Nf-κb media la radio-sensibilizzazione da parte dell'inibitore del parp-1, ag-014699 | oncogene

Nf-κb media la radio-sensibilizzazione da parte dell'inibitore del parp-1, ag-014699 | oncogene

Anonim

Astratto

Il fattore di trascrizione inducibile dallo stress, il fattore nucleare (NF) -κB induce i geni coinvolti nella proliferazione e nell'apoptosi. L'attività aberrante di NF-κB è comune nel cancro e contribuisce alla resistenza terapeutica. La poli (ADP-ribosio) polimerasi-1 (PARP-1) viene attivata durante la riparazione della rottura del filo del DNA ed è un noto co-regolatore trascrizionale. Qui, abbiamo studiato il ruolo della funzione PARP-1 durante l'attivazione di NF-κB usando l'RNA interferente (siRNA) p65 piccolo, siRNA PARP o il potente inibitore PARP-1, AG-014699. I test di sopravvivenza e apoptosi hanno mostrato che le cellule NF-κB p65 - / - erano più sensibili alle radiazioni ionizzanti (IR) rispetto alle cellule p65 + / + . Co-incubazione con siRNA p65, siRNA PARP o AG-014699 p65 + / + radio-sensibilizzati, ma non con cellule p65 - / -, dimostrando che il PARP-1 media i suoi effetti sulla sopravvivenza tramite NF-κB. La cinetica di riparazione della rottura del singolo filamento (SSB) e l'effetto dell'inibizione della riparazione dell'SSB da parte di AG-014699 erano simili nelle cellule p65 + / + e p65 - / - . Poiché la prevenzione della riparazione dell'SSB non ha sensibilizzato le cellule p65 - / - delle cellule, concludiamo che la radio-sensibilizzazione di AG-014699 è dovuta all'inibizione a valle dell'attivazione dell'NF-κB e indipendente dall'inibizione della riparazione dell'SSB. L'attività catalitica di PARP-1 era essenziale per il legame del DNA p65 indotto da IR e la trascrizione genica dipendente da NF-κB, mentre per le cellule trattate con fattore di necrosi tumorale (TNF), la sola proteina PARP-1 era sufficiente. Ipotizziamo che questo differenziale dipendente dallo stimolo sia mediato dalla stimolazione del polimero poli (ADP-ribosio), che è stato indotto a seguito di IR, non di TNF-α. Il targeting NF-κB attivato dal danno del DNA usando AG-014699 può quindi superare la tossicità osservata con gli inibitori NF-κB classici senza compromettere altre funzioni infiammatorie vitali. Questi dati evidenziano il potenziale degli inibitori di PARP-1 di superare la resistenza terapeutica mediata da NF-κB e di ampliare lo spettro dei tumori in cui questi agenti possono essere utilizzati.

introduzione

È noto che il fattore di trascrizione inducibile dallo stress, il fattore nucleare (NF) -κB regola i geni coinvolti nell'apoptosi, nella proliferazione cellulare, nell'angiogenesi e nella metastasi. NF-κB è il complesso eterodimero delle proteine ​​della famiglia Rel (p50, p52, p65, c-Rel e Rel B) che viene mantenuto inattivo nel citoplasma attraverso la sua interazione con le proteine ​​inibitori κB (IκB). Allo stimolo, a causa del danno al DNA o delle citochine infiammatorie, viene indotta la via canonica dell'attivazione di NF-κB. In breve, le cascate di segnalazione convergono all'inibitore del complesso kappa-B chinasi (IKK), che fosforila IκBα, mirando a questo per degrado e promuovendo la traslocazione nucleare dell'eterodimero p65 / p50, attivando la trascrizione di molti geni, incluso l'anti-apoptotico Bcl- Inibitore delle proteine ​​dell'apoptosi legato all'X e X (XIAP) (Ghosh e Karin, 2002).

NF-κB costitutivamente attivo è comune in molti tumori e leucemia (Basseres e Baldwin, 2006) ed è stato dimostrato che è associato a una prognosi sfavorevole nella leucemia linfocitica cronica (CLL) (Hewamana et al., 2009). L'attivazione di Aberrant NF-κB è correlata ad un aumento del potenziale metastatico, una più rapida progressione della malattia, una percentuale più elevata di recidiva del tumore e resistenza terapeutica (Prasad et al., 2009). È noto che l'attività cellulare di NF-κB è indotta da dosi variabili di radiazioni ionizzanti (IR) e questo differenziale è probabilmente sia di tipo cellulare sia di tessuto specifico (Brach et al., 1991; Criswell et al., 2003). L'NF-κB attivato dal danno del DNA induce geni anti-apoptotici, inibendo così l'apoptosi (Wang et al., 1998; Barkett e Gilmore, 1999). Aberrant NF-κB contribuisce alla radio-e chemio-resistenza nei tumori al seno (Biswas et al., 2004; Wu e Kral, 2005) e la perdita o l'inibizione di NF-κB ha dimostrato di chemio- o radio-sensibilizzare in molti diversi tipi di tumore (Jung e Dritschilo, 2001; Russo et al., 2001; Criswell et al., 2003; Hewamana et al., 2008a, 2008b). Tuttavia, è importante notare che la dose di IR richiesta per NF-κB attivo può essere di tipo cellulare o dipendente dal tessuto. Ad esempio, Brach et al. (1991) hanno mostrato che la dose clinicamente rilevante di 2 Gy potrebbe indurre l'attivazione di NF-κB nella linea cellulare mieloide, KG-1. Inoltre, nella linea cellulare linfoblastoide umana 244B trasformata dal virus di Epstein-Barr, 0, 5 Gy IR ha mostrato di attivare l'attivazione di NF-κB (Sahijdak et al., 1994). Considerando che, altri studi, come Stilmann et al. (2009), hanno usato dosi iper letali di 80 Gy quando inducono una risposta NF-κB.

Pertanto, l'inibizione di NF-κB rappresenta una potenziale strategia terapeutica nel cancro e ci sono un certo numero di inibitori che prendono di mira vari componenti del percorso nello sviluppo. Questi includono inibitori del complesso IKK, come Parthenolide o inibitori proteosomici come Bortezomib, che possono prevenire la degradazione di IκB. (Gilmore e Herscovitch, 2006). Una nuova strategia potrebbe essere quella di inibire l'attività NF-κB indotta dal danno del DNA per superare gli effetti tossici o fuori bersaglio spesso incontrati con IKK o inibitori proteosmali. Qui, descriviamo una nuova funzione per l'inibitore della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP), AG-014699, sviluppato all'Università di Newcastle in collaborazione con Pfizer, nell'inibire specificamente l'attività NF-κB indotta da danno al DNA.

PARP-1 è un enzima nucleare, che modula la risposta cellulare al danno del DNA (Smith, 2001) e in precedenza abbiamo dimostrato che il PARP-1 agisce come un sensore per le rotture del DNA a filamento singolo e doppio in risposta all'IR (Veuger et al., 2003). Più recentemente, ci sono prove per un ruolo del PARP-1 nella coregolamentazione dei fattori di trascrizione. Ciò può avvenire attraverso la modifica locale della struttura della cromatina (Althaus et al., 1994) e / o la modulazione dell'attività del fattore di trascrizione mediante legame diretto alle sequenze di regolazione genica o interazioni fisiche con proteine, inclusi i fattori di trascrizione tra cui Oct-1, NF-κB, AP-1 e HIF-1α (Kraus e Lis, 2003; Martin-Oliva et al., 2006). Abbiamo precedentemente dimostrato che l'attività di PARP-1 è vitale per l'attivazione di NF-κB a seguito di IR utilizzando un pannello di linee cellulari di carcinoma mammario e l'inibitore di piccole molecole di PARP-1, AG-14361 (Veuger et al., 2009).

