Il magnesio induce l'apoptosi neuronale sopprimendo l'eccitabilità | morte cellulare e malattia

Il magnesio induce l'apoptosi neuronale sopprimendo l'eccitabilità | morte cellulare e malattia

Anonim

Soggetti

  • L'apoptosi
  • Eccitabilità
  • Magnesio
  • neurodegenerazione

Astratto

In ostetricia clinica, l'uso di magnesio solfato (MgSO 4 ) è molto diffuso, ma non sono noti effetti sullo sviluppo del cervello. Molti agenti che deprimono l'eccitabilità neuronale aumentano la neuroapoptosi dello sviluppo. In questo studio, abbiamo usato colture dissociate di ippocampo roditore per esaminare gli effetti del Mg ++ sull'eccitabilità e sulla sopravvivenza. Perdita cellulare associata alla caspasi-3 indotta da Mg ++ a concentrazioni clinicamente rilevanti. Le tecniche di patch-clamp su cellule intere hanno misurato gli effetti Mg ++ sulla soglia del potenziale d'azione, sull'ampiezza del picco del potenziale d'azione, sul numero di picchi e sui cambiamenti nel potenziale di membrana a riposo. Soglia del potenziale d'azione depolarizzata Mg ++, presumibilmente dagli effetti di schermatura della carica superficiale sui canali del sodio dipendenti dalla tensione. Mg ++ ha anche ridotto il numero di potenziali d'azione in risposta all'iniezione di corrente fissa senza influire sull'ampiezza del picco del potenziale d'azione. Sorprendentemente, Mg ++ ha anche depolarizzato il potenziale di riposo neuronale in modo dipendente dalla concentrazione con uno spostamento di +5, 2 mV a 10 mM. Le rampe di tensione hanno suggerito che Mg ++ ha bloccato una conduttanza di potassio contribuendo al potenziale di riposo. Nonostante questo effetto depolarizzante di Mg ++, l'effetto inibitorio netto di Mg ++ ha quasi completamente silenziato l'attività della rete neuronale misurata con registrazioni di array multielettrodi. Concludiamo che sebbene Mg ++ abbia effetti complessi sull'eccitabilità cellulare, l'influenza inibitoria complessiva di Mg ++ riduce la sopravvivenza neuronale. Presi insieme alle recenti prove in vivo , i nostri risultati suggeriscono che può essere necessaria cautela nell'uso di Mg ++ in ostetricia clinica e neonatologia.

Principale

Il solfato di magnesio (MgSO 4 ) è stato utilizzato in ostetricia clinica per oltre 70 anni per il trattamento di pre-eclampsia / eclampsia e parto pretermine, condizioni che complicano circa il 3 e il 12, 4% di gravidanze, rispettivamente, negli Stati Uniti ogni anno. 1 Attualmente MgSO 4 è lo standard di cura per la prevenzione e il trattamento di convulsioni eclamptiche e sebbene la sua sicurezza ed efficacia come tocolitico sia controversa, 2, 3 si stima che oltre 150.000 donne negli Stati Uniti ricevano una terapia tocolitica prima o poi 34 settimane di gestazione all'anno, con MgSO 4 usato come prima linea di trattamento nella maggior parte dei casi. 4, 5 Sebbene MgSO 4 sia stato generalmente considerato sicuro senza effetti avversi nei neonati, nessuno studio ha valutato se l'esposizione di cervelli in via di sviluppo normali ad alte concentrazioni di Mg ++ abbia effetti o conseguenze deleteri.

Al contrario, Mg ++ è stato ampiamente studiato come potenziale neuroprotettore per prevenire o migliorare gli esiti di lesioni cerebrali derivanti da ipossia / ischemia perinatale come encefalopatia, emorragia intraventricolare, leucomalacia periventricolare e paralisi cerebrale. 6, 7 Tuttavia, la sicurezza e l'efficacia neuroprotettiva di Mg ++ per i neonati prematuri a rischio rimangono controverse. 8 Recensioni recenti che hanno valutato l'uso di MgSO 4 per la neuroprotezione del feto o l'uso come tocolitico nelle donne a rischio di parto pretermine hanno concluso che non sono stati stabiliti effetti neuroprotettivi; MgSO 4 è inefficace nel ritardare o prevenire la nascita pretermine e può effettivamente aumentare la morbilità e la mortalità neonatale. 2, 9

Il magnesio è secondo solo al potassio in abbondanza come catione intracellulare nel corpo umano e Mg ++ partecipa a molte funzioni cellulari, tra cui produzione di energia, neurotrasmissione sinaptica e segnalazione intracellulare. Mg ++ blocca i canali ionici del recettore del glutammato N- metil-D -aspartato (NMDA), impedendo il flusso ionico ai potenziali potenziali di riposo neuronali. 10 cationi divalenti, incluso Mg ++ a concentrazioni di mM, riducono l'attivazione dei canali con tensione di tensione attraverso effetti di screening della carica superficiale, 11, 12, 13, 14, riducendo così l'eccitabilità neuronale. Il Mg ++ ad alte concentrazioni extracellulari blocca anche l'afflusso di Ca ++ e diminuisce la trasmissione sinaptica. 15 Apparentemente le azioni tocolitiche derivano dalla ridotta contrattilità miometriale attraverso azioni Mg ++ extra e intracellulari. 16 Tuttavia, il Mg ++ soprafisiologico blocca anche le conduttanze di potassio e i recettori dell'acido γ- aminobutirrico (GABA) A. 17, 18, 19 Prove recenti suggeriscono che il sollievo dall'inibizione indotta da Mg ++ a lungo termine potrebbe comportare aumenti omeostatici del potenziamento e della plasticità a lungo termine. 20 Pertanto, a concentrazioni soprafisiologiche, Mg ++ può avere azioni complesse sull'eccitabilità neuronale e non è chiaro se l'eccitazione o l'inibizione netta prevarranno durante l'incubazione prolungata.

