Nbn fosforilazione regola l'accumulo di mrn e atm nei siti di rotture del doppio filamento del dna | oncogene

Nbn fosforilazione regola l'accumulo di mrn e atm nei siti di rotture del doppio filamento del dna | oncogene

Anonim

Soggetti

  • Segnalazione cellulare
  • Punti di controllo del danno al DNA
  • Rotture del DNA a doppio filamento

Astratto

In risposta alle radiazioni ionizzanti, il complesso MRE11 / RAD50 / NBN si ridistribuisce ai siti delle rotture del doppio filamento di DNA (DSB) in cui ciascuno dei suoi singoli componenti è fosforilato dalla serina-treonina chinasi, ATM. La fosforilazione ATM di NBN è necessaria per l'attivazione del checkpoint in fase S, ma il meccanismo per cui questi eventi di fosforilazione segnalano che la macchina del checkpoint rimane inspiegabile. Qui, descriviamo l'uso della trasduzione diretta delle proteine ​​dell'endonucleasi di riferimento, I- Ppo I, nelle cellule umane per generare DSB specifici del sito. La trasduzione diretta della proteina I- Ppo I determina un rapido accumulo e turnover dell'endonucleasi nelle cellule vive, facilitando il confronto tra più linee cellulari. Dimostriamo l'utilità di questo sistema introducendo I- Ppo I nelle linee cellulari isogeniche che trasportano mutazioni nei siti di fosforilazione ATM in NBN e testando gli effetti di queste mutazioni sulla distribuzione spaziale e l'accumulo temporale di NBN e ATM nei DSB mediante immunoprecipitazione della cromatina, così come i tempi e l'estensione della riparazione DSB. Sebbene la distribuzione spaziale di NBN e ATM reclutati nei siti di DSB fosse comparabile tra le cellule di controllo e quelle che esprimono mutanti di fosforilazione di NBN, i tempi di accumulo di NBN e ATM sono stati modificati. Le mutazioni da serina ad alanina che hanno bloccato la fosforilazione hanno comportato un ritardo nel reclutamento di NBN e ATM nei DSB. Le sostituzioni di acido serino-glutammico che imitavano l'evento di fosforilazione hanno comportato un aumento e un prolungamento dell'accumulo di NBN e ATM presso i DSB. La riparazione di DSB in cellule prive di NBN a lunghezza intera è stata significativamente ritardata rispetto alle cellule di controllo, mentre il blocco della fosforilazione di NBN ha comportato un ritardo più modesto nella riparazione. Questi dati indicano che a seguito dell'induzione di DSB, la fosforilazione di NBN regola il suo accumulo, e quello di ATM, in siti di DNA DSB, nonché i tempi della riparazione di questi siti.

introduzione

La sindrome da rottura di Nijmegen (NBS) è una rara malattia autosomica recessiva caratterizzata da ritardo della crescita, microcefalia, immunodeficienza e elevata incidenza di cancro. 1, 2, 3 NBS risulta da mutazioni ipomorfe bialleliche nel gene NBN , che codifica per la proteina 754 degli aminoacidi, la Nibrina. 3, 4, 5 La maggior parte dei pazienti con NBS presenta mutazioni troncanti in entrambi gli alleli del gene NBN . Di conseguenza, le loro cellule non riescono a produrre NBN a tutta lunghezza rilevabile, ma possono produrre quantità variabili di frammenti troncati dalle estremità terminali amminiche e carbossiliche della proteina. 6, 7 In vitro , le cellule di pazienti NBS mostrano una sopravvivenza compromessa e l'incapacità di attivare il checkpoint in fase S dopo l'esposizione ad agenti, come le radiazioni ionizzanti, che generano rotture del DNA a doppio filamento (DSB). 8, 9 Questi fenotipi sono anche osservati nelle cellule di pazienti con atassia-teleangectasia (A-T), che deriva da mutazioni deletere nell'ATM serina-treonina chinasi. 10

NBN si associa costitutivamente alle proteine ​​MRE11 e RAD50 per formare il complesso MRE11 / RAD50 / NBN (MRN). 4, 11 Knockouts di uno qualsiasi dei componenti del complesso MRN nei topi portano alla letalità embrionale precoce, 12, 13, 14 che riflette il ruolo essenziale di questo complesso nella replicazione del DNA. Sebbene MRE11 e RAD50 abbiano ruoli enzimatici predominanti nel complesso, NBN ha un ruolo principalmente regolatorio, orientando la localizzazione nucleare del complesso, la ridistribuzione del complesso ai DSB in seguito all'esposizione ad agenti dannosi per il DNA e stimolando le attività dell'altro componenti. 15, 16, 17, 18, 19 Il complesso MRN si associa a DSB del DNA in pochi minuti dopo la loro formazione, 20, 21 e contribuisce al reclutamento di ATM in DSB del DNA attraverso l'interazione diretta proteina-proteina tra ATM e l'estremità C-terminale di NBN . 22, 23