Il ruolo dell'attività catalitica di PARP-1 nell'attivazione di NF-κB è alquanto controverso e probabilmente dipenderà principalmente dallo stimolo, ma anche dal tipo di cellula (Hassa e Hottiger, 1999; Oliver et al., 1999; Hassa et al., 2001). In questo studio, abbiamo testato questo confronto tra due attivatori canonici di NF-κB, IR e fattore di necrosi tumorale (TNF) -α. Il TNF-α è una citochina rilasciata durante la risposta immunitaria, che è in grado di iniziare sia la morte cellulare mediata dal recettore della morte che l'attivazione canonica dell'NF-κB (Clevers, 2004). Illustriamo che PARP-1 è richiesto differenzialmente nell'induzione di NF-κB, e questo dipende dalla capacità degli stimoli di attivare il polimero poli (ADP-ribosio) (PAR). A tal fine, il recente lavoro di Stilmann et al. (2009) descrive la formazione di un'impalcatura di segnalazione PARP-1 attraverso interazioni proteina-proteina dirette con modificatore essenziale NF-κB (NEMO), inibitore proteico di STATγ (PIASγ) attivato e mutazione dell'atassia telangiectasia (ATM) in risposta al danno del DNA. Questa formazione di segnalosomi richiede il legame con il polimero PAR e porta all'attivazione NF-κB pro-sopravvivenza (Stilmann et al., 2009).

Il potente e specifico inibitore PARP-1, AG-014699 è stato utilizzato negli studi clinici di fase I e II per tumori solidi in combinazione con chemioterapici standard e anche come trattamento autonomo (Plummer et al., 2008). Gli studi hanno anche dimostrato che AG-014699 migliora la regressione del tumore nei modelli di xenotrapianto (Daniel et al., 2009). Tuttavia, l'effetto di questo agente sull'attività trascrizionale NF-κB rimane indeterminato. Qui, mostriamo usando AG-014699 e piccoli RNA (siRNA) interferenti rivolti a NF-κB p65 e fibroblasti embrionali di topo (MEF) competenti e carenti di NF-κB p65 che l'inibizione di PARP-1 modula positivamente la risposta apoptotica a IR. Sorprendentemente, mostriamo che la radio-sensibilizzazione mediante inibizione del PARP-1 è dovuta esclusivamente all'inibizione dell'NF-κB e non alla prevenzione della riparazione del DNA. Illustriamo anche che PARP-1 è richiesto in modo differenziato nell'induzione di NF-κB, e questo dipende dallo stimolo di attivazione e dalla capacità di tali stimoli di attivare il polimero PAR.

risultati

Caratterizzazione di linee cellulari

Abbiamo precedentemente confermato, utilizzando le analisi occidentali lo stato p50, p65 e PARP-1 in tutte le linee cellulari. In breve, i MEF knock out mancavano delle proteine ​​pertinenti, mentre mostravano bande di intensità simile per le altre proteine ​​(Veuger et al., 2009). L'attività PARP-1 è molto simile nei MEF PARP + / +, p65 + / + e p65 - / - e molto bassa (<5%) nei MEF PARP-1 - / - qui usati (Veuger et al., 2009) . La trasfezione transitoria di siRNA p65 50 n M ha provocato il knockdown della proteina p65, e questo è stato massimo (riduzione del 95%) di 48 ore (Figura 1a) e ha persistito fino a 72 ore. Allo stesso modo, la trasfezione di siRNA PARP-1 50 n M (Figura 1b) ha provocato un knockdown proteico di circa il 75% a 48 ore, e questo è persistito fino a 72 ore. SiRNA non specifico (NS) non ha avuto alcun effetto sull'espressione proteica.

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Caratterizzazione di linee cellulari e knockdown di siRNA. ( a ) Macchie occidentali di estratti di cellule intere di p65 + / + e p65 - / - MEF a 48 ore dopo la trasfezione con il solo veicolo (finto), NS siRNA o p65 siRNA. ( b ) Macchie occidentali di estratti di cellule intere di p65 + / + e p65 - / - a 48 ore dopo la trasfezione con solo veicolo (finto), NS siRNA o PARP-1 siRNA. ( c ) Istogramma che mostra l'attività PARP, misurata usando un test di immunoblot validato, che quantifica la formazione di polimero PAR, in p65 + / + MEF dopo trasfezione con solo veicolo (finto), p65 siRNA, AG-014699, siRNA PARP-1, una combinazione di p65 siRNA + AG-014699 o NS siRNA. ( d ) Attività PARP misurata utilizzando un test di immunoblot convalidato, che quantifica la formazione di polimero PAR in p65 - / - MEF a seguito di trasfezione con solo veicolo (finto), p65 siRNA, AG-014699, PARP-1 siRNA, una combinazione di siRNA p65 + AG-014699 o NS siRNA 10H anticorpo è stato usato per misurare la formazione di PAR. I dati sono rappresentati come media ± sem di tre esperimenti indipendenti. * Il significato relativo al controllo simulato era P <0, 05 utilizzando il test t di Student non accoppiato.

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Per confermare il knockdown PARP e la specificità di AG-014699, l'attività PARP è stata valutata in MEF p65 + / + e p65 - / - in seguito a trasfezione con PARR-1 o siRNA p65 o in seguito a trattamento con AG-014699 (Figure 1c e d). È stata anche valutata una combinazione di p65 siRNA e AG-014699. Le cellule trattate con AG-014699 o una combinazione di AG-014699 e siRNA p65 hanno mostrato un'attività PARP molto bassa (<5%) ( P = 0, 03 e P = 0, 02, rispettivamente, rispetto ai controlli siRNA NS). PARR-1 siRNA ha mostrato un'attività PARP del 25% rispetto ai controlli ( P = 0, 004), in entrambe le linee cellulari, il che conferma l'analisi occidentale. siRNA targeting p65 non ha alcun effetto significativo sull'attività PARP-1 in entrambe le linee cellulari, rispetto ai controlli siRNA NS. Va notato che sembra esserci qualche effetto nel confrontare i siRNA NS con i controlli simulati. Altri gruppi hanno documentato effetti sui processi cellulari tra cui vitalità cellulare, proliferazione, distribuzione del ciclo cellulare, apoptosi e migrazione (Jackson e Linsley, 2004; Tschaharganeh et al., 2007). Suggeriamo qui che ciò potrebbe forse essere dovuto all'aumentato rapporto di acido nucleico nelle cellule trattate con siRNA NS rispetto ai controlli falsi trasfettati, causando un certo stress alle cellule.

La radio-sensibilizzazione mediante knockdown p65, knockdown PARP-1 o AG-014699 è associata all'induzione dell'apoptosi

Abbiamo studiato la capacità di knockdown p65, knockdown PARP-1 o AG-014699 di sensibilizzare MEFs p65 + / + e p65 - / - e MEF PARP-1 + / + e PARP-1 - / - usando IR formando colonie saggi. Abbiamo anche valutato una combinazione di siRNA p65 e AG-014699. Nel nostro studio precedente, i valori di PF 50 hanno dimostrato che i MEF p65 - / - erano 1, 3 volte più sensibili al solo IR rispetto ai MEF p65 + / + (Veuger et al., 2009) (Figure 2a contro b). Ciò è coerente con NF-κB che conferisce radio-resistenza (Biswas et al., 2004; Wu e Kral, 2005). Qui, mostriamo che, la co-incubazione con AG-014699, siRNA p65 o siRNA PARP-1 p65 + / + MEF radio-sensibilizzati 1, 4 volte rispetto alle cellule mock-transfected trattate con IR. Significativamente, una combinazione di siRNA p65 e AG-014699 non ha mostrato ulteriore sensibilizzazione (Figura 2a). In particolare, questi trattamenti non hanno avuto alcun effetto sui MEF p65 - / - (Figura 2b). I MEF PARP-1 - / - erano 2, 7 volte più sensibili all'IR rispetto ai MEF PARP-1 + / + (Figure 2c contro d). I MEF PARP-1 + / + hanno mostrato una sensibilizzazione di 1, 3 volte a IR mediante AG-014699, knockdown p65 o knockdown PARP-1, rispetto ai soli controlli IR (Figura 2c).