I composti che inibiscono l'attività neuronale, inclusi antagonisti NMDA e calcio-antagonisti, innescano la neurodegenerazione apoptotica diffusa nel cervello in via di sviluppo durante la finestra della vulnerabilità (topi e ratti 0-14 giorni dopo la nascita). 21, 22, 23 Nei roditori, questo periodo critico corrisponde all'incirca al terzo trimestre dello sviluppo umano, quando l'esposizione a MgSO 4 si verifica in genere nell'uomo. 24 Se Mg ++ inibisce sufficientemente i neuroni, la somministrazione di Mg ++ in animali giovani potrebbe aumentare la neuroapoptosi dello sviluppo. In effetti, abbiamo dimostrato che MgSO 4 in vivo induce una neuroapoptosi diffusa del sistema nervoso centrale nei giorni 3 e 7 postnatali, ma non nei giorni postnatali 14. 25 Questo lavoro non ha indagato esplicitamente se Mg ++ agisse direttamente o indirettamente su neuroni bersaglio sensibili, una domanda a cui i preparati in vitro sono particolarmente adatti.

Date le complesse azioni cellulari di Mg ++ sull'eccitabilità annotate sopra e le domande sul fatto che Mg ++ causi direttamente la morte neuronale, abbiamo esaminato la sopravvivenza in vitro , insieme a studi eletrofisiologici per testare gli effetti di Mg ++ sull'eccitabilità dei neuroni. Per questi studi meccanicistici, abbiamo sfruttato una preparazione di coltura primaria di neuroni ippocampali di roditori.

risultati

Effetti di sopravvivenza / neuroni caspase-3 attivati

Abbiamo scoperto che sia MgSO 4 che MgCl 2 a concentrazioni di 5 e 10 mM hanno indotto la morte dei neuroni dell'ippocampo rispetto alle colture di controllo (Figure 1a e b). Nelle colture trattate sono stati osservati meno neuroni rispetto ai controlli e spesso i profili cellulari dei neuroni morenti erano visibili e caratterizzati da nuclei condensati e frammentati, come spesso è associato alla morte delle cellule apoptotiche. 21 MgSO 4 e MgCl 2 hanno entrambi avuto forti effetti negativi sulla sopravvivenza a 5 mM e a 10 mM hanno aggiunto Mg ++ (Figura 1b). Ciò pone la concentrazione alla quale Mg ++ uccide i neuroni nell'intervallo in cui ha effetti importanti sui canali ionici ed è clinicamente rilevante. 26 Sulla base del significativo grado di morte cellulare prodotto a concentrazioni di 5 e 10 mM di MgSO 4, abbiamo esaminato la sopravvivenza in uno studio di concentrazione-risposta confrontando 1, 2, 5 e 5 mM. In questi studi (Figura 1c), si è verificata una tendenza alla perdita neuronale con concentrazioni fino a 1 mM di MgSO 4 aggiunto ( P = 0, 07). Questa tendenza è diventata statisticamente significativa a 2, 5 e 5 mM al di sopra delle condizioni di controllo (Figura 1c).

Image

Mg ++ riduce la sopravvivenza neuronale nelle colture primarie di ippocampi. ( a ) Fotomicrografia a contrasto di fase che mostra neuroni sani (esempi indicati con frecce) utilizzati nel conteggio delle cellule. ( b ) Riepilogo dei conteggi di campi selezionati casualmente da piatti trattati con MgSO 4 o MgCl 2 alle concentrazioni indicate. I conteggi sono stati normalizzati a conteggi da colture di fratelli di controllo ( n = 5 esperimenti su piastre indipendenti). Il trattamento con Mg ++ è stato dal giorno in vitro 5 al giorno in vitro 10. ( c ) Riepilogo dei test delle concentrazioni inferiori di MgSO 4 sulla percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo. Sebbene questo insieme di colture sia stato leggermente meno suscettibile agli effetti di Mg ++ 5 mM rispetto alle colture in ( a ), concentrazioni di appena 1 mM al di sopra del controllo hanno prodotto una riduzione significativa della sopravvivenza rispetto al controllo. Le barre rappresentano la media ± SEM ( n = 6). * P <0, 05; *** P <0, 001

Immagine a dimensione intera

MgSO 4 induce un'ondata di neurodegenerazione apoptotica nel cervello di topo neonatale, 25 in parte definita dall'attivazione di caspase-3, una caspasi effettrice in molti tipi di apoptosi neuronale. 27 Per determinare se i neuroni esposti in Mgro in vitro subiscono cambiamenti apoptotici e per identificare positivamente i neuroni morenti, abbiamo immunocolorato le colture di ippocampi per caspase-3 attivato. L'immunocolorazione per caspase-3 attivato presenta vantaggi rispetto ad altre misure dell'attività della caspase perché identifica il tipo di cellula contenente l'enzima attivato (nel nostro caso neuroni dell'ippocampo). L'identificazione del tipo di cellula è una caratteristica utile nella nostra cultura mista di astrociti e neuroni. Abbiamo immunizzato le cellule in condizioni di controllo e le colture trattate con 5 e 10 mM di MgSO 4 aggiuntivo per 3 giorni a partire da 6 giorni in vitro . L'apoptosi in risposta al blocco dell'attività in vitro mostra un aumento significativo della colorazione della caspasi-3 nelle cellule sensibili e Mg ++ ha prodotto un aumento dipendente dalla concentrazione della percentuale di neuroni immunoreattivi nelle colture (Figura 2), simile a una varietà di trattamenti che inibiscono attività neuronale. 28, 29 Il numero medio assoluto di cellule sane nel gruppo controllo rispetto a quello trattato era simile (68, 8 ± 22, 8 cellule per controllo; 64, 1 ± 20, 5 cellule per 5 mM; e 64, 4 ± 26, 7 cellule per 10 mM). Questa somiglianza è risultata dalla valutazione precoce delle colture a 3 giorni dopo il trattamento con MgSO 4 (Figura 2) rispetto ai 6 giorni dopo la valutazione del trattamento in Figura 1 (vedere anche Moulder et al. 28 ). Entrambi i gruppi MgSO 4 da 5 e 10 mM hanno mostrato percentuali significativamente più elevate di cellule positive alla caspasi-3 rispetto ai controlli di pari livello (Figure 2c ed d). Le basse percentuali assolute di neuroni immunoreattivi della caspasi-3 riflettono la lenta perdita complessiva dei neuroni, combinata con l'immunoreattività transitoria della caspasi-3 nei singoli neuroni. Un'istantanea dell'immunoreattività della caspasi-3 in qualsiasi momento durante la progressiva perdita di neuroni produce solo una minoranza di cellule positive. 28, 29