L'ATM si attiva in presenza di DNA DSB e fosforilati un gran numero di substrati, alcuni dei quali, simili ai componenti del complesso MRN, si accumulano nei siti dei DSB. 24, 25, 26, 27, 28 ATM fosforilati NBN su ben tre residui di serina (posizioni 278, 343 e 397) in risposta al danno al DNA. 29, 30, 31, 32 Le sostituzioni di alanina in una di queste posizioni abrogano parzialmente il checkpoint del ciclo cellulare in fase S, risultando in un fenotipo di sintesi di DNA radio-resistente. 33 Tuttavia, il meccanismo preciso con cui la fosforilazione in questi siti segnala alla macchina del checkpoint rimane sconosciuto.

In questo studio, utilizziamo I- Ppo I, un'endonucleasi di riferimento eucariotico, per creare DSB del DNA in siti endogeni definiti in linee cellulari isogeniche portanti mutazioni diverse nei siti di fosforilazione in NBN, permettendoci di tracciare e confrontare il reclutamento e la perdita di proteine ​​a o intorno a queste interruzioni per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), monitorando anche la riparazione dei DSB tramite PCR quantitativa. I nostri dati indicano che la fosforilazione di NBN regola la stabilizzazione e / o l'accumulo di NBN o ATM nei siti di DSB, nonché i tempi di riparazione in questi siti.

risultati

I- Ppo I purificato può essere efficacemente distribuito alle cellule mediante trasduzione di proteine

Berkovich et al. 34 ha precedentemente descritto una linea cellulare umana progettata per esprimere una versione regolata da tamoxifene di I- Ppo I che consente l'induzione di DSB del DNA in siti I- Ppo I sui cromosomi 1 e 8 e la caratterizzazione della risposta al danno del DNA in questi siti da parte del ChIP. Per facilitare il confronto della risposta I- Ppo I su più linee cellulari e limitare la lunghezza dell'esposizione delle cellule alla nucleasi, abbiamo sviluppato un approccio di trasduzione proteica per l'espressione di I- Ppo I nelle cellule umane utilizzando peptidi penetranti nelle cellule (CPP). 35, 36 CPP hanno dimostrato di fornire una vasta gamma di carichi diversi, tra cui proteine, farmaci, acidi nucleici e reagenti per imaging a una vasta gamma di tipi di cellule con efficienza generalmente elevata, consentendo potenzialmente l'applicazione di I -Ppo I a una varietà di diverse linee cellulari. Un gene che codifica per I- Ppo I è stato sintetizzato chimicamente, clonato e il suo prodotto proteico è stato purificato per affinità da Escherichia coli (Figura 1a). L'incubazione notturna di I- Ppo I purificato con un plasmide linearizzato contenente la sequenza di riconoscimento I- Ppo I a 15 bp ha confermato l'attività e la specificità dell'enzima e l'assenza di altre attività significative di endonucleasi (Figura 1b). La CPP che incorpora un segnale di localizzazione nucleare è stata quindi utilizzata per introdurre l'I- Ppo I purificato in una linea cellulare di fibroblasti trasformati in SV40 da un paziente NBS (cellule NBS-ILB1) 37 stabilmente trasfettati con il gene NBN wild-type (ILB1- [ NBN]), NBN con sostituzioni di alanina nelle celle S278 e S343 (ILB1- [NBN-S> A]) o nel vettore retrovirale vuoto (cellule ILB1). La proteina I- Ppo I del peso molecolare atteso è stata rilevata in ciascuna di queste linee cellulari già 1 h dopo la trasduzione (Figura 1c) e localizzata prevalentemente sul nucleo in tutti i punti testati (Figura 1d). Non sono state osservate differenze significative tra le linee cellulari nell'assorbimento o nella successiva perdita di I- Ppo I da parte della macchia occidentale.