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La radio-sensibilizzazione mediante knockdown p65, knockdown PARP-1 o AG-014699 è associata all'induzione dell'apoptosi. Gli effetti dell'aumento delle dosi di IR da soli o co-incubati con siRNA p65, AG-014699, siRNA PARP-1 o una combinazione di siRNA p65 e AG-014699, sulla sopravvivenza cellulare sono stati valutati usando il saggio di sopravvivenza clonogenico. Le cellule sono state trattate con siRNA pertinente (o controllo del veicolo), lasciate per 48 ore, pretrattate con AG-014699 o controllo dimetilsolfossido 1 ora prima dell'IR, quindi ripiantate dopo altre 24 ore e lasciate formare colonie per 7-21 giorni . (La curva di sopravvivenza ( a ) mostra p65 + / + MEF, ( b ) p65 - / - MEF, ( c ) PARP + / + MEF e ( d ) PARP - / - MEF). ( e ) L'effetto del solo IR (finto, barra bianca) ± p65 siRNA (barra nera) ± AG-104699 (solo AG, barra grigio chiaro, AG + p65 siRNA, barra grigio scuro) sull'induzione dell'apoptosi in p65 + / + MEFs. Le cellule sono state trattate con siRNA rilevante o controllo lasciato per 48 ore, pretrattato con AG-014699, o controllo 1 ora prima dell'IR, quindi sono state autorizzate a riparare per altre 24 ore prima della raccolta e della valutazione dell'induzione dell'apoptosi mediante l'attivazione della fluorescenza dell'allegatoina V analisi dell'ordinamento cellulare (FACS). I risultati mostrati sono normalizzati a controlli non trattati. ( f ) L'effetto di IR (finto, barra bianca) ± p65 siRNA (barra nera) ± AG-104699 (solo AG, barra tratteggiata, AG + p65 siRNA, barra a strisce) sull'induzione dell'apoptosi in p65 - / - MEFs . Le cellule sono state trattate con siRNA rilevante o controllo lasciato per 48 ore, pretrattato con AG-014699, oppure il controllo 1 ora prima dell'IR ha poi permesso di riparare per altre 24 ore prima della raccolta e della valutazione dell'induzione dell'apoptosi mediante analisi dell'allegato V FACS. I risultati mostrati sono normalizzati a controlli non trattati. Tutti i dati mostrati sono rappresentati come media ± sem di tre esperimenti indipendenti. * Il significato relativo al controllo simulato era P <0, 05 utilizzando il test t di Student non accoppiato.

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Abbiamo anche ripetuto questi test formanti colonie con IR da solo, o in combinazione con AG-014699, in cellule p65 - / - che erano state geneticamente integrate con p65 wild-type (WT) e in cellule di controllo pertinenti (Figure supplementari 1B e C). Insieme ai dati nelle figure 1a eb, i risultati delle cellule ricostituite confermano che le cellule radio-sensibilizzate AG-014699 contenenti WT p65 ma non le cellule null p65.

Per valutare gli effetti sull'apoptosi, abbiamo usato l'allegatoina V coniugata con isotiocianato di fluoresceina, che ha un'alta affinità per la fosfatidilserina di fosfolipide di membrana. Innanzitutto, abbiamo scoperto che i MEF p65 - / - hanno livelli intrinseci di apoptosi triplicati più alti dopo IR rispetto a p65 + / + (33, 73 ± 3, 1 per p65 - / - rispetto a 12, 60 ± 2, 7 per p65 + / +, dati non mostrati). Ciò è coerente con i rapporti secondo cui l'attivazione di NF-κB aumenta la sopravvivenza in seguito a danni al DNA (Wang et al., 1996; Russo et al., 2001; Criswell et al., 2003). Abbiamo quindi misurato i livelli di apoptosi dopo IR (2 o 5 Gy) e knockdown p65 o AG-014699 in MEF p65 + / + e p65 - / - (Figure 2e contro f). Abbiamo anche valutato una combinazione di siRNA p65 e AG-014699 (Figura 2e). Rispetto alla sola IR (finto), sia il knockdown della p65 sia l'AG-014699 hanno aumentato significativamente l'apoptosi successiva alla IR (circa 2, 5 volte) nei MEF p65 + / + ( P = 0, 03 e P = 0, 04, rispettivamente). È importante sottolineare che quando AG-014699 è stato usato insieme al knockdown p65, non vi è stato alcun cambiamento nel livello di apoptosi nei MEF p65 + / + rispetto a uno dei due agenti. Non è stato osservato un aumento dell'apoptosi nei MEF p65 - / - (Figura 2f) con nessuno dei trattamenti rispetto alla sola IR. Questi dati sono stati confermati utilizzando un test di attività caspase (Promega, Southampton, Regno Unito), (dati non mostrati).

AG-014699 inibisce la riparazione della rottura del singolo filamento (SSB) in misura simile indipendentemente dallo stato cellulare di NF-κB

Il test della cometa alcalina è stato utilizzato per esaminare la formazione e la riparazione di SSB indotte da IR a livello di singola cellula. La cinetica della riparazione è stata valutata nelle linee cellulari p65 + / + e p65 - / - (Figure 3c ed d). La Figura 3 mostra che immediatamente dopo 10 Gy IR, entrambe le linee cellulari avevano lo stesso livello iniziale di SSB. Non vi era alcuna differenza significativa nei livelli di SSB rimanenti nelle due linee cellulari 60 min post-IR, con> 85% di interruzioni riunite nonostante la differenza di radio-sensibilità. È importante sottolineare che AG-014699 ha inibito la riparazione dell'SSB (come dimostrato dall'aumento dei livelli di SSB residui in tutti i punti temporali post-IR) nella stessa misura in entrambe le linee cellulari (Figure 3a contro b). Inoltre, abbiamo ripetuto questi esperimenti in cellule p65 - / - che erano state geneticamente integrate con WT p65 e anche in controlli null p65. È importante sottolineare che abbiamo scoperto che sia la cinetica di riparazione dell'SSB che l'estensione dell'inibizione dell'SSB da parte di AG-014699 erano molto simili in entrambe le linee cellulari (Figure 3e contro f). Per tutti i saggi Comet, il DNA di coda percentuale è mostrato nella Figura 2 aggiuntiva.

