Un romanzo di piccola molecola idrossilato inibisce preferibilmente l'attività dell'hdac6 e la crescita del tumore | diario britannico del cancro

Un romanzo di piccola molecola idrossilato inibisce preferibilmente l'attività dell'hdac6 e la crescita del tumore | diario britannico del cancro

Anonim

Soggetti

  • Terapia del cancro
  • Meccanismo di azione
  • Farmacologia

Astratto

Sfondo:

Questo studio indaga se un inibitore dell'istone deacetylase sottotipo 6 (HDAC6) possa essere usato nel trattamento dei tumori solidi.

metodi:

Abbiamo valutato l'effetto di un nuovo inibitore, C1A, sull'attività biochimica dell'HDAC6 e sulla crescita cellulare. Abbiamo esaminato ulteriormente il potenziale dell'imaging non invasivo precoce della proliferazione cellulare mediante tomografia ad emissione di positrone di fluorotimidina [ 18 F] ([ 18 F] FLT-PET) per rilevare la risposta alla terapia.

risultati:

L'acetilazione indotta da C1A di substrati di HDAC6, α- tubulina e HSP90, rispetto all'attuale SAHA inibitore di HDAC clinicamente approvato. Il C1A ha indotto l'apoptosi e ha inibito la proliferazione di un pannello di linee cellulari tumorali umane di diversa origine nella bassa gamma micromolare. La somministrazione sistemica del farmaco ha inibito la crescita dei tumori del colon in vivo del 78%. Il farmaco ha mostrato un'attività limitata sull'espressione genica con <0, 065% dei geni modulati durante 24 ore di trattamento. Il trattamento con C1A ha ridotto l'assorbimento di FLT del tumore [ 18 F] di 1, 7 volte a 48 ore, suggerendo che l'imaging molecolare potrebbe fornire valore in studi futuri su questo composto.

Conclusione:

C1A inibisce preferibilmente l'HDAC6 e modula gli obiettivi a valle dell'HDAC6 portando all'inibizione della crescita di una serie diversificata di linee cellulari tumorali. Questa proprietà, unita alla farmacocinetica favorevole e all'efficacia in vivo, la rende candidata per un ulteriore sviluppo preclinico e clinico.

Principale

Gli enzimi dell'istone deacetylase (HDAC) che influenzano lo stato di acetilazione degli istoni e varie proteine ​​cellulari sono stati riconosciuti come bersagli terapeutici nei disturbi del sistema nervoso centrale e nel cancro (Xu et al, 2007; Kazantsev e Thompson, 2008; Haberland et al, 2009; Marks e Xu, 2009). Due inibitori, vorinostat (SAHA) e romidepsina, sono stati approvati dalla FDA per il trattamento del linfoma cutaneo a cellule T (Duvic e Vu, 2007; Piekarz et al, 2009). Esistono 18 HDAC, classificati strutturalmente in classe I (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8), classe IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9), classe IIb (HDAC6, HDAC10), classe III (sirtuine; SIRT1-7 ) e gruppi di classe IV (HDAC11). Gli HDAC di classe I sono principalmente nucleari, espressi in modo ubiquitario e mostrano attività enzimatica nei confronti dei substrati istonici. I membri della classe II si spostano tra il nucleo e il citoplasma, colpiscono principalmente substrati non istonici e la loro espressione è specifica del tessuto. Parallelamente all'esplosione della ricerca sull'HDAC, il numero di candidati ai farmaci inibitori dell'HDAC (HDACI) è cresciuto esponenzialmente nell'ultimo decennio. La maggior parte degli HDACI finora descritti inibisce più isoforme HDAC, in particolare HDAC1 e HDAC3, e sebbene abbiano effetti antiproliferativi desiderabili, un certo numero di questi provoca anche effetti collaterali profondi, tra cui soppressione del midollo osseo, perdita di peso, affaticamento e aritmie cardiache (Bruserud et al, 2007; Marsoni et al, 2008). La scoperta di HDACI con diversi profili isoformi o in effetti un'inibizione selettiva isoforme è importante per chiarire il meccanismo d'azione di specifici enzimi HDAC e può avere maggiori promesse rispetto alle loro controparti non selettive, riducendo al minimo la tossicità.