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Purificazione e trasduzione della proteina I- Ppo I in cellule umane. ( a ) La proteina I- Ppo I purificata da E. coli è stata rilevata mediante colorazione di Coomassie. ( b ) pcDNA3.1 contenente un sito I- Ppo I sintetico è stato linearizzato dalla digestione Pvu I e incubato con entrambe le proteine ​​di controllo (Con) (prodotte da pET45b (+) cellule vuote trasformate con vettore) o con proteine ​​I- Ppo I purificate a 37 ° C durante la notte. I prodotti sono stati separati su gel di agarosio. ( c ) Le cellule ILB1, ILB1- [NBN] o ILB1- [NBN-S> A] sono state trasdotte con proteina I- Ppo I purificata complessata con CPP. Le cellule sono state raccolte a 0, 1, 2, 3 e 5 ore dopo la trasduzione. Il lisato proteico totale è stato separato su un gel Bis-Tris con gradiente del 4-12%, trasferito sulla membrana di trasferimento immobilon-P e immunoblottato con un anticorpo monoclonale anti-His e un anticorpo monoclonale anti-tubulina, rispettivamente. ( d ) Le cellule ILB1- [NBN] sono state trasdotte con proteina I- Ppo I purificata complessata con CPP. Le cellule sono state raccolte a 0, 1, 3 e 5 ore dopo la trasduzione. Le frazioni citoplasmatiche e nucleari sono state preparate e separate su un gel Bis – Tris con gradiente del 4-12%, trasferite sulla membrana di trasferimento immobilon-P e immunoblotate con anticorpo anti-His, anti-Hsp90 (come controllo citoplasmatico) e anti-p84 (come un controllo nucleare).

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I- Ppo I trasdotto induce la scissione del DNA specifica del sito in vivo

Una ricerca BLAST della sequenza di riferimento del genoma umano (hg19) ha identificato 10 siti di identità di sequenza nel sito di restrizione I- Ppo I. Oltre ai siti precedentemente riportati sul cromosoma 1 all'interno del gene DAB1 e sul cromosoma 8 all'interno del cluster di DNA ribosomiale, sono stati identificati 34 siti sul cromosoma 1, 2, 3, 7, 11, X, Y e in un segmento non allineato. Per valutare l'attività di I- Ppo I trasdotto, le cellule ILB1- [NBN] sono state trasdotte con I- Ppo I e la PCR quantitativa è stata eseguita con primer che coprono ciascuno di questi siti di scissione putativa. La resa del prodotto PCR da ciascuno di questi siti in diversi punti temporali dopo la trasduzione è stata confrontata con quella di una sequenza di riferimento che non conteneva un sito I- Ppo I (Figura 2a). In tre esperimenti indipendenti, 8 dei 10 siti hanno mostrato un taglio dopo trasduzione con I- Ppo I, come evidenziato da rese <100%, ma il taglio massimo non ha mai superato il 30% per nessun sito.

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I- Ppo I trasdotto induce la scissione del DNA specifica del sito in vivo . ( a ) Nelle cellule ILB1- [NBN], la resa dei prodotti PCR che coprono ciascuno dei 10 siti I- Ppo I identificati in punti temporali diversi è stata confrontata con quella di una sequenza di riferimento sul cromosoma 1 che non conteneva un I- Ppo I posto. I dati sono stati mediati da tre esperimenti indipendenti e le barre di errore rappresentano la media ± sd ( b ) in ILB1, ILB1- [NBN], ILB1- [NBN-S> A], ILB1- [NBN-S> E] e 411BRneo cellule, resa del prodotto PCR in un singolo sito I- Ppo I nel gene DAB1 sul cromosoma 1 rispetto a una sequenza di riferimento priva di un sito I- Ppo I sullo stesso cromosoma. I dati rappresentano la media ± sd di esperimenti triplicati indipendenti, ciascuno dei quali include due repliche tecniche. ( c ) Nelle cellule BLCL-309 e HEK293T, i campioni di DNA e proteine ​​sono stati raccolti a 0, 1 e 3 ore dopo la trasduzione I- Ppo I. La resa del prodotto PCR in un singolo sito I- Ppo I nel gene DAB1 sul cromosoma 1 è stata confrontata con quella di una sequenza di riferimento sul cromosoma 1 che non conteneva un sito I- Ppo I (pannello inferiore). Le macchie occidentali mostrano una trasduzione proteica efficace e rapida (pannello superiore).

