Controllo multigenico della resistenza alla tubercolosi: analisi di un qtl sul cromosoma di topo 7 e suo sinergismo con sst1 | geni e immunità

Controllo multigenico della resistenza alla tubercolosi: analisi di un qtl sul cromosoma di topo 7 e suo sinergismo con sst1 | geni e immunità

Anonim

Astratto

La tubercolosi rimane un grave problema di salute globale: un terzo della popolazione umana è infettata da Mycobacterium tuberculosis (MTB) e il 10% di quelli è a rischio di sviluppare la tubercolosi. Nella maggior parte degli individui infetti, i determinanti genetici della suscettibilità rimangono in gran parte sconosciuti a causa del complesso controllo multigenico e dell'influenza dei geni - interazioni ambientali. La variazione genetica della resistenza dell'ospite all'MTB nei modelli animali riflette l'eterogeneità tra gli esseri umani. La dissezione graduale di queste interazioni consentirà di decifrare la complessa strategia di virulenza di MTB. In precedenza, abbiamo caratterizzato un locus di supersuscepibility del mouse ( sst1 ) che controlla l'immunità antitubercolosi. In questo studio, sono stati mappati otto loci di tratto quantitativo di resistenza ospite (QTL) che controbilanciano l'effetto devastante di sst1, tra i quali un QTL sul cromosoma 7 (Chr7) era più prominente. I loci Chr7 e sst1 controllano indipendentemente meccanismi distinti di resistenza all'MTB, ma i loro effetti apparentemente convergono sui macrofagi in notevole sinergia. La combinazione di questi alleli di resistenza su uno sfondo sensibile a C3HeB / FeJ ha ridotto la patologia polmonare e migliorato la sopravvivenza dopo la sfida MTB, rappresentando la metà della differenza tra i ceppi parentali sensibili e resistenti. Questi dati rivelano nuove interazioni geniche che controllano la resistenza MTB e consentiranno di identificare i geni di resistenza codificati nel locus Chr7.

introduzione

La tubercolosi (TB) rimane una significativa minaccia per la salute globale; si stima che circa un terzo della popolazione mondiale sia infetto da virulenta tubercolosi del Mycobacterium con quasi 8 milioni di nuovi casi e quasi 2 milioni di decessi ogni anno. 1 È accertato che esiste un'eterogeneità genetica nella resistenza della popolazione ospite all'infezione da micobatteri, che va dall'estrema suscettibilità ai micobatteri avirulenti al controllo efficace della MTB completamente virulenta. Questa eterogeneità è vera per le popolazioni umane, in cui il <10% degli individui immunocompetenti sviluppa una malattia clinica dopo l'infezione con MTB completamente virulenta. 2, 3, 4, 5 La variazione genetica dell'ospite è vera anche per i modelli sperimentali di infezione da topo, cavia e coniglio, 6, 7, 8, 9 e senza considerare il contributo della genetica dell'ospite, lo sviluppo di interventi farmacologici e vaccinali più efficienti sarà impegnativo.

Nella maggior parte dei pazienti immunocompetenti, la tubercolosi viene controllata sistematicamente, ma il polmone viene distrutto portando alla propagazione e alla trasmissione a nuovi ospiti attraverso la via dell'aerosol. 3, 10 Varianti genetiche dell'ospite che predispongono gli ospiti immunocompetenti alla tubercolosi indebolendo le loro difese abbastanza da consentire la distruzione polmonare e la trasmissione dei patogeni rimane da chiarire. La patogenesi della TB, una sequenza di eventi estremamente complessa, è multistadio con molti tipi di cellule che partecipano durante l'infezione cronica. Ci si aspetterebbe una gerarchia di fattori genetici che controllano una rete di processi biologici. Districare il complesso controllo genetico della suscettibilità alla tubercolosi nell'uomo è intrinsecamente difficile. Pertanto, i modelli animali vengono utilizzati per identificare i geni di suscettibilità in condizioni sperimentali controllate in cui è possibile standardizzare la via dell'infezione, la dose, lo sforzo e la virulenza della M. tubercolosi , nonché i fattori ambientali, come la dieta e lo stress (rivisto in Fortin et al 11 e Nord e Jung 12 ). La variazione naturale della resistenza genetica dell'ospite all'MTB può essere affrontata usando approcci genetici avanzati, cioè dal fenotipo al gene (i). I punti di forza di questo approccio sono la capacità di identificare meccanismi precedentemente sconosciuti dell'immunità anti-TB e rivelare la loro gerarchia, interazioni e contributi individuali alla patogenesi durante le interazioni ospite-patogeno in vivo . I modelli murini di infezione da MTB sono stati utilizzati in tre studi indipendenti per mappare i geni di resistenza / suscettibilità (rivisto in Fortin et al. 11 ). In ogni studio, una diversa combinazione di topi congeniti è stata utilizzata come partner resistente e sensibile per l'analisi del collegamento. 13, 14, 15, 16, 17, 18 Indipendentemente dalle combinazioni dei genitori, tutti i gruppi hanno riportato un controllo multigenico complesso della resistenza dell'ospite alla tubercolosi.

