Micrornas nella rete hox: un collegamento apparente alla prevalenza posteriore | la natura rivede la genetica

Micrornas nella rete hox: un collegamento apparente alla prevalenza posteriore | la natura rivede la genetica

Anonim

Astratto

I fattori di trascrizione Homeobox (Hox) conferiscono coordinate assiali anteriore-posteriore (AP) agli embrioni vertebrati. I geni hox si trovano in cluster che contengono anche geni per microRNA (miRNA). La nostra analisi dei target previsti di miRNA indica che i miRNA incorporati nel cluster Hox colpiscono preferibilmente gli mRNA Hox. Inoltre, i presunti geni bersaglio di Hox sono situati prevalentemente sul lato 3 'di ciascun locus HoR di miRNA. Questi risultati suggeriscono che i miRNA di Hox aiutano a reprimere più programmi anteriori, rafforzando così la prevalenza posteriore, che è il dominio gerarchico della funzione del gene Hox posteriore rispetto a quella anteriore che si osserva nei bilateriani. In questo modo, la regolazione mediata dal miRNA sembra ricapitolare le interazioni ad altri livelli di espressione genica, alcuni più ancestrali, all'interno di una rete sotto selezione stabilizzante.

Punti chiave

  • All'interno dei cluster di geni Hox vi sono loci che codificano i microRNA (miRNA). Questi includono: miR-10, presente in tutta la Bilateria; miR-196, trovato nei vertebrati; e miR-iab4, presente negli insetti.

  • I miRNA Hox colpiscono preferibilmente l'mRNA dei fattori di trascrizione Hox, con una forte propensione a colpire quelli provenienti da loci situati sul lato 3 'di ciascun locus HoR miRNA.

  • Queste preferenze di targeting suggeriscono che i miRNA di Hox aiutano a reprimere più programmi anteriori, rafforzando così la prevalenza posteriore, che è il controllo gerarchico della funzione del gene Hox posteriore rispetto a quella anteriore.

Principale

Come determinanti dell'identità anatomica regionale in tutta la Bilateria, i cluster di geni homeobox (Hox) sono soggetti a forti vincoli evolutivi, con piccoli cambiamenti che danno origine a profonde alterazioni dei piani corporei 1, 2 . La conservazione a causa della selezione purificatrice è esemplificata dal motivo dell'homebox dei fattori di trascrizione di Hox, in cui il 99, 7% delle mutazioni non sinonime viene eliminato, in contrasto con una stima di rimozione media dell'85% tra un insieme casuale di coppie di geni umani e di topo 3 . Rispetto ai geni Hox bilaterali ancestrali, l'insieme dei vertebrati è anche notevolmente limitato rispetto all'organizzazione dei cluster, all'ordine dei geni, all'orientamento e alla compattezza 1 . D'altra parte, si verificano grandi deviazioni da cluster simili a vertebrati altamente ordinati nei genomi delle lame con piani corporei molto divergenti - come nel caso degli echinodermi, in cui il cluster è confuso 4, o negli urochordati, in cui si è disintegrato e i geni centrali sono stati persi 5, 6 . La variazione naturale degli elementi regolatori Hox è stata utilizzata per spiegare le differenze morfologiche tra i segmenti corporei delle specie correlate all'interno degli artropodi. Tra i vertebrati, questo tipo di variazione (come il guadagno di un potenziatore globale per guidare l'espressione lungo un asse secondario) avrebbe potuto consentire lo sviluppo di novità strutturali, incluso l'arto tetrapode 7, 8 .

Un codice iterativo lungo l'asse AP

I quattro gruppi di mammiferi Hox si mappano su cromosomi distinti, hanno dimensioni comprese tra 100 e 200 kb e contengono ciascuno da 9 a 11 geni codificanti per proteine ​​dispersi tra 13 gruppi paralogici, tutti trascritti da un filamento di DNA. Nella nomenclatura del gene Hox, la numerazione del paralogo scende nella direzione della trascrizione, con i paraloghi di Hox1 mappati sul bordo 3 'di ciascun cluster (Fig. 1a). I paraloghi di Hox sono stati derivati ​​dalla duplicazione in tandem di un modello iniziale più strettamente correlato alle sequenze di codifica a 3 'fine. Si ritiene che un insieme accoppiato di geni protoHox1 / 2 e protoHox3 presenti in un primo metazoan si sia duplicato per generare i predecessori Hox e paraHox, ciascuno dei quali successivamente ha subito ulteriori repliche 9 . L'ammasso di cordati ancestrali presumibilmente assomigliava di più al singolare ∼ 450 kb di ammasso di urocordato marino vivente libero 10 meno il suo gene più posteriore Hox14 , che probabilmente sarà il prodotto di un evento di duplicazione specifico della discendenza urochordata 11 . Da questo prototipo ancestrale, numerosi vertebrati sono nati nei vertebrati attraverso una serie di duplicazioni su larga scala che coinvolgono il genoma circostante.

