Tutti i gel sono stati sottoposti alle stesse condizioni sperimentali.

analisi statistica

I dati sono mostrati come media ± SEM. Il significato ( P <0, 05) è stato determinato dal test t di Student o dall'analisi della varianza (ANOVA) seguito dalla valutazione delle differenze (SPSS 12.0). L'analisi di sopravvivenza è stata eseguita usando il metodo Kaplan-Meier. Le analisi di sopravvivenza univariate sono state eseguite utilizzando i grafici di KaplanMeier e confrontate con il test log-rank.

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