In precedenza, abbiamo studiato le basi genetiche per l'estrema suscettibilità del ceppo di topo congenito da C3HeB / FeJ a MTB. 19 Questi topi congeniti si distinguono dalla maggior parte degli altri ceppi, perché formano grandi lesioni necrotiche nei polmoni dopo l'infezione da MTB 14 e Mycobacterium bovis virulenti (I Kramnik, osservazioni non pubblicate). I topi C3HeB / FeJ colpiscono poiché mancano di gravi anomalie immunologiche nei meccanismi essenziali noti dell'immunità anti-TB poiché le loro (1) cellule dendritiche producono interleuchina 12 (E Eruslanov, osservazioni non pubblicate), (2) le cellule T CD4 + T specifiche per i micobatteri si differenziano lungo il percorso Th1 e (3) i macrofagi sono in grado di rispondere all'interferone - γ. 20 Tuttavia, i topi C3HeB / FeJ mostrano un tempo di sopravvivenza paragonabile ai topi omozigoti per knockouts nelle catene α e β del recettore delle cellule T, catena interleuchina 12 β e più brevi di quelli dell'inducibile ossido nitrico sintasi (iNOS), CD4 e MHC classe II knockouts (Kramnik, in corso di stampa). Abbiamo usato la genetica diretta per rivelare i difetti alla base della resistenza dell'ospite alla tubercolosi. Il locus sst1 (super suscettibilità alla TB 1) sul cromosoma 1 è stato mappato 19 e un gene candidato, Ipr1 (resistenza patogena intracellulare 1) è stato identificato mediante clonazione posizionale. 21 Due ceppi congenici sst1 , C3H.B6- sst1 e un ceppo congenico reciproco B6.C3H- sst1 (Tabella 1) sono stati generati per testare l'effetto isolato di sst1 su sfondi genetici C3HeB / FeJ e C57BL / 6J. La sopravvivenza di entrambi i ceppi congenici di sst1 è caduta a intermittenza tra i ceppi parentali indicando che i loci non sst1 hanno avuto un effetto sulla sopravvivenza dell'ospite. Quattro di questi loci sui cromosomi 7, 12, 15 e 17 sono stati mappati usando un incrocio tra ceppi C3H.B6- sst1 e C57BL / 6J resistenti allo sst1 R ( sst1 R ). 18 Penetrazione dell'allele incompleta sst1 -settibile ( sst1 S ) nella croce originale e maggiore resistenza dei topi B6.C3H- sst1 rispetto a C3HeB / FeJ (entrambi sst1 S ) hanno indicato che i meccanismi di resistenza dell'ospite, indipendentemente dal locus sst1 e in grado di esisteva una compensazione per il deficit di sst1 .

Tabella a grandezza naturale

Nel caso di tratti quantitativi multigenici, l'identificazione di geni polimorfici causali codificati all'interno di ciascun locus rappresenta una sfida significativa. Dei 2000 loci di tratto quantitativo (QTL) mappati nel 2005, i polimorfismi genetici sottostanti sono stati identificati per <1%. 22 I fattori che impediscono il progresso dal QTL all'identificazione del gene causale includono ampi intervalli candidati, effetti deboli di singoli loci sul fenotipo generale, sottofenotipi sconosciuti (cioè effetti funzionali specifici) di ciascun locus, una possibilità di interazioni epistatiche tra i singoli loci e il potenziale complessità di ciascuna regione candidata che può codificare diversi geni funzionalmente correlati. 11, 23, 24, 25 Pertanto, i tentativi di isolare e dissezionare i singoli loci dopo la mappatura QTL iniziale spesso non hanno successo.

In questo studio, abbiamo eseguito la caratterizzazione genetica e funzionale del secondo locus di resistenza alla TB più potente nel nostro modello: un locus tratto quantitativo sul cromosoma di topo 7 (Chr7) e caratterizzato le sue interazioni epistatiche con lo sst1 . I nostri dati dimostrano l'importanza del Chr7 QTL nel controllo della resistenza dell'ospite all'MTB negli ospiti immunocompetenti e forniscono una base per la successiva identificazione di nuovi geni di resistenza alla TB all'interno del locus Chr7 usando la clonazione posizionale.

risultati

Il locus del cromosoma 7 è coinvolto nel controllo genetico indipendente dalla sst1 della resistenza dell'ospite all'infezione da tubercolosi

Nei nostri studi precedenti, abbiamo osservato un effetto significativo del background genetico sull'espressione fenotipica dell'allele sensibile del locus sst1 ( sst1 S ) confrontando la progressione della tubercolosi in due ceppi innati omozigoti per i topi parentali C3HeB / FeJ e il ceppo di topo congenico sst1 S B6.C3H- sst1 (Tabella 1). I topi congenici B6.C3H- sst1 sono geneticamente identici al ceppo parentale resistente alla TB C57BL / 6J con l'eccezione di un segmento di 12 cM del cromosoma 1 (47–59 cM) che comprende il locus sst1 . Anche se le varietà Sst1 S (B6.C3H- sst1 e C3HeB / FeJ) erano più sensibili all'MTB rispetto alle loro controparti sst1 R (B6 e C3H.B6- sst1 , rispettivamente), la TB ha progredito più rapidamente in C3HeB / FeJ rispetto a B6 .C3H- sst1 topi. Dopo infezione endovenosa con una dose standard di MTB (ceppo Erdman, Trudeau Institute, Saranac Lake, NY, USA; 5 × 10 4 CFU (unità formanti colonie) per topo), i topi B6.C3H- sst1 sono sopravvissuti per 9-12 settimane, mentre C3HeB / FeJ ha ceduto entro 3, 5-5, 5 settimane (Tabella 1). Una sfida di aerosol a basse dosi con MTB ha comportato un tempo di sopravvivenza mediano (MST) nei topi B6.C3H- sst1 e C3HeB / FeJ di 225 giorni e 153 giorni, rispettivamente. 18 Utilizzando una croce di due ceppi Sst1 R C57BL / 6J (B6) e C3H.B6- sst1 , abbiamo precedentemente mappato quattro loci di resistenza TB sui cromosomi di topo 7, 12, 15 e 17. 18 A quel tempo era impossibile determinare se lo stesso o diversi loci hanno contribuito alla resistenza dell'ospite nei topi B6.C3H- sst1 sst1 -sensibili, poiché la popolazione degli ibridi sst1 S F2 (C3HeB / FeJ × B6.C3H- sst1 ) era molto più suscettibile all'infezione da IV una dose standard di MTB, rispetto agli ibridi sst1 R (C3H.B6- sst1 × B6) F2. 18