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a | I mouse Hox si raggruppano. Le linee blu e verde indicano la repressione da parte dei microRNA (miRNA) miR-10 e miR-196, rispettivamente. Tutti gli obiettivi sono conservati nell'uomo, tranne Hoxd1 e Hoxa4 (linea tratteggiata). b | Un modello per il ruolo dei miRNA Hox nella modulazione del codice Hox. I miRNA Hox sono collocati all'interno di uno schema di sviluppo embrionale lungo un asse anteriore-posteriore segmentato. Il segmento più anteriore mostra lo stato di sviluppo predefinito che è specificato in assenza dell'espressione Hox. Questo stato viene modificato verso più destini posteriori dai miRNA che smorzano l'attività dei geni Hox che si trovano 3 ′ del locus miRNA. Il secondo segmento più anteriore è il limite anteriore di espressione per i geni Hox che si trovano 3 ′ del locus miRNA, che specificano i destini anteriori e più anteriori. I miRNA Hox smorzano l'espressione posteriore dei loro bersagli Hox da 3 '. Nei domini più posteriori, agiscono in parallelo con i geni Hox 5 ′ per rafforzare la gerarchia della funzione Hox 5 ′. All'interno dei domini più posteriori dell'espressione del miRNA di Hox, i miRNA forniscono una repressione a prova di errore della trascrizione aberrante o di basso livello e sperimentalmente non rilevabile. In alternativa, potrebbero indugiare come specie stabili a seguito dell'autorizzazione di bersagli Hox da 3 '. Gli obiettivi sono generalmente espressi prima dei miRNA e quindi anche la modulazione dei domini di espressione mediata dal miRNA ha una dimensione temporale (non mostrata).

Immagine a dimensione intera

I geni hox sono espressi in domini sfalsati e sovrapposti in tutti gli strati germinali embrionali lungo l'asse anteriore-posteriore (AP), chiamato anche asse rostrocaudale, con confini anteriori netti e diffusi 2 . Il limite anteriore di espressione è il sito con i più alti livelli di trascrizione e in cui i fenotipi di perdita di funzione sono più evidenti, quindi è definito come dominio funzionale 2, 12 . L'ordine dei geni all'interno di un cluster è correlato con le coordinate dei domini funzionali lungo l'asse AP e con l'inizio relativo dell'espressione genica durante la gastrulazione dei vertebrati. Queste proprietà conservate, per cui i geni all'estremità 3 'del cluster Hox sono espressi prima e più anteriormente e più geni 5' sono espressi più tardi e più avanti verso la coda, sono denominate colinearità spaziale e temporale 2, 13, 14 . L'espressione nidificata dei geni Hox porta a un codice modulare che specifica le coordinate spaziali lungo l'asse AP e determina le identità anatomiche regionali 15, 16 .

Una serie elaborata di meccanismi regolatori trascrizionali globali e locali sembra essere responsabile della colinearità spaziale e temporale dell'espressione di Hox 17, 18 . Anche la regolazione post-trascrizionale è osservata alle 19, 20, ma ha ricevuto meno attenzione sperimentale. Ciò include la regolazione da parte di microRNA (miRNA), che sono RNA non codificanti ∼ 22-nucleotide (nt) che guidano la repressione post-trascrizionale dei geni codificanti proteine ​​accoppiandosi ai messaggi di questi geni, generalmente entro i loro 3′UTR 21 . La cosa più importante per il riconoscimento del bersaglio è l'associazione alla regione 5 'del miRNA, in particolare ai nucleotidi di miRNA 2–7, che è noto come seme. Gli obiettivi conservati di un miRNA possono essere previsti su uno sfondo di previsioni falso positive cercando corrispondenze 7-nt conservate con la regione seme 22, 23, 24, 25 . Questo approccio indica che oltre un terzo dei geni codificanti per le proteine ​​dei mammiferi sono stati sottoposti a pressioni selettive per mantenere l'associazione con i miRNA 23 . Questi messaggi mirati vengono repressi tramite repressione traslazionale, destabilizzazione dell'mRNA o entrambi. Qui consideriamo la repressione nota e prevista degli mRNA Hox da parte dei miRNA e in che modo questa repressione mediata dai miRNA si riferisce alla regolazione e alla funzione complessive dei cluster Hox durante lo sviluppo e l'evoluzione embrionale.

Collegamento genomico dei miRNA di Hox e dei loro bersagli

Almeno 30 dei 39 Hox 3′UTR dei mammiferi hanno una o più partite conservate ai miRNA dei vertebrati, molti dei quali sono stati supportati sperimentalmente. Questi includono Hoxa7 , Hoxb8 , Hoxc8 e Hoxd8 , che hanno un supporto sperimentale come obiettivi conservati di miR-196 (Rif 26, 27). Nel pollo, Hoxb8 ha un sito di abbinamento dei semi ma, nella maggior parte dei vertebrati, Hoxb8 è atipico come bersaglio per i miRNA in quanto privo di perfetto abbinamento dei semi e invece ha un'ampia complementarità con miR-196, rendendolo un substrato per miRNA diretto scissione. L'espressione di mir-196 è più bassa nella parte anteriore rispetto a quella posteriore, dove il miRNA agisce come un inibitore di Hoxb8 e ne impedisce l'induzione da parte dell'acido retinoico ectopico 28 . Hoxc8 , Hoxd8 e Hoxa7 hanno abbinamenti di semi canonici, il tipo di siti che mediano la repressione traslazionale e la destabilizzazione dell'mRNA senza scissione diretta dai miRNA. I frammenti 3′UTR contenenti questi siti mediano la repressione dei reporter nelle cellule di carcinoma cervicale umano (HeLa) in coltura 26 . Esperimenti simili supportano il targeting di mRNA Hoxd10 da parte di miR-10 in cellule di carcinoma mammario umano non metastatico (SUM149) in coltura 29 . La modifica dei livelli di miR-10 negli embrioni di zebrafish porta alla misexpression di Hoxb1a e Hoxb3a , entrambi i quali presentano corrispondenze di semi entro i 3′UTR 30 . Inoltre, il blocco funzionale di miR-10 e miR-196 negli embrioni di pulcino porta a estesi difetti scheletrici, tra cui trasformazioni omeotiche, coerenti con la regolazione dei geni Hox da parte di questi due miRNA (E. McGlinn, SY, DPB e CJT, osservazioni non pubblicate). Allo stesso modo, gli esperimenti sulle mosche supportano la repressione prevista dei geni Drosophila Hox da parte dei miRNA di miR-10 e miR-iab 31, 32, 33, 34, 48, incluso uno studio sulla perdita di funzione che indica che i miRNA dei miR-target agiscono sull'Ultrabithorax ( Ubx ) per la repressione in più segmenti posteriori 31 .