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Un esperimento di corso di tempo più esteso è stato eseguito in un singolo sito utilizzando le celle ILB1, ILB1- [NBN], ILB1- [NBN-S> A], ILB1- [NBN-S> E] e 411BRneo. ILB1- [NBN-S> A], che è stato precedentemente descritto, 38 ha espresso NBN con mutazioni S> A nelle posizioni 278 e 343. ILB1- [NBN-S> E], appena generato per lo studio attuale, ha espresso NBN con Mutazioni S> E nelle posizioni 278, 343 e 397. La linea cellulare 411BRneo manca di attività ligasi IV rilevabile a causa di una mutazione omozigote missenso in un residuo altamente conservato (R278H). 39 Se la scissione limitata di I- Ppo I osservata è il risultato della riparazione di questi siti mediante giuntura non omologa, allora ci si potrebbe aspettare che le cellule 411BRneo mostrino un taglio migliorato in questo test. Tuttavia, il taglio di I- Ppo I in cellule 411BRneo non era significativamente maggiore di quanto osservato in nessuna delle linee cellulari derivate da ILB1, sebbene la riparazione non fosse completa nemmeno 24 ore dopo la trasduzione con I- Ppo I. I- Ppo I i siti nelle cellule ILB1- [NBN] e ILB1- [NBN-S> A] sono stati completamente riparati di 8 ore sebbene le cellule ILB1- [NBN-S> A] siano rimaste indietro rispetto alle cellule ILB1- [NBN] alle 5 ore punto temporale. Le cellule ILB1, prive di NBN a lunghezza intera, e le celle ILB1- [NBN-S> E] hanno richiesto un periodo di tempo più lungo per completare la riparazione (Figura 2b). Il taglio massimo non ha superato il 30% in nessuna di queste linee cellulari di fibroblasti. Limitazioni simili sull'estensione massima del taglio sono state osservate in linee cellulari di altre origini come HEK293T e una linea cellulare linfoblastoide B, 309, nonostante la riuscita trasduzione di I -Ppo I in queste linee cellulari usando CPP (Figura 2c).

La trasduzione della proteina I- Ppo I attiva la risposta al danno del DNA dipendente dall'ATM

La Figura 3a mostra l'attivazione di ATM, come testato dalla fosforilazione su serina 1981 dopo il trattamento delle cellule ILB1 e ILB1- [NBN] con I- Ppo I. Come previsto, la fosforilazione di ATM viene attenuata nei primi punti nelle cellule ILB1 dove la lunghezza NBN è assente, mentre la fosforilazione S1981 è stata rilevata a 1 ora ed era ancora presente a 3 ore nelle cellule ILB1- [NBN] integrate (Figura 3a, pannello superiore). La fosforilazione di NBN su serina 343 da parte di ATM attivato è analogamente osservata nelle cellule ILB1- [NBN] (Figura 3a, pannello inferiore).

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La trasduzione della proteina I- Ppo I attiva la risposta al danno del DNA dipendente dall'ATM. ( a ) Nel pannello superiore, le cellule trattate con I- Ppo I per la quantità di tempo indicata sono state lisate, gli estratti nucleari sono stati preparati e separati da gel gradiente 3-8%, trasferiti su membrane di trasferimento immobilon-P e immunoblottati con anticorpi contro ATM-phosphor-serine1981 (ATM-pS1981) e ATM totale. Nel pannello inferiore, i lisati provenienti da cellule trattate con I- Ppo I per i tempi indicati sono stati immunoprecipitati con un anticorpo anti-NBN e immunoblottati con anticorpi contro NBN-fosfo-serina343 (NBN-pS343) e NBN totale. ( b ) Le cellule ILB1- [NBN] sono state trasdotte con PBS (NA), proteina di controllo (Con) o proteina I- Ppo I purificata (I- Ppo I) utilizzando un reagente per il rilascio di proteine ​​(Chariot) e raccolte a 1 e 2 h dopo la trasduzione. I saggi di ChIP sono stati eseguiti utilizzando nessun anticorpo o anticorpo contro γH2AX. Il DNA immunoprecipitato è stato quantificato mediante PCR usando un set di primer adiacente al sito I- Ppo I nel gene DAB1 sul cromosoma 1 o set di primer destinato a un gene di pulizia, GAPDH . ( c ) Le cellule ILB1- [NBN] sono state trattate in modo fittizio (nessun trattamento), trattate solo con CPP (CPP) o trasdotte con proteine ​​di controllo (con trattamento) o con proteine ​​I- Ppo I purificate (trattate con I- Ppo I ) complessato con CPP. Le cellule sono state fissate a 0, 1, 2, 4 e 6 ore dopo la trasduzione e colorate con γH2AX e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo. Le immagini con ingrandimento basso (× 20) e alto (× 40) vengono visualizzate per ciascun punto temporale.

