P53-r273h mutante media la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza agli anoiki attraverso la soppressione akt-dipendente del fattore modificante la bcl2 (bmf) | morte cellulare e malattia

P53-r273h mutante media la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza agli anoiki attraverso la soppressione akt-dipendente del fattore modificante la bcl2 (bmf) | morte cellulare e malattia

Anonim

Soggetti

  • L'apoptosi
  • Segnalazione cellulare
  • Terapie mirate
  • Proteine ​​tumorali-soppressori

Astratto

p53 è il gene soppressore del tumore più frequentemente mutato nei tumori umani. A differenza di altri geni soppressori del tumore, le mutazioni di p53 si verificano principalmente come mutazioni missenso all'interno del dominio di legame del DNA, portando all'espressione della proteina p53 mutante a lunghezza intera. Le proteine ​​mutanti della p53 non solo perdono la loro funzione di soppressore del tumore, ma possono anche acquisire nuove funzioni oncogeniche e promuovere la tumorigenesi. Qui, abbiamo dimostrato che il silenziamento del mutante endogeno di contatto p53-R273H, ma non mutante conformazionale p53-R175H, ridotta fosforilazione di AKT, induzione del fattore modificante BCL2 (BMF), dissociazione BIM sensibilizzata da BCL-X L e apoptosi mitocondria indotta nelle cellule tumorali. È importante sottolineare che anche le cellule tumorali che ospitano il mutante endogeno del p53-R273H sono state intrinsecamente resistenti agli anoikis e mancano di induzione del BMF a seguito di coltura in sospensione. Alla base di queste attività c'è la capacità del mutante p53-R273H di sopprimere l'espressione di BMF che dipende dalla segnalazione costitutivamente attiva di PI3K / AKT. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che p53-R273H può guidare specificamente la segnalazione di AKT e sopprimere l'espressione di BMF, con conseguente maggiore sopravvivenza delle cellule e resistenza agli anoikis. Questi risultati aprono la possibilità che il blocco di PI3K / AKT avrà un beneficio terapeutico nei mutanti p53-R273H che esprimono tumori.

Principale

La proteina p53 è un soppressore del tumore che funziona come un fattore di trascrizione specifico della sequenza che regola l'espressione di vari geni bersaglio coinvolti in apoptosi, arresto del ciclo cellulare, riparazione del DNA, senescenza e inibizione dell'angiogenesi e della metastasi. 1 Tuttavia, circa il 50% di tutti i tumori umani contiene una mutazione nel gene TP53 , con la maggior parte di queste mutazioni che si verificano all'interno del dominio di legame al DNA, causando un legame alterato di p53 al DNA. 2, 3, 4, 5 A differenza della maggior parte dei geni soppressori del tumore, che sono prevalentemente inattivati ​​da delezioni o troncamento delle mutazioni durante la progressione del cancro, il gene TP53 nei tumori umani è spesso trovato a subire mutazioni missenso che producono una proteina a lunghezza intera contenente solo un sostituzione di un singolo aminoacido con emivita notevolmente prolungata. 6, 7

La maggior parte delle mutazioni associate al cancro TP53 possono essere attribuite a due classi principali: contatto con il DNA e mutanti conformazionali. Il primo gruppo include mutazioni nei residui direttamente coinvolti nel legame al DNA (ad es. R248Q e R273H). Il secondo gruppo comprende mutazioni che causano distorsioni conformazionali locali (ad es. R249S e G245S) o globali (ad es. R175H e R282W). 8, 9, 10 Le conseguenze biologiche delle mutazioni di p53 vanno dalla semplice perdita di funzione al guadagno di funzione. Molti studi in vitro hanno dimostrato chiaramente che alcuni mutanti della p53 possono acquisire nuove funzioni, contribuendo così attivamente all'inizio del tumore, alla progressione e all'aumentata resistenza ai trattamenti anticancro convenzionali. 3, 10, 11, 12, 13 In effetti, i topi hanno bussato con il mutante p53-R270H o p53-R172H, corrispondente ai mutanti hotspot p53-R273H e p53-R175H, rispettivamente, hanno sviluppato tumori altamente metastatici rispetto ai topi p53-null, supportando la nozione di proprietà di guadagno di funzione acquisite dal mutante p53. 14, 15, 16, 17, 18, 19

A livello molecolare, sono stati suggeriti diversi meccanismi per tenere conto del guadagno di funzione del p53 mutante tra cui l'attivazione trascrizionale di MYC, BAG1, MDR1, NFκB2, EGR1, GEF-H1, ID4 e MAD1; 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 repressione trascrizionale di ATF3, CD-95, ID2, hTERT e MST1; 30, 31, 32, 33 interazione unica con specifici motivi del DNA come le regioni di attaccamento della matrice nucleare / impalcatura; 34 modificazione epigenetica, 35 regolazione di miRNA 36, 37, 38 e interazioni con altre proteine ​​(es. P63, p73, NFY e BRD1). 39, 40, 41, 42

Precedenti studi dei nostri laboratori hanno dimostrato che un sottoinsieme di mutanti p53 derivati ​​dal tumore mediano la sopravvivenza cellulare nelle cellule del carcinoma mammario che li hanno espressi. 43 Abbiamo scoperto che il silenziamento del mutante p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468 ha indotto un'apoptosi massiccia. 43 È importante sottolineare che gli effetti apoptotici a seguito del knockdown del mutante p53 erano indipendenti dalla funzione TAp63 e TAp73. Sebbene siano disponibili prove considerevoli che documentano i potenziali meccanismi attraverso i quali i mutanti p53 liberalizzano la crescita cellulare, i meccanismi attraverso i quali le proteine ​​mutanti p53 migliorano la sopravvivenza delle cellule tumorali rimangono relativamente inesplorati.