Targeting preferenziale degli mRNA di Hox . Sia miR-10 che miR-196, i due miRNA vertebrati implicati sperimentalmente nel prendere di mira gli mRNA di Hox, sono espressi da famiglie di geni che sono essi stessi codificati da sequenze all'interno dei cluster Hox 26, 47 (Fig. 1a), portando alla questione se questi due miRNA Hox potrebbero preferibilmente colpire gli mRNA Hox. L'esame di siti miRNA conservati che corrispondevano alle 73 famiglie miRNA di vertebrati altamente conservati 23, 35 ha rivelato che il 15% dei siti che rientravano negli Hox 3′UTR corrispondeva ai due miRNA Hox. Inoltre, i due miRNA Hox sono stati classificati al primo e terzo posto tra le famiglie di 73 miRNA quando è stata considerata la frazione di siti conservati che rientravano negli Hox 3′UTR (Tabella 1). Pertanto, sebbene i miRNA codificati in cluster Hox abbiano molti bersagli conservati diversi dai geni Hox, e sebbene gli mRNA Hox contengano siti target ad altri miRNA, i due miRNA Hox sembrano regolare preferibilmente i geni Hox.

Tabella a grandezza naturale

Questo targeting preferenziale è tanto più sorprendente perché le previsioni sul target dei miRNA sono lungi dall'essere perfette e indubbiamente producono molti falsi positivi e falsi negativi. La nostra analisi, che si concentrava principalmente su siti con corrispondenza dei semi di 7–8 mer che rientravano in 3′UTRs, avrebbe perso siti con accoppiamento non canonico o siti situati altrove nel messaggio. L'efficacia e la conservazione preferenziale sono state segnalate per i siti che rientrano negli ORF, ma l'efficacia è circa un decimo di quella osservata in 3′UTR e la conservazione dovuta alla codifica porta a una specificità di previsione ridotta, giustificando l'esclusione di questi siti dalla considerazione 23, 35 . I siti senza un perfetto accoppiamento alla regione del seme possono ancora funzionare se hanno un ampio accoppiamento alla regione 3 'del miRNA, che può compensare una mancata corrispondenza o rigonfiamento nell'accoppiamento del seme. In effetti, il sito miR-196 in Hoxb8 3′UTR è un esempio ben noto di tale sito 3-compensativo, e simili siti miR-196 in Hoxc8 e Hoxd8 sono stati proposti 26 . Tuttavia, gli esperimenti che esaminano gli effetti dell'interruzione del sito sulla repressione mediata dal miRNA devono ancora scoprire eventuali ulteriori siti 3-compensativi negli mRNA dei vertebrati, anche se tali esperimenti hanno supportato la funzione di innumerevoli siti corrispondenti ai semi. Un'analisi sistematica della conservazione dei siti indica che è probabile che nei vertebrati funzionino altri siti compensativi di 3′, ma che sono rari e costituiscono meno del due percento di tutti i siti mantenuti selettivamente per i miRNA dei vertebrati (R. Friedman, KK Farh, CB Burge e DPB, osservazioni non pubblicate). Dei 30 siti di compensazione 3′ più probabili, classificati in base alla qualità dell'associazione 3 'e all'entità della conservazione, gli unici due che rientrano in Hox 3′UTR sono i siti miR-196 in Hoxb8 (classificato 1) e Hoxc8 (classificato in i primi 20). Questi risultati sono coerenti con gli esperimenti che dimostrano che i siti previsti dagli algoritmi che consentono disallineamenti dei semi hanno scarsa efficacia 35 . Sulla base di queste considerazioni, la nostra analisi ha incluso i tre siti di compensazione 3′ miR-196 26 ma non ha preso in considerazione altri siti non corrispondenti ai semi. L'associazione alla regione 3 ′ del miRNA può anche integrare i siti corrispondenti al seme per aumentare l'efficacia del sito ma, poiché l'associazione consequenziale 3′ supplementare sembra essere rara e impartisce solo un modesto aumento dell'efficacia del sito 35, non è stato considerato.