Image

Più neuroni mostrano immunoreattività alla caspasi-3 in colture trattate con Mg ++ . ( a ) Campo di controllo che mostra neuroni sani negativi per l'immunoreattività di caspasi-3 attivata. ( b ) Campo proveniente da una cultura trattata con Mg ++ di pari livello che mostra un neurone positivo per caspase-3 attivato (freccia). ( c ) I grafici a barre riassumono la percentuale di cellule positive alla caspasi-3 rispetto alle cellule sane degli stessi campi. Entrambe le concentrazioni di MgSO 4 (5 e 10 mM) hanno aumentato significativamente la percentuale di neuroni apoptotici rispetto al controllo ( n = 5 esperimenti). ( d ) Riepilogo di ulteriori esperimenti progettati per testare la protezione mediante incubazione di KCl. KCl da solo ha mostrato una tendenza alla protezione contro la perdita neuronale attrizionale e ha ridotto la percentuale di immunoreattività per controllare i livelli in combinazione con l'esposizione a Mg ++ ( n = 5). * P <0, 05; ** P <0, 01

Immagine a dimensione intera

L'incubazione cronica di neuroni con elevate concentrazioni di KCl nel terreno di coltura ha dimostrato di proteggere i neuroni dalla morte cellulare apoptotica risultante da iperinibizione e dalla privazione del fattore neurotrofico. Si ritiene che la depolarizzazione di 23, 28, 29, 30, 31 KCl prevenga l'apoptosi aumentando moderatamente la concentrazione intracellulare di Ca 2+ . 30 Se Mg ++ agisce diminuendo l'attività neuronale, ipotizzeremmo che il trattamento con KCl contrasterebbe l'effetto di Mg ++ . Al contrario, se Mg ++ agisse con altri meccanismi, come l'eccessiva eccitazione, potremmo aspettarci che la depolarizzazione di KCl dovrebbe esacerbare la morte. Pertanto, per aiutare a chiarire ulteriormente la natura della morte neuronale indotta da Mg ++ in vitro , abbiamo testato l'effetto di 30 mM KCl sulla morte cellulare associata alla caspasi indotta da Mg ++ . Abbiamo scoperto che KCl ha protetto in modo significativo sia la morte neuronale spontanea che la morte cellulare indotta da MgSO 4 (Figura 2d). Come mostrato negli esperimenti precedenti, il confronto tra controllo e MgSO 4 ha mostrato una presenza di caspasi-3 attivata significativamente aumentata. Il confronto tra le figure 2c ed d mostra una notevole variabilità nella quantità di apoptosi correlata all'attrito tra colture di controllo di diversi tipi di platino (∼ 8% nella figura 2c contro ∼ 2% nella figura 2d). Sebbene tutti i fattori che partecipano al livello di apoptosi di fondo non siano completamente compresi, l'aumento indotto da Mg ++ nell'immunoreattività della caspasi-3 è stato robusto nel contesto di una perdita attrizionale inferiore e superiore.

Elettrofisiologia

Per determinare gli effetti di Mg ++ sull'eccitabilità dei neuroni dell'ippocampo, sono stati condotti esperimenti di elettrofisiologia con le stesse concentrazioni di MgCl 2 degli esperimenti di sopravvivenza (2, 5, 5 e 10 mM). MgCl 2, anziché MgSO 4, è stato utilizzato negli esperimenti di elettrofisiologia poiché i sali di cloruro sono abitualmente utilizzati nell'elettrofisiologia della coltura. Mentre prevedevamo una riduzione netta dell'eccitabilità da parte di Mg ++ sulla base dei nostri studi di sopravvivenza, abbiamo confrontato gli effetti delle concentrazioni crescenti di tetrodotossina (TTX), un antagonista altamente selettivo dei canali del sodio dipendenti dalla tensione con effetti ben definiti sull'eccitabilità. 32 Il silenziamento del TTX uccide i neuroni nella cultura dell'ippocampo attraverso l'apoptosi in un arco temporale simile a quello di Mg ++, 28, 29, quindi è servito come un comparatore pertinente.

In modalità pinza amperometrica, è stato utilizzato un impulso di corrente di 20 ms da +70 a +220 pA per avviare potenziali di azione. Le ampiezze attuali ben oltre la reobase della cellula sono state utilizzate per aiutare a garantire che lo spiking fosse provocato da un'ampiezza di corrente fissa, nonostante la ridotta eccitabilità prevista con l'applicazione Mg ++ e TTX. Le tracce sono state registrate e analizzate per la soglia del potenziale d'azione, l'ampiezza del picco del potenziale d'azione, il numero di picchi e le variazioni del potenziale della membrana a riposo ( V m ).

