La leucemia mieloide-1 è un importante fattore di sopravvivenza apoptotica nel carcinoma mammario triplo negativo | morte cellulare e differenziazione

La leucemia mieloide-1 è un importante fattore di sopravvivenza apoptotica nel carcinoma mammario triplo negativo | morte cellulare e differenziazione

Anonim

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Astratto

Il cancro al seno è il secondo tumore mal diagnosticato più frequentemente nelle donne statunitensi. Il sottotipo di carcinoma mammario triplo negativo (TNBC), privo di espressione del recettore degli estrogeni, del recettore del progesterone e del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano, colpisce il 15% dei pazienti ed è refrattario alle attuali terapie mirate. Come molti tumori, le cellule TNBC spesso deregolano la morte cellulare programmata sovraregolando le proteine ​​anti-apoptotiche della famiglia delle cellule B CLL / linfoma 2 (Bcl-2). Un membro della famiglia, leucemia a cellule mieloidi-1 (Mcl-1), è comunemente amplificato in TNBC e si correla con una prognosi clinica sfavorevole. Qui mostriamo l'effetto del silenziamento dell'espressione dell'isoforma 1 (Bcl-xL) di proteina 1 simile a Mcl-1 e Bcl-2 sulla vitalità in un pannello di diciassette linee cellulari di TNBC. La morte cellulare è stata osservata in un sottogruppo dopo il knockdown Mcl-1. Al contrario, il knockdown di Bcl-xL ha ridotto solo modestamente la vitalità, indicando che Mcl-1 è un fattore di sopravvivenza più importante. Tuttavia, il doppio silenziamento di Mcl-1 e Bcl-xL ha ridotto la vitalità nella maggior parte delle linee cellulari testate. Questi risultati sulla proliferazione sono stati ricapitolati da esperimenti di profilazione BH3. Il trattamento con un peptide Bcl-xL e Bcl-2 ha avuto solo un effetto moderato su una qualsiasi delle linee cellulari TNBC, tuttavia, è stato efficace il co-dosaggio di un peptide selettivo Mcl-1 con un peptide che inibisce Bcl-xL e Bcl-2 in ogni riga testata. Allo stesso modo, l'inibitore selettivo di Bcl-xL WEHI-539 era solo debolmente citotossico in tutto il pannello, ma la sensibilizzazione mediante knockdown Mcl-1 ha migliorato notevolmente la sua EC 50 . ABT-199, che inibisce selettivamente Bcl-2, non si è sinergizzato con il knockdown di Mcl-1, indicando l'importanza relativamente bassa di Bcl-2 in queste linee. La sensibilità di Mcl-1 non è prevista dai livelli di mRNA o di proteine ​​di un singolo membro della famiglia Bcl-2, tranne per una debole correlazione per l'espressione delle proteine ​​Bak e Bax. Tuttavia, un indice più completo composto dalle proteine ​​Mcl-1, Bcl-xL, Bim, Bak e Noxa o dall'espressione di mRNA si correla bene con la sensibilità di Mcl-1 nel TNBC e può anche prevedere la dipendenza da Mcl-1 nelle cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule Linee.

Principale

Il carcinoma mammario è il secondo tumore mal diagnosticato più frequentemente nelle donne statunitensi con 230.000 nuovi casi e 40.000 decessi nel 2011. Il sottotipo di carcinoma mammario triplo negativo (TNBC), che non esprime il recettore degli estrogeni (ER) e il recettore del progesterone ( PR) e privo di sovraespressione del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2), colpisce quasi il 15% di tutti i pazienti con carcinoma mammario e rimane refrattario alle terapie endocrine e HER2 attualmente disponibili. 1, 2 L'attuale standard di cura per la TNBC è la radioterapia e la chemioterapia citotossica neoadiuvante e presenta una prognosi clinica sfavorevole. 3, 4, 5

Come con la maggior parte dei tumori, le cellule TNBC sono sotto stress metabolico e oncogenico e richiedono l'inibizione della via intrinseca apoptotica per la sopravvivenza. 6 In normali condizioni fisiologiche, questo percorso è strettamente regolato da membri sia pro che anti-apoptotici della famiglia delle cellule B CLL / linfoma 2 (Bcl-2). Stressori come danni al DNA, ipossia o segnalazione oncogenica, causano maggiore espressione o traslocazione dei membri della famiglia Bcl-2 pro-apoptotici, come Bim, Bad e Noxa, nei mitocondri. 7 Queste proteine ​​in seguito innescano la formazione di pori nella membrana mitocondriale esterna attraverso la multimerizzazione indotta di Bak o Bax, un processo che porta al rilascio di citocromo c, alla scissione della caspasi e all'impegno per l'apoptosi.