Conservazione dei siti target . Sebbene la conservazione fornisca informazioni utili sulla rilevanza funzionale di un sito regolatorio, non tutti gli mRNA sensibili ai miRNA hanno conservato i siti. Infatti, i siti non conservati spesso mediano la repressione dipendente dal miRNA nei saggi reporter e la maggior parte dei messaggi repressi quando viene introdotto un miRNA, così come la maggior parte di quelli che vengono derepressi quando un miRNA viene inibito o eliminato, hanno siti che lo fanno non soddisfa i criteri di conservazione generalmente utilizzati per la previsione target 35, 36, 37, 38, 39 . Se la repressione mediata da questi miRNA fosse insignificante, non ci si aspetterebbe che i siti fossero sotto selezione purificatrice, e questo potrebbe essere il caso di alcune interazioni di targeting non conservate. In alcuni casi, tuttavia, i siti potrebbero fornire funzioni specifiche del lignaggio recentemente evolute ma importanti, oppure potrebbero essere una forma di regolamentazione ancestrale che è sotto la purificazione della selezione ma che tuttavia è persa (o che non è in grado di essere allineata) in una delle le specie di riferimento. Per trovare potenziali bersagli non conservati degli mRNA Hox da parte dei miRNA Hox, abbiamo esaminato in modo indipendente gli Hox 3′UTR di cinque genomi vertebrati rappresentativi - umani, topo, pulcino, pesce zebra e pesce palla - per siti canonici corrispondenti a semi di semi 7–8-mer ( vedere la casella 1 per i metodi utilizzati). Più di un terzo dei 3′UTR aveva almeno uno e fino a sei siti canonici per miR-196 o miR-10 (Fig. 1a; Tabella 2). Sebbene la conservazione, l'allineamento o la sintesi locale di 3′UTR non fossero necessari per la loro identificazione, tutti tranne tre dei siti erano presenti sia nel genoma umano che in quello del topo. In questi tre casi la storia del sito è stata valutata esaminando più allineamenti del genoma dei mammiferi. Hoxa4 e Hoxb13 sembrano aver ottenuto match di semi 7-mer unici con miR-196 nei lignaggi dei roditori e dei primati, rispettivamente. Hoxd1 ha mantenuto un sito a 8 mer che corrisponde alla regione del seme di miR-10 nel topo, ma lo ha perso nel ratto e nel lignaggio dei primati. L'opossum, che è basale per i mammiferi eutheriani, non ha il sito, ma altri sei mammiferi che sono basali sia per i primati che per i roditori hanno un sito a 7 mer che corrisponde alla regione dei semi di miR-10. In un numero di casi, tra cui Hoxa4 murino e Hoxa7 , che mostrano prove di poliadenilazione alternativa, i siti di miRNA sono presenti nell'isoforma più lunga e potrebbero contribuire alla regolazione specifica dell'isoforma. Concludiamo che la maggior parte del targeting da parte dei miRNA Hox esisteva prima dell'emergenza dei mammiferi ed è stata sottoposta a un'elevata pressione selettiva per essere mantenuta.

Utilizzando le informazioni sul targeting dei miRNA di Lewis et al . 23, abbiamo previsto obiettivi di miR-10 e miR-196 nei cluster umani, topo, pulcino, zebrafish e Takifugu Hox senza imporre requisiti di conservazione. Un target conteneva almeno una corrispondenza canonica 7–8-mer a miR-196 (partita a 8 mer, ACTACCTA; partite a 7 mer, ACTACCT e CTACCTA) o a miR-10 (partita a 8 mer, ACAGGGA; 7-mer partite, ACAGGG e CAGGGA) nel suo 3′UTR. Sono stati inclusi anche i siti di compensazione 3′ miR-196 identificati negli UTR Hoxb8 , Hoxc8 e Hoxd8 26 . Nei mammiferi, i 3′UTR sono stati definiti dalla più lunga annotazione RefSeq, ad eccezione del 3′UTR di Hoxb1 , che è stato esteso oltre l'annotazione esistente a causa della presenza di EST sovrapposte e conservazione sopra la sequenza intergenica circostante. Nel pollo, gli UTR erano definiti usando l'ortologia per i mammiferi, così come le sequenze EST, e nei teleostei gli UTR erano definiti come la sequenza da 2 kb 3 ′ al codone di stop.

Tabella a grandezza naturale

Espressione e funzione in tutta la Bilateria . Quando si valuta il significato funzionale del targeting preferenziale degli mRNA Hox da parte dei miRNA Hox, è utile considerare l'espressione e l'evoluzione di questi miRNA. I geni mir-10 e mir-196 sono trascritti con lo stesso orientamento dei geni codificanti le proteine ​​in ciascun cluster e sono espressi in schemi che approssimano l'espressione caratteristica dei geni Hox, compresi i limiti anteriori di espressione correlati con le loro posizioni genomiche all'interno il cluster 26, 27, 30, 40, 41 . Entrambe le famiglie di miRNA hanno la massima espressione nel tubo neurale e livelli di espressione più bassi nel mesoderma del tronco, con limiti anteriori mal definiti e ampia espressione posteriore attraverso la coda. Negli embrioni di topo, la risoluzione dell'espressione di miRNA è troppo bassa per determinare i limiti esatti. Tuttavia, i domini di espressione osservati dei miRNA sono in accordo con i modelli previsti sulla base della loro posizione all'interno dei cluster Hox. Ad esempio, il limite anteriore previsto dell'espressione mir-196 sarebbe leggermente posteriore a quello di Hoxb9 (Rif. 27), che è adiacente a mir-196 all'interno del cluster Hox. L' espressione di Hoxb9 ha un limite anteriore nel mesoderma parassiale fino alla prevertebra 3 nei topi embrionali del giorno 9.5 (E9.5), che viene spostato caudalmente nella prevertebra toracica 8 da E12.5 (Rif. 15). Il limite anteriore di miR-10 è caudale o equivalente a quello delle trascrizioni del gene adiacente Hoxb4 (Rif. 27), che ha un limite di espressione nel mesoderma parassiale nella prevertebra 2 nei topi E10.5 20 .