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AG-014699 inibisce la riparazione dell'SSB in misura simile indipendentemente dallo stato cellulare di NF-κB. Diagrammi a dispersione che mostrano l'estensione degli SSB (SSB) in ( a ) p65 + / + MEF e ( b ) p65 - / - MEF trattati con 10 Gy IR ± AG-014699 (AG, indicato con +) e autorizzati a riparare (0, 15, 30 e 60 min). La riparazione dell'SSB è stata misurata utilizzando il test COMET alcalino e il momento Olive Tail (mostrato qui) viene utilizzato come misura della dimensione rilevabile più piccola del DNA migrante (riflessa nella lunghezza della coda della cometa) e del numero di pezzi rilassati / rotti (rappresentati da l'intensità del DNA nella coda). Tutti i dati sono stati testati per la distribuzione gaussiana e le linee mostrate indicano la media dei dati tracciati. Grafico a linee che mostra la cinetica della riparazione SSB in p65 + / + ( c ) e p65 - / - MEF ( d ). I dati sono normalizzati ai controlli pertinenti e in entrambi i casi le linee nere continue rappresentano la riparazione nel tempo delle cellule trattate con 10 Gy IR e le linee tratteggiate rappresentano la riparazione nel tempo delle cellule trattate con 10 Gy IR + AG-014699. Diagrammi a dispersione che mostrano l'estensione degli SSB in ( e ) p65 - / - MEF ricostituiti con WT p65 e ( f ) p65 - / - (controllo) MEF trattati con 10 Gy IR ± AG-014699 (AG, indicato con +) e consentito per riparare (0, 15, 30 e 60 min). La riparazione dell'SSB è stata misurata usando il test COMET alcalino e qui è mostrato il momento Olive Tail. Tutti i dati sono stati testati per la distribuzione gaussiana e le linee mostrate indicano la media della distribuzione. Tutti i risultati mostrati sono la media di tre esperimenti indipendenti ± sem

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L'attività PARP è essenziale per l'attivazione di NF-κB dopo IR, non TNF-α

Abbiamo studiato la capacità di p65 di legarsi con la sua sequenza di consenso in seguito a IR o TNF-α in p65 + / + o p65 - / - MEF. È stato stabilito che 2 ore dopo l'attivazione del legame con il DNA di entrambi gli stimoli p65 era massima (Figure supplementari 3C e D). Il legame è stato specificamente contrastato dall'eccesso di oligonucleotide WT e non è stato influenzato dalla co-incubazione con oligonucleotide mutante in eccesso (dati non mostrati). 10 Gy IR ha aumentato di due volte l'attività legante il DNA rispetto alle cellule p65 + / + trattate in modo fittizio (Figura 4a). Inoltre, siRNA destinato a p65 o una combinazione di siRNA p65 e AG-014699 ha ridotto il legame del DNA> 85% dopo IR in cellule p65 + / + ( P = 0, 008 e P = 0, 009 rispetto al solo IR, rispettivamente). Il siRNA PARP-1 ha inibito il legame del DNA di circa il 60% ( P = 0, 03 rispetto all'IR). Significativamente, AG-014699 ha anche ridotto il legame del DNA indotto dall'IR a livelli comparabili con i controlli non trattati ( P = 0, 05 rispetto all'IR). NS siRNA non ha avuto alcun effetto sul legame con il DNA dopo IR. 10 ng / μl di TNF-α hanno aumentato l'attività di legame al DNA di p65 di 2, 3 volte rispetto alle cellule p65 + / + trattate in modo fittizio. p65 siRNA o una combinazione di p65 siRNA e AG-014699 hanno ridotto il legame del DNA ai livelli relativi ai controlli simulati, seguendo TNF-α ( P = 0, 009 e P = 0, 007 rispetto al solo TNF-α, rispettivamente). È importante sottolineare che il siRNA PARP-1 ha anche ridotto il legame del DNA del 25% dopo il trattamento con TNF-α ( P = 0, 02 rispetto al TNF-α). In netto contrasto, AG-014699 non ha avuto alcun effetto sul legame con il DNA di p65 dopo TNF-α. Dopo qualsiasi trattamento nelle cellule p65 - / - con IR o TNF-α è stata osservata un'attività trascurante di legame al DNA p65 (dati non mostrati).

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L'attività PARP è essenziale per l'attivazione di NF-κB dopo IR, non TNF-α. Istogramma che mostra l'effetto di IR o TNF-α ± p65 siRNA ± AG-014699 (AG) ± PARP-1 siRNA ± (p65 siRNA + AG-014699) ± NS siRNA control sull'attività di legame del DNA NF-κB, misurata usando un enzima dosaggio basato su dosaggio immunoso-assorbente ( a ) e ( b ) NF-κB-dipendente, misurato mediante un test reporter luciferasi, in p65 + / + MEFs. Barre aperte IR, barre nere TNF-α. Tutti i risultati sono la media di tre esperimenti indipendenti con sem ** Il significato relativo al controllo simulato è stato P <0, 01 utilizzando il test t di Student non accoppiato. * Il significato relativo al controllo simulato era P <0, 05 utilizzando il test t di Student non accoppiato. Dati di Western blotting che mostrano traslocazione nucleare di p65 in seguito ( c ) IR o TNF-α ( d ) ± p65 siRNA ± AG-014699 (AG) ± PARP-1 siRNA ± (p65 siRNA + AG-014699) ± NS siRNA control, in p65 + / + MEFs. Le cellule sono state trattate con siRNA rilevante o controllo, lasciato per 48 ore, pretrattato con AG-014699 o controllato 1 ora prima dell'IR e raccolto 1 ora dopo l'IR. Il caricamento è stato normalizzato per laminare il controllo del caricamento nucleare in tutti i casi. Istogramma che mostra l'attività di PARP, misurata usando un test di immunoblot validato, che quantifica la formazione di polimero PAR, in p65 + / + MEF dopo aver aumentato le dosi di IR ( e ) e TNF-α ( f ).

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Al fine di valutare il ruolo di PARP-1 sulla trascrizione del gene reporter dipendente da NF-κB in seguito a IR o TNF-α, è stato utilizzato un test reporter di luciferasi. L'attività della luciferasi è risultata essere massima 8 ore dopo il trattamento IR o TNF-α e anche dose-dipendente in MEF p65 + / + (dati non mostrati). Coerentemente con l'aumento del legame con il DNA, a seguito di 10 Gy IR o 10 ng / μl di TNF-α, l'attività della luciferasi è stata aumentata rispettivamente di 2 e 2, 5 volte, rispetto ai controlli simulati (Figura 4b). Inoltre, siRNA indirizzato a p65 o una combinazione di siRNA p65 e AG-014699 ha ridotto l'attività della luciferasi> 80% dopo IR ( P = 0, 008 e P = 0, 007, rispettivamente) o TNF-α ( P = 0, 02 e P = 0, 03, rispettivamente) in p65 + / + celle. Il siRNA PARP-1 ha inibito l'attività della luciferasi di circa il 70%, seguendo uno degli stimoli ( P = 0, 01 rispetto a IR, P = 0, 04 rispetto a TNF-α). Significativamente, AG-014699 ha anche ridotto l'attività del reporter della luciferasi indotta da IR a livelli comparabili con i controlli non trattati ( P = 0, 02). Tuttavia, AG-014699 non ha avuto alcun effetto sull'attività della luciferasi a seguito del TNF-α rispetto al solo TNF-α, in linea con altre segnalazioni (Hassa et al., 2001). Abbiamo anche precedentemente dimostrato che l'espressione costitutiva della luciferasi era circa 10 volte inferiore nei MEF PARP-1 - / - rispetto ai MEF PARP-1 + / + e che l'IR non riusciva ad attivare la trascrizione genica nei MEF PARP-1 - / -, ma ha chiaramente stimolato l'espressione della luciferasi nei MEF PARP-1 + / + (Veuger et al., 2009).

Inoltre, mostriamo qui che la traslocazione nucleare di p65 nei MEF p65 + / + osservata 2 ore dopo IR o TNF-α (Figure 4c ed d), non è stata influenzata da AG-014699 o siPNA PARP-1. I controlli citoplasmatici sono mostrati nelle figure supplementari 3A e B.

IR, non TNF-α stimola la formazione di polimeri PAR

L'induzione dell'attività PARP, mediante formazione del polimero PAR è stata determinata usando un test validato (Plummer et al., 2005a, 2005b; Zaremba et al., 2009). È ben documentato che l'IR stimola l'attività del PARP, e coerentemente con ciò mostriamo qui che l'IR induce la formazione di polimero PAR in modo dose-dipendente in MEF p65 + / + (Figura 4e). Tuttavia, abbiamo scoperto che, a un intervallo di dosi (5–50 ng / μl), il TNF-α non riesce a stimolare la formazione di PAR rispetto ai livelli basali in MEF p65 + / + (Figura 4f).