Nel presente studio, pertanto, abbiamo studiato gli effetti dei mutanti p53 di guadagno di funzione sulla deregolamentazione della sopravvivenza cellulare. Abbiamo scoperto che il mutante a contatto p53-R273, ma non il mutante conformazionale p53-R175, promuove la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza agli anoiki delle cellule tumorali. Alla base di queste attività c'è la capacità del mutante p53-R273H di sopprimere l'espressione di BMF in un modo che dipende dalla via di segnalazione PI3K / AKT. I nostri risultati, quindi, hanno fornito un altro meccanismo su come le proteine ​​mutanti p53 possano contribuire alla diversa segnalazione oncogenica e pro-metastatica.

risultati

Il knockdown del mutante endogeno di contatto p53-R273H, ma non il mutante conformazionale R175H, induce apoptosi mitocondria-dipendente

Per determinare i ruoli funzionali dei mutanti p53 nelle cellule di carcinoma mammario umano, il gene endogeno p53 è stato messo a tacere usando la trasduzione lentivirale di shRNA. Come mostrato nelle Figure 1a ec e nella Figura 1 supplementare, il silenziamento del p53-R273H endogeno contatta il mutante p53 da due shRNA lentivirali specifici specifici di p53 in MDA-MB-468 (seno), HT29 (colon) e A431 (epidermoide) ha provocato la morte massiccia delle cellule apoptotiche, come evidenziato dalla scissione del PARP, dal sanguinamento cellulare e dalla colorazione dell'annessina V / 7-AAD. Inoltre, le attività di caspase 3, caspase 9 e, in misura minore, caspase 8 sono state significativamente sovraregolate a seguito del knockdown mutante p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468 (Figura 1d). L'inibizione delle attività di caspase 9, caspase 3 e pan-caspase ha bloccato l'apoptosi indotta dal silenziamento di p53-R273H, mentre l'inibizione dell'attività della caspasi 8 non ha salvato le cellule dall'apoptosi, suggerendo che è necessaria l'induzione dell'apoptosi a seguito dell'esaurimento della p53-R273H caspase 9 e caspase 3, ma non attività di caspase 8 (Figura 1e). Coerentemente, l'esaurimento della p53-R273H endogena nelle cellule MDA-MB-468 ha anche indotto una quantità significativa di depolarizzazione mitocondriale (Figura 1f). Al contrario, non sono stati osservati effetti apoptotici nelle cellule MCF-7 che esprimono p53 wild-type, né nelle cellule SKBR3 che esprimono mutante conformazionale p53-R175H (Figura 1a e Figura complementare 1c). Questi risultati suggeriscono che il mutante endogeno del contatto p53-R273H sta mediando la sopravvivenza delle cellule del carcinoma mammario sopprimendo la via apoptotica mitocondriale.

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Il knockdown del mutante endogeno p53-R273H a contatto, ma non il mutante conformazionale R175H, induce apoptosi mitocondri-dipendente. ( a - c ) Il mutante p53-R273H è necessario per la sopravvivenza delle cellule di carcinoma mammario umano. Le cellule sono state trasdotte con vettore di controllo (vec), non-targeting (NS) e due diversi costrutti lentivirali che colpiscono specificamente la p53 umana (p53si-1 e p53si-2). I lisati sono stati preparati per l'immunoblotting a 72 ore dopo la trasduzione. La β -attina funge da controllo del carico. Cambiamenti morfologici sono stati osservati a 96 ore dopo trasduzione lentivirale mediante microscopia ottica (ingrandimento originale × 100). La morte delle cellule apoptotiche è stata determinata usando la citometria a flusso di annessina V / 7-AAD a 96 ore dopo la trasduzione. ( d ) Il knockdown del mutante p53 induce l'attivazione di caspase 8, 9 e 3. Le attività di caspase sono state valutate mediante saggio CaspaseGlo a 72 ore dopo la trasduzione. ( e ) L'esaurimento del mutante p53 nelle cellule MDA-MB-468 induce apoptosi che richiede attività di caspasi 9 e 3, ma non di caspasi 8. La morte cellulare dipendente dalla caspasi è stata valutata mediante citometria a flusso con annessina V / 7-AAD in presenza o in assenza di 20 μ M di inibitore della caspasi a seguito del knockdown del mutante p53-R273H. ( f ) Il knockdown del mutante p53 nelle cellule MDA-MB-468 induce la depolarizzazione della membrana mitocondriale. Le cellule sono state colorate con JC-1 a 72 ore dopo la trasduzione di shRNA lentivirale p53. Il colore rosso indica la presenza di aggregati JC-1 nei mitocondri intatti. Il colore verde indica i monomeri JC-1 nel citoplasma. Le cellule colorate JC-1 sono state analizzate mediante microscopia a epifluorescenza (ingrandimento originale × 100). Le barre rappresentano la media ± DS di tre esperimenti. * indica un significato statistico ( P <0, 05) dal test t di Student

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L'esaurimento del mutante p53-R273H induce il fattore modificante il BCL2 (BMF)

Poiché è stato dimostrato che le proteine ​​della famiglia BCL2 svolgono un ruolo critico nel percorso apoptotico dipendente dai mitocondri, ipotizziamo che il mutante p53-R273H possa mediare la sopravvivenza delle cellule del cancro al seno attraverso la regolazione dell'espressione delle proteine ​​della famiglia BCL-2. Per verificare questa ipotesi, abbiamo studiato l'espressione delle proteine ​​della famiglia BCL2 sia pro che anti-apoptotica per il loro ruolo nel percorso apoptotico dipendente dai mitocondri. Come mostrato nella Figura 2a e nella Figura 1a supplementare, una delle proteine ​​della famiglia BCL2 pro-apoptotica, BMF, è stata sovraregolata a 48 ore dopo l'esaurimento della p53-R273H endogena, prima dell'evento apoptotico che si è verificato a 72 ore (come indicato dalla scissione PARP ). Al contrario, nessuna differenza significativa nell'espressione di altri pro-apoptotici (ad es. P-BAD, BAD, BAX, BID, BIM, PUMA e BOK) o anti-apoptotici (ad es. BCL-X L e MCL-1) BCL -2 membri della famiglia sono stati osservati (Figura 2 aggiuntiva).