Espresso dai loci tra i paraloghi di Hox4 e Hox5 (Fig. 1a) o all'interno dell'introne di Hoxd4 (ad esempio, il mouse miR-10b), miR-10 è tra l'insieme di miRNA bilateriali di base con ortologi negli insetti 42, nematodi 43 e planaria 44 . Gli studi sull'RNA-blot suggeriscono l'eventuale presenza di un omologa nell'anemone di mare di startlet, Nematostella vectensis , suggerendo che la sequenza di miR-10 potrebbe aver preceduto la divisione cnidaria-bilateriana 44, 45 . L'ortologo nei nematodi, miR-57, condivide la regione del seme del miR-10 cordato, e quindi ci si aspetta che riconosca essenzialmente gli stessi siti. Tuttavia, mir-57 non si trova tra i geni Hox, né ha un abbinamento canonico di semi agli mRNA di Caenorhabditis elegans Hox. Il gene Drosophila mir-10 è insolito perché produce miRNA maturi, apparentemente funzionali da entrambi i bracci della forcina del precursore, che espande il potenziale di targeting da questo locus 33, 46 . Inoltre, l'omologo fly mir-10 viene spostato di un nucleotide alla sua estremità di 5 ', che dovrebbe avere un profondo effetto sul riconoscimento del bersaglio in quanto cambia uno dei due siti a 7 mer riconosciuti da questo miRNA 46 . Tuttavia, il gene fly mir-10 assomiglia alla sua controparte vertebrale in due aspetti: si trova in un locus ortologo all'interno del complesso antennapedia 47 della mosca, ed entrambi i miRNA di miR-10 delle mosche hanno il potenziale conservato per colpire gli mRNA Hox 33, 46 .

L'altro gene HoR miRNA, mir-196 , che si trova tra i paraloghi Hox9 e Hox10 in tutti tranne il cluster HoxD (Fig. 1a), sembra essere emerso più recentemente. L'assenza di mir-196 da cordati non vertebrati e la sua presenza nel lampreda senza mascella e in più cluster di vertebrati indicano un'origine nell'antenato comune dei vertebrati, precedente all'evento iniziale di duplicazione del cluster. Sebbene gli omologhi mir-196 sembrino assenti al di fuori dei vertebrati, un analogo funzionale, mir-iab-4 , risiede nella posizione ortologica nel complesso di Bithorax della mosca 26, 32 . Tramite la trascrizione di uno dei due filamenti di DNA, il locus fly produce due miRNA alternativi: miR-iab-4s e miR-iab-4as (Ref. 33). Nessuno di questi miRNA volanti ha un'omologia rilevabile per miR-196, ma entrambi sembrano colpire gli mRNA Hox nelle vicinanze 26, 31, 32, 33, 34, 48 .

Distribuzione asimmetrica dei loci mRNA target

Nel nostro sondaggio sui siti conservati e non conservati nei cinque genomi rappresentativi dei vertebrati, abbiamo scoperto che i geni target previsti erano distribuiti in modo non uniforme in tutti i cluster. Ai fini di questa analisi, i loci miRNA sono stati trattati come confini genomici e i geni Hox sono stati divisi in due gruppi, a seconda di quale parte di questo confine sono caduti (Fig. 1a). Pertanto, per il locus mir-196 , i paraloghi di Hox1–9 sono stati indicati in modo intercambiabile come 3 ′ o anteriore e i paraloghi di Hox10–13 come 5 ′ o posteriori. Indipendentemente dalla conservazione dei singoli siti, una significativa maggioranza dei target 3′UTR apparteneva a geni in gruppi paraloghi situati 3 ′ ai loci mir-196 , quindi con più confini di espressione anteriore. Ad esempio, gli umani possiedono dieci obiettivi da 3 'di miR-196, ma solo un singolo bersaglio era situato nella parte 5'. All'interno del set 3 ', più della metà degli obiettivi previsti erano nelle immediate vicinanze del locus miRNA, cioè all'interno dei paraloghi centrali di Hox5-9 . Inoltre, la frazione di geni Hox 3 ′ previsti come target di miR-196 era superiore ai geni Hox 5 ′, con una media vertebrata del 38% di geni 3 ′ e 4% di geni 5 ′ (Tabella 2). Allo stesso modo, nelle fruitflower i miRNA del locus iab-4 hanno il potenziale di colpire 3′UTRs del downstream e più geni anteriori addominali A ( abd-A ), Ultrabithorax ( Ubx ), Antennapedia ( Antp ) e Sex pettini ridotti ( Scr ) 32, 48, sebbene nelle mosche il numero di geni Hox sia troppo basso per testare la significatività statistica. Queste tendenze nei vertebrati e nelle mosche implicano una logica ricorrente del gene Hox che prende di mira miR-iab-4 o miR-196, in cui questi miRNA agiscono per reprimere i geni che sono espressi in domini più anteriori.