In assenza di stress ambientali o oncogenici, i membri della famiglia Bcl-2 multi-dominio come leucemia a cellule mieloidi-1 (Mcl-1), Bcl-2 e isoforma 1 della proteina 1 simile a Bcl-2 (Bcl-xL), prevengono apoptosi sequestrando i familiari pro-apoptotici. Molti tipi di cancro bloccano in modo aberrante la segnalazione apoptotica oncogena aumentando l'espressione allo stato stazionario di una o più di queste proteine ​​attraverso l'amplificazione genetica, l'upregolazione della trascrizione o la riduzione della degradazione. 8 Non sorprende quindi che gli inibitori della famiglia Bcl-2, come ABT-263 e ABT-199, abbiano mostrato efficacia preclinica e clinica. 9, 10, 11 L'uso efficace di queste terapie mirate richiede una previsione accurata delle proteine ​​anti-apoptotiche da cui il tumore dipende per sopravvivere. Un'alta espressione di un membro della famiglia Bcl-2 pro-sopravvivenza non è necessariamente correlata alla dipendenza da quella proteina per prevenire l'apoptosi. 12, 13, 14 Le singole proteine ​​della famiglia Bcl-2 pro-sopravvivenza inibiscono preferibilmente un sottogruppo di membri della famiglia pro-apoptotici, 15 e le cellule tumorali richiedono un antagonista controbilanciante per qualsiasi stimolo pro-apoptotico. Inoltre, ulteriori meccanismi regolatori, come la limitazione del traffico ai mitocondri o l'induzione del degrado, possono alterare l'attività indipendentemente dal livello proteico assoluto espresso. 16 Previsioni più accurate utilizzano un indice multiproteico, come il rapporto tra Mcl-1 e Bcl-xL per prevedere la dipendenza da Mcl-1 nel carcinoma polmonare a piccole cellule, 17 o il rapporto tra fosfo-Bcl-2 / (Mcl-1 + Bcl-2) per prevedere la sensibilità all'inibitore S1 pan-Bcl-2 nella leucemia. 18

La sovraespressione di mcl-1 è stata riportata in diversi tumori ematologici e solidi del tumore ed è uno dei geni più frequentemente amplificati nel cancro umano 19, 20 tra cui prostata, polmone, pancreas, mammella, ovaio, melanoma, leucemia linfocitica cronica a cellule B, acuta leucemia mieloide e leucemia linfoblastica acuta. La sovraespressione nel carcinoma mammario è associata a un alto grado di tumore e alla scarsa sopravvivenza 21, e le prove precliniche suggeriscono che Mcl-1 rappresenta un obiettivo promettente per il trattamento dei tumori al seno. 19, 22, 23 In effetti, il gene MCL1 è l'amplificazione genetica più comune (dopo TP53) che si verifica in seguito alla terapia con neoadiuvanti nel TNBC. 24 Inoltre, la sovraespressione di Mcl-1 è implicata come fattore di resistenza per terapie multiple, tra cui paclitaxel e vincristina, agenti bersaglio di microtubuli ampiamente prescritti 25 e composti che inibiscono i familiari correlati Bcl-2 e Bcl-xL. 26, 27 Sovraespressione inducibile dalla doxiciclina del Mcl-1 antagonizzante Bcl-2 omologia dominio 3 (BH3) -solo proteina Noxa, ma non Bim, Puma o tBid, sinergizza con il trattamento con Bcl-2 e Bcl-xL inibitore ABT-737 in Celle Jurkat J16. 28 È stato riportato che la sovraespressione forzata di Mcl-1 nei topi transgenici presenta un'alta incidenza di linfoma a cellule B, 29 mentre è stato dimostrato che la downregulation di Mcl-1 con oligonucleotidi antisenso o RNA di piccole interferenze (siRNA) induce l'apoptosi in un numero di tipi di cellule tumorali. 30, 31

Allo stesso modo, Bcl-xL è comunemente amplificato nel cancro 20 ed è stato implicato nella prevenzione di vari tumori sottoposti a morte cellulare programmata, tra cui il melanoma 32 e le cellule staminali del cancro del colon. 33 Inoltre, nei tumori della mammella e del polmone, l'amplificazione di Bcl-xL è correlata a una ridotta sensibilità ai repressori trascrizionali. 19

Qui esploriamo le dipendenze di Mcl-1 e Bcl-xL in un pannello di linee cellulari di TNBC e studiamo le proteine ​​apoptotiche che determinano principalmente la sensibilità. Questi dati aiuteranno a identificare i determinanti genetici e molecolari della sensibilità agli inibitori anti-apoptotici nel TNBC, che potrebbero aiutare nella progettazione di studi clinici sugli inibitori di Mcl-1, sulla selezione dei pazienti e sull'identificazione dei biomarker.

risultati

Mcl-1 protegge un sottoinsieme di linee cellulari TNBC dall'apoptosi

Dato che Mcl-1 e Bcl-xL sono frequentemente sovraregolati nel carcinoma mammario umano e sulla base della loro importanza per prevenire l'apoptosi in molti tipi di cancro, abbiamo ipotizzato che alcune linee cellulari di TNBC possano dipendere da queste proteine ​​per prevenire l'apoptosi e che silenziando una o entrambi ridurrebbero la vitalità cellulare. Per verificare questa ipotesi, abbiamo messo a tacere l'espressione di Mcl-1 o Bcl-xL usando siRNA. Per prima cosa abbiamo convalidato il nostro protocollo siRNA: dei quattro motivi unici testati per ogni proteina, Mcl-1 motif-17 e Bcl-xL motif-14 hanno prodotto in modo riproducibile il massimo knockdown di oltre l'85% rispetto al controllo non silenziante (NSC) in MDA -MB-468 e MDA-MB-453 cellule (figure supplementari S1A e B). Il motivo NSC non ha ridotto la vitalità cellulare; tuttavia, il silenziamento dell'espressione di Mcl-1 ha sostanzialmente ridotto la vitalità delle cellule MDA-MB-468 in modo dipendente dalla proteina knockdown (Figure supplementari S1C e D). Al contrario, il silenziamento di Bcl-xL ha avuto un effetto minore su entrambe le linee cellulari nonostante l'elevato knockdown proteico (> 90%).