HDAC6 è recentemente emerso come un target attraente per la cura del cancro (Boyault et al, 2007; Lee et al, 2008; Kawada et al, 2009; Rivieccio et al, 2009). HDAC6 ha dimostrato di essere la deacetilasi per una diversa serie di substrati coinvolti nella tumorigenesi, come HSP90, α- tubulina, cortattina e perossiredossine, ma a differenza di altri HDAC, si ritiene che l'inibizione di HDAC6 non sia associata a grave tossicità; Il knockout di HDAC6 nei topi non porta alla letalità embrionale (Hubbert et al, 2002; Haggarty et al, 2003; Bali et al, 2005; Zhang et al, 2007; Parmigiani et al, 2008; Witt et al, 2009; Kaluza et al, 2011). Ad oggi, gli inibitori selettivi dell'HDAC6 (tubacina, tubastatina A) hanno contribuito solo a convalidare l'HDAC6 come target, ma i loro profili farmacocinetici sfavorevoli (PK) hanno impedito loro di ulteriore sviluppo preclinico e clinico, rendendoli solo buoni strumenti di ricerca (Haggarty et al, 2003; Butler et al, 2010).

Qui riportiamo lo sviluppo di un nuovo inibitore HDAC6, C1A. Mostriamo che, C1A induce la morte cellulare e una significativa inibizione della crescita in un pannello di cellule tumorali e, grazie al suo profilo PK favorevole, è efficace nei tumori solidi in vivo .

risultati

C1A è un efficace inibitore dell'HDAC6

Il C1A è stato sviluppato sulla base della trichostatina A e SAHA di pan HDACI presenti in natura. Sebbene il mantenimento della parte idrossammata della molecola, responsabile del legame con la tasca Zn 2+ di HDAC in generale, la porzione di senape azotata aromatica, originariamente introdotta per migliorare la durata dell'azione farmacologica, è stata trovata per migliorare il legame preferenziale con HDAC6 (Figura 1A ; Finnin et al, 1999). È stato utilizzato un approccio di modellistica molecolare per illustrare l'affinità preferenziale tra dominio catalitico C1A e HDA6 (cd) II (Figura 1B e C) rispetto a HDAC1cd (Figura 1D ed E). In molti aspetti, la modalità di associazione per le due isoforme, HDAC1 e HDAC6, è molto simile. Entrambi sono legati allo ione Zn 2+ nella parte inferiore della tasca in modo bidentato. Esistono interazioni idrofobiche tra la catena di carbonio coniugata di C1A e le catene laterali di Phe150 e Phe205 in HDAC1cd e le catene laterali di Phe620 e Phe680 in HDAC6cdII. Tuttavia, ci sono differenze importanti che si possono vedere confrontando le superfici accessibili dall'acqua. Per HDAC1cd, la senape all'anilina si lega alla superficie della proteina in una zona sfavorevole esposta al solvente. La tasca HDAC6cdII è molto più ampia e può ospitare molto meglio l'inibitore, e la porzione di senape all'anilina si lega a un solco idrofobo ben definito, che contribuisce alla selettività isoforme osservata.

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Specificità migliorata di C1A verso HDAC6 rispetto a HDAC1. ( A ) Struttura chimica di C1A. ( BE ) Strutture rappresentative dei modelli di omologia del dominio catalitico HDAC6, (HDAC6cdII; area di superficie accessibile ai solventi 3D ( B ); diagramma a nastro 3D che mostra le interazioni chiave degli amminoacidi ( C ) e HDAC1cd (area di superficie accessibile ai solventi 3D ( D ); 3D diagramma a nastro che mostra le interazioni chiave degli aminoacidi ( E ) con C1A legato allo Zn 2+ nel sito attivo. La colorazione elettrostatica della superficie in B e D è rossa (carica negativa) e blu (carica positiva). ( F ) Inibizione dell'HDAC6 ricombinante e HDAC1 di C1A.