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L'esaurimento del mutante p53-R273H induce BMF. Il knockdown del mutante p53 induce ( a ) la proteina BMF e ( b ) l'espressione dell'mRNA. Le cellule MDA-MB-468 sono state trasdotte con shRNA lentivirale p53. L'espressione di proteine ​​e mRNA è stata raggiunta rispettivamente da immunoblot e RT-PCR quantitativa. L'espressione dell'mRNA di BMF è stata normalizzata contro GAPDH umano. ( c ) L'espressione ectopica di BMF è sufficiente per indurre l'apoptosi nelle cellule MDA-MB-468. Le cellule sono state trasfettate con 5 μ g di BMF marcato con HA usando il reagente di trasfezione DNA X-tremeGENE HP come discusso nella sezione Materiali e metodi. ( d - e ) L'esaurimento del BMF salva le cellule MDA-MB-468 dall'apoptosi indotta dal knockdown mutante della p53. I lisati proteici e l'apoptosi sono stati analizzati mediante ( d ) immunoblotting e ( e ) annessina citometria a flusso V / 7-AAD a 72 ore dopo la trasduzione. Le barre rappresentano la media ± DS di tre esperimenti. * indica un significato statistico ( P <0, 05) dal test t di Student

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Per studiare ulteriormente se la sovraregolazione del BMF si è verificata a livello trascrizionale, è stata eseguita la RT-PCR in tempo reale per determinare il livello di espressione dell'mRNA del BMF nelle cellule MDA-MB-468 dopo il knockdown di p53-R273H. Come mostrato nella Figura 2b, il knockdown di p53-R273H ha indotto in modo significativo l'espressione dell'mRNA di BMF a 48 e 72 h, confermata dall'upregolazione dei livelli proteici. Al contrario, nessuna induzione del genere è stata osservata nelle cellule SKBR3 che esprimono p53-R175H (dati non mostrati). In particolare, la soppressione dell'espressione di BMF da parte del mutante p53-R273H nelle cellule del carcinoma mammario è indipendente dal legame diretto con il promotore, poiché non è stata rilevata alcuna p53-R273H endogena nel promotore del BMF mediante test di immunoprecipitazione della cromatina (Figura 3 aggiuntiva).

La BMF è necessaria per l'induzione dell'apoptosi a seguito dell'esaurimento della p53-R273H endogena

Al fine di verificare se la sovraregolazione della sola BMF potesse indurre l'apoptosi, l'espressione ectopica della BMF è stata eseguita nelle cellule MDA-MB-468 mediante transfezione transitoria. Come mostrato nella Figura 2c, l'espressione ectopica della BMF induce una quantità significativa di apoptosi, suggerendo che, in effetti, la sovraespressione della BMF potrebbe indurre l'apoptosi nelle cellule MDA-MB-468.

Abbiamo ulteriormente studiato se l'apoptosi indotta dall'esaurimento della p53-R273H richiedesse la funzione endogena di BMF. Il nostro risultato ha mostrato che l'esaurimento della p53-R273H ha indotto una significativa sovraregolazione del BMF nelle cellule di controllo vettoriale corroborate da morte cellulare apoptotica significativa (Figure 2d ed e e Figura 4 aggiuntiva); i livelli di apoptosi erano significativamente ridotti nelle cellule impoverite del BMF, suggerendo che l'induzione dell'apoptosi in seguito alla deplezione di p53-R273H richiedeva la funzione BMF.

L'induzione del BMF sensibilizza il rilascio di BIM da BCL-X L per promuovere l'apoptosi mitocondriale

Vari studi hanno dimostrato che alcuni segnali di danno, come la perdita di attaccamento cellulare, rilasceranno BMF, permettendogli di traslocare e legarsi alle proteine ​​pro-apoptotiche solo BH3, BIM, spostando BCL2 o BCL-X L pro-sopravvivenza indurre l'apoptosi. 44, 45, 46 Qui, abbiamo studiato se la sovraregolazione del BMF a seguito dell'esaurimento della p53-R273H endogena nelle cellule MDA-MB-468 potrebbe indurre eterodimerizzazione BCL-X L / BMF e interrompere l'interazione BCL-X L / BIM. In effetti, i nostri risultati hanno dimostrato che BCL-X L si legava al BIM ma non alla BMF in condizioni normali (Figura 3a). Tuttavia, dopo l'induzione del BMF a seguito del knockdown di p53-R273H, è stato scoperto che una quantità significativa di BMF legava BCL-X L, in coincidenza con la dissociazione del BIM da BCL-X L (Figura 3a). Coerentemente, la sovraespressione di BCL-X L ha completamente abrogato gli effetti apoptotici della deplezione di p53-R273H (Figure 3b e c). Da notare che nessun BCL-2 è stato rilevato nelle cellule MDA-MB-468. Insieme, questi risultati suggeriscono che il silenziamento del p53-R273H mutante endogeno nelle cellule MDA-MB-468 ha indotto l'espressione di BMF e la formazione di complessi BMF / BCL-X L. Questo a sua volta porta allo spostamento del BIM da BCL-X L per indurre l'apoptosi.