Abbiamo messo a tacere Mcl-1 o Bcl-xL usando questi siRNA in un pannello di 17 linee cellulari luminali e basali disponibili pubblicamente (Figura 1). La vitalità cellulare è stata misurata dopo 5 giorni per consentire diversi raddoppiamenti della popolazione e l'efficienza del knockdown è stata verificata mediante western blot alla conclusione dell'esperimento (Tabella supplementare S1). Il knockdown di Mcl-1 ha notevolmente ridotto la proliferazione del 60% o più in sette righe (blu, Figura 1a). Quattro linee hanno una dipendenza intermedia da Mcl-1 (perdita del 40-60%, ciano), e il resto era in gran parte insensibile (rosso). Abbiamo osservato un aumento dell'attività della caspasi 3/7 dopo la trasfezione di siRNA Mcl-1 solo nelle linee cellulari dipendenti da Mcl-1, ma non indipendenti (Figura 1b, Figura supplementare S2). Analogamente, usando la citometria a flusso abbiamo osservato un aumento della colorazione del marker apoptotico di Annexin V dopo il knockdown Mcl-1 solo nelle linee cellulari dipendenti (Figura supplementare S3). Questi dati suggeriscono che un sottoinsieme delle nostre linee cellulari dipendono esclusivamente dall'Mcl-1 per la sopravvivenza e una ridotta proliferazione dopo il knockdown della proteina Mcl-1 è causata dall'induzione apoptotica.

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Un sottoinsieme di linee cellulari TNBC dipende esclusivamente da Mcl-1 per eludere l'apoptosi. ( a ) L'espressione di Mcl-1 è stata messa a tacere dal siRNA e la proliferazione cellulare si è normalizzata come il rapporto tra cellule trattate con siRNA e cellule trattate con NSC, sottraendo ciascun valore dal conteggio iniziale delle cellule. Con questo ridimensionamento, il 100% indica che il knockdown non ha alcun effetto sulla vitalità rispetto a NSC, lo 0% indica che non vi sono cambiamenti nella conta cellulare e valori negativi indicano la morte cellulare. Un sottoinsieme di linee è sensibile al knockdown Mcl-1 (vitalità cellulare ridotta del 60% o più, blu). Due linee sono intermedi sensibili (vitalità ridotta del 40–60%, ciano), mentre il resto è insensibile alla perdita di Mcl-1 (rosso). ( b ) Induzione pieghevole dell'attività della caspasi 3/7 da cellule non trattate misurata da Caspase-Glo. Il knockdown di Mcl-1 ma non il siRNA di NSC induce l'attività della caspasi 3/7 in linee cellulari dipendenti, ma non indipendenti, dopo 24 ore. ( c ) L'espressione di Bcl-xL è stata messa a tacere da siRNA. Due linee sono sensibili con una riduzione> 60% della proliferazione. Al contrario, silenziando due volte l'espressione Mcl-1 e Bcl-xL ( d ) riduce la vitalità nella maggior parte delle linee. I valori sono la media di almeno tre esperimenti indipendenti (barre di errore SD)

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Al contrario, il silenziamento del siRNA dell'espressione di Bcl-xL ha avuto solo un modesto effetto sulla vitalità per la maggior parte delle linee cellulari testate (Figura 1c). Solo 2 delle 17 linee si qualificano come sensibili ai nostri criteri, uno dei quali è anche sensibile al silenziamento Mcl-1 (HCC1395). Questi dati suggeriscono che a differenza di Mcl-1, poche di queste linee TNBC dipendono esclusivamente da Bcl-xL per la sopravvivenza.

È facile immaginare che alcune linee cellulari di TNBC possano bloccare l'apoptosi attraverso la protezione da due o più membri della famiglia Bcl-2 pro-sopravvivenza. Per testare questo, abbiamo messo a tacere l'espressione delle proteine ​​Mcl-1 e Bcl-xL con il trattamento con siRNA simultaneo. Il knockdown di entrambe le proteine ​​provoca una morte cellulare significativamente maggiore attraverso il pannello TNBC rispetto al knockdown di entrambe le proteine ​​(Figura 1d), incluso per le linee cellulari insensibili al knockdown Mcl-1.

La profilazione BH3 conferma la dipendenza specifica da Mcl-1 per la sopravvivenza

La profilazione di BH3 è stata utilizzata per prevedere la sensibilità delle linee cellulari e delle cellule tumorali ematologiche derivate dal paziente agli inibitori della famiglia Bcl-2 e per definire la dipendenza da specifici membri della famiglia. 34, 35 Questo dosaggio quantifica la depolarizzazione mitocondriale dopo la somministrazione di un peptide derivato da BH3 in cellule intere permeabilizzate con digitonina. Questi peptidi hanno differenti specificità di legame con i membri della famiglia Bcl-2, il che consente una dissezione sofisticata dei singoli contributi di queste proteine ​​per prevenire l'apoptosi.

Abbiamo eseguito la profilazione BH3 su un sottoinsieme del nostro pannello TNBC per chiarire ulteriormente il ruolo protettivo dei singoli membri della famiglia Bcl-2 anti-apoptotici. Il trattamento con 10 μ M dell'antagonista della famiglia pan-Bcl-2 altamente potente e il peptide Bim-BH3 depolarizzato i mitocondri in tutte le linee cellulari testate (Figura 2a), verificando che siano sensibili all'antagonismo mediato da BH3. Al contrario, il trattamento con il peptide specifico per Mcl-1 MS-1 (Figura 2b) 36 a mitocondri depolarizzati 100 μ M solo nelle linee cellulari dipendenti da Mcl-1. Le diverse concentrazioni vengono utilizzate per riflettere la minore attività dell'MS-1 e sono coerenti con le concentrazioni precedenti utilizzate per questo peptide e altri in letteratura. 36 Il peptide Bad-BH3, che antagonizza Bcl-2 e Bcl-w oltre a Bcl-xL, mitocondri depolarizzati in misura minore rispetto al peptide MS-1, che concorda anche con il siRNA Bcl-xL sopra (Figura 2c). Da notare la risposta più alta del previsto a Bad-BH3 nelle cellule MDA-MB-231, sebbene ciò sia forse spiegato dall'ampia attività di Bad-BH3 per antagonizzare anche altri membri della famiglia Bcl-2.