La Figura 3 mostra che c'è stato un aumento dipendente dalla concentrazione delle soglie del potenziale d'azione con il trattamento con Mg ++ (Figure 3a e b), che ha provocato una diminuzione dell'eccitabilità, misurata come il numero di picchi provocati dall'iniezione di corrente fissa (Figura 3c ). L'effetto sull'iniziazione del picco è diventato così grave a 10 mM Mg ++ che in due cellule non siamo stati in grado di evocare potenziali d'azione a questa concentrazione. Anche il TTX (30 nM) ha significativamente depolarizzato la soglia (Figura 4a). Quantitativamente, l'effetto del TTX di 30 nM sulla soglia del potenziale d'azione era simile all'effetto di Mg ++ 2, 5 e 5 mM, con effetti più forti di 60 nM e 90 TT TTM ( P <0, 001) rispetto a 30 nM.

Image

Mg ++ aumenta la soglia di tensione per l'avvio del potenziale d'azione e diminuisce il numero di picchi in risposta all'iniezione di corrente prolungata. ( a ) Esempi rappresentativi di potenziali di azione suscitati da un'iniezione di corrente ad ampiezza fissa (+120 pA) nelle registrazioni di patch-clamp su cellula intera. Vengono fornite soglie di potenziale d'azione per ogni traccia, che rappresentano da sinistra a destra: 1 (basale), MgCl 2 aggiuntivo di 2, 5, 5 e 10 mM. Vedere la Figura 4 per i dati di riepilogo. ( b ) Prime tracce derivate dagli esempi mostrati in ( a ). Mg ++ ha ridotto la pendenza massima dei potenziali d'azione (ampiezza di picco della prima derivata), in linea con una riduzione della disponibilità dei canali Na + . ( c ) Effetti di Mg ++ sul numero di potenziali d'azione suscitati in risposta a un'iniezione di corrente fissa. Gli esempi provengono dalle stesse registrazioni dei pannelli ( a ) e ( b ). Vedere la Figura 4 per i dati di riepilogo

Immagine a dimensione intera

Image

Riepilogo dei dati cumulativi dalle registrazioni di patch-clamp su celle intere. ( a ) Pannello di sinistra: la soppressione della soglia del potenziale d'azione dipendeva dalla concentrazione di Mg ++ . Pannello di destra: gli effetti TTX sulla soglia del potenziale d'azione erano paragonabili a quelli di Mg ++ . ( b ) Mg ++ ha ridotto il numero di picchi per iniezione corrente. Una tendenza dipendente dalla concentrazione ha raggiunto un significato statistico con la più alta concentrazione di Mg ++ . TTX ha nuovamente approssimato l'effetto di Mg ++ . ( c ) L'ampiezza del picco del potenziale d'azione non è stata influenzata da Mg ++ ma è stata significativamente ridotta dal TTX. ( n = 13 per cellule trattate con Mg ++ e 11 per cellule trattate con TTX). ** P <0, 01; *** P <0, 001

Immagine a dimensione intera

Mg ++ non ha influenzato in modo significativo l'ampiezza di picco dei potenziali di azione se non alla massima concentrazione (10 mM). Tuttavia, la variazione della pendenza massima e dell'ampiezza del picco della prima derivata del potenziale d'azione (Figure 3b e 4) è coerente con una ridotta disponibilità e attivazione dei canali Na + e successivo spostamento della soglia. 33 Al contrario, il TTX a concentrazioni di 30 nM ( P <0, 01) e superiori ( P <0, 001) ha ridotto significativamente l'ampiezza dei potenziali d'azione (Figura 4c). Ciò era previsto a causa del blocco diretto dei canali del sodio da parte del TTX. Mg ++ ha anche indotto una diminuzione dipendente dalla concentrazione del numero di potenziali d'azione evocati dall'iniezione di corrente ad ampiezza fissa (Figura 4b). Come Mg ++, il TTX a 30, 60 e 90 nM ha ridotto il numero di picchi rispetto alla linea di base (Figura 4).

Nonostante questi effetti inibitori di Mg ++, abbiamo anche osservato un effetto eccitatorio imprevisto di Mg ++ . Mg ++ depolarizzato neuronale a riposo V m in modo dipendente dalla concentrazione (Figure 5a e b). Questo effetto è stato associato ad una maggiore resistenza di input cellulare (Figura 5c). Per definire il potenziale di inversione approssimativo della corrente interessata, abbiamo bloccato le celle di tensione ed eseguito protocolli di rampa di tensione (Figura 5c). La variazione di pendenza della risposta corrente alla rampa di tensione evidenzia la diminuzione della conduttanza della membrana in risposta all'applicazione Mg ++ . La sottrazione digitale della risposta basale dalla risposta in presenza di Mg ++ ha suggerito un potenziale di inversione fortemente negativo per la corrente sensibile al Mg ++ (-84, 8 ± 14, 3 mV, n = 6 cellule). In una cella, abbiamo verificato che l'inversione non era influenzata aumentando la concentrazione di cloruro di pipetta a 140 mM (potenziale di inversione per cloruro (E Cl− ) = 0 mV). Nella maggior parte delle cellule, la corrente sensibile al Mg ++ ha mostrato un'apparente rettifica verso l'interno (vedi esempio in Figura 5c). Ciò potrebbe suggerire che Mg ++ blocca una corrente di rettifica interna, ma non possiamo escludere un blocco dipendente dalla tensione di una conduttanza ohmica. Come previsto, il TTX non ha prodotto alcun cambiamento costante nel riposo V m (-63, 4 ± 2, 4 mV contro 30 nM TTX: -63, 7 ± 3, 7 mV). In sintesi, questi esperimenti suggeriscono che Mg ++ influenza il potenziale di riposo principalmente bloccando una conduttanza di potassio aperta a riposo, possibilmente una conduttanza raddrizzante internamente.