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C1A ha inibito HDAC di classe I / II e sirtuine, con la massima affinità per HDAC6 (IC 50 = 479 n M) rispetto a HDAC1 (IC 50 = 14 μ M; Figura 1F e Tabella supplementare S1). L'HDAC8 è stato inoltre inibito dal C1A a concentrazioni submicromolari (tabella supplementare S1). I primi rapporti suggeriscono che l'inibizione del farmaco HDAC8 ha avuto scarso effetto nelle linee cellulari derivate da tumori solidi (ad es. HCT-116), che hanno suscitato la nostra attenzione verso l'inibizione dell'HDAC6 e la sua applicazione nei nostri modelli sperimentali di cancro (Balasubramanian et al, 2008).

Il trattamento con C1A influenza i substrati noti di HDAC6

Abbiamo valutato l'effetto di C1A su substrati HDAC6. Nelle cellule HCT-116 di carcinoma del colon umano, abbiamo osservato un aumento dell'acetilazione di α- tubulina e HSP90, substrati noti di HDAC6, già 4 h dopo 1 μ M di trattamento C1A (Figura 2A e B). L'effetto di C1A sull'acetilazione dell'α- tubulina era dipendente dalla concentrazione del farmaco a 4 e 24 h (Figura 2B e C). Anche il trattamento con l'inibitore ad ampio spettro clinicamente autorizzato, SAHA, ha aumentato l'acetilazione dell'α- tubulina. A differenza di C1A, tuttavia, SAHA ha aumentato l'acetilazione dell'istone H3, un biomarcatore per l'inibizione degli HDAC di classe I (Figura 2A e C). Se trattato ininterrottamente per 4 ore (10 μ M) e il farmaco è stato successivamente rimosso mediante lavaggio per imitare il dosaggio intermittente in vivo , l'acetilazione dell'α- tubulina è stata mantenuta per 3 ore dopo il lavaggio di C1A ma non con SAHA (Figura 2D). Questi risultati mostrano che il C1A è associato ad un effetto prolungato sulla risposta dell'HDAC6 che consentirebbe di dosare il farmaco meno frequentemente.

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C1A è un inibitore selettivo di HDAC6 associato ad un effetto prolungato. ( A ) Inibizione dei substrati di HDAC6 da parte di C1A (1 μ M; 4 h) rispetto a SAHA nelle cellule HCT-116. ( B ) Acetilazione dipendente dalla concentrazione del farmaco di α- tubulina a 4 ore e ( C ) a 24 ore rispetto all'espressione dell'istone acetile H3. ( D ) Effetto di 10 μ M C1A o SAHA sull'acetilazione dell'α- tubulina nelle cellule HCT-116 dopo 4 ore di incubazione e lavaggio del farmaco (cellule raccolte 3 ore dopo il lavaggio). ( E ) Effetto cognitivo di C1A e SAHA e C1A sulla proteina del cliente HSP90 CDK4 dopo un trattamento di 24 ore. L'inibitore HSP90, 17-AAG, è stato usato come controllo positivo. ( F ) Effetto del C1A sulla crescita delle cellule carenti di riparazione e competenti per la riparazione del DNA rispetto al clorambucile. Le linee cellulari UV23 e UV96 sono carenti di XPB ed ERCC1, rispettivamente; proteine ​​coinvolte nel percorso di riparazione dell'escissione nucleotidica. Irs1 e Irs1SF sono carenti di XRCC2 e XRCC3, rispettivamente; proteine ​​coinvolte nel percorso di riparazione della ricombinazione omologa. XRS5 è carente in XRCC5; proteine ​​coinvolte nella via non omologa di giunzione finale. Sono anche presentate curve di crescita nelle linee cellulari competenti per la riparazione dei genitori AA8 (per UV23, UV96 e Irs1SF), CHO-K1 (per XRS5) e V79 (per Irs1).