Persistenza del legame al DNA di NF-κB in seguito all'inibizione del PARG

Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) è l'enzima responsabile del catabolismo del polimero PAR. È onnipresente espresso a bassi livelli in tutte le cellule e tessuti (rivisto in Bonicalzi et al., 2005). Qui, abbiamo usato il potente e specifico inibitore di PARG, ADP-HPD (adenosina fosfato (idrossimetil) pirrolidinediolo) (Slama et al., 1995) e il dosaggio PARP validato (Zaremba et al., 2009) per dimostrare che co- l'incubazione con ADP-HPD determina una maggiore stabilità del polimero PAR nelle cellule trattate con IR. In condizioni normali, il polimero viene degradato e ritorna ai livelli basali 1-2 h dopo IR, mentre nelle cellule trattate con ADP-HPD il polimero persiste per un trattamento post-IR fino a 4 ore.

Inoltre, una maggiore stabilità del polimero è correlata a una persistenza nel legame al DNA di NF-κB, come mostrato nella Figura 5b. Il legame con il DNA è massimo 2 ore dopo l'IR prima di diminuire rapidamente e tornare ai livelli basali dopo l'IR. Contrariamente, nelle cellule trattate con legame ADP-HPD DNA è massimo 2 ore post-IR e questo persiste fino a 8 ore. Coerentemente con un aumento del legame con il DNA di NF-κB conferisce radio-resistenza (Biswas et al., 2004; Wu e Kral, 2005), mostriamo qui, usando il saggio di sopravvivenza clonogenico (Figura 5c) che il trattamento con ADP-HPD protegge dall'IR cellulare uccisione cellulare indotta in cellule p65 + / + . Inoltre, non vi sono effetti sulla sopravvivenza nelle cellule p65 - / - (dati non mostrati). Per dimostrare che questi risultati erano fisiologicamente rilevanti, abbiamo continuato a determinare se l'inibizione del PARG porta ad un aumento dell'espressione di alcuni geni anti-apoptotici mediati da NF-κB, nelle cellule p65 + / + . Usando la trascrittasi inversa quantitativa – PCR, mostriamo che l'IR aumenta significativamente l'espressione di Bcl-xL ( P = 0, 04 rispetto ai controlli non trattati) e questo è ulteriormente aumentato dalla co-incubazione con ADP-HPD ( P = 0, 0089 rispetto al solo ADP-HPD controlli) (Figura 4A supplementare). Anche l'espressione del regolatore di apoptosi simile a CASP8 e FADD (cFLAR) (Figura supplementare 4B) è stata aumentata dopo IR ( P = 0, 103) e questo è stato significativamente aumentato dalla co-incubazione con ADP-HPD ( P = 0, 0098). Abbiamo anche osservato una tendenza simile con l'espressione XIAP (Figura complementare 4C).

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Persistenza del legame al DNA di NF-κB in seguito all'inibizione del PARG. ( a ) Istogramma che mostra il tempo di attività PARP, misurato usando un test di immunoblot validato, che quantifica la formazione di polimero PAR, in p65 + / + MEF dopo 10 Gy IR ± ADP-HPD (barre aperte IR, barre nere IR + ADP-HPD). ( b ) Istogramma che mostra il time-lapse NF-κB di legame al DNA misurato usando un metodo basato su dosaggio di immunosorbenti enzimatico secondo IR ± ADP-HPD (barre aperte IR, barre nere IR + ADP-HPD). ( c ) Gli effetti dell'aumento delle dosi di IR sulla sopravvivenza cellulare, da soli (linea continua) o co-incubati con ADP-HPD (linea tratteggiata) sono stati valutati usando la sopravvivenza clonogena in MEF p65 + / + . Le cellule sono state pretrattate con ADP-HPD o controllate 1 ora prima dell'IR, quindi sono state ripassate dopo altre 24 ore e sono state lasciate formare colonie per 7-21 giorni. Tutti i risultati sono la media di tre esperimenti indipendenti con sem

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AG-014699 supera la resistenza terapeutica mediata da NF-κB nel glioblastoma

Usando il western blotting, abbiamo confermato lo stato di p65 e PARP-1 nelle cellule di glioblastoma U251. Abbiamo usato siRNA per colpire p65 o PARP-1 per abbattere queste proteine ​​(Figure 6a eb), e abbiamo studiato la capacità di knockdown p65, knockdown PARP-1 o AG-014699 per sensibilizzare le cellule U251 a IR usando saggi di formazione di colonie. Abbiamo anche valutato una combinazione di siRNA p65 e AG-014699. Analogamente ai risultati osservati nei MEF p65 + / +, mostriamo qui che, la co-incubazione con AG-014699, siRNA p65 o siRNA PARP-1 ha provocato una radio-sensibilizzazione di 2, 4 volte rispetto alle cellule trattate con mock-transfected con IR. Ancora una volta, una combinazione di siRNA p65 e AG-014699 non ha mostrato ulteriore sensibilizzazione (Figura 6d).

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AG-014699 radio-sensibilizza le cellule del glioblastoma U251 tramite l' inibizione di NF-κB. ( a ) Macchie occidentali di estratti di cellule intere di cellule U251 48 h dopo trasfezione con solo veicolo (finto), siRNA NS o siRNA p65. ( b ) Macchie occidentali di estratti di cellule intere di cellule U251 a 48 ore dopo la trasfezione con il solo veicolo (finto), siRNA NS o siRNA PARP-1. ( c ) Istogramma che mostra l'effetto di IR ± p65 siRNA ± AG-014699 (AG) ± PARP-1 siRNA ± (p65 siRNA + AG-014699) ± NS siRNA control sull'attività legante il DNA di NF-κB, misurata usando un enzima dosaggio basato su dosaggio di immunosorbenti collegato. Tutti i risultati sono la media di tre esperimenti indipendenti con sem ** Il significato relativo al controllo simulato è stato P <0, 01 utilizzando il test t di Student non accoppiato. ( d ) Gli effetti dell'aumento delle dosi di IR da soli o co-incubati con siRNA p65, AG-014699, siRNA PARP-1 o una combinazione di siRNA p65 e AG-014699, sulla sopravvivenza delle cellule U251 sono stati valutati utilizzando la sopravvivenza clonogena dosaggio. Le cellule sono state trattate con siRNA pertinente (o controllo del veicolo), lasciate per 48 ore, pretrattate con AG-014699, o controllo dimetilsolfossido, 1 ora prima dell'IR, quindi ripassate dopo altre 24 ore e lasciate formare colonie per 7-21 giorni. ( e ) Diagrammi a dispersione che mostrano l'estensione degli SSB nelle cellule U251 trattate con 10 Gy IR ± AG-014699 (indicato con +) e autorizzate a riparare (0, 15 e 30 min). La riparazione dell'SSB è stata misurata usando il test alcalino COMET e qui è mostrato il momento Olive Tail (descritto sopra). Tutti i dati sono stati testati per la distribuzione gaussiana e le linee mostrate indicano la media dei dati tracciati. ( f ) Diagrammi a dispersione che mostrano l'estensione degli SSB nelle cellule U251 trattate con 10 Gy IR + p65 siRNA ± AG-014699 (indicato con +) e autorizzate a riparare (0, 15 e 30 min). La riparazione dell'SSB è stata misurata usando il test alcalino COMET e qui è mostrato il momento Olive Tail (descritto sopra). Tutti i dati sono stati testati per la distribuzione gaussiana e le linee mostrate indicano la media dei dati tracciati.