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La profilazione BH3 conferma lo stato di dipendenza Mcl-1. ( a ) Il trattamento a cellule intere con peptide Bim-BH3 da 10 μ M, un antagonista non specifico della famiglia Bcl-2 pro-sopravvivenza, ha indotto la depolarizzazione dei mitocondri in tutte le linee cellulari testate. ( b ) Al contrario, l'antagonista specifico per Mcl-1 MS-1 a 100 μ M mitocondri selettivamente depolarizzati solo nelle linee cellulari dipendenti da Mcl-1. ( c ) Il peptide Bad-BH3, che antagonizza Bcl-2 e Bcl-w in aggiunta a Bcl-xL, mitocondri depolarizzati a 10 μ M fortemente solo nella linea cellulare MDA-MB-231. ( d ) Somministrazione combinata di peptide Bad-BH3 0, 05 μ M con peptide MS-1 come nei mitocondri depolarizzati più fortemente. Sono mostrati la media di almeno tre esperimenti indipendenti (barre di errore SD)

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Infine, abbiamo simulato i nostri doppi risultati di siRNA somministrando contemporaneamente il peptide MS-1 e una dose sub-E10 (50 nM) di Bad-BH3, una concentrazione scelta per dimostrare chiaramente l'effetto sinergico del co-dosaggio. In accordo con i nostri risultati precedenti, la depolarizzazione dei mitocondri è aumentata rispetto al solo peptide MS-1 per le tre linee cellulari indipendenti da Mcl-1 testate. Il cambiamento nella polarizzazione per MDA-MB-453 supera quello previsto dai nostri esperimenti sul doppio siRNA, presumibilmente a causa del profilo di legame espanso di Bad-BH3. Non sorprende che l'aumento della concentrazione del peptide Bad-BH3 a 1 μ M abbia ulteriormente sensibilizzato queste linee cellulari al peptide MS-1 (dati non mostrati).

Il knockdown di Mcl-1 supera la resistenza agli inibitori di piccole molecole Bcl-xL

Poiché le linee cellulari nel nostro pannello TNBC sono in gran parte resistenti al silenziamento di Bcl-xL, abbiamo pensato che queste linee potrebbero anche essere resistenti all'inibitore di piccole molecole specifico di Bcl-xL WEHI-539, 37 e che co-dosando con knockdown Mcl-1 può ridurre sinergicamente la redditività. Per verificare questa ipotesi, abbiamo misurato la fattibilità IC 50 per WEHI-539 durante il trattamento concomitante da NSC o siRNA Mcl-1 (Figura 3a). I valori di IC 50 per le cellule trattate con NSC sono nel range micromolare basso, indicando che queste cellule non sono altamente sensibili in base alla potenza osservata per altri inibitori della famiglia Bcl-2. 38 Tuttavia, in combinazione con il knockdown Mcl-1, la potenza composta migliora notevolmente attraverso il pannello, come il miglioramento di 15 volte per le cellule MDA-MB-157 (Figura 3b). Successivamente abbiamo testato se Bcl-2 è un importante fattore di sopravvivenza ripetendo l'esperimento di cui sopra usando l'inibitore specifico di Bcl-2 ABT-199. 39 Le cellule erano insensibili al composto da solo o in combinazione con siRNA Mcl-1 (Figure 3c ed d). Infine, abbiamo ripetuto questo esperimento con ABT-263, un doppio inibitore Bcl-2 e Bcl-xL (Figura 3c). 30 Come visto con WEHI-539, le cellule erano ampiamente resistenti al solo composto ma erano estremamente sensibili alla combinazione con il silenziamento Mcl-1 (Figure 3e e f). In sintesi, gli inibitori Bcl-xL ABT-263 e WEHI-539, ma non l'inibitore selettivo Bcl-2 ABT-199, hanno un effetto additivo con knockdown Mcl-1 per ridurre la vitalità cellulare in queste linee cellulari.

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Inibitori di Bcl-2 e Bcl-xL in combinazione con il silenziamento di Mcl-1. Le cellule sono state trattate con siRNA NSC o Mcl-1, quindi dosate con composto per misurare IC 50 . ( a ) L'IC 50 osservato dell'inibitore selettivo di Bcl-xL WEHI-539 è ridotto marcatamente attraverso il pannello quando Mcl-1 viene eliminato rispetto al controllo NSC. ( b ) Curve rappresentative dose-risposta in cellule MDA-MB-157 trattate con WEHI-539. Al contrario, le cellule sono rimaste resistenti all'ABT-199 (un inibitore selettivo Bcl-2) indipendentemente dal knockdown Mcl-1 attraverso il pannello ( c ) ed esemplificato nelle cellule MDA-MB-157 ( d ). ( e ) Le linee cellulari sono anche resistenti alla doppia inibizione di Bcl-xL e Bcl-2 da parte dell'inibitore ABT-263 quando somministrato con siRNA NSC, ma co-dosando ABT-263 con siRNA Mcl-1 diminuisce il composto IC 50 simile a quello osservato con WEHI-539. Le curve rappresentative per MDA-MB-157 sono mostrate in f . Sono mostrati la media di almeno due esperimenti indipendenti (barre di errore SEM)