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L'induzione di BMF sensibilizza il rilascio di BIM da BCL-X L. ( a ) Le cellule MDA-MB-468 sono state trasdotte con shRNA (NS) non bersaglio o shRNA lentivirale p53si-1 per 72 ore e l'interazione di BMF / BCL-X L e BIM / BCL-X L è stata rilevata da co- test di immunoprecipitazione. Anche gli input per la co-immunoprecipitazione sono stati sottoposti all'analisi dell'immunoblot. Le IgG e la catena pesante (HC) sono state usate rispettivamente come controllo negativo e controllo del carico. ( b - c ) La sovraespressione di BCL-X L ha abrogato gli effetti apoptotici del knockdown mutante p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468. Le cellule sono state co-trasfettate con il costrutto dell'espressione BCL-X L e shRNA p53si-1. I lisati proteici e l'apoptosi sono stati analizzati mediante immunoblotting e citometria a flusso con annessina V / 7-AAD a 72 ore dopo la co-trasfezione. Le barre rappresentano la media ± DS di tre esperimenti. * indica significatività statistica ( P <0, 05) dal test t di Student rispetto alle cellule di controllo vettoriale

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Il mutante p53-R273H sopprime l'anoiki cellulare

Poiché i nostri risultati hanno mostrato che il p53-R273H endogeno media la sopravvivenza delle cellule del cancro al seno attraverso la soppressione del BMF e che BMF è stato segnalato per mediare gli anoiki cellulari, 44, 47 abbiamo ipotizzato che il p53-R273H potesse anche esercitare la sua funzione oncogena attraverso la soppressione di anoiki cellulari nelle cellule tumorali. Per verificare questa ipotesi, abbiamo esaminato la sensibilità di un certo numero di linee cellulari tumorali che ospitano diverse mutazioni della p53 in anoiki. Come mostrato nella Tabella 1, più di 50% di morte cellulare apoptotica è stata osservata nelle linee cellulari tumorali che esprimono p53 wild-type o vari mutanti (R280T, R175H, R179R, L194F e M246I) in coltura in sospensione. Al contrario, le cellule tumorali che esprimono p53-R273H (MDA-MB-468, HT29 e A431) mostrano una resistenza significativa all'anoiki. Analogamente, nelle cellule MCF-7 e MCF-10A (wild-type p53) e SKBR3 (p53-R175H) sensibili agli anoichi è stata osservata una significativa induzione di mRNA e proteina, mentre non è stata osservata alcuna induzione significativa di BMF negli anoiki- cellule resistenti MDA-MB-468, HT29 e A431 che ospitano la mutazione p53-R273H (Figure 4a ece Figure supplementari 5a e b). Questi risultati suggeriscono che il mutante p53-R273H potrebbe inibire l'anoiide cellulare attraverso la soppressione dell'induzione del BMF.

Tabella a grandezza naturale

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Il mutante p53-R273H sopprime l'anoiki cellulare. ( a - b ) Il p53-R273H endogeno sopprime l'induzione del BMF nelle cellule di carcinoma mammario coltivate in sospensione. I campioni di RNA totale e i lisati proteici derivati ​​da cellule coltivate come monostrati attaccati o in sospensione sono stati sottoposti rispettivamente a analisi RT-PCR in tempo reale e immunoblotting. ( c ) le cellule MDA-MB-468 che esprimono p53-R273H erano intrinsecamente resistenti all'anoiki. Tutte le cellule sono state coltivate come in a. L'apoptosi / anoikis è stata determinata usando la citometria a flusso con annessina V / 7-AAD. ( d ) L'espressione ectopica di p53-R273H, ma non di p53-R175H, sopprime l'induzione della proteina BMF e dell'mRNA (Figura 5c supplementare) nelle cellule MCF-10A coltivate in sospensione. Le cellule MCF-10A p53si-3 sono state trasfettate con plasmide che esprime vettore, p53-R175H o p53-R273H. I lisati proteici derivati ​​da cellule coltivate come monostrati attaccati (att) o in sospensione (susp) sono stati sottoposti a immunoblotting. ( e ) L'espressione ectopica di p53-R273H conferisce resistenza agli anoiki nelle cellule MCF-10A. Le cellule MCF-10A p53si-3 sono state coltivate e trasfettate come in d . L'apoptosi è stata analizzata mediante citometria a flusso con annessina V / 7-AAD a 48 ore dopo la coltura. La barra rappresenta la media ± DS di tre esperimenti indipendenti. * indica significatività statistica ( P <0, 05) dal test t di Student

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Per convalidare direttamente se il mutante a contatto p53-R273H fosse effettivamente in grado di sopprimere l'espressione e l'anoiosi del BMF, e non a causa della resistenza intrinseca agli anoiki delle cellule MDA-MB-468, HT29 o A431, abbiamo eseguito un esperimento di ricostituzione genica nei non MCF-10A trasformate. È stato generato un pool di cellule MCF-10A stabilmente trasdotte con uno shRNA p53 lentivirale mirato al 3′-UTR endogeno del p53 di tipo selvaggio (p53si-3) seguito dall'espressione transitoria ectopica dei mutanti p53-R175H o p53-R273H. I livelli di anoiki sono stati quindi analizzati coltivando le cellule trasfettate su piastre di coltura tissutale trattate con poli-HEMA, seguite dall'analisi della citometria a flusso con annessina V / 7-AAD.

Come mostrato in Figura 4d, oltre l'80% dell'espressione endogena di p53 è stata downregolata in cellule che esprimono stabilmente shRNA p53si-3 in cellule MCF-10A. Come previsto, il distacco di cellule ha indotto una significativa sovraregolazione dell'mRNA di BMF e dei livelli di proteine ​​nelle cellule di controllo vettoriale e nel p53-R175H che esprime MCF-10A (Figura 4d e Figura complementare 5c). Al contrario, nessuna sovraregolazione del BMF è stata osservata nelle cellule trasfettate con il mutante p53-R273H, suggerendo che p53-R273H, ma non p53-R175H, sopprime l'espressione di BMF nelle cellule MCF-10A che crescono in sospensione. Coerentemente, le cellule MCF-10A che esprimono p53-R273H erano significativamente più resistenti agli anoiki rispetto alle cellule che esprimono il vettore o p53-R175H ( P <0, 05, test t di Student) (Figura 4e). Risultati simili sono stati osservati anche nelle cellule di carcinoma polmonare H1299 p53-null (Figure supplementari 5d ed e), suggerendo che il mutante di contatto p53-R273H, ma non il mutante conformazionale p53-R175H, conferisce resistenza agli anoiki nelle cellule tumorali umane.