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Abbiamo quindi determinato l'effetto dei trattamenti sopra descritti sul legame con il DNA di NF-κB usando il metodo basato sul dosaggio di immunosorbenti enzimatico e abbiamo scoperto che le nostre osservazioni erano coerenti con quelle osservate nei MEF p65 + / + . 10 Gy IR ha aumentato di due volte l'attività legante il DNA rispetto alle cellule trattate in modo fittizio (Figura 6c). Inoltre, p65 siRNA da solo o in combinazione con AG-014699 ha ridotto il legame del DNA> 85% dopo IR in cellule U251 ( P = 0, 0003 e P = 0, 005 rispetto al solo IR, rispettivamente). È importante sottolineare che sia il PARR-1 siRNA che l'AG-014699 hanno ridotto il legame del DNA indotto dall'IR a livelli comparabili con i controlli non trattati ( P = 0, 0053 e P = 0, 0079 rispetto a IR, rispettivamente). NS siRNA non ha avuto alcun effetto sul legame con il DNA dopo IR.

Il test della cometa alcalina è stato utilizzato per esaminare la formazione e la riparazione di SSB indotte da IR nelle cellule U251. Immediatamente dopo 10 Gy IR, le cellule trattate con IR solo o IR in combinazione con siRNA p65 avevano lo stesso livello iniziale di SSB (Figure 6e e f). Non vi era alcuna differenza significativa nei livelli di SSB rimanenti nelle cellule U251 o U251 con siRNA p65 30 min dopo IR, con> 95% di interruzioni riunite nonostante le differenze osservate nella radio-sensibilità mostrata nella Figura 6d. È importante sottolineare che AG-014699 ha inibito la riparazione dell'SSB (come dimostrato dall'aumento dei livelli di SSB residui in tutti i punti temporali post-IR) nella stessa misura nelle cellule indipendentemente dallo stato p65 (Figure 6e contro f).

Discussione

In questo studio, dimostriamo che il knockdown di PARP-1 e l'inibitore di PARP, AG-014699 hanno ridotto significativamente la sopravvivenza e hanno indotto l'apoptosi a seguito di IR nei MEF p65 + / + senza avere alcun effetto nei MEF p65 - / - . La sensibilizzazione è stata di 1, 3 volte ed è avvenuta in modo importante a dosi clinicamente rilevanti di IR. Una combinazione di AG-014699 e knockdown p65 non ha ulteriormente migliorato questa risposta, il che è coerente con i rapporti secondo cui PARP-1 e NF-κB sono meccanicamente collegati in un percorso comune (Hassa e Hottiger, 1999; Chang e Alvarez-Gonzalez, 2001 ; Stilmann et al., 2009; Veuger et al., 2009). I livelli di SSB in p65 + / + e p65 - / - MEF indotti da IR erano simili ed entrambi erano ugualmente competenti nella loro riparazione. L'AG-014699 è stato anche in grado di aumentare il livello di interruzioni nella stessa misura in entrambe le linee cellulari, in linea con il ruolo noto del PARP-1 nella riparazione dell'escissione di base (Durkacz et al., 1980). Pertanto, possiamo concludere che l'effetto potenziante di AG-014699 quando usato in combinazione con IR non è principalmente dovuto all'inibizione transitoria ampiamente segnalata della riparazione di SSB ma a una conseguenza della segnalazione a valle di PARP-1 a NF-κB. Ciò è coerente con l'osservazione che le cellule gravemente compromesse nella riparazione del DNA (ad esempio, PARP-1 - / - ) sono in grado di dividersi e continuare a sopravvivere nonostante abbiano livelli costantemente più elevati di rotture rispetto alle loro controparti del WT, anche in assenza di danno esogeno (Trucco et al., 1998). Questi dati, insieme alle nostre precedenti scoperte secondo cui il danno al DNA indotto da IR avvia eventi di segnalazione nel nucleo e continua nel citoplasma, con conseguente attivazione di NF-κB (Veuger et al., 2009), supportano l'esistenza di una segnalazione intermedia proteina / complesso come descritto da Stilmann et al. (2009).

Vi sono prove evidenti che gli effetti che abbiamo osservato utilizzando il test Comet sono probabilmente dovuti a SSB, sebbene il test Comet alcalino sia in grado di rilevare una piccola quantità di rotture a doppio filamento e SSB. In primo luogo, Ogorek e Bryant (1985) hanno dimostrato che alle basse dosi di IR utilizzate nei nostri esperimenti, il rapporto tra SSB e rottura a doppio filamento è di circa 20: 1. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che il PARP-1 ha un ruolo minore nella riparazione di rotture a doppio filamento da parte di estremità non omologhe in assenza della proteina chinasi DNA-dipendente (Veuger et al., 2003). Tuttavia, le cellule p65 + / + e p65 - / - utilizzate qui hanno una proteina chinasi dipendente dal DNA funzionale, e quindi eventuali rotture a doppio filamento verrebbero riparate mediante unione di estremità non omologa, con AG-014699 l'unico responsabile dell'inibizione di SSB.

Per studiare gli effetti sull'attività di NF-κB indotti da stimoli diversi dall'IR, abbiamo usato TNF-α. Sebbene il knockdown della proteina PARP-1 abbia abrogato l'attivazione di NF-κB a seguito dello stimolo infiammatorio, l'inibizione enzimatica di PARP-1 non ha prodotto alcun effetto. Al contrario, la proteina PARP e l'attività erano necessarie per inibire la risposta NF-κB indotta da IR. Il ruolo della proteina PARP-1 piuttosto che la sua attività catalitica come co-attivatore di NF-κB è controverso. I nostri dati sono coerenti con alcuni studi (Hassa et al., 2001) ma altri hanno dimostrato che l'inibizione di PARP-1 è stata in grado di alleviare la neurotossicità mediata da MMP-9 NF-κB stimolata da TNF-α in microglia in un modello di lesioni cerebrali (Kauppinen e Swanson, 2005). Questo può dipendere dalla linea cellulare o dal modello del sistema e può anche variare a seconda dell'attivazione di altre subunità NF-κB. Ad esempio, abbiamo recentemente dimostrato che l'attivazione delle subunità è un equilibrio complesso in CLL (Mulligan et al., 2010). Tuttavia, è anche possibile che in questo caso il PARP-1 possa facilitare un ruolo strutturale nel complesso trascrizionale NF-κB, come Hassa et al. (2005) illustrato dimostrando che l'acetilazione di PARP-1, mediante HDAC1 e p300, regolava l'attività di NF-κB. Un'ulteriore spiegazione è che l'inibizione di PARP può produrre diversi effetti fisiologici rispetto al knockdown proteico. Sebbene l'inibizione di altre proteine ​​della famiglia PARP, come PARP-2 da AG-014699, non possa essere rigorosamente esclusa, la coerenza nei dati ottenuti sia dagli studi sull'inibizione che dagli studi sul knock-out del PARP-1 mostrati qui indica che non è così. Abbiamo anche precedentemente dimostrato che le cellule PARP-1 - / - hanno una formazione PAR trascurabile usando il saggio di attività PARP (Veuger et al., 2009), supportando così i nostri risultati qui che AG-014699 radio-sensibilizza le cellule attraverso l' inibizione di PARP- 1, non PARP-2.