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I livelli di mRNA o proteine ​​del membro della famiglia Bcl-2 non predicono la sensibilità Mcl-1

I nostri esperimenti di profilassi siRNA, trattamento composto ed BH3 suggeriscono tutti un ruolo critico per Mcl-1 per proteggere un sottoinsieme di linee TNBC dall'apoptosi. Tuttavia, non era chiaro il motivo per cui alcune (ma non tutte) le linee dipendessero da Mcl-1 per la sopravvivenza. Non abbiamo trovato alcuna correlazione tra espressione di mRNA e vitalità cellulare in queste linee TNBC per i membri della famiglia Bcl-2 Mcl-1, Bcl-xl, Noxa, Bim, Bax, Bak e Bax (Figura supplementare S4). Poiché l'espressione delle proteine ​​allo stato stazionario può variare in modo significativo dai livelli di mRNA, abbiamo ulteriormente profilato ogni linea cellulare mediante western blot (Figura 4). Come previsto, l'espressione differiva tra le linee cellulari, in particolare i livelli delle proteine ​​solo BH3 Noxa e Bim e le proteine ​​anti-apoptotiche Bcl-2, Mcl-1 e Bcl-xL. Non abbiamo trovato alcuna correlazione significativa tra la sensibilità Mcl-1 e l'espressione proteica per Mcl-1, Bcl-xL e Bcl-2 anti-apoptotici (figure 5a ec), né per l'espressione delle proteine ​​solo BH3 Bim e Noxa (figure 5d ed e). Espressione delle proteine ​​boia pro-apoptotiche Bak e Bax debolmente correlate con la dipendenza da Mcl-1, con R 2 rispettivamente di 0, 35 e 0, 44 ( P <0, 05) (Figure 5f e g). Insieme, l'espressione delle singole proteine ​​nella migliore delle ipotesi è solo debolmente correlata alla dipendenza da Mcl-1.

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Livelli di espressione proteica della famiglia Bcl-2 nel pannello della linea cellulare TNBC. Una quantità uguale (18 μ g) di lisato cellulare è stata analizzata mediante western blot e sondata per la proteina indicata, con tubulina come controllo del carico

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L'espressione individuale delle proteine ​​della famiglia Bcl-2 non è fortemente correlata alla sensibilità Mcl-1. ( a - e ) I livelli di espressione proteica normalizzati con tubulina per Mcl-1, Bcl-xL, Bcl-2, Noxa e Bim non sono significativamente correlati alla vitalità cellulare dopo il knockdown di Mcl-1. ( f - g ) L'espressione della proteina della famiglia Bcl-2 del boia Bak e Bax è correlata alla sensibilità Mcl-1 con un R 2 di 0, 34 e 0, 44, rispettivamente ( P <0, 05)

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Un indice combinato delle proteine ​​della famiglia Bcl-2 predice meglio la dipendenza da Mcl-1

Mentre le proteine ​​Bcl-2 lavorano in concerto per regolare l'apoptosi, un approccio più olistico per prevedere la dipendenza da sopravvivenza da Mcl-1 dovrebbe includere livelli multipli di espressione proteica. Usando una regressione lineare multipla (1) dove y è la vitalità cellulare dopo il knockdown Mcl-1 e [proteina] è l'espressione proteica normalizzata alla tubulina dall'analisi western blot, abbiamo usato un adattamento dei minimi quadrati dell'equazione 1 per ottenere la costante fattori b e m 1-5 . Mcl-1 e Bcl-xL sono stati inclusi a causa del loro ruolo nella protezione singola o doppia della cellula dall'apoptosi, come si vede nelle Figure 1 e 2. Bak è stato scelto a causa della sua funzione meccanicistica per depolarizzare i mitocondri dopo Mcl-1 e Bcl- xL sono antagonizzati e la sua significativa correlazione con la sensibilità Mcl-1 nella Figura 5. Bim e Noxa sono rispettivamente importanti proteine ​​antagonizzanti solo per BH3 generali e specifiche per Mcl-1.

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Usando questa equazione, abbiamo previsto la sensibilità Mcl-1 per ogni linea cellulare e la abbiamo tracciata rispetto alla vitalità determinata sperimentalmente (Figura 6a). L'adattamento risultante ha un R 2 di 0, 71 ( P <0, 001). Per identificare l'importanza relativa di ciascuna proteina nell'equazione, abbiamo ricalcolato rimuovendo singolarmente ciascun fattore (Figure supplementari S5 AE). La rimozione di Bak ha avuto l'effetto maggiore su R 2, seguito rispettivamente da Bcl-xL, Bim, Mcl-1 e Noxa, il che è coerente con la nostra regressione a linea singola che mostra Bak come il più forte predittore individuale di sensibilità tra queste cinque proteine. Abbiamo ulteriormente testato questa equazione sostituendo il contributore meno significativo (Noxa) con Bcl-2, ma la qualità dell'adattamento è diminuita (Figura supplementare S5F).