Image

Mg ++ depolarizza il potenziale di riposo neuronale. ( a ) Esempio rappresentativo della variazione del riposo V m appena prima dell'iniezione corrente (freccia) con concentrazioni crescenti di Mg ++ . Ogni aumento della concentrazione di Mg ++ ha indotto una depolarizzazione di circa 2 mV a riposo V m . ( b ) Il grafico a barre rappresenta la variazione cumulativa in V m rispetto a tutte le registrazioni cellulari ( n = 13). Vi è circa uno spostamento di +5, 2 mV nella media V m nel controllo rispetto al gruppo Mg ++ elevato (totale 11 mM) * P <0, 05; *** P <0, 001. ( c ) Esempio di rampa di tensione eseguita in condizioni basali e in presenza di 10 mM aggiunta Mg ++ (11 mM in totale). La rampa era da -140 a -40 mV in 20 ms. La sottrazione di una risposta in presenza di Mg ++ da una scansione di controllo ha prodotto una corrente sensibile al Mg ++ con potenziale di inversione di -84, 8 mV in questa cella

Immagine a dimensione intera

Nel contesto delle nostre cellule bloccate dalla corrente immerse in antagonisti del recettore postsinaptico, gli effetti inibitori di Mg ++ sembravano dominare l'effetto eccitatorio sul potenziale di riposo. Tuttavia, gli effetti misti di Mg ++ sollevano la questione di quali effetti sarebbero predominanti in una rete spontaneamente attiva, come nei nostri studi di sopravvivenza. Per rispondere a questa domanda, ci siamo rivolti alle registrazioni MEL (multielectrode array) delle nostre culture (Figura 6). Abbiamo usato 30 nM TTX come comparatore perché approssimava la soglia aumentata di potenziali d'azione e diminuiva l'eccitabilità osservata con la concentrazione intermedia di Mg ++ . Quando le colture MEA sono state immerse nella registrazione di soluzione salina contenente un ulteriore Mg ++ 2, 5 o 5 mM, è stato osservato un silenziamento quasi completo della rete neuronale (Figura 6). TTX a 30 nM, attività di rete similmente depressa, con una soppressione quasi completa dell'attività (Figura 6). In tutti i casi, gli effetti del trattamento sono stati confrontati con l'attività media delle condizioni di controllo e washout per tenere conto della potenziale perdita di attività a causa del danno neuronale derivante da scambi ripetuti di soluzioni. I livelli di attività in Mg ++ 2, 5 mM, Mg ++ 5 mM e TTX 30 nM non erano significativamente diversi l'uno dall'altro e tutte le attività di rete erano fortemente e quasi completamente soppresse. Questi risultati suggeriscono chiaramente che l'inibizione è l'effetto predominante di Mg ++ extracellulare elevato nella rete intatta.

Image

Mg ++ sopprime l'attività di rete. ( a - c ) Grafici raster di registrazioni MEA da controllo ( a ), Mg ++ 2, 5 mM ( b ) e washout ( c ). La registrazione di washout è stata eseguita dopo che la coltura è stata sottoposta a registrazioni eseguite nelle condizioni di trattamento Mg ++ 2, 5 mM, Mg ++ 5 mM e TTX 30 nM. Sebbene l'attività non fosse così solida nelle registrazioni di washout, era significativamente maggiore rispetto a qualsiasi delle condizioni di trattamento. La diminuzione dell'attività tra il basale e il washout era probabilmente dovuta alla rimozione incompleta del TTX e agli effetti di lavaggi ripetuti. Gli scambi di soluzioni singole sullo stesso supporto non hanno avuto alcun effetto sui tassi di rilevamento degli spike (ASDR) a livello di array. ( d ) Il riepilogo dei livelli di attività nei gruppi di trattamento ha mostrato come una frazione di ASDR, espressa in relazione alla media dei tassi di ASDR al basale e di washout. Il silenziamento quasi completo della rete neuronale è stato osservato in tutti i trattamenti sperimentali. ( n = 3 esperimenti indipendenti). ** P <0, 01

Immagine a dimensione intera

Discussione

Sebbene Mg ++ abbia effetti complessi sull'eccitabilità cellulare, comprese le influenze sia eccitatorie che inibitorie, i nostri dati indicano che l'influenza inibitoria complessiva di Mg ++ rappresenta la riduzione della sopravvivenza neuronale con esposizione prolungata. Nonostante una sorprendente depolarizzazione del potenziale di riposo, l'effetto netto di Mg ++ è inibitorio, come dimostrato dalle registrazioni dell'attività di rete. La ridotta eccitabilità innesca la morte neuronale e la depolarizzazione con potassio protegge dalla morte. Questi risultati suggeriscono che l'apoptosi neuronale indotta da Mg ++ in vivo 25 probabilmente deriva direttamente dagli effetti di Mg ++ sui neuroni sensibili piuttosto che attraverso conseguenze secondarie della somministrazione sistemica di Mg ++ agli animali. In ostetricia clinica, la somministrazione di Mg ++ è in genere titolata per mantenere livelli sierici materni di circa 4-8 mg per 100 ml (1, 6-3, 3 mM). Queste concentrazioni sono vicine alle concentrazioni più basse che hanno indotto una significativa tossicità neuronale nei nostri esperimenti.