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I fosforilati ATM attivati ​​istone H2AX nei siti di danno al DNA che formano γH2AX. 40 Un test ChIP che utilizzava anticorpi diretti contro γH2AX e primer di amplificazione adiacenti al sito I- Ppo I sul cromosoma 1 nel gene DAB1 ha rivelato che γH2AX poteva essere rilevato in questo sito di 1 ora dopo la trasduzione della proteina I- Ppo I (Figura 3b) . La microscopia immunofluorescente ha rivelato la colorazione γH2AX nella maggior parte (> 90%) delle cellule trattate con I- Ppo I (Figura 3c, pannello a bassa risoluzione) e danni ai fuochi nelle singole cellule coerenti con il numero di siti noti I- Ppo I nel genoma umano (Figura 3c, pannello ad alta risoluzione).

La fosforilazione ATM di NBN ne facilita l'accumulo nei siti di danno al DNA

Per valutare il ruolo della fosforilazione ATM di NBN sulla tempistica e sulla distribuzione spaziale del suo accumulo nei DSB del DNA, sono state utilizzate due diverse versioni trasfettate di cellule ILB1, ILB1- [NBN-S> A] e ILB1- [NBN-S> E ] cellule. In confronto alle cellule ILB1 trasfettate con un costrutto NBN di tipo selvaggio, entrambe le linee cellulari esprimevano livelli comparabili di NBN e nessuna delle due era significativamente compromessa nella sopravvivenza a seguito dell'esposizione a radiazioni ionizzanti (Figure supplementari 1 e 2). Per valutare il reclutamento e la distribuzione di proteine ​​in corrispondenza di un DSB specifico del sito in queste linee cellulari, abbiamo utilizzato coppie di primer per l'analisi ChIP spaziate fino a 20 kb su entrambi i lati del sito I- Ppo I situato all'interno del gene DAB1 su cromosoma 1 e testato per l'accumulo di proteine ​​da 1 a 8 ore dopo il trattamento di cellule con I- Ppo I. Nelle cellule ILB1, NBN non ha potuto essere rilevato da ChIP in nessun momento (Figura 4a, primo pannello). Nelle cellule ILB1- [NBN], NBN è stato rilevato nel sito di scissione entro 1 ora dalla trasduzione, raggiungendo un picco a 3 ore e quindi diminuendo di 5 ore. In momenti successivi, l'accumulo di NBN si spostava in siti da 3 a 10 kb affiancando il DSB (Figura 4a, secondo pannello). Nelle cellule ILB1- [NBN-S> A], l'accumulo di NBN nel sito di scissione è stato ritardato rispetto al tipo selvaggio, con un picco di 5 ore seguito dal normale declino e spostamento ai siti distali di 8 ore (Figura 4a, terzo pannello ). Nelle cellule ILB1- [NBN-S> E], l'accumulo di NBN nel sito di scissione era paragonabile al tipo selvaggio nel punto temporale di 3 ore ma poi non è riuscito a risolversi, continuando ad aumentare fino a un ampio accumulo di NBN ae intorno il sito di scissione era evidente all'ultimo momento, 8 ore (Figura 4a, quarto pannello).

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La mutazione dei siti di fosforilazione ATM su NBN modifica i tempi di reclutamento di ATM e NBN sui siti di danno. ( a, b ) ILB1, ILB1- [NBN], ILB1- [NBN-S> A] e ILB1- [NBN-S> E] sono state trasdotte con proteina I- Ppo I purificata usando CPP. Le cellule sono state lisate a 0, 1, 3, 5 e 8 ore dopo la trasduzione. I test ChIP sono stati eseguiti utilizzando anticorpi contro NBN ( a ) e ATM ( b ).