In questo studio, abbiamo ottimizzato la dose infettiva di MTB per aumentare la variazione fenotipica, usato una strategia di allevamento di backcross per ridurre la variazione genetica e testato popolazioni di topi più grandi per rendere più potenti le analisi statistiche. I maschi ibridi sst1 S (C3HeB / FeJ × B6.C3H- sst1 ) F1 sono stati incrociati su sfondi C3HeB / FeJ o B6.C3H- sst1 . Un totale di 220 progenie di backcross su B6 e 160 progenie su sfondi C3H sono stati analizzati per la sopravvivenza dopo l'infezione con 2 × 10 4 CFU di MTB iv Topi backcrossed che rappresentavano il 20% di estremi resistenti e sensibili in ciascun backcross sono stati selezionati per una scansione dell'intero genoma, che è stato eseguito utilizzando un pannello di 240 marcatori di polimorfismo a singolo nucleotide informativo (SNP) informativo (polimorfico tra i ceppi parentali). In questa analisi, il locus Chr7 ha prodotto i punteggi di linkage più alti in entrambi i backcross su backround genetici B6.C3H- sst1 e C3HeB / FeJ (rispettivamente Z- score 3.12 e 4.29). I topi che trasportavano due copie degli alleli derivati ​​da B6 su Chr7 erano più resistenti degli eterozigoti nel backcross su sfondo B6.C3H- sst1 , mentre i topi eterozigoti erano più resistenti degli omozigoti per gli alleli derivati ​​dal C3H nel backcross sul C3HeB / FeJ sfondo. Pertanto, per il locus di resistenza derivato da B6 su Chr7, i tempi di sopravvivenza sono stati distribuiti come bb> bh> hh indicando che l'allele di resistenza derivato da B6 era dominante con una modalità additiva di ereditarietà.

Successivamente, abbiamo eseguito una genotipizzazione ad alta densità usando marcatori SNP che coprivano l'intero Chr7 a intervalli di 1-2 cM in tutti i topi che sono stati testati in quattro esperimenti indipendenti, tra cui il (C3H.B6- sst1 × C57BL / 6J) F2 e (C3HeB / FeJ × B6.C3H- sst1 ) topi incrociati F2 riportati in precedenza 18 e i topi crosscross sopra descritti. Come mostrato nella Tabella 2, l'effetto del locus Chr7 era prominente nella progenie interstiziale sst1 R C3H- sst1 R B6F2, ma aveva un significato borderline nella progenie sst1 S C3FeB6- sst1 F2 dopo infezione con la stessa dose di MTB. Quando è stata utilizzata una dose infettiva più bassa di MTB per testare la progenie del backcross sst1 S, l'effetto del locus Chr7 era maggiore. Da notare che le regioni candidate QTL su Chr7 identificate in ciascuno dei quattro esperimenti indipendenti erano grandi, coprivano 50-70 Mb e si sovrapponevano solo parzialmente tra 30 e 66 Mb di Chr7.

Tabella a grandezza naturale

Pertanto, la resistenza TB QTL su Chr7 (Chr7 QTL) è stata replicata in un totale di quattro incroci indipendenti (Tabella 2). Tuttavia, ulteriori esperimenti non hanno permesso di delineare più chiaramente la regione candidata, né hanno escluso la presenza di diversi loci di resistenza / suscettibilità su questo cromosoma. Pertanto, per un'ulteriore dissezione funzionale e genetica del Chr7 QTL, abbiamo generato un ceppo consomico Chr7 C3H-Chr7 B6, che trasportava due copie dell'intero Chr7 derivato dal B6 sul background genetico C3HeB / FeJ.

Effetto individuale del locus Chr7 sulla resistenza dell'ospite all'infezione da TB e la sua sinergia con il locus sst1

Un effetto isolato del Chr7 QTL sulla resistenza TB ospite è stato testato confrontando la sopravvivenza dei ceppi di topo consomici C3HeB / FeJ e C3H-Chr7 B6 parentali dopo infezioni da iv e aerosol con MTB. L'allele Chr7 resistente al locus ha prodotto un piccolo aumento della sopravvivenza dopo infezione da IV con una dose standard di MTB: i topi C3HeB / FeJ avevano ceduto all'infezione entro 42 giorni dopo la sfida per via endovenosa, mentre il C3H-Chr7 B6 è morto entro la settimana successiva ( Figura 1a, pannello di sinistra). Dopo un'infezione da aerosol a basso dosaggio, tuttavia, i topi sensibili C3HeB / FeJ del ceppo parentale sono morti molto prima con un MST di 75 giorni, mentre i topi C3H-Chr7 B6 sono sopravvissuti per 120-150 giorni dopo l'infezione (figura 1a, a destra pannello). Pertanto, il locus Chr7 ha influenzato significativamente la progressione della tubercolosi solo durante l'infezione cronica causata da un'infezione da aerosol a basse dosi con MTB.

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Effetto del locus Chr7 sul decorso della tubercolosi nei topi con background genetico C3HeB / FeJ. ( a ) Sopravvivenza del ceppo consomico C3HeB / FeJ e Chr7 parentale (C3H-Chr7 B6 ) a seguito di una sfida iv sistemica con 4 × 10 4 CFU di M. tuberculosis (Erdman; pannello di sinistra). Sopravvivenza dei topi consomici C3HeB / FeJ (C3H) e C3H-Chr7 B6 dei genitori a seguito di una sfida con aerosol con 30–50 CFU di M. tuberculosis Erdman (pannello di destra). In ogni esperimento sono stati utilizzati da sei a otto topi per gruppo. ( b ) Interazioni dei loci Chr7 e sst1 nel corso della tubercolosi a seguito di una sfida endovenosa con M. tuberculosis . Carico MTB (CFU) negli organi di C3H – Chr7 B6 ( sst1 S, S) e C3H.B6- sst1 , Chr7B6 ( sst1 R, R) a 45 giorni dopo la sfida iv con 5 × 10 4 CFU di MTB (quattro topi per gruppo). ( c ) Istopatologia delle lesioni polmonari rappresentative della tubercolosi del C3H-Chr7 B6 (pannelli sinistro e medio) e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 (pannello destro) topi congenici doppi 45 giorni dopo la sfida iv. H&E, ingrandimento originale × 40; colorazione fluorescente insetto acido-resistente di MTB, ingrandimento originale × 400. CFU, unità formante colonie; MTB, Mycobacterium tuberculosis ; Chr7, cromosoma 7; H&E, ematossilina ed eosina.