Il mutante p53-R273H regola la via di segnalazione PI3K / AKT

Al fine di identificare il meccanismo mediante il quale il mutante p53-R273H media la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza all'anoiki, è stata condotta la profilazione del gene microarray a seguito della deplezione endogena di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468. Un totale di 58 geni sono stati sovraregolati (> 1, 5 cambi di piega), mentre 117 geni sono stati regolati verso il basso a 72 ore dopo il knockdown di p53-R273H (Figura 6 aggiuntiva). Da notare, i risultati del microarray mostrano che l'espressione di BMF è stata sovraregolata mentre l'mRNA di p53 è stato downregolato a seguito del knockdown di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468, convalidando indipendentemente i nostri risultati precedenti che hanno dimostrato che l'esaurimento di p53-R273H induce mRNA di BMF ed espressione proteica .

Per convalidare i risultati del microarray, abbiamo eseguito RT-PCR in tempo reale indipendente su un certo numero di geni candidati. In effetti, l'espressione di LZTFL1, POU2F3 e SOSTDC1 è stata sovraregolata in modo dipendente dal tempo a seguito del knockdown di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468, mentre TMBIM1, ICAM1 e LIFR erano significativamente sottoregolati, coerentemente con i dati del microarray (Figura 6 aggiuntiva ).

Dopo aver accertato la firma del gene p53-R273H, abbiamo cercato di identificare il bersaglio molecolare diretto di p53-R273H utilizzando la risorsa Mappa di connettività. 48, 49 La Connectivity Map è costituita da un software di abbinamento di modelli che confronta una firma del gene di input con un database di 7000 profili di espressione che rappresentano 1309 piccole molecole (chiamate perturbageni). Un punteggio di connettività compreso tra +1 e −1 viene quindi assegnato in base al grado di somiglianza o dissomiglianza tra le due firme. 48, 49 Pertanto, un farmaco con un elevato punteggio di connettività e un basso valore di P ha una firma genica molto simile alla firma della query e potrebbe essere ipotizzato che agisca su un percorso in parallelo con la droga che ha generato la firma della query.

L'analisi della Connectivity Map mostra che tre dei primi cinque perturbageni hanno previsto di condividere percorsi comuni attivati ​​dall'esaurimento della p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468 erano inibitori diretti o indiretti della via di segnalazione PI3K (Tabella 2). Questi includono wortmannin e LY-294002, che sono inibitori PI3K, 50 e sirolimus, un inibitore mTOR. 51 Inoltre, abbiamo identificato anche vorinostat e tricostatina A, entrambi inibitori dell'istone deacetilasi, come uno dei successi dopo il knockdown di p53-R273H. Tuttavia, a differenza degli inibitori PI3K, la firma genica che è stata arricchita a seguito del knockdown di p53-R273H è stata inversamente correlata con le firme geniche indotte dagli inibitori dell'istone deacetilasi. Questi risultati ci hanno portato a ipotizzare che p53-R273H potrebbe esercitare i suoi effetti di guadagno di funzione attraverso l'attivazione della via di segnalazione PI3K / AKT e / o l'inibizione delle attività dell'istone deacetilasi.

Tabella a grandezza naturale

Esaurimento dei defosforilati p53-R273H AKT

Per testare direttamente questa ipotesi, l'immunoblotting è stato eseguito per valutare l'espressione di AKT fosforilato a seguito del knockdown di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468.

Come mostrato nella Figura 5a e nella Figura 7a supplementare, l'induzione del BMF a seguito dell'esaurimento della p53-R273H endogena corroborata dalla riduzione della fosforilazione dell'AKT alla serina 473 e treonina 308. Analogamente, espressione ectopica della p53-R273H in MCF-10A p53si-3 o Le cellule H1299 hanno indotto una significativa fosforilazione dell'AKT e la soppressione della BMF, mentre tali effetti non sono stati osservati nelle cellule trasfettate con p53-R175H, né nelle cellule trasfettate con controllo vettoriale (Figura 5b e Figura complementare 7b).

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Il mutante p53-R273H regola la via di segnalazione PI3K / AKT. ( a ) Il knockdown di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468 riduce la fosforilazione di AKT. Le cellule MDA-MB-468 sono state trasdotte con shRNA lentivirale non bersaglio (NS) o p53si-1 e i lisati sono stati isolati per l'analisi di immunoblotting a 48 e 72 ore dopo la trasduzione. ( b ) L'espressione ectopica del mutante p53-R273H, ma non p53-R175H, induce la fosforilazione dell'AKT. Le cellule MCF-10A sono state trasdotte con il vettore lentivirale o con shRNA p53si-3 mirati al 3′-UTR del p53 di tipo selvaggio endogeno seguito da una breve selezione di farmaci (1 μ M di puromicina). Il pool di cellule 3 che esprimono stabilmente p53si-3 è stato trasfettato con vettore, p53-R175H o p53-R273H seguito da immunoblotting a 72 ore dopo la trasfezione. ( c ) L'espressione ectopica di myr-AKT sopprime l'espressione di BMF a seguito del knockdown di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468. ( d ) L'espressione ectopica di myr-AKT ha abrogato gli effetti apoptotici indotti dalla deplezione di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468. Le cellule sono state co-trasfettate con myr-AKT e p53si-1 per 72 ore. L'apoptosi è stata determinata usando la citometria a flusso con annessina V / 7-AAD. La barra rappresenta la media ± DS di tre esperimenti indipendenti

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Abbiamo studiato ulteriormente la dipendenza della soppressione BMF mediata da p53-R273H e la sopravvivenza cellulare dall'attività AKT. In effetti, l'espressione di un AKT miristoilato costitutivamente attivo ha completamente abrogato l'induzione della BMF e ha ridotto drasticamente l'apoptosi in seguito all'esaurimento di p53-R273H nelle cellule MDA-MB-468, HT29 e A431 (Figure 5c e d e Figure supplementari 7c e d). Insieme, questi risultati dimostrano che il mutante p53-R273H è in grado di regolare la segnalazione PI3K e AKT.