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Poiché il reclutamento di ATM nei siti di danno al DNA viene stimolato in tempi precoci dopo l'induzione del danno al DNA grazie alla sua interazione con l'estremità terminale carbossica di NBN, 23 il test ChIP è stato utilizzato anche per esaminare il reclutamento di proteine ​​ATM nel sito di taglio I- Ppo I. Sebbene NBN si sia accumulato direttamente nel sito del DNA DSB, l'ATM è stato rilevato in regioni di 3-10 kb che fiancheggiano il sito, in modo simile all'accumulo di NBN dopo 5 ore (Figura 4b). Nelle cellule ILB1 c'è stato un aumento molto modesto della quantità di ATM presente in questi siti nel tempo, in linea con l'evidenza che NBN stimola l'attivazione di ATM ma non è obbligatorio per la sua attivazione (Figura 4b, primo pannello). 38, 41, 42, 43, 44, 45 Nelle cellule ILB1- [NBN], è stato osservato un robusto accumulo di ATM su entrambi i lati del DSB di 1 ora dopo la diminuzione della trasfezione I- Ppo I (Figura 4b, secondo pannello). Come osservato per NBN, nelle cellule ILB1- [NBN-S> A], l'accumulo di ATM nel sito di taglio I- Ppo I è stato ritardato rispetto alle cellule ILB1- [NBN]. L'ATM non era rilevabile a 1 ora e non raggiungeva il picco fino a circa 5 ore dopo la trasfezione I- Ppo I prima del calo (Figura 4b, terzo pannello). L'accumulo di ATM nelle cellule ILB1- [NBN-S> E] ha rispecchiato in modo simile i risultati dell'accumulo di NBN con questo mutante, raggiungendo livelli wild-type a 3 ore ma poi continuando ad accumularsi fino a 8 ore invece di diminuire come è stato osservato per tipo NBN (Figura 4b, quarto pannello).

Sebbene l'accumulo di ATM nel sito del DNA indotto DSB sia stato alterato nelle cellule ILB1- [NBN-S> A] e ILB1- [NBN-S> E], la quantità di ATM attivato nelle cellule, analizzata dalla fosforilazione su S1981, era generalmente indistinguibile da quello nelle cellule ILB1- [NBN] a 1, 3 e 8 h (Figura 5a), con la possibile eccezione di un livello basale leggermente elevato di fosforilazione S1981 nelle cellule ILB1- [NBN-S> E]. La fosforilazione di CHEK2 su T68 46 allo stesso tempo i punti era indistinguibile dal tipo selvaggio (Figura 5b). Un substrato aggiuntivo, SMC1, che è fosforilato da ATM su S957, 44 fosforilazione nelle cellule ILB1- [NBN-S> E] è stato aumentato nel punto temporale di 1 ora rispetto alle altre linee cellulari (Figura 5c).

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La mutazione dei siti di fosforilazione ATM su NBN non altera la fosforilazione di ATM e dei suoi effettori a valle. ( a ) Le cellule ILB1- [NBN], ILB1- [NBN-S> A] e ILB1- [NBN-S> E] sono state trasdotte con proteina I- Ppo I purificata e lisate a 0, 1, 3 e 8 h dopo trasduzione. Sono stati preparati estratti nucleari. Quantità equivalenti di estratto nucleare della stessa preparazione sono state separate su un gel Tris-Acetato al 3–8% e un gel Bis-Tris al 4–12% singolarmente, trasferite su membrane di trasferimento Immobilon-P e immunoblotate con anticorpi contro ATM-fosforo- serine1981 (ATM-pS1981, su gel di tris-acetato), ATM (su gel di bis-Tris), ( b ) CHK2-fosforo-tirosina68 (CHK pT68, su gel di tris-acetato) e CHK2 (su gel di bis-Tris), ( c ) SMC1-fosforo-Serina957 (SMC1 S957, su gel Bis – Tris) e SMC1 (su gel Tris-acetato).

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Discussione

L'esatto ruolo della fosforilazione ATM di NBN nella risposta al danno del DNA rimane irrisolto. Le sostituzioni da serina a alanina nei siti di fosforilazione ATM noti su NBN hanno, nella migliore delle ipotesi, solo effetti modesti sulla sopravvivenza delle cellule dopo l'irradiazione. 29, 31, 32, 47 Queste mutazioni conferiscono un fenotipo di sintesi di DNA radio-resistente ma il meccanismo per cui la fosforilazione su questi residui segnala ai macchinari del checkpoint in fase S non è stato chiarito. Non ci sono prove di interazioni proteiche dipendenti dalla modifica nei residui di NBN che sono fosforilati da ATM.