Le nostre osservazioni attuali sono anche coerenti con i nostri precedenti studi in vitro che mostrano che la depressione dell'attività spontanea dei neuroni dell'ippocampo in vitro produce perdita di cellule apoptotiche. 28, 29 Anche se il modello di coltura è stato utile e generalmente si correla bene con i risultati in vivo , c'è almeno una differenza con gli studi neonatali in vivo che merita di essere menzionato. La perdita cellulare in vitro dipendente dall'attività ha un decorso caratteristicamente più lento di quanto osservato in vivo . La perdita in vitro dura> 3 giorni, mentre i marker di apoptosi in vivo sono osservati entro poche ore dal trattamento. 34, 35 Tuttavia, il modello in vitro è stato utile per identificare e studiare i dettagli meccanicistici dell'apoptosi indotta da agenti che sopprimono l'eccitabilità neuronale in vivo . 28, 29

Il magnesio endogeno mantiene la funzione cellulare, l'integrità e la produzione di energia, e Mg ++ extracellulare modula una varietà di diversi canali ionici e recettori, inclusi recettori NMDA, 10 canali Ca ++, 36 recettori GABA A 17 e canali dipendenti da tensione. 11, 12, 32 È stato dimostrato che la manipolazione di ciascuno di questi tipi di canali influenza la sopravvivenza cellulare durante la sinaptogenesi dello sviluppo, quando molti neuroni subiscono la morte cellulare fisiologica. 31, 34 Il tema comune con agenti neuroattivi apoptotici, incluso Mg ++, è che l'attività neuronale è fortemente soppressa. In soggetti sensibili, la soppressione dell'attività dei neuroni attiva un "trigger" apoptotico. Questo trigger comune potrebbe essere ridotto di Ca ++ intracellulare, 30 ma il setpoint del trigger può essere influenzato da fattori ambientali. 29

Nonostante la varietà di bersagli sensibili al Mg ++ che potrebbero essere rilevanti per gli effetti sulla sopravvivenza, i nostri risultati suggeriscono che un'alterazione del potenziale d'azione alterata e il gating dei canali del sodio sono probabilmente la chiave per spiegare gli effetti della sopravvivenza. I nostri confronti con il selettore selettivo del canale del sodio TTX sono la base per questa conclusione. Abbiamo precedentemente dimostrato che il silenziamento TTX dei neuroni è sufficiente per causare apoptosi in un arco di tempo simile a quello osservato qui con Mg ++ . Poiché Mg ++ aumenta la soglia del potenziale d'azione a valori simili a quelli raggiunti dal TTX ed entrambi hanno effetti simili sull'eccitabilità della rete nelle registrazioni MEA, è ragionevole concludere che gli effetti sulla soglia del canale Na + e sulla soglia del potenziale d'azione spiegano principalmente Mg ++ effetti sull'eccitabilità e sulla sopravvivenza, con poca necessità di invocare spiegazioni meccanicistiche che coinvolgono altri canali (ad es. recettori NMDA o canali Ca 2+ ). Se le celle raggiungono raramente la soglia del potenziale di azione a causa dell'alterazione del gate dei canali con gate di tensione, i canali Ca ++ con gate di tensione non si apriranno. Allo stesso modo, l'effetto diretto di Mg ++ sui recettori NMDA sarà in gran parte irrilevante in assenza di potenziali di azione per guidare il rilascio di glutammato. Tuttavia, i contributi di questi altri meccanismi inibitori non possono essere completamente esclusi.

Gli effetti sulla soglia del potenziale d'azione e sull'eccitabilità della rete derivano quasi certamente da effetti descritti in modo classico di cationi bivalenti su canali dipendenti da tensione. Gli effetti di screening della carica superficiale di Mg ++ e di altri cationi bivalenti sono stati descritti in numerose impostazioni. 11, 12, 13, 14, 32 Questo effetto deriva probabilmente dal legame dei cationi bivalenti extracellulari a cariche negative fisse sulla membrana cellulare. 32 Ciò riduce efficacemente il potenziale di superficie e produce un'influenza iperpolarizzante locale sui domini dei canali sensibili alla tensione. Questo effetto di schermatura della carica viene rilevato come uno spostamento depolarizzante nell'attivazione e inattivazione del canale dipendente dalla tensione. Il lavoro classico ha descritto l'influenza di una moltitudine di cationi bivalenti sull'eccitabilità nei nodi di Ranvier delle fibre nervose mielinizzate delle rane; un aumento di 10 volte della concentrazione di ioni sposta la soglia di accensione fino a +25 mV a seconda dello ione. 12 In particolare, un aumento di Mg ++ da 1 a 10 mM sposta l'attivazione del canale Na + di circa +15 mV, in coincidenza con lo spostamento di circa +13 mV nella soglia del potenziale d'azione osservata nei nostri esperimenti.

Abbiamo anche identificato un potenziale effetto eccitatorio di Mg ++ sul riposo V m . Un aumento della concentrazione di Mg ++ da 1 a 10 mM ha depolarizzato la V a riposo di 5, 2 mV. A nostra conoscenza, questo effetto di Mg ++ non è stato precedentemente segnalato. I meccanismi candidati basati sul potenziale di inversione della corrente sensibile al Mg ++ includono il blocco di vari canali di "dispersione" come i canali K + raddrizzanti verso l'interno e i canali K + del dominio a 2 pori, come Kir2.1 e TREK-1 K + canali, rispettivamente. 18, 19 Sebbene la depolarizzazione indotta da Mg ++ possa, a valore nominale, aumentare l'eccitabilità cellulare, gli effetti di screening della carica superficiale sopra descritti impedirebbero significativi effetti funzionali della depolarizzazione sull'eccitabilità. La depolarizzazione a riposo era più piccola (+5, 2 mV) rispetto allo spostamento previsto in gating e inattivazione dello stato stazionario (+13 mV) dagli effetti della carica superficiale (vedi sopra). L'influenza di Mg ++ sul riposo V m merita un'ulteriore esplorazione e potrebbe fornire ulteriore comprensione del contributo dei canali di "perdita" al riposo cellulare V m .