Nei vertebrati è stata trovata anche una significativa distribuzione non casuale di geni target previsti per la più antica famiglia di miRNA Hox, miR-10, per la quale i paraloghi Hox1–4 erano definiti come 3 ′ o anteriori al locus mir-10 , e Hox5–13 paraloghi come 5 ′ o posteriori al locus mir-10 . La posizione genomica di mir-10 nei cluster (tra Hox4 e Hox5 ) ha dettato che c'erano meno geni Hox 3 ′ disponibili per il targeting. Nell'anfioxus, sono stati trovati abbinamenti di semi con miR-10 in Hox1 , Hox2 e Hox5 3′UTRs. Nei vertebrati, sebbene miR-10 sembri colpire un minor numero di geni Hox rispetto a miR-196, la disposizione genomica dei loci target ha mostrato la stessa inclinazione unilaterale. Come con miR-196, una frazione più elevata di geni 3 ′ rispetto ai geni 5 ′ era prevista come target di miR-10 (una media vertebrata del 37% di geni 3 ′ e 8% di geni 5 ′; Tabella 2). Questa tendenza non è stata osservata, tuttavia, nelle mosche, in cui miR-10 sembra colpire anche 5 'e più geni posteriori come Addominale B ( Abd-B ) e Scr 46 . Ciò suggerisce che il targeting alterato ed espanso nelle mosche, dovuto alla fine spostata del miRNA e all'arruolamento del miRNA dall'altro braccio della forcella, ha portato a una divergenza nel targeting per miR-10 che è in netto contrasto con il modello di targeting osservato per vertebrato miR-10, vertebrato miR-196 e fly miR-iab-4.

Prevalenza posteriore

All'interno di domini di coespressione, i geni Hox più vertebrati posteriori rendono i geni Hox anteriori irrilevanti nelle regioni in cui i loro schemi di espressione si sovrappongono, un fenomeno noto come prevalenza posteriore 12, 16, 49 . In altre parole, i geni posteriori e 5 'sono epistatici ai geni anteriori e 3' 50 . Il fenomeno è stato descritto per la prima volta come soppressione fenotipica sulla base di osservazioni morfologiche effettuate in larve di mosca con mutazioni nei locus extra di favi ( esc ) 12, 50 . Tali mutazioni inattivano i repressori delle proteine ​​del gruppo Polycomb e causano una generale derepressione dell'espressione di Hox 12, 50 . Il modello segmentale risultante nei mutanti esc riflette l'attività del gene Hox ad azione posteriore, Abd-B , in modo tale che i segmenti della testa, del torace e dell'addome si trasformano in un fenocopia di A8, il segmento addominale più posteriore. Le larve esc mutanti che mancano anche di Abd-B si sviluppano con la ripetizione di segmenti A4, tipicamente specificati da abd-A , il secondo gene più posteriore. Larve esc mutanti con la cancellazione di tutti i geni Hox addominali - Ubx , abd-A e Abd-B - si sviluppano con reiterazioni dei segmenti toracici normalmente specificati da Scr e Antp . Quando Scr e Antp vengono eliminati in aggiunta ai tre geni addominali, le larve di esc hanno segmenti cefalici in tutto. Pertanto è stata definita una gerarchia della funzione del gene omeotico 50 . Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che la regolazione incrociata trascrizionale non è la principale forza motrice della soppressione fenotipica. L'espressione ubiquitaria derivata sperimentalmente di geni Hox sotto promotori che sono noti per essere trascrizionalmente irreprimibili porta a trasformazioni solo in regioni anteriori al dominio funzionale del gene. Ad esempio, l' Antp toracica, quando espressa in modo ubiquitario, sopprime i geni Hox della testa, causando una trasformazione posteriore dei segmenti della testa verso un'identità toracica senza influire sull'addome - qui, l'effetto di Antp è fenotipicamente soppresso da geni complessi di Bithorax come come Ubx 12, 51 .

Analoghe osservazioni sono state fatte negli embrioni di vertebrati transgenici per un certo numero di geni Hox. Ad esempio, l'introduzione di un transgene Hoxd4 sotto controllo trascrizionale del promotore Hoxa1 porta a uno spostamento rostrale nel limite anteriore dell'espressione 52 di Hoxd4 ( Hoxd4 non è un bersaglio previsto di miR-10 o miR-196). Gli embrioni transgenici mostrano trasformazioni posteriori delle ossa occipitali alla base del cranio verso strutture che mostrano le caratteristiche della colonna vertebrale segmentata, in particolare delle prime due vertebre cervicali. Tuttavia, i fenotipi sono limitati al dominio anteriore dell'espressione ectopica, anche se i livelli sono sovraespressi o espressi ectopicamente altrove nell'embrione 52 . Il modello di prevalenza posteriore spiega le tendenze generali dei fenotipi omeotici, con perdita di funzione che spesso porta alla trasformazione anteriore ai confini dell'espressione rostrale; in assenza di un gene Hox, ora è consentito il funzionamento di più geni ad azione anteriore che sono tipicamente soppressi. Il modello spiega anche i cambiamenti osservati in seguito al guadagno di funzione o espressione ectopica di un gene Hox, che generalmente provoca trasformazioni posteriori nelle regioni anteriori al dominio endogeno, dove l'espressione ectopica può sopprimere l'effetto dei geni Hox residenti.