Nel presente studio, abbiamo esaminato l'orientamento spaziale e i tempi di reclutamento di NBN e ATM nei siti di rotture del DNA indotti in linee cellulari isogeniche che non esprimevano NBN a lunghezza intera, NBN wild-type o NBN in cui erano stati situati i siti di fosforilazione ATM mutato in alanina o acido glutammico al fine di determinare se esistessero caratteristiche della risposta spazio-temporale al danno del DNA dipendenti dalla fosforilazione di NBN mediata da ATM. Precedenti studi hanno esplorato questo problema usando la microirradiazione laser in cellule vive seguita da microscopia confocale. 20, 48, 49 Per ottenere un livello di risoluzione più elevato di quello disponibile tramite microscopia, abbiamo adottato un approccio basato su ChIP basato su enzimi di restrizione. L'approccio dell'uso di endonucleasi di restrizione, come I- Ppo I usato qui, per indurre DSB del DNA nelle cellule di mammifero e la successiva applicazione di ChIP a questi siti non è nuovo, 34, 50, 51 ma nelle precedenti implementazioni questi approcci si sono basati su trasfezione del gene che codifica per l'enzima di restrizione o creazione di linee cellulari in cui l'enzima di restrizione era sotto il controllo di un promotore inducibile. Tali implementazioni comportano sfide particolari tra cui la sovraespressione o l'esposizione prolungata all'enzima di restrizione in caso di trasfezione transitoria e la necessità di progettare individualmente linee cellulari che trasportano mutazioni diverse nel caso di promotori inducibili. Tuttavia, Berkovich et al. sono stati in grado di utilizzare un costrutto I- Ppo I modificato la cui localizzazione nucleare potrebbe essere indotta in cellule trasfettate con tamoxifene, per dimostrare il reclutamento di ATM e NBN nel sito I- Ppo I sul cromosoma 1 e la concomitante perdita di istone H2B in questo posto.

Nell'approccio qui descritto, impieghiamo i CPP per introdurre la proteina I- Ppo I prodotta dai batteri e marcata con epitopo nelle cellule umane portanti diverse mutazioni site specific nei geni di risposta al danno del DNA. Dimostriamo che nelle condizioni utilizzate, la maggior parte delle cellule (> 90%) viene trasdotta con la proteina, incorre in DSB DNA specifici del sito e avvia una normale risposta al danno del DNA alla presenza di questi DSB. Otto dei 10 siti di restrizione I- Ppo I putativi identificati nel genoma umano mediante analisi di sequenza hanno mostrato evidenza di taglio da parte dell'endonucleasi esogena introdotta. Dopo la trasduzione di cellule con I- Ppo I complessate con CPP, la scissione del DNA specifica per sito è stata rilevata 1 ora dopo la trasduzione (il primo punto temporale testato) ed è stata completamente riparata entro 8 ore. Sebbene la maggior parte delle cellule trattate con I- Ppo incorra in alcuni DSB del DNA, come evidenziato dalla colorazione positiva per γH2AX, il taglio massimo, per singolo sito, non ha superato il 30%. Le mutazioni nelle proteine ​​coinvolte nel rilevamento o nella riparazione del danno al DNA hanno influenzato il tempo necessario per completare la riparazione ma non il taglio massimo, suggerendo che cicli ripetuti di taglio e riparazione non erano probabilmente un fattore importante nel determinare il livello massimo di taglio. Nelle cellule ILB1- [NBN] trasdotte da I- Ppo I, il profilo del taglio e della riparazione endonucleolitici ha seguito leggermente le misure dei livelli di I- Ppo I, che hanno raggiunto il picco a 1 ora e sono diminuite in seguito. Solo quantità limitate di I- Ppo I sono state rilevate dopo 5 ore da immunoblot o immunofluorescenza. Nelle cellule ILB1 prive di NBN a lunghezza intera e nelle cellule 411BRneo prive di ligasi IV, la riparazione è stata significativamente ritardata. Alla fine, le cellule ILB1 si sono ricongiunte ai DSB indotti, mentre in 411BRneo le cellule sono rimaste non riparate più della metà dei siti di taglio dopo 24 ore.

I diversi siti genomici testati nel test di taglio includono siti all'interno dei geni e in regioni intergeniche e persino altamente ripetitive, che probabilmente differiranno nella configurazione della cromatina. Non abbiamo osservato differenze coerenti tra, ad esempio, i siti genici e intergenici, nei livelli massimi di taglio raggiunti, ma la variabilità tra i diversi siti di taglio suggerisce che il ruolo della cromatina in questo processo debba essere ulteriormente studiato. Abbiamo anche osservato risultati simili nelle linee cellulari di diversa origine, come cellule HEK293 o cellule linfoblastoide B. È possibile che i preparati dell'enzima I- Ppo I con diverse attività specifiche possano differire nella misura massima del taglio, ma, ad oggi, non abbiamo osservato differenze significative tra i preparati che abbiamo fatto (dati non mostrati).