Poiché entrambi gli stimoli hanno portato a quantità simili di traslocazione nucleare p65, e questo non è stato influenzato né dal knockdown AG-014699 o PARP-1, allora i requisiti differenziali di PARP-1 per NF-α attivato da IR e TNF-α devono lo stadio di legame e trascrizione del DNA. È stato dimostrato il requisito del polimero PAR nell'NF-κB attivato dal danno del DNA (Stilmann et al., 2009) e questo è coerente con i nostri dati secondo cui IR, non TNF-α stimola la formazione di polimeri. Stilmann et al. (2009) hanno identificato chiaramente un nuovo meccanismo di attivazione NF-κB pro-sopravvivenza mediato tramite il polimero PAR. Sulla base delle nostre osservazioni, possiamo proporre un ulteriore meccanismo (Figura 7). L'interfaccia di legame al DNA di p65 è sepolta fino a quando non viene indotto un cambiamento conformazionale, di solito quando p65 si trova in prossimità della regione caricata negativamente della sua sequenza di consenso del DNA (Ghosh et al., 1999). È noto che il polimero PAR ha una grande carica negativa complessiva (Ueda e Hayaishi, 1985). Poiché non abbiamo mostrato alcun cambiamento nei livelli di p65 nucleare a seguito di danni al DNA o trattamento con AG-014699, ma tuttavia il legame con il p65 del DNA è aumentato sulla stimolazione della formazione di polimeri, possiamo postulare che la carica negativa sul polimero induca questo cambiamento conformazionale in p65, portando così ad un aumento dell'attivazione del legame e della trascrizione (Figura 5). I dati che presentiamo qui utilizzando l'inibitore PARG, ADP-HPD, supportano questa ipotesi. Mostriamo che una maggiore stabilità dei polimeri, in virtù dell'inibizione della degradazione dei polimeri, porta a una persistenza del legame del DNA NF-κB, un aumento dell'espressione genica anti-apoptotica e una protezione contro la morte cellulare indotta da IR. Ciò conferma un ruolo per il polimero PAR nell'attivazione di NF-κB a seguito di danni al DNA.

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PAR è essenziale per il danno al DNA attivato NF-κB. ( a ) Il danno al DNA, come IR, attiva il PARP-1, reclutandolo nel sito del DNA danneggiato. Ciò provoca la formazione del polimero PAR caricato negativamente. L'eterodimero NF-κB p65-p50 viene inoltre traslocato nel nucleo in seguito a danno del DNA attraverso l'attivazione della via canonica dell'attivazione di NF-κB. In prossimità di regioni con carica negativa complessiva, come quella del polimero PAR, può essere indotta una variazione conformazionale in p65, esponendo l'interfaccia di legame al DNA caricata positivamente di p65. Pertanto, proponiamo che è questa carica negativa sul polimero PAR che sta attirando p65 per legare il DNA, (poiché PARP-1 e il polimero sono reclutati in siti di DNA danneggiato), sovraregolando la trascrizione di geni dipendenti da NF-κB, proteggendo contro l'apoptosi e conferendo radio-resistenza. ( b ) Quando è presente l'inibitore PARP, AG-014699, PARP-1 non è più attivo e non può formare il polimero. Quindi in questo caso, vediamo una riduzione del legame con il DNA e l'attivazione trascrizionale dopo IR, con induzione dell'apoptosi e infine radio-sensibilizzazione.

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L'inibizione di NF-κB è chiaramente un bersaglio attraente per la terapia del cancro (Gilmore e Herscovitch, 2006). Tuttavia, l'inibizione globale può anche avere alcuni aspetti negativi. Ad esempio, NF-κB ha un ruolo vitale nella risposta infiammatoria, e quindi la completa inibizione di NF-κB, ad esempio, con un inibitore IKK, può avere effetti negativi. Il complesso IKK ha molte funzioni conosciute all'interno della cellula (Chariot, 2009; Criollo et al., 2010) e l'inibizione può essere citotossica. Long-term NF-κB inhibition may also increase the likelihood of immunodeficiency, because it has a pivotal role in the innate and adaptive immune response, and can possibly delay bone marrow recovery because of some reports of chemotherapeutic-induced apoptosis of hematopoietic progenitors (Grossman et al., 1999; Turco et al., 2004). The data here suggest that AG-014699 inhibits IR-induced NF-κB activation but not an inflammatory stimulus and thus may overcome these potential toxicities. Furthermore, ongoing gene expression analysis shows that AG-014699 has no effect on vital inflammatory response genes following TNF-α treatment (data to be published separately). Consequently, blockade of DNA damage-activated NF-κB by AG-014699 may therefore represent preferable therapeutic strategy, because we demonstrate here that the survival function of NF-κB can be directly inhibited without compromising other functions, such as the immune response.

AG-014699 has been shown to be efficacious both in vitro and in vivo (Plummer et al., 2008; Daniel et al., 2009; Zaremba et al., 2009; Drew et al., 2010) and is currently in phase II trials for BRCA defective breast and ovarian cancer as a single agent (//www.clinicaltrials.gov). AG-014699 was the first PARP inhibitor to enter clinical trial for cancer therapy and phase I trials showed that profound and sustained PARP inhibition could be achieved after a single intravenous infusion (Plummer et al., 2005a, 2005b). Phase II trials combining AG-014699 with temozolomide in metastatic melanoma patients showed an improvement in the response rate in comparison with temozolomide alone (Plummer et al., 2006). A number of pharmaceutical companies are now undertaking clinical trials of PARP inhibitors for the treatment of cancer (Drew and Plummer, 2009); however, this is the first investigation of the clinically relevant PARP inhibitors in the context of their potential utility as inhibitors of DNA damage-induced NF-κB activation.

Radio-therapy is one of the main-stays of therapy for glioblastoma multiforme, the most frequent and refractory adult brain tumor (Burger et al., 1985). Aberrant activation of NF-κB is known to have a role in the tumorigenesis of both diffuse and high-grade gliomas (Kanzawa et al., 2003; Wang et al., 2004). Hence, here we have used the glioblastoma cell line, U251, to highlight the potential utility of AG-014699 in inhibiting DNA damage-activated NF-κB in tumor cells.

In summary, this is the first report to demonstrate that a very potent and specific PARP-1 inhibitor, AG-014699, can re-sensitize cells to irradiation and that this is mediated directly via NF-κB, rather than the inhibition of SSB repair. These data present a novel mechanism for PARP-1 in the regulation of NF-κB and highlight important new therapeutic avenues for the use of PARP inhibitors, which may prove useful in overcoming NF-κB-mediated therapeutic resistance.

Materiali e metodi

Linee cellulari e reagenti

The p65 +/+ and p65 −/− MEFs were kindly provided by Professor Ron Hay, Dundee University, UK. PARP-1 +/+ and PARP-1 −/− MEFs were a gift from Professor Gilbert de Murcia, École Superieure de Biotechnologie de Strasbourg, France. All of the above cell lines were cultured in RPMI-1640 medium (supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum and 2 m M glutamine). The p65 −/− control MEFs, and the MEFs that have been genetically complemented with WT protein were a kind gift from Professor Neil Perkins, Newcastle University, UK. These were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium medium (supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum, 2 m M glutamine and 4 μg/ml Puromycin). The U251 glioblastoma cell line was donated by Dr Gareth Veal, Newcastle University, UK, and was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium medium (supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum and 2 m M glutamine).

PARP-1 Inhibitor. AG-014699 was synthesized by Pfizer GRD, La Jolla, CA, USA. AG-014699 was dissolved in anhydrous dimethylsulphoxide (Sigma, Dorset, UK) at a stock concentration of 10 m M and stored at −20 °C. AG-014699 was added in cell culture such that the final dimethylsulphoxide concentration was kept constant at 0.1% (v/v), and was used at a final concentration of 0.1 μ M in all experiments.