L'uso di Mg ++ in ostetricia clinica e neonatologia come anticonvulsivante, tocolitico e neuroprotettore è molto diffuso, ma studi a sostegno della sua efficacia clinica sono controversi e nessuno studio ha esaminato o stabilito la sicurezza dei suoi effetti sul cervello normale in via di sviluppo. Presi insieme al nostro recente studio in vivo , 25 i nostri risultati suggeriscono che lo sviluppo di neuroni e reti neuronali richiede un livello adeguato di input attivo per un corretto sviluppo e sopravvivenza. Le concentrazioni di Mg ++ clinicamente rilevanti uccidono i neuroni in questa fase smorzando l'eccitabilità e aumentando l'apoptosi. Abbiamo osservato la morte cellulare apoptotica indotta da Mg ++ nei nostri precedenti studi in vivo , e questo è stato supportato dai presenti esperimenti in vitro . I nostri esperimenti aiutano a collegare Mg ++ ad altri agenti neuro depressivi che promuovono l'apoptosi nei giovani neuroni. Sono necessari ulteriori studi per valutare l'effetto a lungo termine dell'esposizione prenatale al Mg ++ sul corretto sviluppo neurocognitivo e intellettuale.

Riferimenti

  1. 1.

    Martin Jr JN, Thigpen BD, Moore RC, Rose CH, Cushman J, May W. Ictus e preeclampsia grave ed eclampsia: un cambio di paradigma incentrato sulla pressione arteriosa sistolica. Obstet Gynecol 2005; 105 : 246–254.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  2. 2.

    Crowther CA, Hiller JE, Doyle LW. Solfato di magnesio per prevenire la nascita pretermine in travaglio pretermine minacciato. Cochrane Database Syst Rev 2002 art. n .: CD001060.

      • Google Scholar
  3. 3.

    Lyell DJ, Pullen K, Campbell L, Ching S, Druzin ML, Chitkara U et al . Solfato di magnesio rispetto alla nifedipina per tocolisi acuta del travaglio pretermine: uno studio controllato randomizzato. Obstet Gynecol 2007; 110 : 61–67.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  4. 4.

    Mittendorf R, Pryde PG. Una revisione del ruolo del solfato di magnesio nel travaglio pretermine. BJOG 2005; 112 (Suppl 1): 84–88.

      • Google Scholar
  5. 5.

    Grimes DA, Nanda K. Tocolisi di magnesio solfato: tempo di smettere. Obstet Gynecol 2006; 108 : 986–989.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  6. 6.

    Ichiba H, Yokoi T, Tamai H, Ueda T, Kim TJ, Yamano T. Esito dello sviluppo neurologico di neonati con asfissia alla nascita trattati con solfato di magnesio. Pediatr Int 2006; 48 : 70–75.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  7. 7.

    Perlman JM. Strategie di intervento per danno cerebrale ipossico-ischemico neonatale. Clin Ther 2006; 28 : 1353–1365.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  8. 8.

    Doyle LW, Crowther CA, Middleton P, Marret S. Solfato di magnesio prenatale ed esito neurologico nei neonati pretermine: una revisione sistematica. Obstet Gynecol 2009; 113 : 1327–1333.

      • PubMed
      • Google Scholar
  9. 9.

    Pryde PG, Mittendorf R. Uso contemporaneo del solfato di magnesio ostetrico: indicazione, controindicazione e rilevanza della dose. Obstet Gynecol 2009; 114 : 669–673.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  10. 10.

    Mayer ML, Westbrook GL. Permeazione e blocco dei canali del recettore dell'acido N-metil-D-aspartico da cationi bivalenti nei neuroni centrali in coltura di topo. J Physiol 1987; 394 : 501–527.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Scholar
  11. 11.

    Frankenhaeuser B, Meves H. L'effetto del magnesio e del calcio sulla fibra nervosa mielinizzata della rana. J Physiol 1958; 142 : 360–365.

      • Google Scholar
  12. 12.

    Hille B, Woodhull AM, Shapiro BI. Carica superficiale negativa vicino ai canali del sodio dei nervi: ioni bivalenti, ioni monovalenti e pH. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1975; 270 : 301–318.

      • Google Scholar
  13. 13.

    Hahin R, Campbell DT. Semplici cambiamenti nella dipendenza dalla tensione del gate del canale del sodio causati da cationi bivalenti. J Gen Physiol 1983; 82 : 785–805.

      • Google Scholar
  14. 14.

    Frankenhaeuser B, Hodgkin AL. L'azione del calcio sulle proprietà elettriche degli assoni di calamaro. J Physiol 1957; 137 : 218–244.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  15. 15.

    Dodge Jr FA, Rahamimoff R. Azione cooperativa a ioni di calcio nel rilascio del trasmettitore alla giunzione neuromuscolare. J Physiol 1967; 193 : 419–432.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Scholar
  16. 16.

    Fomin VP, Gibbs SG, Vanam R, Morimiya A, Hurd WW. Effetto del solfato di magnesio sulla forza contrattile e sulla concentrazione intracellulare di calcio nel miometrio umano in gravidanza. Am J Obstet Gynecol 2006; 194 : 1384–1390.

      • Google Scholar
  17. 17.

    Moykkynen T, Uusi-Oukari M, Heikkila J, Lovinger DM, Luddens H, Korpi ER . Magnesium potentiation of the function of native and recombinant GABA A receptors. Neuroreport 2001; 12 : 2175–2179.