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Abbiamo ipotizzato che l'effetto individuale dell'allele di resistenza Chr7 sia stato soppresso a causa dell'assenza di altri loci di resistenza derivati ​​da B6 dopo l'infezione con una dose più alta di MTB iv Per testare le interazioni dei loci Chr7 e sst1 , i topi consomici C3H-Chr7 B6 erano incrociato con il ceppo congenico sst1 R C3H.B6- sst1 per produrre ibridi F1 eterozigoti in entrambi i loci. Gli ibridi (C3H.B6- sst1 × C3H-Chr7 B6 ) F1 sono stati sottoposti a backcrossing su ceppo consomico C3H-Chr7 B6 per produrre progenie omozigoti per l'allele resistente a Chr7, ma segregate nel locus sst1 . I topi di backcross sono stati infettati con una dose standard (5 × 10 4 CFU) di MTB iv e uccisi 45 giorni pi per valutare la progressione della TB. I carichi batterici negli organi dei topi raggruppati per il loro allele sst1 sono presentati nella Figura 1b. I topi con l'allele sensibile del locus sst1 (S) hanno sviluppato lesioni polmonari necrotiche nonostante la presenza dell'allele resistente nel locus Chr7 (Figura 1c, pannelli sinistro e medio). La progenie del backcross che trasportava l'allele resistente alla sst1 (R) aveva significativamente meno batteri nei loro organi (Figura 1b) e non sviluppava necrosi polmonare (Figura 1c, pannello di destra). Pertanto, l'allele resistente del locus Chr7 non è riuscito a prevenire lo sviluppo della necrosi polmonare, controllata dal locus sst1 . Tuttavia, l'allele resistente alla Chr7 ha limitato l'estensione della necrosi associata alle lesioni polmonari della tubercolosi nei topi sst1- sensibili: nei topi C3H-Chr7 B6 resistenti alla Chr7, le aree di necrosi sono state trovate al centro dei tubercoli ben organizzati ( Figura 1c, pannello di sinistra) e aree necrotiche avanzate sono state separate dal normale tessuto polmonare da una parete di cellule infiammatorie (Figura 1c, pannello centrale). Ciò è in contrasto con i topi C3HeB / FeJ parentali sensibili a Chr7 (anche sst1 S ), in cui un'infiammazione estesa simile alla polmonite caseosa si è verificata entro 25–35 giorni dall'infezione e ha provocato la morte precoce di questi topi.

Questi dati dimostrano che un effetto individuale dell'allele resistente del Chr7 QTL sulla progressione della TB può essere rilevato nel background genetico sensibile C3HeB / FeJ. Tuttavia, un aumento complessivo della resistenza dell'ospite dovuto a Chr7 QTL non impedisce la formazione di necrosi nelle lesioni polmonari della tubercolosi. Quest'ultimo è specificamente controllato dal locus sst1 . Pertanto, meccanicamente, l'espressione fenotipica di Chr7 QTL è indipendente da sst1 , ma il suo impatto sulla progressione della tubercolosi a livello dell'intero organismo è limitato in presenza dell'allele sst1 .

Il locus Chr7 media il controllo sistemico della tubercolosi nelle fasi successive dell'infezione

Per esaminare l'effetto del locus Chr7 sulla resistenza TB in presenza dell'allele sst1 R , l'allele Chr7 derivato da B6 è stato introdotto sullo sfondo C3H.B6- sst1 . La progenie, omozigote per l'allele sst1 R e segregata nel locus Chr7, è stata prodotta dall'allevamento backcross-intercross e infettata da MTB iv come descritto sopra. Le curve di sopravvivenza dei topi intercross, raggruppate per il loro allele Chr7, sono presentate nella Figura 2a. Il locus Chr7 ha mostrato un forte effetto sulla sopravvivenza in presenza dell'allele sst1 R : l'MST per topi omozigoti per l'allele Chr7 (bb) resistente derivato dalla B6 era di 131 giorni; il MST per gli omozigoti C3H (hh) era di 56 giorni. Gli eterozigoti Chr7 (bh) avevano un MST intermedio, che concorda con gli effetti additivi di questo locus determinati dalle analisi di collegamento (Tabella 2). Successivamente, sono stati condotti studi dettagliati sul locus Chr7 sullo sfondo sst1 R usando un doppio ceppo consomico / congenito C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 che trasportava alleli Chr7 derivati ​​da B6 omozigoti e sst1 sullo sfondo C3HeB / FeJ (Tabella 1).

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L'effetto Chr7 sul decorso della tubercolosi nel background genetico sst1 R a seguito di una sfida IV con M. tuberculosis (Erdman). ( a ) Effetto dose-dipendente dell'allele di resistenza derivato da B6 del locus Chr7 sulla sopravvivenza dei topi sst1 R dopo infezione endovenosa sistemica con 7 × 10 4 CFU di MTB. C3H.B6- sst1 , Chr7 bh e C3H.B6- sst1 , Chr7 bb portano rispettivamente uno o due alleli resistenti derivati ​​da B6 di Chr7. Nell'esperimento sono stati usati da sette a dodici topi per gruppo. ( b ) Istopatologia della lesione polmonare della tubercolosi nei ceppi di topo congenici sst1 R C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 doppio, Chr7 B6 post-infezione a 56 giorni con MTB (H&E, ingrandimento originale × 40). ( c ) Analisi cinetica dei carichi micobatterici in milza, polmoni e fegati dei genitori C57BL / 6 (B6), C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 topi 18, 38 e 56 giorni dopo la sfida iv con 5 × 10 4 CFU di MTB (asse y - CFU per organo). CFU, unità formanti colonie; MTB, Mycobacterium tuberculosis ; Chr7, cromosoma 7; H&E, ematossilina ed eosina.

