Una nuova famiglia di geni slitrk è espressa su cellule staminali ematopoietiche e leucemie | leucemia

Una nuova famiglia di geni slitrk è espressa su cellule staminali ematopoietiche e leucemie | leucemia

Anonim

Alla ricerca di nuovi marcatori per cellule ematopoietiche primitive, abbiamo scoperto che una nuova famiglia di sei recettori transmembrana putativi, chiamata slitrk1-slitrk6 , di recente descrizione , sono espressi su cellule leucemiche e linfomatiche e su cellule staminali ematopoietiche. Gli slitrk appartengono alla superfamiglia ripetuta ricca di leucina. Sono proteine ​​transmembrane a passaggio singolo, con omologia alla famiglia delle fessure nel dominio extracellulare N-terminale e ai recettori della neurotrofina trk nel dominio intracellulare C-terminale; quindi assegnato con il nome slitrk . 1 Gli slitrk sono altamente conservati attraverso l'evoluzione, con gli umani che sono 89-97% omologhi con quelli murini . 2 Aruga e Mikoshiba 1 hanno descritto il modello di espressione di questi geni nello sviluppo del cervello e del midollo spinale, nonché il loro coinvolgimento nel controllo della migrazione dei neuriti e nella guida assonale. Abbiamo precedentemente descritto l'espressione differenziale di slitrk5 (indicato come KIAA0918) su linee cellulari leucemiche CD34 +. 3 Questi dati hanno portato all'ipotesi che fossero rilevanti per l'ematopoiesi e possibilmente leucemogenesi. I risultati del presente studio hanno rivelato che su 13 linee cellulari leucemiche tutte e quattro leucemia linfoblastica acuta, cinque su sette leucemia mieloide acuta e tutte e due le linee cellulari di leucemia mieloide cronica esprimono uno o più membri della famiglia degli slitrk (Figura 1a). Il confronto tra le due linee cellulari strettamente correlate KG1 e KG1a ha rivelato un modello di espressione specifico per slitrk4 : è espresso solo dalla variante indifferenziata KG1a, ma non dalla linea cellulare parentale KG1. Solo due linee cellulari leucemiche non esprimono alcuno dei fessure , vale a dire le linee cellulari leucemiche mieloidi NB4 e HL60. Sebbene non sia stato possibile rilevare un modello di espressione ben definito , vi è una tendenza verso le cellule leucemiche linfoblastiche che esprimono più slitrk1 e slitrk6 , mentre le cellule leucemiche mieloidi esprimono più slitrk4 e slitrk5 . Le linee cellulari del linfoma hanno mostrato un modello di espressione distinto; ad esempio, due linee cellulari (Daudi e GA10) non mostrano alcuna espressione di nessuno degli slitrk mentre tre linee cellulari (BC1, BC3 e BCBL1) mostrano l'espressione di cinque su sei slitrks (Figura 1b). In particolare, queste ultime linee cellulari sono tutte linfomi a effusione primaria (PEL), un'entità clinica distinta di linfomi diffusi localizzati nella cavità corporea senza massa a singolo tumore e una prognosi peggiore rispetto ad altri linfomi. 4, 5

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Espressione di slitrk1 - slitrk6 da parte delle cellule primarie e delle linee cellulari di leucemia e linfoma. RT-PCR è stata eseguita su cDNA da linee cellulari di leucemia e linfoma e cellule primarie. ( a ) Sia i sottogruppi mieloidi che linfoidi delle cellule leucemiche esprimono vari fessure , le leucemie linfoidi esprimono più slitrk1 e slitrk6 , mentre le leucemie mieloidi esprimono più slitrk4 e slitrk5 . Nessuna delle linee cellulari leucemiche studiate esprime slitrk3 ; NB4 e HL60 non esprimono alcun membro degli slitrks . ( b ) Le linee cellulari di linfoma esprimono una gamma più ampia di slitrk rispetto alle linee cellulari leucemiche, in particolare il linfoma a effusione primaria (BC1, BC3 e BCBL1), che esprimono cinque su sei slitrks ; Daudi e GA-10 non esprimono alcun membro di slitrk . ( c ) RT-PCR è stata eseguita su cDNA da cellule staminali embrionali, BS fetale, HFF adulti e HUVSC, HUVEC e MNC. Per ogni campione di cDNA (corsia superiore) è stato eseguito un campione di RNA (corsia inferiore) per controllare la contaminazione del DNA genomico. I numeri sul lato sinistro indicano le dimensioni dei frammenti della scala del DNA in coppie di basi.