Queste tendenze generalmente sono vere nelle mosche, ma non sempre nei vertebrati, in cui si verificano deviazioni dalla regola, così come difetti diversi dalle trasformazioni omeotiche (per un esempio vedi Rif. 53). I geni Fly Hox sembrano essere sotto il controllo di elementi regolatori più indipendenti e hanno domini di espressione distinti, mentre i geni Hox vertebrati hanno una regolazione più coordinata, ridondanza tra i paraloghi e maggiore sovrapposizione di espressioni. In generale, i sistemi vertebrati sembrano essere più sensibili alle differenze quantitative nell'espressione del gene Hox; in questi sistemi i rapporti dei geni Hox che costituiscono il codice Hox determinano le specifiche del destino. Tuttavia, come regola generale i geni Hox localizzati in 5′ modificano più programmi anteriori.

L'ipotetica condizione ancestrale . La gerarchia funzionale intesa come prevalenza posteriore sembra essere una proprietà mantenuta del cluster Hox ancestrale, osservata anche in assenza di colinearità spaziali e temporali assolute, o di segmentazione, come nel cluster cluster 54 di nematodi altamente derivato. Nella sua essenza, i regolatori master Hox hanno un'abilità gerarchica crescente, che è in linea con l'ordine genetico, di modificare i programmi specificati gli uni dagli altri. Questa gerarchia avrebbe potuto essere inerente ai primi eventi di neofunzionalizzazione che seguivano le duplicazioni iniziali del gene tandem, che precedevano la divisione cnidari-bilateriana e la formazione di un ammasso più ampio. Un ipotetico embrione eubilateriano potrebbe aver espresso almeno una coppia di geni Hox collegati per polarizzare il suo asse longitudinale 55 e governare gli eventi di differenziazione durante lo sviluppo reiterando i programmi genetici. Tale espressione porterebbe alla specifica dei destini cellulari anteriori prima di quelli posteriori. Questo tratto è persistito tra gli insetti basali 56 e i cordati, in cui le cellule all'interno dei segmenti sono specificate in sequenza, con progressione da anteriore a posteriore. Il rombomere posteriore dell'encefalo più anteriore nell'embrione di pesce zebra è specificato prima, un processo che non coinvolge l'espressione di Hox e si differenzia per essere lo stato predefinito che i rombomeri posteriori ritornano a seguito dell'eliminazione della funzione cofattore Hox 57 . Durante l'ontogenesi, un tale stato di default potrebbe essere modificato nei moduli di sviluppo che si formano successivamente o più posteriormente a causa dell'attività gerarchica molecolare, creando così una gamma di possibili risultati morfologici. La capacità di scavalcare ed elaborare un programma preesistente come meccanismo per evolvere una nuova unità di sviluppo potrebbe essere stata una forza trainante per aumentare il numero di copie dei geni Hox con attività gerarchica mantenuta. Pertanto, la prevalenza posteriore potrebbe essere invocata come proprietà fondamentale dei geni Hox ancestrali che aiuta a spiegare la loro propagazione riuscita nei genomi animali.

Rinforzo derivato di gerarchie stabilite

I meccanismi molecolari che stabiliscono l'attività gerarchica, sebbene mal spiegati, sono attribuiti principalmente alle proprietà dei fattori di trascrizione Hox 12 e dei loro obiettivi a valle. In almeno alcuni casi, le proteine ​​Hox ad azione posteriore sono più efficienti di quelle anteriori nell'esercizio della funzione a valle, ad esempio mediante competizione per siti di legame promotori condivisi o cofattori 58 . Inoltre, i geni Hox posteriori potrebbero esercitare il dominio dirigendo l'espressione di diversi geni target in modo che una rete Hox posteriore sia dominante nella funzione rispetto a una anteriore. All'interno di un dominio funzionale, il dominio di un gene è facilitato da livelli più elevati di trascrizione assoluta. Infine, ci sono prove della gerarchia mediante regolazione incrociata trascrizionale, con geni posteriori che dirigono la repressione di quelli anteriori 12 .

La tendenza conservata nella distribuzione genomica dei geni target dei miRNA all'interno dei cluster Hox, se considerata insieme ai modelli di espressione trascrizionale dovuti alla colinearità spaziale e temporale, indica che i miRNA Hox smorzano la produzione di proteine ​​in regioni più posteriori dell'espressione genica Hox dei vertebrati domini. Inoltre, i miRNA di Hox funzionano come regolatori post-trascrizionali negativi ritardati dei loro bersagli Hox da 3 '. Pertanto, come suggerito di recente per singoli esempi 30, 48, i miRNA di Hox sembrano avere una propensione generale sorprendente a promuovere la prevalenza posteriore (Fig. 1b). La regolazione dei geni Hox da parte di miR-196 è un'innovazione dei vertebrati e quindi un'aggiunta normativa che è apparsa dopo l'emergere della gerarchia funzionale. Nei vertebrati entrambi i miRNA Hox sembrano contribuire e rafforzare la gerarchia funzionale tra i geni Hox, supportando così l'ipotesi che una moltitudine di approcci molecolari siano continuamente selezionati per mantenere questo tratto ancestrale.