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La progressione della tubercolosi in due diversi ceppi di Chrst sst1 R - C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 e il ceppo parentale resistente B6 - sono stati confrontati dopo infezione da IV con una dose standard di MTB. La crescita iniziale di MTB fino a 38 giorni pi era simile nei topi C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 (Figura 2c), mentre un forte effetto del locus Chr7 si è verificato a 8 settimane pi: a 1, 5– È stato osservato un aumento di 2 log del carico MTB in tutti gli organi dei topi C3H.B6- sst1 che trasportavano l'allele sensibile al Chr7 (Figura 2c). L'effetto sistemico dell'allele resistente a Chr7 è stato fortemente protettivo: il carico batterico si è stabilizzato nei polmoni e diminuito significativamente nelle milze e nei fegati del topo congenico C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 (Figura 2c). A 8 settimane l'istopatologia ha rivelato una maggiore infiammazione polmonare, una diminuzione degli spazi aerei e il consolidamento delle lesioni polmonari nei topi sensibili al Chr7 C3H.B6- sst1 (Figura 2b, pannello di sinistra). Nel frattempo, i topi C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 resistenti a Chr7 presentavano un'infiammazione polmonare interstiziale localizzata moderata (Figura 2b, pannello di destra), che a quel tempo era simile ai topi B6 resistenti ai genitori (non mostrati).

Per esaminare ulteriormente l'effetto Chr7 in un modello di TB fisiologicamente più rilevante, i topi C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 sono stati infettati con una bassa dose di MTB (30-50 UFC per animale) attraverso l'aerosol. Quattro topi di ogni ceppo sono stati uccisi a 2, 6, 12 e 20 settimane pi per monitorare la progressione della TB (Figura 3a). Cinetica simile della crescita batterica è stata osservata fino alla 12a settimana pi. Tuttavia, vi è stato un aumento di 1, 5–2 log del carico MTB negli organi dei topi C3H.B6- sst1 tra la 12a e la 20a settimana pi, mentre le cariche batteriche sono rimaste stabili nei topi consomici resistenti a Chr7 C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 .

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Effetto del Chr7 sul decorso della tubercolosi in seguito alla sfida dell'aerosol a basso dosaggio con M. tuberculosis (Erdman). ( a ) Carichi batterici negli organi dei topi C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 a 2, 6, 12 e 20 settimane dopo la sfida dell'aerosol con 30-50 CFU di ceppo MTB (Erdman). Quattro topi per ceppo sono stati uccisi in ogni momento. ( b ) Istopatologia della lesione polmonare della tubercolosi dei topi C3H.B6- sst1 e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 20 settimane dopo l'infezione da aerosol a basso dosaggio con MTB. Pannelli superiori - H & E, ingrandimento originale × 200, pannelli inferiori - colorazione auramina-rodamina di micobatteri acidi rapidi, ingrandimento originale × 400. CFU, unità formante colonie; MTB, Mycobacterium tuberculosis ; Chr7, cromosoma 7; H&E, ematossilina ed eosina.

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L'esame istopatologico a 20 settimane pi ha rivelato che i polmoni di topo sensibili a Chr7 contenevano aree più grandi di infiammazione e meno spazio aereo, rispetto a quelli dei topi consomici C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 (Figura 3b, pannelli in alto a sinistra e a destra, rispettivamente ). Nessuna necrosi nelle lesioni polmonari di entrambi i ceppi è stata trovata coerente con il loro genotipo sst1 R. In accordo con le più alte cariche batteriche determinate dalla placcatura di omogenati di organi, la colorazione fluorescente ad acido veloce delle sezioni polmonari ha rivelato un numero maggiore di micobatteri all'interno delle lesioni polmonari dei topi sensibili a Chr7 (Figura 3b, pannelli inferiori). I batteri erano intracellulari in entrambi i ceppi. Tuttavia, i macrofagi nelle lesioni polmonari dei topi consomici C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 contenevano 1-3 batteri per cellula, mentre quelli nei topi C3H.B6- sst1 sensibili a Chr7 sono stati caricati con 10-20 o più MTB per cellula ( Figura 3b, pannelli inferiori destro e sinistro, rispettivamente). Questi dati suggeriscono che il locus Chr7 è coinvolto nel controllo della moltiplicazione intracellulare di MTB in vivo . Resta da stabilire se questo locus genetico influenza direttamente la funzione dei macrofagi o se si tratta di un effetto secondario dovuto all'insufficiente attivazione dei macrofagi da parte di stimoli esogeni prodotti nelle lesioni della TB da altri tipi di cellule.

Riassumendo, il locus Chr7 media il controllo della moltiplicazione intracellulare dell'MTB nei macrofagi all'interno dei granulomi di tubercolosi in vivo e il suo effetto viene mostrato sistematicamente in una fase successiva della malattia. L'espressione fenotipica del locus Chr7 è significativamente più pronunciata in presenza dell'allele sst1 R , che previene la necrosi nelle lesioni polmonari della tubercolosi, la moltiplicazione extracellulare dell'agente patogeno e la letalità precoce.