      • Google Scholar
  18. 18.

    Maingret F, Honore E, Lazdunski M, Patel AJ . Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K + channel. Biochem Biophys Res Commun 2002; 292 : 339–346.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  19. 19.

    Murata Y, Fujiwara Y, Kubo Y . Identification of a site involved in the block by extracellular Mg 2+ and Ba 2+ as well as permeation of K + in the Kir2.1 K + channel. J Physiol 2002; 544 (Pt 3): 665–677.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  20. 20.

    Slutsky I, Abumaria N, Wu LJ, Huang C, Zhang L, Li B et al . Enhancement of learning and memory by elevating brain magnesium. Neuron 2010; 65 : 165–177.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  21. 21.

    Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, Bittigau P, Vockler J, Dikranian K et al . Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science 1999; 283 : 70–74.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  22. 22.

    Jevtovic-Todorovic V, Hartman RE, Izumi Y, Benshoff ND, Dikranian K, Zorumski CF et al . Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. J Neurosci 2003; 23 : 876–882.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Scholar
  23. 23.

    Turner CP, Miller R, Smith C, Brown L, Blackstone K, Dunham SR et al . Widespread neonatal brain damage following calcium channel blockade. Dev Neurosci 2007; 29 : 213–231.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  24. 24.

    Dobbing J, Sands J . Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev 1979; 3 : 79–83.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  25. 25.

    Dribben WH, Creeley CE, Wang HH, Smith DJ, Farber NB, Olney JW . High dose magnesium sulfate exposure induces apoptotic cell death in the developing neonatal mouse brain. Neonatology 2009; 96 : 23–32.

      • Google Scholar
  26. 26.

    Mittendorf R, Covert R, Elin R, Pryde PG, Khoshnood B, Lee K . Umbilical cord serum ionized magnesium level and total pediatric mortality. Obstet Gynecol 2001; 98 : 75–78.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  27. 27.

    Young C, Tenkova T, Dikranian K, Olney JW . Excitotoxic versus apoptotic mechanisms of neuronal cell death in perinatal hypoxia/ischemia. Curr Mol Med 2004; 4 : 77–85.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  28. 28.

    Moulder KL, Fu T, Melbostad H, Cormier RJ, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Ethanol-induced death of postnatal hippocampal neurons. Neurobiol Dis 2002; 10 : 396–409.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  29. 29.

    Shute AA, Cormier RJ, Moulder KL, Benz A, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Astrocytes exert a pro-apoptotic effect on neurons in postnatal hippocampal cultures. Neuroscience 2005; 131 : 349–358.

      • Google Scholar
  30. 30.

    Franklin JL, Johnson Jr EM . Suppression of programmed neuronal death by sustained elevation of cytoplasmic calcium. Trends Neurosci 1992; 15 : 501–508.

      • Google Scholar
  31. 31.

    Heck N, Golbs A, Riedemann T, Sun JJ, Lessmann V, Luhmann HJ . Activity-dependent regulation of neuronal apoptosis in neonatal mouse cerebral cortex. Cereb Cortex 2008; 18 : 1335–1349.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  32. 32.

    Hille B . Ion Channels of Excitable Membranes . 3rd edn Sinauer: Sunderland, MA, 2001. xviii, 814 p.pp.

      • Google Scholar
  33. 33.

    Meeks JP, Mennerick S . Action potential initiation and propagation in CA3 pyramidal axons. J Neurophysiol 2007; 97 : 3460–3472.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  34. 34.

    Olney JW, Wozniak DF, Jevtovic-Todorovic V, Farber NB, Bittigau P, Ikonomidou C . Drug-induced apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Brain Pathol 2002; 12 : 488–498.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  35. 35.

    Xu W, Cormier R, Fu T, Covey DF, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Slow death of postnatal hippocampal neurons by GABA A receptor overactivation. J Neurosci 2000; 20 : 3147–3156.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Scholar
  36. 36.

    Hagiwara S, Takahashi K . Surface density of calcium ions and calcium spikes in the barnacle muscle fiber membrane. J Gen Physiol 1967; 50 : 583–601.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  37. 37.

    Mennerick S, Que J, Benz A, Zorumski CF . Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J Neurophysiol 1995; 73 : 320–332.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Scholar
  38. 38.

    Zorumski CF, Thio LL, Clark GD, Clifford DB . Blockade of desensitization augments quisqualate excitotoxicity in hippocampal neurons. Neuron 1990; 5 : 61–66.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  39. 39.

    Potter SM, DeMarse TB . A new approach to neural cell culture for long-term studies. J Neurosci Methods 2001; 110 : 17–24.

      • CAS
      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar
  40. 40.

    Wagenaar DA, Pine J, Potter SM . An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neurosci 2006; 7 : 11.

      • PubMed
      • Articolo
      • Google Scholar

Scarica riferimenti

Ringraziamenti

We thank A Taylor and A Benz for technical help and laboratory members for advice and discussion. This work was supported by US National Institutes of Health grants 5K08NS048113–04 (WHD), NS44041 (LNE), NS54174 and MH78823 (SM), a grant from the Epilepsy Foundation of America (LNE), and an NIH Neuroscience Blueprint Core Grant P30NS057105 to Washington University.

Glossario

AMPA

α -amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate

GABA

γ -aminobutyric acid

ANOVA

analysis of variance

ASDR

array-wide spike detection rate

V m

membrane potential

MEA

multielectrode array

NMDA

N -methyl- D -aspartate

∣ TTX

tetrodotoxin

Author Contributions: WHD, LNE and SM all participated in the conception and design of the experiments, in collection, analysis and interpretation of data and in writing and revising the paper.