Per esplorare gli effetti della fosforilazione ATM di NBN sull'accumulo di queste proteine ​​nei siti di DSB del DNA, abbiamo applicato il sistema di trasduzione I- Ppo I a due linee cellulari mutanti, ILB1- [NBN-S> A] cellule, una precedente ha descritto la linea cellulare con sostituzioni da serina a alanina nei siti di fosforilazione ATM in NBN e cellule ILB1- [NBN-S> E], una nuova linea in cui questi residui sono stati cambiati in acido glutammico per imitare la fosforilazione costitutiva. Abbiamo osservato effetti significativi sia sulla tempistica della riparazione che sull'accumulo di ATM e NBN nei siti I- Ppo I in questi mutanti, ma questi effetti non hanno comportato una sopravvivenza ridotta nei test clonogenici. Nelle cellule ILB1- [NBN-S> A] il decorso della riparazione dei DSB del DNA indotti da I- Ppo I è stato ritardato di 5 ore rispetto a quello osservato nelle cellule ILB1 integrate con NBN wild-type, ma è stato ancora completato da 8 h. Anche il blocco della fosforilazione di NBN in questi siti ha avuto un effetto sostanziale sull'accumulo di NBN in prossimità del DSB indotto da I- Ppo I nel gene DAB1 sul cromosoma 1, nonché sull'accumulo di ATM nello stesso sito. È interessante notare che nelle cellule ILB1- [NBN-S> E] il decorso temporale della riparazione dei DSB del DNA indotti da I- Ppo I è stato più gravemente ritardato rispetto a quello nelle cellule ILB1- [NBN], sebbene sia ancora completo di ∼ 18 h. Le cellule ILB1- [NBN-S> E] hanno mostrato un normale accumulo di NBN e ATM nel sito I- Ppo I, ma le proteine ​​non sono riuscite a dissociarsi dal sito, come osservato per le cellule ILB1- [NBN], e hanno mostrato un accumulo continuo.

In generale, la distribuzione spaziale di NBN e ATM nel sito DSB nei nostri test ChIP era indistinguibile nelle cellule ILB1 integrate con NBN wild-type e il mutante S> A o S> E, così come l'estensione dell'attivazione dell'ATM; era solo il momento dell'accumulo che è stato influenzato. Questo modello spaziale di accumulo di NBN e ATM era anche coerente con quello osservato da Berkovitch et al., 34 sebbene non sia chiaro quanto bene corrispondano i punti temporali in cui sono state fatte le osservazioni nei due diversi sistemi. I nostri risultati indicano che il principale effetto della fosforilazione ATM di NBN è di stabilizzare la proteina nel sito del DSB portando al suo accumulo e quello di ATM. In assenza di fosforilazione, sia NBN che ATM si accumulano ancora ma con cinetica più lenta. Quando la fosforilazione di NBN viene potenziata mediante sostituzioni di aminoacidi fosfo-mimici, l'accumulo di NBN e ATM nel sito del DSB viene potenziato in modo simile, in particolare dall'incapacità di queste proteine ​​di dissociarsi dal sito in modo tempestivo, come osservato in cellule che esprimono NBN wild-type. Paradossalmente, questo accumulo potenziato è associato alla riparazione ritardata del sito. Tuttavia, sulla base delle osservazioni sui tempi di accumulo di XRCC4 nei siti dei DSB, Berkovich et al. 34 ha ipotizzato che fosse necessario che le proteine ​​di riparazione spostassero le proteine ​​di segnalazione, come ATM, dal sito di taglio in momenti di ritardo per eseguire la riparazione. Si è tentati di ipotizzare che la forma mutante di NBN nelle cellule ILB1- [NBN-S> E], la cui dissociazione dal sito è compromessa, possa ostacolare l'accesso delle proteine ​​di riparazione al DSB e ritardare così la riparazione. Un grande vantaggio del sistema ChIP qui descritto è che gli effetti di mutazioni come questa sulle caratteristiche spazio-temporali della risposta cellulare ai DSB del DNA sono entrambi facilmente osservabili e comparabili tra le linee cellulari anche nei casi in cui saggi classici, come il clonogenico sopravvivenza, non è possibile discriminare tra le diverse linee cellulari mutanti.

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