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Un indice combinato di più proteine ​​della famiglia Bcl-2 prevede la sensibilità al knockdown Mcl-1. ( a ) Una regressione lineare multipla è stata utilizzata per adattarsi all'espressione delle proteine ​​Mcl-1, Bcl-xL, Bim, Bak e Noxa per prevedere la vitalità cellulare dopo il knockdown di Mcl-1; l'adattamento viene tracciato rispetto alla vitalità sperimentale e viene tracciata una linea di regressione lineare con adattamento dei minimi quadrati ( R 2 = 0, 71, P <0, 0001). ( b ) L'uso dei valori di espressione dell'mRNA determina un adattamento complessivo più debole, ma comunque significativo ( R 2 = 0, 54, P <0, 001). ( c ) Usando questo indice derivato dall'mRNA, abbiamo previsto la sensibilità Mcl-1 in un pannello di nove linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule e confrontato quei numeri con la vitalità determinata sperimentalmente dopo aver silenziato l'espressione di Mcl-1. ( d ) Raggruppare le linee cellulari per sottotipo indica che il Basale A è significativamente correlato alla sensibilità Mcl-1, mentre le linee cellulari sottotipo Basale B sono insensibili al Mcl-1 (test t a due code, P <0, 0004, barre di errore SD)

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I coefficienti dipendono dall'importanza della proteina per prevedere la vitalità e dall'intensità della banda Western Blot quantificata (ad esempio, le bande Noxa a bassa intensità producono un coefficiente elevato). Pertanto, questa equazione dipende fortemente dalla colorazione uniforme della banda tra gli esperimenti e richiede un controllo del carico per standardizzare i risultati ottenuti in condizioni diverse. L'espressione di mRNA normalizzata è un'altra metrica che viene spesso utilizzata come surrogato dell'espressione proteica ed è disponibile per un gran numero di linee cellulari tumorali in database pubblici (come il CCLE), consentendo una rapida identificazione di linee cellulari potenzialmente più sensibili per ulteriori studi. Abbiamo testato se i livelli di mRNA prevedevano la sensibilità della linea cellulare (Figura 6b). Sebbene la bontà di adattamento e la pendenza siano entrambe diminuite, l' R 2 complessiva era significativa a 0, 54 ( P <0, 001) (equazione 3).

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Successivamente abbiamo testato se i coefficienti derivati ​​dalle linee cellulari TNBC avrebbero valore predittivo in altri tipi di cancro. Abbiamo messo a tacere l'espressione di Mcl-1 in un pannello di linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule e confrontato la loro vitalità sperimentale con previsioni basate sull'equazione 3. L'equazione ha previsto correttamente la dipendenza di sette dei nove testati, tra cui l'identificazione di H23 e HCC78 come molto sensibile e H358 e H727 come insensibili (Figura 6c). L'equazione ha erroneamente classificato due linee cellulari come sensibili che i dati di siRNA hanno rivelato come insensibili.

Infine, abbiamo esaminato se le linee cellulari sensibili a Mcl-1 si separano in un particolare sottotipo di TNBC. A conferma di un precedente rapporto, 23 abbiamo trovato che la sensibilità Mcl-1 è correlata al sottotipo TNBC basale A come definito da Neve et al., 40 mentre il sottotipo basale B è resistente (Figura 6d).

Discussione

Le cellule cancerose spesso si proteggono dalla morte cellulare programmata sovraregolando i membri anti-apoptotici della famiglia proteica Bcl-2 o, al contrario, riducendo l'espressione dei membri della famiglia pro-morte. La rimozione farmacologica di questo blocco apoptotico può ripristinare l'apoptosi e fornisce un utile approccio terapeutico per il trattamento dei tumori. 38 Le proteine ​​responsabili della protezione apoptotica possono differire per singoli tumori e linee cellulari e avere importanti implicazioni nella scelta del trattamento. In questo studio, abbiamo scoperto che una frazione significativa delle linee cellulari TNBC (41%) dipendono da Mcl-1 per la sopravvivenza, come evidenziato dalla marcata riduzione della vitalità dopo abbattimento delle proteine ​​Mcl-1, attivazione della caspasi 3/7, colorazione dell'allegato V e depolarizzazione mitocondriale da un peptide specifico per Mcl-1. Al contrario, il silenziamento di Bcl-xL ha avuto solo un modesto effetto nelle linee cellulari TNBC esaminate. Sorprendentemente, il co-silenziamento ha prodotto entrambi un aumento significativo della morte cellulare e una riduzione della vitalità nella maggior parte delle linee cellulari, anche quelle che erano resistenti al silenziamento di entrambe le proteine ​​individualmente.

Coerentemente con questi risultati, l'inibitore di Bcl-xL WEHI-539 era in gran parte inefficace se usato da solo contro le linee di cellule TNBC, ma ha potenzialmente ucciso le cellule in combinazione con il knockdown Mcl-1. Allo stesso modo, il doppio inibitore di Bcl-2 e Bcl-xL ABT-263 era solo leggermente citotossico quando usato da solo, indicando che l'inibizione combinata di Bcl-2 e Bcl-xL non riduce la vitalità, ma in combinazione con il silenziamento Mcl-1 è fortemente citotossico . Questi risultati suggeriscono che l'inibizione di Mcl-1 nel TNBC potrebbe re-sensibilizzare i tumori a seguito della resistenza acquisita alla chemioterapia terapeutica della famiglia Bcl-2, come si osserva in altri tipi di cancro. 26, 27, 41