Il mutante p53-R273H regola specificamente l'espressione di AKT e BMF in una vasta gamma di cellule tumorali

Per determinare se l'effetto pro-sopravvivenza del mutante p53-R273H è presente in altri tipi di tumore, abbiamo eseguito il knockdown del gene p53 in un pannello di linee cellulari tumorali umane che ospitavano varie mutazioni di p53. Come mostrato nella Figura 6, l'esaurimento della p53-R273H endogena in MDA-MB-468, HT29 e A431 ha indotto una quantità significativa di apoptosi ed espressione di BMF, in linea con le nostre precedenti osservazioni.

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Il mutante p53-R273H regola l'espressione di AKT e BMF in una vasta gamma di cellule tumorali. Le cellule sono state trasdotte con shRNA lentivirale p53si-1. I lisati proteici sono stati isolati per l'immunoblotting a 72 ore dopo la trasduzione. Notare la defosforilazione dell'AKT confermata dall'induzione del BMF solo nelle cellule recanti p53-R273H.

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Curiosamente, l'esaurimento di p53-R280K endogeno in MDA-MB-231 e p53-R280T in cellule CNE-1 ha anche ridotto la fosforilazione di AKT, ma invece di upregulation, l'espressione di BMF è stata significativamente ridotta e non è stata osservata alcuna morte cellulare apoptotica. In netto contrasto, l'esaurimento della p53-M246I nelle cellule tumorali polmonari NCI-H23 ha portato alla downregulation del BMF con livelli invariati di fosfo-AKT. I livelli di fosfo-AKT e BMF sono rimasti invariati in SKBR3 (p53-R175H), KM12 (p53-H179R), MCF-7 (p53 di tipo selvaggio) o MCF-10A (p53 di tipo selvaggio) dopo il knockdown p53 endogeno. Questi risultati suggeriscono che il mutante p53-R273H, ma non altri mutanti, regolano specificamente la sopravvivenza delle cellule tumorali attraverso la soppressione AKT-dipendente dall'AKT.

Il mutante p53 è correlato alla fosforilazione dell'AKT nei tumori mammari primari

Poiché i nostri risultati prevedono che i tumori con p53 mutante mostrerebbero un segnale PI3K / AKT più attivo, abbiamo colorato i microarrays tissutali dei campioni di carcinoma mammario umano per p53 e confrontato questo con i livelli di fosforilazione dell'AKT. Abbiamo usato la colorazione ad alta p53 come indicazione della presenza di potenziali mutazioni di p53 con guadagno di funzione (Figura 6 aggiuntiva). Coerentemente con il nostro modello, è stata rilevata una significativa correlazione positiva ( P <0, 001, test Chi-quadro) tra elevata colorazione di p53 e alti livelli di fosforilazione di AKT (Figura 8 aggiuntiva). Collettivamente, questi risultati suggeriscono che i mutanti p53 guidano specificamente la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza agli anoiki attraverso l'alterazione della segnalazione di AKT.

Discussione

Questo studio descrive un guadagno di funzione del mutante p53-R273H nel promuovere sia la sopravvivenza cellulare che la resistenza agli anoiki delle cellule tumorali. Alla base di queste attività c'è la capacità del mutante p53-R273H di sopprimere l'espressione di BMF in un modo che dipende dalla via di segnalazione PI3K / AKT. Esaurimento del mutante endogeno di contatto hot spot p53-R273H, ma non del mutante conformazionale p53-R175H, fosforilazione AKT downregolata, espressione di BMF indotta, dissociazione BIM sensibilizzata da BCL-X L e indotta significativa apoptosi mitocondria-dipendente in un'ampia gamma di tumori le cellule. È importante sottolineare che il knockdown del BMF o l'espressione ectopica di un AKT miristoilato ha significativamente salvato gli effetti apoptotici dell'esaurimento di p53-R273H, suggerendo che è necessaria l'induzione del BMF per la morte delle cellule apoptotiche dopo il knockdown di p53-R273H. Allo stesso modo, le cellule tumorali che ospitano il mutante endogeno del p53-R273H sono state anche trovate intrinsecamente resistenti all'anoiki e alla mancanza di induzione del BMF in seguito alla coltura in sospensione. Come previsto da questo modello, la sovraespressione di p53-R273H, ma non di p53-R175H, nelle cellule MCF-10A wild-type p53 ha reso le cellule resistenti agli anoiki e sopprime l'induzione del BMF. Questi risultati suggeriscono che il mutante p53-R273H guida specificamente la sopravvivenza delle cellule tumorali attraverso la soppressione del BMF, che potrebbe contribuire ad aumentare la resistenza agli anoikis durante le metastasi. Poiché l'induzione del BMF è stata anche abolita nelle cellule che esprimono AKT miristoilato a seguito del knockdown di p53-R273H, sembra probabile che l'induzione del BMF sia a valle dell'inibizione dell'AKT.

Un'ulteriore dimostrazione della rilevanza clinica dei mutanti p53 e dell'asse PI3K / AKT è stata fornita dalla colorazione IHC dei tumori mammari umani primari che mostravano una correlazione positiva tra alta espressione di p53 (un indicatore della presenza di mutante p53 patogeno) e forte colorazione fosfo-AKT.