Mappatura fine del locus Chr7 utilizzando ceppi subcongenici resistenti allo sst1

Poiché la differenza nella suscettibilità alla TB tra i topi che trasportavano gli alleli resistenti al Chr7 o sensibili era massima in presenza dell'allele sst1 R , per la mappatura fine del locus Chr7, abbiamo prodotto una serie di ceppi subcongenici che portavano Chr7 ricombinante sul C3H .B6- sst1 background genetico. Essendo derivato dallo stesso maschio nonno C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 dopo un secondo backcross su femmina C3H.B6- sst1 , ogni ceppo subcongenico era di origine genetica C3HeB / FeJ, omozigote per l'allele sst1 derivato da B6 e trasportato un Chr7 ricombinante omozigote con un singolo evento di ricombinazione, in modo tale che un segmento derivato da B6 in ciascun ceppo subcongenico si sovrapponga parzialmente alla regione QTL candidata, come mostrato nella Figura 4a.

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Mappatura del locus Chr7 utilizzando ceppi di topo subcongenici specifici dell'intervallo Chr7. ( a ) Diagramma schematico dei ceppi di topo subcongenici specifici dell'intervallo Chr7. Le scatole in bianco e nero rappresentano rispettivamente gli alleli omozigoti C57BL / 6J e C3HeB / FeJ. I ceppi di topo subcongenici Chr7 (A – D) sono sst1 R. L'allele Chr7 è determinato in base alla sopravvivenza (B e C) e ai carichi batterici d'organo (D) dopo infezione da IV con MTB. ( b ) Sopravvivenza di quattro ceppi di topo subcongenici del cromosoma 7 (A – D) e dei topi parentali C3H.B6-sst1 e C3H.B6-sst1, Chr7 B6 dopo infezione endovenosa con una dose standard di MTB (Erdman). ( c ) Confronti a coppie delle curve di sopravvivenza di ciascun ceppo subcongenico con i ceppi parentali per determinare l'allele del locus Chr7. ( d ) carichi batterici negli organi dei ceppi subcongenici e genitoriali di topo Chr7 10 settimane dopo l'infezione con 5 × 10 4 CFU di MTB iv CFU, unità formante colonie; MTB, Mycobacterium tuberculosis ; Chr7, cromosoma 7.

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I ceppi subcongenici A, B, C e D, e i corrispondenti ceppi parentali sono stati testati per la sopravvivenza dopo una sfida endovenosa con una dose standard di MTB. L'MST del ceppo subcongenico A (101 giorni) era significativamente più breve rispetto ai ceppi subcongenici B, C e D (MST = 147, 151 e 142.5, rispettivamente, Figura 4b). I confronti a coppie delle curve di sopravvivenza Kaplan-Mayer usando il test log-rank hanno dimostrato che la sopravvivenza del ceppo subcongenico A era statisticamente indistinguibile da quella del ceppo parentale sensibile al Chr7 C3H.B6- sst1 e significativamente più corta di quella del ceppo consomico resistente C3H .B6- sst1 , Chr7 B6 (Figura 4c). Le curve di sopravvivenza dei ceppi subcongenici B, C e D erano significativamente diverse da quelle del C3H.B6- sst1 e del ceppo subcongenico A, e questi ceppi subcongenici erano resistenti quanto il ceppo parentale consomico C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 . Questi dati indicano che i ceppi subcongenici B, C e D trasportano il resistente e il ceppo A, gli alleli sensibili del Chr7 QTL, e quindi l'intervallo critico Chr7 è delimitato dai marcatori di microsatellite D7Mit230 e D7Mit350 (Figura 4a).

Poiché, oltre al suo effetto sulla sopravvivenza del topo, il Chr7 QTL ha avuto un chiaro effetto sistemico sui carichi batterici nelle fasi avanzate della progressione della malattia, in un secondo esperimento abbiamo usato sia la sopravvivenza che i carichi batterici di milza, fegato e polmone a 10 settimane dall'infezione IV per differenziare gli alleli sensibili a Chr7 e sensibili. Come mostrato nella Figura 4d, il carico batterico nei polmoni, nella milza e nel fegato dei ceppi A e C3H.B6- s1 erano simili e significativamente più alti ( P <0, 05) rispetto ai ceppi B, C e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 . In questo esperimento, il MST dei ceppi sensibili A e C3H.B6- sst1 era rispettivamente pari a 103 e 104 giorni, mentre il MST dei ceppi B, C e C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 era pari a 150, 163 e 143 giorni, rispettivamente. Pertanto, secondo entrambi i criteri, i ceppi subcongenici Chr7 potrebbero essere divisi in due gruppi: resistente (ceppi B e C) e sensibile (ceppo A) indicando che lo stesso intervallo Chr7 delimitato dai marcatori di microsatellite D7Mit230 e D7Mit350 controlla sia la sopravvivenza del topo che l'MTB carico d'organo. Poiché non c'erano differenze statisticamente significative tra i ceppi subcongenici resistenti B, C e il ceppo parentale resistente C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 ( P > 0, 3), secondo entrambi i criteri, abbiamo concluso che l'intero effetto del Chr7 QTL su La resistenza alla TB era dovuta a questo intervallo di 8, 7 cM ed escludeva con sicurezza i geni irf3 e irf7 dal locus Chr7.

Discussione

La patologia polmonare insolitamente grave unita alla letalità precoce che si sviluppa dopo l'infezione con MTB virulenta è la caratteristica dei topi congeniti C3HeB / FeJ. Poiché questi topi non riescono a controllare la progressione della tubercolosi nei polmoni, nonostante un sistema immunitario funzionale, 20 una situazione tipica anche nell'uomo, una migliore comprensione della patogenesi MTB polmonare può emergere identificando difetti genetici causali in questi topi. Utilizzando una croce di questi topi con un ceppo di topo di razza B6 relativamente resistente alla TB, abbiamo determinato che il controllo genetico della resistenza alla TB nel nostro modello è multigenico e mappato diversi loci di resistenza alla TB sui cromosomi di topo 1 (sst1), 7, 12, 15 e 17.