Successivamente abbiamo cercato di capire perché alcune linee cellulari (ma non tutte) rispondessero al knockdown di Mcl-1. Ogni linea cellulare in questo pannello TNBC esprime le proteine ​​del boia Bak, Bax e solo proteine ​​BH3, ei loro mitocondri si depolarizzano in risposta a Bim. Questi dati suggeriscono che il blocco apoptotico della via intrinseca è dovuto all'antagonismo da parte di alti livelli di proteine ​​anti-apoptotiche (ad esempio, Mcl-1, Bcl-xL, ecc.). 42 Sebbene esistano percorsi alternativi per bloccare l'apoptosi senza influire sulle proteine ​​della famiglia Bcl-2 sul mitocondrio (come ad esempio sovraregolando gli inibitori delle proteine ​​dell'apoptosi o bloccando l'attivazione delle proteine ​​solo BH3), la sensibilità della maggior parte delle linee cellulari al singolo Mcl-1, o l'abbattimento combinato di Mcl-1 e Bcl-xL, suggerisce che questi altri meccanismi sono sottoutilizzati. Abbiamo osservato livelli elevati (sebbene vari) di Mcl-1 e Bcl-xL e bassi livelli di espressione proteica di Bcl-2 attraverso il pannello della linea cellulare TNBC. Sebbene l'espressione di una particolare proteina anti-apoptotica non indichi necessariamente che una cellula dipenda da essa per la sopravvivenza, 13, 14 un'espressione significativa è probabilmente un prerequisito necessario affinché la proteina sia un importante sensore degli stimoli della morte cellulare e quindi un obiettivo praticabile per manipolazione terapeutica. In effetti, tutte le linee cellulari Mcl-1, Bcl-xL o doppiamente sensibili esprimevano le proteine ​​necessarie. Inoltre, i livelli di proteina Bak e Bax in modo significativo (seppur debolmente) erano correlati con una ridotta vitalità dopo il knockdown Mcl-1, indicando la loro importanza centrale per eseguire la depolarizzazione mitocondriale quando viene rimosso l'antagonismo della famiglia Bcl-2 anti-apoptotica.

Le cellule tumorali differiscono non solo nei livelli di espressione assoluta delle proteine ​​anti-apoptotiche, ma anche nella loro estensione di attivazione delle proteine ​​pro-apoptotiche. Una linea cellulare o tumore con una maggiore attivazione pro-apoptotica è più "preparata per la morte" e richiederà più proteine ​​anti-apoptotiche per sopravvivere. 42 Pertanto, non sorprende che non sia stata osservata alcuna correlazione tra la proteina Mcl-1 o l'mRNA e la dipendenza da Mcl-1 poiché questi non sono in grado di spiegare le differenze nel potenziale pro-apoptotico cellulare. Allo stesso modo, l'estensione delle proteine ​​anti-apoptotiche non legate è anche un criterio importante per prevedere la dipendenza. Oltre il 40% delle linee testate ha risposto al knockdown di Mcl-1 da solo, ma la maggior parte delle linee insensibili hanno richiesto il knockdown combinato di Mcl-1 e Bcl-xL per morire, suggerendo che queste linee esprimono ulteriori proteine ​​anti-apoptotiche sufficienti a sequestrare qualsiasi pro rilasciato fattori apoptotici dopo perdita di Mcl-1. 14

È interessante notare che il knockdown di Bcl-xL da solo ha avuto un effetto relativamente scarso rispetto al knockdown di Mcl-1. Sebbene le due proteine ​​abbiano specificità uniche per le proteine ​​solo BH3 (ad esempio, Mcl-1 può legare Noxa ma Bcl-xL può legare Bad), i loro meccanismi anti-apoptotici complessivi sono simili. Questa discrepanza è stata osservata anche in altri tipi di cancro, tra cui la leucemia mieloide acuta 43 e carcinoma mammario ER-positivo. 12 Il peptide Bad-BH3, che antagonizza Bcl-2, Bcl-w e Bcl-xL, mitocondri depolarizzati in misura minore rispetto al peptide specifico per Mcl-1. Ciò suggerisce che in queste linee cellulari il pool di Bcl-2, Bcl-w e Bcl-xL contribuisce marginalmente rispetto a Mcl-1 nella protezione contro l'induzione apoptotica. Forse Mcl-1 sequestra più attivamente le proteine ​​pro-apoptotiche, con la maggior parte di Bcl-xL impedito di bloccare l'apoptosi mediante localizzazione o inattivazione.

Come risultato di queste complicazioni, non siamo sorpresi di trovare diversi indici multiproteici precedentemente pubblicati per prevedere la risposta agli inibitori della famiglia Bcl-2. 17, 44 I nostri dati suggeriscono che un'ulteriore metrica per prevedere la dipendenza da una particolare proteina anti-apoptotica prenderà in considerazione le quantità relative di entrambe le proteine ​​pro e anti-apoptotiche. Abbiamo scoperto che un indice di cinque proteine ​​(Mcl-1, Bcl-xL, Bim, Bak e Noxa) potrebbe predire altamente la sensibilità Mcl-1 con un R 2 di 0, 71. Poiché queste previsioni erano basate su esperimenti in vitro , le loro prestazioni in vivo con fattori complicanti come lo stroma e il microambiente associato meritano ulteriori studi.

Includere Bcl-2 nell'indice non ha migliorato le nostre previsioni di fattibilità in TNBC. Le linee cellulari TNBC testate erano resistenti all'inibitore specifico di Bcl-2 ABT-199 da solo o in combinazione con il silenziamento di Mcl-1, il che suggerisce che Bcl-2 fornisce poca protezione anti-apoptotica in queste linee cellulari. Tuttavia, includendo Bcl-2 può rendere l'equazione più ampiamente applicabile ad altri tipi di cancro che si basano fortemente su Bcl-2 per proteggere dall'apoptosi durante la perdita di Mcl-1.