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La perdita di attività chaperone di HSP90 è una conseguenza funzionale della sua acetilazione (Scroggins et al, 2007). CDK4 è una proteina client riconosciuta del chaperone HSP90 e viene degradata dall'inibizione di HSP90 (Banerji et al, 2005). Sia C1A che SAHA erano associati a un declino dell'espressione di CDK4, coerente con l'inibizione di HSP90 (Figura 2E). Come controllo, anche il trattamento delle cellule con l'inibitore HSP90, 17-AAG, ha ridotto l'espressione di CDK4 in queste cellule (Figura 2E). Il trattamento con tubastatina A di controllo positivo, un composto dello strumento inibitore dell'HDAC6, è stato anche associato a un declino del CDK4, in concomitanza con un aumento dipendente dalla concentrazione farmacologica della forma acetilata di α- tubulina (Figura 1 supplementare).

Allo stesso modo, le cellule HCT-116 trasfettate con shRNA HDAC6 hanno mostrato un aumento dell'acetilazione della α- tubulina in concomitanza con una diminuzione di CDK4 (Figura supplementare S2).

C1A non promuove l'alchilazione del DNA non specifica

Ci siamo chiesti se la presenza di una frazione di senape azotata nella C1A favorisse l'alchilazione del DNA non specifica. Poiché gli agenti alchilanti del DNA saranno generalmente più attivi nelle linee cellulari carenti nei macchinari di riparazione del DNA, abbiamo testato la potenza del farmaco nelle linee cellulari carenti delle proteine ​​di riparazione del DNA. Abbiamo dimostrato che, a differenza dell'agente alchilante del DNA clorambucile, la potenza inibitoria della crescita di C1A non è stata influenzata da difetti di riparazione del DNA (Figura 2F), suggerendo che la frazione di senape azotata in C1A non induca alchilazione di DNA non specifica.

L'inibizione dell'HDAC6 è associata all'attività antiproliferativa e all'apoptosi

C1A ha inibito la crescita di un pannello di 17 linee cellulari tumorali umane, comprese le linee cellulari derivate da 8 diversi tipi istologici di tumori solidi e un tipo di malignità delle cellule B, con un effetto inibitore della crescita medio (GI 50 ) di 3, 1 ± 2, 2 μ M dopo 72 ore di esposizione continua (Tabella 1). Quando le cellule sono state trattate per 6 ore, lavate e lasciate crescere per altre 72 ore in mezzo di crescita privo di droghe, l'effetto inibitorio della crescita di C1A era di oltre 300 volte maggiore rispetto a SAHA (Figura 3A). In condizioni di washout, quest'ultimo non ha mostrato alcun effetto antiproliferativo alle concentrazioni testate. L'effetto cellulare di C1A è stato ulteriormente caratterizzato nelle cellule HCT-116 per studiare il meccanismo di inibizione della crescita. Gli studi di citometria a flusso hanno mostrato che il trattamento delle cellule con C1A per 24 ore ha aumentato la popolazione sub-G1 in modo correlato alla concentrazione del farmaco (dal 4% nelle cellule non trattate al 64% alla massima concentrazione testata, ovvero 10 μ M; Figura 3B e C), suggerendo un meccanismo apoptotico. La caratteristica frazione sub-G1 aumentata è stata dimostrata anche nella linea cellulare di carcinoma ovarico umano A2780 ma non nella linea cellulare di carcinoma mammario umano carente di caspasi-3, MCF7 (Figura complementare S3; Janicke, 2009). Al contrario, SAHA ha aumentato la frazione di cellule arrestate in G2 / M (dal 30 al 41%) nelle cellule HCT-116. Anche il SAHA ha indotto una popolazione sub-G1, ma a differenza del C1A questo effetto ha raggiunto un plateau al 22% da una bassa concentrazione di droga. Abbiamo confermato l'aumento indotto dal farmaco nel sub-G1 come si verifica attraverso l'apoptosi misurando l'attività della caspasi-3/7: sia C1A che SAHA hanno indotto un aumento correlato alla concentrazione del farmaco nell'attività della caspasi-3/7 (Figura 3D); un aumento dell'attività della caspasi-3/7 è stato ulteriormente confermato nelle cellule HCT-116 mediante citometria a flusso (FLICA positivo / SYTOX rosso negativo; Figura supplementare S4). In queste cellule è stato anche osservato un aumento dipendente dalla concentrazione del farmaco nell'attività caspase-3/7 con tubastatina A (Figura supplementare S5). L'attivazione della caspasi-3/7 da parte di C1A si è verificata anche nella linea cellulare A2780 ma non nella linea cellulare MCF7 con carcinoma mammario con carpasi-3 (Figura supplementare S3). La proliferazione di cellule trasfettate con shRNA di HDAC6 è stata inibita del 24% dopo 3 giorni dalla semina, ma a differenza del trattamento farmacologico non è stata rilevata alcuna differenza nell'attività della caspasi-3/7 (Figura supplementare S6). Gli studi di citometria a flusso hanno rivelato che, le cellule trasfettate con shRNA HDAC6 avevano un aumento della popolazione sub-G1 (dall'1, 2% per shRNA-scramble al 31, 8% per shRNA HDAC6), suggerendo che il picco di caspase-3/7 potrebbe essersi verificato in precedenza punto temporale.