La conservazione di mir-10 e mir-196 all'interno dei cluster Hox potrebbe essere spiegata dalla loro vicinanza ad altri geni codificanti e ai loro elementi regolatori, portando a un modello di espressione coordinata dei miRNA e dei loro obiettivi. I cluster Hox potrebbero possedere proprietà che consentono a un meccanismo attivo di evitare riarrangiamenti o inserzioni ed eliminazioni genomiche, mantenendo così la sintesi e la compattezza complessiva. Inoltre, la presenza di miRNA a intervalli regolari all'interno dei cluster e tra i loro target si traduce in un ambiente DNA locale condiviso. Questo ambiente può produrre reazioni coordinate con uguale risposta a perturbazioni non specifiche che incidono sulla trascrizione globale, preservando così rapporti di trascrizione costanti. Questa risposta condivisa tra i miRNA e i loro obiettivi potrebbe essere tra le forze trainanti per trattenere i miRNA all'interno dei cluster. Il paesaggio genomico conservato con la sua distribuzione non casuale di corrispondenze di semi in sequenze trascritte potrebbe essere indicativo di un gradiente di vincoli su sequenze 3′UTR, con tassi di mutazione più rapidi di geni 5 ′ che coincidono con la cooptazione in nuove espressioni in cellule derivate. Quindi, l'esaurimento relativo delle corrispondenze dei semi tra le trascrizioni 5 ', e la conseguente libertà dai vincoli della repressione del miRNA di Hox, avrebbe potuto predisporre questo gruppo all'acquisizione di funzioni secondarie, coerentemente con il ruolo dell'espressione di Hoxd9–13 nello stabilimento del prossimale –Asse distale dell'arto tetrapode.

Non tutti i geni Hox più anteriori hanno siti corrispondenti ai miRNA Hox (Fig. 1a; Tabella 2), il che implica inoltre che altri meccanismi regolatori, forse più ancestrali, predominano nello stabilire e mantenere la prevalenza posteriore. Inoltre, i siti corrispondenti ai miRNA Hox, sebbene più abbondanti rispetto alla maggior parte degli altri miRNA specifici, costituiscono solo il 15% dei siti 7–8-mer conservati negli Hox 3′UTRs. Questo rapporto suggerisce che, considerando la regolazione del gene Hox da parte di tutti i miRNA, il rafforzamento della prevalenza posteriore è meno diffuso rispetto al ruolo più ampio e generico dei miRNA, che è quello di regolare la produzione di proteine ​​per molti altri scopi, scolpendo così i modelli di espressione con la complessità e la precisione sarebbe difficile da creare usando la sola regolamentazione trascrizionale 59 . In effetti, i miRNA Hox probabilmente partecipano a queste altre funzioni oltre al loro ruolo nella prevalenza posteriore, poiché sembrano avere molti obiettivi non Hox.

conclusioni

L'acquisizione ancestrale della gerarchia tra i geni Hox ha permesso di specificare le identità cellulari lungo un asse AP regionalizzato mediante la reiterazione di un programma genetico con modifiche unidirezionali, ed è stata rafforzata nel tempo da più strati di interazioni a molti livelli di espressione genica. Il contributo della repressione mediata dal miRNA al modello di prevalenza posteriore aggiunge uno strato di interazioni regolatorie a livello post-trascrizionale, che comporta la coscrizione di pochi nucleotidi in una regione resistente alle mutazioni. La stratificazione additiva della regolamentazione complementare potrebbe consentire un risultato più stabile limitando la dipendenza da una qualsiasi modalità normativa. Inoltre, l'arruolamento della regolazione genica mediata dal miRNA consente risultati regolatori più complessi, con il conseguente potenziale di diversificazione dei piani del corpo animale. Man mano che vengono generati più animali con mutazioni nei miRNA di Hox e nei loro siti regolatori, verranno dimostrate le conseguenze funzionali di questi nodi nella rete normativa di Hox.

Glossario

Bilateria

Membri del clade animale che hanno simmetria bilaterale - la proprietà di avere due lati simili, con superfici superiori e inferiori definite, e estremità anteriore e posteriore. I bilateriani includono cordati, artropodi, nematodi, anellidi e molluschi, tra gli altri gruppi.

Mutazione non sinonimo

Un cambiamento nella sequenza nucleotidica che altera l'amminoacido codificato.

paralogous

L'omologia tra due segmenti genomici nello stesso organismo sorti da un evento di duplicazione.

Neofunctionalization

Il processo mediante il quale una coppia di geni duplicati viene permanentemente preservata quando una copia acquisisce mutazioni, conferendo una nuova funzione.

rhombomere

Ognuno dei sette segmenti neuroepiteliali trovati nell'encefalo embrionale che adottano distinte proprietà molecolari e cellulari, restrizioni nella miscelazione cellulare e domini ordinati di espressione genica.

Link correlati

ULTERIORI INFORMAZIONI

  • Il laboratorio Bartel
  • Il laboratorio Tabin
  • Previsioni target microRNA
  • RefSeq