Nel nostro precedente studio di mappatura, l'effetto del locus Chr7 era il più forte in un incrocio di due ceppi innati che portavano l'allele resistente alla sst1 - B6 e la C3H.B6- sst1 congenita sst1 . Tuttavia, in un incrocio di due ceppi di topo suscettibili con sst1 , C3HeB / FeJ e il ceppo di topo congenico sst1 B6.C3H- sst1 derivato da B6 , l'effetto Chr7 è sceso al di sotto della soglia statistica. Ciò ha sollevato la possibilità che l'espressione fenotipica del Chr7 QTL e di altri loci non- sst1 precedentemente identificati dipendessero dalla presenza dell'allele resistente allo sst1 . Diverse osservazioni, tuttavia, hanno suggerito l'esistenza di fattori genetici indipendenti dalla sst1 in grado di contrastare l'effetto devastante dell'allele sst1 S sulla progressione della tubercolosi. Abbiamo ripetuto il nostro tentativo di mappare nuovi loci di resistenza alla tubercolosi in un incrocio di due ceppi parentali sensibili alla sst1 usando la dose infettiva ottimizzata e la strategia di allevamento del backcross. Sorprendentemente, i punteggi più alti di collegamento sono stati ottenuti per loci sui cromosomi 7, 15 e 17, che si sovrappongono ai QTL identificati nel nostro precedente incrocio dei genitori R sst1 . Questi dati dimostrano che, in linea di principio, meccanismi simili di resistenza dell'ospite possono operare in presenza e in assenza del meccanismo dipendente dalla sst1 , sebbene i loro effetti siano meno pronunciati nel background genetico della sst1 S.

A causa del "rumore genetico" prodotto da più loci non collegati nell'analisi QTL, gli intervalli candidati sono difficili da determinare con precisione. In ciascuna delle nostre croci, la posizione del picco Chr7 QTL è variata. Pertanto, un cosiddetto ceppo di topo consomico (sostituzione cromosomica) C3H-Chr7 B6 è stato costruito trasferendo l'intero Chr7 derivato da B6 sul background genetico C3HeB / FeJ usando una strategia di allevamento assistita da marker. 25 Inizialmente, l'effetto individuale del locus Chr7 sulla sopravvivenza del topo è stato testato dopo l'infezione endovenosa. Sebbene statisticamente significativo, era debole e difficilmente suscettibile di ulteriore dissezione e identificazione genetica. In isolamento, l'allele Chr7 resistente al locus non è stato in grado di prevenire la necrosi nelle lesioni polmonari della tubercolosi nei topi C3HeB / FeJ. Sullo sfondo genetico sst1 R , tuttavia, il locus Chr7 derivato da B6 ha prodotto un effetto fenotipico dose-cromosoma molto più pronunciato, coerente con il predetto modello di ereditarietà dominante / additiva.

At the whole organism level, the combined effect of the two loci, sst1 and Chr7, transformed an extremely TB-susceptible parental mouse C3HeB/FeJ that succumbs in 3.5–5 weeks to systemic MTB infection into a mouse with a relatively resistant phenotype that survives for 18–24 weeks, approximately a half of the difference between parental strain survival times. Each locus had a specific effect in vivo : the sst1 R worked at an earlier time point and was responsible for preventing necrosis within forming TB granulomas specifically in the lungs. In the sst1 resistant setting, the Chr7 locus controlled intracellular MTB multiplication within TB inflammatory lesions. The effect of this locus, observed in lungs, spleens and livers, was systemic and manifested at later time after infection. Differences in phenotypic expression of the sst1 and Chr7 loci suggest that each locus mediates a distinct molecular pathway. We propose the following explanation of the synergistic effect of the two loci: within the lung granulomas the sst1 R locus ensures survival of the MTB-infected macrophages, whereas the resistant allele of the Chr7 locus limits a rate of the intracellular MTB multiplication in these cells. Because the sst1 S macrophages are sensitized to necrotic cell death induced by virulent MTB, 21 formation of necrotic microfoci within the lung lesions of the sst1 S mice creates a favorable environment for rampant extracellular growth of the bacteria in the lungs 20 and, thus limits the effect of the Chr7 locus explaining a hierarchical relationship between the two loci. Although the activities of the two TB resistance loci seemingly converge on macrophages, our ongoing studies will establish whether the effect of the Chr7 locus is macrophage cell autonomous, or it is dependent on interactions of macrophages with other cell types within TB granulomas.

To date, linkage of TB resistance to Chr7 was identified in two independent studies. Mitsos et al. 16, 17 mapped the TB resistance locus on Chr7 ( trl3 ) in a cross of B6 and DBA/2 mouse strains. Peak location of the trl3 on proximal Chr7 overlaps with the Chr7 QTL described here. As C3H inbred mouse strain was derived from a cross of DBA and Bagg albino mice, 26 the two susceptible strains are related and the Chr7 locus may represent a common ancestral genetic polymorphism. On the contrary, the susceptible allele of the sst1 locus represents a recent mutation, which occurred in the C3HeB/FeJ, the only substrain of C3H that carries the sst1 -susceptible allele. The interplay of the Chr7 and sst1 loci illustrates how the effects of common ancestral polymorphisms may be modified, or even obscured, by less frequent recent mutations. Multigenic hierarchical genetic control of TB resistance presented in this study explains why previous attempts to attribute strain differences in TB susceptibility to a single known polymorphic candidate locus 9, 27 were unsuccessful. 28 Instead, identification of causal polymorphisms and physiological pathways whose interactions determine the outcomes of TB infection is possible through systematic forward genetic analysis.