Tabella a grandezza naturale

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Effetto del C1A sulla proliferazione e l'apoptosi. ( A ) Effetto inibitorio della crescita di C1A e SAHA nelle cellule HCT-116 dopo 6 ore di incubazione, lavaggio e incubazione in mezzo privo di farmaco per altre 72 ore. ( BC ) Le cellule HCT-116 sono state trattate con C1A o SAHA per 24 ore e il profilo del DNA è stato analizzato mediante citometria a flusso. ( D ) Effetto del trattamento con C1A o SAHA (24 h) sull'attività della caspase-3/7. ( E ) Effetto di C1A o SAHA (24h – 10 μ M) sull'espressione di p21 nelle cellule HCT-116.

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L'inibizione del ciclo cellulare causata da SAHA è stata accompagnata da un aumento dell'inibitore della ciclina-CDK p21 che era stato precedentemente dimostrato essere una conseguenza dell'iperacetilazione dell'istone indotta da inibitori ad ampio spettro rivolti in gran parte alla classe I HDAC (Richon et al, 2000; Wilson et al, 2006; Figura 3E). Al contrario, i livelli di p21 sono rimasti invariati dopo il trattamento con C1A. Questi studi suggeriscono che l'attività preferenziale di C1A su HDAC6 inibisce la crescita cellulare e induce la morte cellulare in una varietà di linee cellulari.

Abbiamo quindi testato se diversi livelli di espressione della proteina HDAC6 possono avere un impatto sull'inibizione della crescita indotta da C1A. Si è scoperto che l'HDAC6 era espresso in modo ubiquitario e non sono state osservate differenze significative tra le linee cellulari tumorali testate rispetto all'HDAC1 (Figura supplementare S7). Non vi era alcuna relazione tra l'effetto inibitorio della crescita di C1A e HDAC6 né l'espressione della proteina HDAC1 (Figura supplementare S7).

L'inibizione dell'HDAC6 provoca attività antitumorale

Incoraggiati dai nostri risultati in vitro e sullo sfondo che gli inibitori dell'HDAC6 finora segnalati hanno una PK scadente, volevamo quindi sapere se il C1A potesse raggiungere livelli plasmatici sufficienti in vivo . I PK di C1A hanno seguito un modello a due compartimenti con un'emivita terminale apparente di 10 h (Figura 4A). La massima concentrazione di farmaco è stata rapidamente raggiunta (30 min) quando somministrato ip In particolare, dopo la somministrazione di C1A a 20 mg kg −1 si potevano raggiungere livelli equivalenti di GI 50 nelle cellule HCT-116. C1A ha mostrato caratteristiche PK lineari con aumenti dose-proporzionali osservati nella concentrazione plasmatica (Figura 4B).