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Per valutare i modelli di espressione degli slitrk da parte delle cellule primarie, abbiamo studiato l'espressione dei geni slitrk su cellule mononucleate umane (MNC) isolate da sangue periferico, cellule endoteliali delle vene ombelicali umane (HUVEC), stroma osseo fetale umano (BS), fibroblasto del prepuzio umano ( HFF) e cellule di stroma delle vene ombelicali umane (HUVSC) e cellule staminali embrionali umane Miz-hES5 mediante reazione a catena della transcriptasi-polimerasi inversa (RT-PCR). Tutti e sei i membri della famiglia slitrk sono stati espressi da cellule staminali embrionali umane (ESC) (Figura 1c). Per escludere la possibilità di contaminazione da parte delle cellule feeder di fibroblasti embrionali di topo (MEF), abbiamo dimostrato che i membri di slitrk umani non erano espressi da MEF usando lo stesso set di primer. La BS fetale umana ha mostrato uno schema simile a quello dell'ESC, così come l'HUVSC, con tutti e sei i membri di fessure espressi su queste cellule. Tuttavia, l'HFF per adulti ha mostrato un modello diverso e più specifico, esprimendo solo slitrk1 e slitrk6 (Figura 1a). Ciò suggerisce che i tessuti embrionali e fetali mantengono l'espressione di fessure durante lo sviluppo, in contrasto con le cellule differenziate terminalmente.

L'analisi dell'espressione di slitrk sulle cellule vascolari ha rivelato un modello di espressione altamente contrastante con quello dei fibroblasti. L'analisi RT-PCR ha mostrato che HUVEC esprimeva solo slitrk4 e slitrk5 (Figura 1c). L'attivazione di HUVEC con interleuchina1 (IL1) o acetato di mirbolato di miristato (PMA) non ha avuto effetti significativi sul modello di espressione di slitrk1-slitrk6 , tranne che per un leggero aumento dell'espressione di slitrk5 . Le MNC umane isolate dal sangue periferico di donatori sani mediante separazione del gradiente di densità (Ficoll) esprimono solo slitrk4 e slitrk5 (Figura 1c). Questo modello di espressione di slitrk4 e slitrk5 è identico a quello rilevato sugli HUVEC, ma molto diverso dalle linee cellulari leucemiche studiate. Questa differenza nell'espressione di slitrk tra le linee cellulari di leucemia e linfoma e la normale MNC è probabilmente dovuta alla riattivazione degli slitrk durante la trasformazione maligna. Poiché MNC ha mostrato espressione di slitrk4 e slitrk5 , abbiamo studiato l'espressione di questi due geni in diverse frazioni di MNC (MNC totale, CD8 +, CD4 + CD14 + e CD19 +), usando PCR quantitativa (qPCR; Taqman) su un pannello di DNA complementare disponibile in commercio (cDNAs; Human MT Fractions MTC Panel di Clontech, Mountain View, CA, USA). qPCR ha rivelato che slitrk4 è principalmente espresso nel compartimento CD14 + (monociti), mentre slitrk5 è stato principalmente espresso da cellule T (CD8 + e CD4 +) (Figura 2a).

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Espressione di slitrk 4 e slitrk 5 da parte di cellule primarie umane e cellule staminali / progenitrici ematopoietiche e l'effetto dell'impegno di lignaggio. ( a ) cDNA da cellule mononucleari totali (MNC) e loro frazioni sono state analizzate da qPCR (Taqman) per l'espressione di slitrk4 e slitrk5 : slitrk4 è espresso principalmente nel compartimento monocitico (CD14 +), mentre slitrk5 è principalmente espresso da cellule T ( CD8 + e CD4 +); l'espressione relativa è data in molteplici espressioni di MNC totale (media), le barre di errore rappresentano la deviazione standard ( n = 3, misura indipendente). ( b ) Le cellule sono state isolate usando l'ordinamento cellulare (midollo osseo) o isolamento magnetico (sangue cordonale e sangue mobilizzato) e qPCR è stato eseguito su cDNA dalle rispettive cellule. L'espressione relativa di slitrk4 e slitrk5 nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche isolate dal midollo osseo adulto, dal sangue cordonale o dal sangue periferico mobilizzato è più alta nelle popolazioni CD34 + immature rispetto alle popolazioni CD34. Midollo osseo: risultati rappresentativi mostrati; sangue cordonale e sangue mobilizzato: l'espressione di slitrk4 o slitrk5 sulle cellule CD34 è rappresentata in percentuale della popolazione CD34 + (media) e le barre di errore rappresentano la deviazione standard ( n = 3, esperimenti indipendenti). ( c, d ) le cellule ematopoietiche CD34 + sono state differenziate in vitro e qPCR (Taqman) è stato eseguito su cDNA dalle rispettive cellule. ( c ) Mostra l'analisi dei marker di superficie CD11b, CD41a e CD235a mediante citometria a flusso. ( d ) Mostra l'espressione relativa di slitrk4 e slitrk5 da parte delle cellule indifferenziate CD34 + e delle cellule differenziate in vitro misurate mediante PCR quantitativa. L'espressione relativa per ciascun gruppo è data in percentuale dell'espressione relativa corrispondente delle cellule CD34 + (media), le barre di errore rappresentano la deviazione standard ( n = 3, esperimenti indipendenti). G-CSF: cellule trattate con fattore stimolante le colonie di granulociti; EPO: cellule trattate con eritropoietina; TPO: cellule trattate con trombopoietina.