Va tuttavia avvertito che l'effetto del mutante p53 sulla segnalazione PI3K / AKT non è limitato ai soli mutanti p53-R273H. Inoltre, i risultati non implicano necessariamente che tutti i tumori con livelli elevati di fosfo-AKT possiedano la mutazione p53-R273H e abbiano lo stesso grado di resistenza all'apoptosi e agli anoiki. Infatti, l'esaurimento di p53-R280K endogeno in MDA-MB-231 e p53-R280T in cellule CNE-1 conferisce una simile downregulation del fosfo-AKT, ma l'espressione di BMF è stata significativamente ridotta (invece che upregolata come osservato in p53-R273H cellule che esprimono) e nessuna morte di cellule apoptotiche è stata osservata. Sembra probabile che altri mutanti della p53 possano cooperare attraverso meccanismi diversi, indipendenti dalla BMF, per trasmettere segnali oncogenici diversi per promuovere l'aggressività nei tumori umani. Ciò merita ulteriori indagini.

Come, esattamente, i mutanti p53 contribuiscano all'attivazione di PI3K / AKT rimane una domanda aperta. Perché i mutanti con guadagno di funzione della p53 possono guidare la tumorigenesi attraverso l'attivazione dei recettori del fattore di crescita (ad es. Il recettore TGF- β , 52 EGFR 53, 54, 55 e MET 56, 57 ) o promuovere il riciclo guidato dalle proteine ​​accoppiamento integrina / Rab. 53 Questi percorsi di segnalazione sono stati implicati nell'attivazione della segnalazione PI3K / AKT. Quindi, si è tentati di ipotizzare che l'attivazione costitutiva di PI3K / AKT da parte di p53-R273H possa essere parzialmente modulata da uno o una combinazione di questi meccanismi. In effetti, le tre linee cellulari (MDA-MB-468, HT29 e A431) che rispondevano alla defosforilazione dell'AKT, all'induzione del BMF e alla morte cellulare apoptotica a seguito dell'esaurimento della p53-R273H, esprimono livelli di EGFR da moderati a elevati. 58 Sono infatti necessari ulteriori lavori per capire se il ruolo del mutante p53-R273H nella regolazione della segnalazione di PI3K / AKT e dell'espressione di BMF influenza lo sviluppo metastatico nei tumori umani. La ricerca che affronta questo aspetto dovrà anche accertare il contributo relativo di ciascuna proprietà funzionale del mutante p53-R273H, ovvero controllo dell'apoptosi, migrazione cellulare e invasione cellulare, nella tumorigenesi.

Infine, diversi studi hanno anche rivelato un ruolo per TAp63, una proteina della famiglia p53 e un fattore di trascrizione, che interagisce con la p53 mutante ma non di tipo selvaggio. 59, 60 Inibendo TAp63, il mutante p53 può regolare un programma di trascrizione pro-invasiva che include la regolazione dell'espressione di Dicer, DEPDC1, Cyclin G2 e Sharp1. 52, 61 Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che il mutante p53-R273H può regolare la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza agli anoikis indipendentemente dalle funzioni TAp63 (e TAp73). 43 Ciò è coerente con uno studio precedente che dimostra che la perdita di TAp63 è meno potente nell'indurre metastasi rispetto all'espressione p53 mutata in un modello murino di adenocarcinoma duttale pancreatico, suggerendo che la p53 mutante fa molto più che inibire TAp63. 62

In conclusione, abbiamo dimostrato che il mutante a contatto p53-R273H sopprime l'espressione di BMF in un modo che dipende dalla via di segnalazione PI3K / AKT per promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali e la resistenza all'anoiki. I nostri risultati, quindi, forniscono prove di un altro meccanismo che i tumori possono usare per promuovere metastasi, specialmente nei tumori in cui il mutante p53 è altamente espresso. Questi risultati aprono anche la possibilità che il targeting della via di segnalazione PI3K / AKT avrà un beneficio terapeutico nei mutanti p53-R273H che esprimono tumori.

Materiali e metodi

Colture cellulari e costrutti

Linee cellulari di carcinoma mammario umano (HCC38, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 e SKBR3), linee cellulari di carcinoma del colon (HT-29 e KM12), linee cellulari di carcinoma polmonare (NCI-H1299 e NCI- H23), le linee cellulari di carcinoma epidermoide (A431) e carcinoma rinofaringeo (CNE1) sono state mantenute in RPMI 1640 contenente siero bovino fetale al 10%, 100 UI / ml di penicillina e streptomicina 100 μ g / ml (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, STATI UNITI D'AMERICA). Le cellule MCF-10A sono state coltivate in DMEM-F12 (Sigma-Aldrich) integrato con siero di cavallo al 5%, 20 ng / ml di EGF, 0, 5 g / ml di idrocortisone, 100 ng / ml di tossina colera, 10 μ g / ml di insulina, 100 UI / ml di penicillina e 100 μ g / ml di streptomicina. Tutte le cellule sono state mantenute a 37 ° C in un ambiente contenente 5% di CO 2 . I costrutti di espressione sono stati ottenuti da Addgene (Cambridge, MA, USA) e sono stati trasfettati utilizzando il reagente di trasfezione del DNA X-tremeGENE HP (Roche, Indianapolis, IN, USA) secondo le istruzioni del produttore (Tabella supplementare 1).

Produzione e trasduzione lentivirale

I costrutti lentivirali di shRNA furono acquistati da Sigma-Aldrich. Le scorte lentivirali ad alto titolo sono state generate dalla co-trasfezione con i plasmidi di imballaggio psPAX2 (Addgene; plasmide 12260) e i plasmidi di inviluppo pMD2.G (Addgene; plasmide 12259) nelle cellule HEK-293T come precedentemente descritto. 43, 63, 64, 65, 66 Le sequenze target di shRNA per p53 e BMF sono mostrate nella Tabella Supplementare 2.