I nostri risultati suggeriscono che un mimetico BH3 in grado di inibire le interazioni Mcl-1 può rivelarsi efficace come singolo agente terapeutico in alcuni tumori TNBC; mentre l'inibizione da parte di singoli agenti di Bcl-2 o Bcl-xL può essere ampiamente inefficace. In altri tumori del TNBC, può essere necessaria una terapia di associazione. La correlazione altamente significativa dello stato del sottotipo Basale A alla dipendenza da Mcl-1 in queste linee cellulari dovrebbe essere ulteriormente studiata usando campioni derivati ​​dal paziente e potrebbe rivelarsi un biomarcatore efficace per la selezione clinica del paziente con carcinoma mammario. In altri tipi di cancro, un'analisi dei livelli di proteine ​​o mRNA dei membri della famiglia Bcl-2 (ad esempio, Mcl-1, Bcl-xL, Bak e Bim) può essere utile in un'espressione multifattoriale come mostrato qui per prevedere meccanicamente quale è probabile che i tumori rispondano a un inibitore di Mcl-1 attraverso diversi tipi di tumore.

Materiali e metodi

Linee cellulari e condizioni di coltura

Le linee cellulari sono state ottenute dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ad eccezione di Cal148 (ottenuto Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germania) e Sum149PT (ottenuto da Asterand, Detroit, MI, USA). Le cellule sono state coltivate in terreni raccomandati.

Knockdown proteico e vitalità cellulare

L'espressione proteica è stata messa a tacere usando siRNA. Motivi On-targetPLUS specifici per 3'-UTR o ORF per Mcl-1 e Bcl-xL sono stati ottenuti da Dharmacon (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Cells were plated in antibiotic-free medium at 5000 cells per well in a 96-well plate. After 24 h, medium was replaced with siRNA-containing medium consisting of 0.01% Dharmafect I transfection reagent and 25 nM siRNA sequence specific to the target or NSC motif. Control wells received normal media. Cell viability was measured after 5 days using Cell Titer-Glo (Promega, Fitchburg, WI, USA), a fluorescent assay that produces signal corresponding to ATP concentration (a proxy for cell count). Signal was measured on the Spectramax M5 plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) averaged over five replicate wells. Conditions were optimized such that cell viability was reduced by the NSC siRNA by no >30%, and protein knockdown was verified by western blot analysis using lysates collected at the conclusion of the experiment.

Citometria a flusso

Cells were plated in a six-well dish at 100 000 cells per well. Non-silencing or Mcl-1 siRNA were dosed for 24 h before collection and staining with fluorescein isothiocyanate conjugates of annexin V and propidium iodide (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) and analyzed on a 5 Laser LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Western blotting

Cell lysates were collected in RIPA buffer. Equal amount of lysate (18 μ g) was boiled in SDS protein loading buffer supplemented with 10 mM DTT, separated by SDS-PAGE, transferred to Immobilon-FL PVDF membrane (Millipore, Billerica, MA, USA), and blotted for indicated protein. Antibodies for Mcl-1 (Y37), Bcl-xL (E18) obtained from Abcam (Cambridge, UK); Bcl-2 (50E3), Bak and Bax from Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA); Bim (H-191) and Bad (C-7) from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA); Noxa and α -tubulin (DM1A) from Millipore. Each was used at a 1 : 1000 dilution. Blots were probed with species-appropriate IRDye-conjugated secondary antibodies (Licor, Lincoln, NE, USA) at 1 : 20 000 dilution and measured on the Licor Odyssey system. Quantification performed on the Licor Image Studio.

BH3 profiling

Synthetic peptides were ordered from Genscript (Piscataway, NJ, USA). Sequences are as previously described for MS-1, 26 Bim-BH3 and Bad-BH3. 27 BH3 profiling was conducted and analyzed as described. 27 Fluorescence was measured on a Biotek Cytation 3 (Winooski, VT, USA) after 1.5 h. DMSO control was used for zero depolarization, and FCCP at 20 μ M was used for 100% depolarization. Normalized percent polarization is calculated as (Sample–FCCP)/(DMSO–FCCP).

Compound studies

Cells were plated in antibiotic-free medium to a final count of 1000 cells per well in a 96-well plate and left for 24 h. NSC or Mcl-1 siRNA were added as described above. After 2 days, compounds ABT-263, ABT-199 or WEHI-539 (SelleckChem, Houston, TX, USA) were added in 10-point, threefold serial dilutions to a final DMSO concentration of 0.5%. Cell viability was quantified on day 5 by Cell Titer-Glo (Promega, Madison, WI, USA) and read on the Spectramax M5 plate reader (Molecular Devices). Results shown are the average of two or more independent experiments.

mRNA expression data

Robust multi-array average-normalized mRNA expression data for each cell line (excluding Sum149, for which data were not available) was obtained from the Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), available at //www.broadinstitute.org/ccle.

Analisi di regressione

Linear regression and statistical analysis was performed in Prism (Graphpad Software, La Jolla, CA, USA). Multiple linear regression was performed using the LINEST function in Microsoft Excel 2010 (Redmond, WA, USA).

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Glossario

Mcl-1

myeloid cell leukemia-2

TNBC

triple-negative breast cancer

ER

recettore degli estrogeni

PR

progesterone receptor

HER2

human epidermal growth factor receptor-2

Bcl-2

CLL / linfoma a cellule B 2

Bcl-xL

Bcl-2-like protein 1 isoform 1

BH3

Bcl-2 homology domain 3

siRNA

small-interfering RNA

NSC

non-silencing control oligonucleotides

CCLE

Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia.

Informazioni supplementari accompagna questo articolo sul sito Web di Cell Death and Differentiation (//www.nature.com/cdd)