The reduced Chr7 region mapped here contains many attractive candidate genes. However, commenting on the role of individual genes would be highly speculative without further narrowing the critical interval. For example, analysis of interval-specific subcongenic strains in our studies excluded irf3 and irf7, which previously were considered top candidate genes, from the candidate region. It is important to note that the reduced candidate region is partially homologous to human chromosome 15q11–13, which has been previously identified as a TB susceptibility locus with suggestive evidence of linkage using genome-wide linkage analysis in humans by Cervino et al. 29 In a follow-up study, these authors found significant association of TB susceptibility with a 7-bp deletion in UBE3A gene encoded within the 15q11–13 region and concluded that UBE3A or a closely flanking gene may be a TB susceptibility locus. The reduced candidate region on mouse Chr7 also encompasses the UBE3A gene. UBE3A is a ubiquitin ligase known to function in the uniquitination and degradation of several proteins including p53. 30 The role of UBE3A in response to human papilloma virus has been studied, and this protein was shown to mediate the association of the E6 protein of human papilloma virus with p53. 30 However, the function of this gene in control of bacterial infections remains unknown.

Further work to identify the candidate genes and understand their function may reveal novel mechanisms of TB resistance common in mice and humans. Together with the analysis of the pathogen itself, this approach will permit more complete understanding of the pathogenesis of TB infection as well as the evolutionary successful and sophisticated virulence strategy of MTB.

Materiali e metodi

Animali

C3HeB/FeJ and C57BL/6J mice were purchased from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). C3H.B6- sst1 mice were generated by introgression of a B6-derived interval of chromosome 1 (49–60 cM) encompassing the mouse TB-susceptibility sst1 locus on the susceptible genetic background, C3HeB/FeJ, using marker-assisted breeding and 10 backcrosses. 21 The chromosome 7 consomic mice, C3H-Chr7 B6, were generated using a microsatellite marker-assisted speed congenic breeding strategy. 25 The entire B6-derived chromosome 7, which encompasses the Chr7 QTL peak region identified by linkage analysis, was transferred to the C3HeB/FeJ parental strain yielding the C3H-chr7 B6 consomic strain or to the C3H.B6- sst1 congenic strain yielding the C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 double congenic/consomic strain (Table 1). Chr7 subconsomic strains A–D were derived from the C3H.B6- sst1 , Chr7 B6 strain after backcross on to C3H.B6- sst1 background. Mice used in this study are presented in Table 1.

All sst1 R strains carried the C3H-derived resistant allele of the Slc11a1 gene (formerly known as Nramp1 ). 21 Mice were housed under pathogen-free conditions in barrier animal facilities at the Harvard Medical School and were provided autoclaved chow and water ad libitum . Moribund mice were humanely killed. Time to death experiments were performed with the full knowledge and approval of the standing committee on animals at Harvard Medical School (protocol #03000).

batteri

Frozen stocks of M. tuberculosis (Erdman strain)) were prepared from the lungs of B6 mice infected iv at least 6 months before harvest. Lung tissues were ground in a stomacher in 10 ml 1 × PBS (phosphate-buffered saline). To culture mycobacteria, 500 μl from neat and 10 × diluted samples were plated on oleic albumin complex-enriched 7H10 Middlebrook (Difco, MI, USA) agar plates. After 10–12 days of growth on solid media at 37 °C, mycobacteria were collected by scraping the plates that produced visible growth of the bacteria, washed in PBS containing 0.05% Tween-80 and resuspended in 50 ml of oleic acid/albumin/dextrose/catalase-enriched Middlebrook 7H9 medium. Clumps were removed by sedimentation at 1 g and liquid cultures were grown in roller bottles to an optical density (OD) of 0.4–0.6. Aliquots in 500-μl volumes were frozen and stored at −80 °C. The viability of cultures was tested after 1 week by plating dilutions from a vial to determine colony forming units. The virulence of prepared stocks was tested by infecting susceptible C3H and resistant B6 female mice iv

Infezione

An aliquot of M. tuberculosis was thawed, diluted 10 × in PBS (1 × ) containing 0.05% Tween-80 and sonicated for 10 min in a cup horn sonicator. For iv infection, bacteria were diluted with PBS 1 × containing 0.05% Tween-80. Mice were injected iv in the tail vein with 2–10 × 10 4 CFU live bacilli in 100 μl. Aerosol infections were performed using a Madison aerosol chamber. 21 Aliquots of the bacterial suspension used for each infection were plated to determine the actual infectious dose.

To enumerate bacterial loads, organs were harvested under aseptic conditions at the stated times, and were homogenized individually in PBS 1 × containing 0.05% Tween-80 and were plated on Middlebrook 7H10 agar enriched with 10% oleic acid/albumin/dextrose/catalase (Difco) after the serial 10-fold dilutions, and CFU were counted 21–28 days of incubation at 37 °C. Four to five animals per group were tested at each time point. Mice were killed using isoflurane anesthesia.

istopatologia

Organs were fixed in 10% formalin for >24 h, embedded in paraffin, sectioned (5 μm thickness) and stained with hematoxylin and eosin stain by standard procedure at the Harvard Medical School Rodent Histopathology Core Facility.

Auramine/rhodamine staining

Acid-fast bacilli were identified in tissue sections using auramine/rhodamine dye (0.1% auramine O, 0.01% rhodamine B in H 2 O; Sigma, MO, USA). Sections were stained for 20 min at RT in the dark, destaining with 3% HCl in 70% EtOH (5 min, RT) and counterstained with Mayer's hematoxylin (VWR, West Chester, PA, USA).

Analisi del collegamento

Survival phenotype linkage analyses to autosomal loci were performed using the Mapmaker/SURVIVOR extension of MAPMAKER. 31 This software computes logarithm of odds scores for the Cox proportional hazards model using a variant of the expectation maximization algorithm with Monte Carlo simulation. Mapmaker/SURVIVOR is available from MJD at

analisi statistica

Mycobacterium tuberculosis loads were compared using a t -test (GraphPad Prizm, Version 4.0) and are presented as means±sd Kaplan–Meier survival curves of mouse populations stratified by genotype were plotted using GraphPad Prizm, and the log-rank tests were used to identify statistical differences between them.

Glossario

Chr7

chromosome 7 locus

Ipr1

intracellular pathogen resistance protein 1

MTB

Mycobacterium tuberculosis

QTL

quantitative trait locus

sst1

super susceptibility to tuberculosis 1