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La scoperta iniziale di fessure espresse su cellule leucemiche CD34 + ci ha spinto a invesitgate l'espressione di fessure sulle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche. Le cellule staminali e progenitrici CD34 + CD38 ematopoietiche e CD34 + sono state ordinate dal midollo osseo umano (MoFlo High-Performance Cell Sorter, Dako Cytomation, Glostrup, Danimarca) e isolate dal sangue cordonale e dal sangue periferico mobilizzato di donatori sani, rispettivamente (magnetico smistamento delle cellule; MACS Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA). L'analisi qPCR ha rivelato che popolazioni altamente purificate di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche CD34 + CD38 umane isolate dal midollo osseo esprimono slitrk4 e slitrk5 , ma non altri membri della famiglia slitrk . La frazione CD34 + CD38 + esprimeva anche slitrk4 e slitrk5 , mentre le cellule della frazione CD34 esprimevano entrambi i geni a un livello molto basso (Figura 2b). Le cellule progenitrici ematopoietiche umane CD34 + isolate dal sangue del cordone ombelicale esprimevano anche sia slitrk4 che slitrk5 , mentre la popolazione CD34 esprimeva livelli significativamente più bassi di slitrk4 e slitrk5 (Figura 2b). Questo modello è riprodotto nelle popolazioni CD34 + e CD34 purificate dal sangue periferico mobilizzato di donatori sani trattati con fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) (Figura 2b).

Poiché la frazione CD34 esprime slitrk4 e slitrk5 solo a un livello basso, abbiamo studiato l'espressione di questi geni in seguito alla differenziazione in vitro guidata da citochine delle cellule umane CD34 +. La popolazione CD34 + purificata dal sangue cordonale è stata selettivamente differenziata in lignaggi mieloidi / granulocitici, eritroidi e megacariocitici usando G-CSF, eritropoietina (EPO) o trombopoietina (TPO), rispettivamente, per 12 giorni. Il fenotipo delle cellule differenziate è stato confermato dalla citometria a flusso utilizzando tre marcatori specifici del lignaggio, vale a dire CD11b per il mieloide, CD41a per il megacariocitico e CD235a per il lignaggio eritroide (Figura 2c). Sorprendentemente, sebbene le cellule indifferenziate mostrassero una solida espressione di slitrk4 e slitrk5 , l'espressione di questi geni fu drasticamente ridimensionata al momento della differenziazione nei lignaggi analizzati. Sono stati rilevati solo livelli molto bassi di slitrk4 e slitrk5 sul CD11b + mieloide maturo, CD41a + megacariocitico o CD235a + eritroide (Figura 2d). Questi dati indicano che slitrk4 e slitrk5 sono prevalentemente espressi su cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane immature.

Le cellule staminali ematopoietiche sono state studiate per il loro potenziale di ricostituzione dell'ematopoiesi 6 e per la loro promessa di obiettivi nel trattamento delle neoplasie ematologiche. 7 Qui mostriamo per la prima volta che cellule multipotenti indifferenziate, tra cui ESC umano e BS fetale, esprimono tutti e sei i membri della famiglia degli slitrk , indicando la potenziale importanza degli slitrk per l'identificazione di queste cellule primitive durante i processi di sviluppo. Tuttavia, le cellule staminali e progenitrici adulte, ad esempio le cellule CD34 + CD38 + del midollo osseo umano e il sangue cordonale derivato, nonché le cellule CD34 + mobilizzate, esprimono solo slitrk4 e slitrk5. Il nostro studio suggerisce che gli slitrks potrebbero essere coinvolti nell'ematopoiesi normale e maligna, come indicato dall'espressione sulle leucemie, e possibilmente nello sviluppo embrionale. Pertanto, gli slitrks possono costituire un nuovo marcatore delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche e delle cellule staminali embrionali. Anche così, ulteriori studi devono essere condotti per chiarire ulteriormente la funzione biologica delle fessure .