Analisi di immunoblot

I lisati proteici dalle cellule sono stati estratti in tampone di lisi ghiacciato (0, 75% NP-40, DTT 1 mM, inibitori della fosfatasi e inibitori della proteasi in PBS). La proteina totale (50 μ g) è stata sottoposta a SDS-PAGE seguita da immunoblotting. I dettagli sulla fonte di anticorpi utilizzati per l'immunoblotting sono forniti nella Tabella Supplementare 3.

Saggio di apoptosi e anoiki

La quantificazione dell'apoptosi mediante colorazione di Annexin V-PE / 7-AAD è stata eseguita come precedentemente descritto. 43, 63 Tutte le analisi sono state eseguite su un citometro a flusso FACSCalibur utilizzando il software CellQuest Pro (versione 5.1.1; BD Biosciences, San Jose, California, USA). Per il saggio di anoiki, le cellule sono state placcate su piastre di coltura tissutale pretrattate con 20 mg / ml di poliHEMA (Sigma, St. Louis, MO, USA) e analizzate per l'apoptosi mediante saggio allegato V-PE.

Attivazione e inibizione della caspasi

Le attività di caspasi 3, 8 e 9 nelle cellule sono state misurate a 72 ore dopo la trasduzione di shRNA lentivirali utilizzando un kit CaspaseGlo (Promega, Madison, WI, USA) secondo il protocollo del produttore. Caspase 3, 8, 9 o inibitore della pan-caspase (Z-DEVD-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK e Z-VAD-FMK, rispettivamente; Promega) sono stati usati per inibire l'attività della caspasi. La concentrazione ottimale di tutti gli inibitori è stata determinata in 20 μ M. Gli inibitori sono stati aggiunti alle cellule 24 ore dopo la trasduzione lentivirale di shRNA. L'apoptosi è stata misurata mediante saggio sull'Annexin V-PE a 72 ore.

Test di depolarizzazione della membrana mitocondriale

Le cellule sono state incubate con 5 μg / ml di JC-1 (Merck, Darmstadt, Germania) in condizioni di oscurità per 30 minuti a temperatura ambiente, seguite da visualizzazione con microscopia a fluorescenza o analisi citometrica a flusso.

RT-PCR quantitativa

L'RNA totale dalle cellule è stato estratto utilizzando il kit di isolamento dell'RNA Qiagen (Qiagen, Valencia, CA, USA) e il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato utilizzando Master Mix da RNA a cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo dei produttori. I livelli di espressione genica sono stati misurati mediante RT-PCR in tempo reale utilizzando il reagente FastStart Universal SYBR Green Master (Roche) e un sistema di rivelazione PCR in tempo reale Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software per sistemi ottici Bio-Rad iQ5 V1.0. Le sequenze specifiche di primer avanti e indietro sono mostrate nella Tabella supplementare 4. Le condizioni per tutte le reazioni RT-PCR in tempo reale erano le seguenti: 3 minuti a 94 ° C seguiti da 40 secondi a 94 ° C, 40 secondi a 60 ° C e 25 secondi a 72 ° C per 40 cicli. I dati di espressione sono stati normalizzati contro GAPDH o B2M come gene di pulizia.

Analisi di microarray e mappe di connettività

Sono stati condotti esperimenti di microarray in duplicato nelle cellule MDA-MB-468 trasdotte con shRNA lentivirale p53 o con controllo shRNA non specifico per 48 ore. L'RNA isolato è stato inviato a un laboratorio di assistenza certificato Affymetrix (Origen Labs, Singapore) per il controllo e l'elaborazione della qualità. Tutta l'ibridazione è stata eseguita su un array Affymetrix Human Gene 1.0ST. Le analisi dei dati di microarray sono state eseguite utilizzando Affymetrix Expression Console V1.1 (Santa Clara, CA, USA), Gene Set Enrichment Analysis (Broad Institute of Harvard e MIT, MA, USA) 67 e la Connectivity Map. 48 Tutti i dati relativi all'espressione di microarray sono stati depositati nel Gn Expression Omnibus del National Center for Biotechnology Information (numero di accesso serie GEO: GSE65967).

adesioni

Gene Expression Omnibus

  • GSE65967

Informazione supplementare

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  1. 1.

    Figura supplementare 1

  2. 2.

    Figura complementare 2

  3. 3.

    Figura supplementare 3

  4. 4.

    Figura supplementare 4

  5. 5.

    Figura supplementare 5

  6. 6.

    Figura supplementare 6

  7. 7.

    Figura supplementare 7

  8. 8.

    Figura complementare 8

Documenti Word

  1. 1.

    Leggende di figure supplementari

  2. 2.

    Tabelle Supplementari

Glossario

7-AAD

7-aminoattinomicina D

AKT

omologo oncogene virale del timoma murino v-akt 1

ATF3

attivazione del fattore di trascrizione 3

B2M

beta-2 microglobulina

MALE

Agonista della morte cellulare associato a BCL2

BAG1

Athanogene associato a BCL2

BAX

Proteina X associata a BCL2

BCL-2

CLL / linfoma a cellule B 2

BCL-X L

BCL2-like 1 (BCL2L1)

OFFERTA

Agonista della morte del dominio interagente BH3

BIM

BCL2-like 11 (facilitatore dell'apoptosi) (BCL2L11)

BMF

Fattore di modifica Bcl2

BOK

Killer ovarico associato a BCL2

BRD1

bromodomain contenente 1

CD-95

Recettore della morte della superficie cellulare Fas (noto anche come FAS)

DEPDC1

Dominio DEP contenente 1

giocatore di dadi

dicer 1, ribonucleasi tipo III

digitale terrestre

ditiotreitolo

EGF

fattore di crescita epidermica

EGFR

recettore del fattore di crescita epidermica

EGR1

risposta alla crescita precoce 1

GAPDH

gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi

GEF-H1

Fattore di scambio nucleotidico guanina Rho / Rac (GEF) 2 (noto anche come ARHGEF2)

Informazioni supplementari accompagna questo documento sul sito Web di Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)