PARG inhibitor. ADP-HPD was purchased from ENZO Life Sciences, Exeter, UK. It was dissolved in sterile H 2 O (Gibco, Paisley, Scotland) at a stock concentration of 5 mg/ml and stored at −20 °C. ADP-HPD was added in cell culture at a final concentration of 1 μ M in all experiments.

trasfezione siRNA

Cells were seeded in six-well cell culture plates at a density of 5 × 10 4 in 2 ml and incubated overnight. siRNA targeting human p65 (5′-GCCCUAUCCCUUUACGUCA-3′); or PARP-1 (5′-GGAGGAAGGUGUCAACAAA-3′; both from Dharmacon, Cramlington, UK) was transfected at a final concentration of 50 n M using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK), according to the manufacturer's instructions. Controls used included NS siRNA and mock/vehicle only transfected cells. p65 or PARP-1 knock down was confirmed by western analysis (Figure 1).

PARP activity assay

PARP activity was determined in cells transfected with siRNA (or relevant controls, as described above), which had been treated with AG-014699 or dimethylsulphoxide, using a validated assay (Plummer et al., 2005a, 2005b; Zaremba et al., 2009). Briefly, basal PARP activity present in cells was measured in 1 × 10 4 permeabilized cells that had been incubated with NAD + and oligonucleotide (to maximally stimulate PARP activity) (Sigma). PARP activity was also assessed following treatment with IR or TNF-α, by omitting the oligonucleotide stimulation step. The reaction was terminated with excess AG-014699, and replicate samples ( n =3) were blotted onto nitrocellulose membrane (Hybond N, Amersham, UK). A standard curve of purified PAR polymer (pmol of PAR) (Biomol, Exeter, UK) was also blotted to aid with quantification. The membrane was probed with PAR-specific antibody (10 H, a kind gift of Professor Burkle, University of Konstanz, Germany) and chemiluminescence was detected using a 5-min exposure on the Fuji-LAS 3000 CCD camera (Raytex, Sheffield, UK). Images were analyzed using Aida Imaging Analyzer (Raytest, Chesterfield, UK). Data was normalized to mock- (vehicle alone) treated controls and results shown are the mean of three independent experiments.

Western blotting

Proteins were resolved on 4–20% (v/v) Tris-glycine gradient gels (Invitrogen Ltd) and electrotransferred onto nitrocellulose (Hybond C, Amersham, UK). Antibodies against PARP-1 (H-250), p50 (8414), p65 (8008) were purchased from Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA, USA). As loading controls, actin antibody (CP01; Calbiochem, Nottingham, UK) was used for whole cell extracts, lamin A/C (7293; Santa Cruz Biotechnology) for nuclear extracts and α-tubulin for cytoplasmic extracts (Sigma). This was followed by binding of peroxidase-conjugated goat anti-mouse/rabbit antibody (DAKO, Ely, UK) and detection by enhanced chemiluminescence (Amersham, UK). Cells were pretreated with AG-014699 for 1 h and exposed to IR. Cells were harvested at different time points and whole cell extracts were taken using sodium dodecyl sulfate lysis buffer (100 m M Tris–Hcl pH 6.8, 20% v/v glycerol, 4% w/v sodium dodecyl sulfate). Nuclear and cytoplasmic extracts were prepared using the NE-PER extraction kit as per the manufacturer's instructions (Pierce-Perbio Science, Cheshire, UK). α-Tubulin was not detected in nuclear extracts and conversely, lamin was absent in all cytoplasmic extracts thus demonstrating the efficient separation of nuclear extracts. Bands were quantified and normalized to their relevant loading controls using densitometry (Fuji LAS 3000 Imaging).

Test di citotossicità

Clonogenic assays were carried out as described previously (Veuger et al., 2003) and cloning efficiencies were normalized to untreated controls. PF 50 (potentiation factor at 50% cell kill) values were calculated from the ratio of the individual LD 50 (lethal dose producing 50% cell kill) values: that is, LD 50 divided by LD 50 in the presence of AG-014699.

Annexin-V flow cytometry

Apoptosis was measured using the FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Oxford, UK), as per the manufacturer's instructions. Briefly, cells were transfected with p65 siRNA (or relevant controls) 48 h before to 1 h pretreatment with AG-014699 and subsequent irradiation. Cells were harvested and resuspended in 100 μl binding buffer (0.01 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 0.14 M NaCl, 0.25 m M CaCl 2 ). Fluorescein isothiocyanate annexin V and propidium iodide staining solution were added and cells were incubated for 15 min at room temperature, in the dark. Cells were analyzed using the Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson, Oxford, UK) and Cell Quest Software (Becton Dickinson). Results are the mean of three independent experiments.

COMET assay

Following IR treatment, SSB levels were quantified using the alkaline Comet assay (Trevigen, Gaithersberg, MD, USA) following the manufacturer's protocol. Briefly, cells were washed and resuspended in ice-cold phosphate-buffered saline before mixing with proprietary low melting point agarose (37 °C). This mixture was pipetted onto a CometSlide (Trevigen) and allowed to gel at 4 °C. Following lysis, slides were subjected to electrophoresis under alkaline conditions at 20 V for 40 min and then fixed, dried, and stained with SYBR Green I. An Olympus BH2-RFCA fluorescence microscope ( × 10 objective) (GX Optical, Suffolk, UK) with Hamamatsu ORCA II BT-1024 cooled CCD camera (Hamamatsu Photonics, Massy, France) was used to capture images. Image Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA) was used for image capture and analysis was performed using Komet software v 5.5 (Kinetic Imaging, Nottingham, UK). Data for repair kinetics were expressed as a percentage, with 100% representing the mean number of breaks at time 0 post-IR treatment, in the presence of absence of AG-014699. Subsequent time points are expressed as a percentage of the time 0 point.

NF-κB DNA-binding assay

NF-κB p65 DNA-binding activity was determined using an enzyme-linked immunosorbent assay-based EZ detect assay according to the manufacturer's instructions (Promega Southampton, UK). Briefly, streptavidin-coated 96-well plates are bound with biotinylated κB consensus sequence oligonucleotides (5′-GGGACTTTCC-3′). Cells were transfected with siRNA, or relevant controls 48 h before a 1 h pretreatment with AG-014699 and subsequent irradiation. In all, 5 μg of nuclear extracts (prepared 2 h after irradiation, as described above) were added to each well and incubated with primary antibody specific for p65. Binding was detected using a secondary horseradish peroxidase-conjugated antibody and chemiluminescence measured using a CCD camera (LAS-300; Fujifilm). Purity of cytoplasmic and nuclear extracts was confirmed as described above.

Reporter gene assay

Cells were seeded onto 24-well plates and incubated for 24 h. Cells were transiently transfected with 200 ng of an NF-κB-luciferase construct containing three tandemly repeated NF-κB consensus sequence-binding sites in the promoter (Professor Ron Hay, Dundee University), together with 200 ng of a pCMB-β-galactosidase plasmid containing a minimal promoter element up-stream from the β-galactosidase gene, using Lipofecamine 2000 (Invitrogen) for 6 h. siRNA transfection was undertaken simultaneously, as described above. At 48 h after transfection, cells were treated with AG-014699 for 1 h before IR. Following 8-h incubation, cells were lysed and assayed for luciferase activity according to the manufacturer's instructions (Promega, Southampton, UK). Luciferase activity was corrected for β-galactosidase activity as described previously (Brady et al., 1999), and relative activities expressed as fold changes.

Informazione supplementare

File di immagine

  1. 1.

    Figura supplementare S1

  2. 2.

    Figura supplementare S2

  3. 3.

    Figura supplementare S3

  4. 4.

    Figura supplementare S4

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  1. 1.

    Leggende di figure supplementari

    Informazioni supplementari accompagna l'articolo sul sito Web di Oncogene (//www.nature.com/onc)