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La C1A è associata a un profilo farmacocinetico favorevole e una significativa attività antitumorale. ( A ) Profilo farmacocinetico di C1A a seguito di una singola iniezione ip a 20 mg kg −1 ( n = 3). ( B ) Relazione dose-dipendente del profilo farmacocinetico 1 ora dopo l'iniezione ( n = 3). ( C ) Effetto di C1A sulla crescita tumorale nel modello di xenotrapianto di tumore del colon HCT-116 ( n = 6). ANOVA è stato fatto per determinare la significatività statistica tra controllo di gruppo e ogni gruppo trattato con C1A. ( D ) Sono indicati i pesi degli animali utilizzati nel corso dello studio.

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Successivamente, abbiamo testato se la potente attività in vitro di C1A combinata con le sue caratteristiche PK favorevoli ha favorito l'efficacia nei modelli di xenotrapianto di cancro nell'uomo. Diversi schemi e livelli di dose di C1A sono stati testati nel modello di xenotrapianto HCT-116 e l'attività antitumorale è risultata correlata alla dose. I tempi di raddoppio erano 4, 4 ± 1, 1, 8, 3 ± 1, 0, 7, 6 ± 1, 2 e 9, 5 ± 1, 5 giorni per topi di controllo del veicolo e topi trattati con C1A a 40 mg kg −1 qod, 20 mg kg −1 qd e 20 mg kg −1 bid, rispettivamente; Figura 4C). Il trattamento con C1A è stato associato a un ritardo della crescita tumorale (TGD 2x ) di 4, 0 ± 0, 8, 3, 8 ± 1, 2 e 5, 7 ± 1, 4 giorni e un'inibizione della crescita tumorale (TGI) del 57, 69 e 78% rispetto al veicolo a 40 mg kg −1 qod, 20 mg kg −1 qd e 20 mg kg −1 bid, rispettivamente; non vi è stata tossicità generale in nessuna delle coorti trattate come determinato dalle variazioni del peso corporeo (Figura 4D).

L' attività antitumorale in vivo è associata ai cambiamenti dei biomarcatori molecolari e di imaging

La modulazione biochimica del bersaglio in vivo è stata determinata misurando i livelli di α- tubulina acetilata nei tumori HCT-116. Dopo una singola dose di C1A a 40 mg kg −1, α- tubulina acetilata può essere rilevata a 6 ore e sostenuta fino a 24 ore (Figura 5A). Non è stata rilevata alcuna modulazione dell'acetilazione dell'istone H3, a conferma della mancanza di effetti inibitori sugli HDAC di classe I. Inoltre, l'assorbimento del tumore del biomarcatore di imaging di proliferazione, [ 18 F] FLT (Shields et al, 1998; Leyton et al, 2006a), è diminuito dopo il trattamento con C1A (Figura 5B). La radioattività nelle regioni tumorali normalizzata a quella del cuore dello stesso animale è stata utilizzata quantitativamente per confrontare gli effetti di C1A (Leyton et al, 2006a). Vi è stata una riduzione di 1, 7 volte dell'assorbimento di FLT tumorale [ 18 F] negli animali trattati con C1A per 48 ore rispetto ai topi trattati con veicoli; La NUV 60 era 1, 77 ± 0, 11 prima del trattamento e diminuiva a 1, 59 ± 0, 10 ( P = 0, 033) a 24 ore e 1, 06 ± 0, 15 ( P = 0, 0001) a 48 ore dopo l'inizio del trattamento (Figura 5B). L'immunocolorazione Ki-67 è diminuita in questi tumori in linea con la riduzione dell'assorbimento di FLT [ 18 F] tumorale (1, 7 volte; P <0, 0001) (Figura 5C). Abbiamo valutato ulteriormente se l'apoptosi indotta da C1A in vivo . L'espressione della caspasi-3 attivata e la successiva colorazione frammentata del DNA (TUNEL) sono aumentate rispettivamente di 6- ( P = 0, 0082) e 7 volte ( P <0, 0001), insieme a una diminuzione del contenuto di DNA ( P = 0, 023; Figura 5D).

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Biomarcatori molecolari e di imaging per il monitoraggio della risposta a C1A. Topi nudi recanti xenotrapianti di tumore HCT-116 sono stati iniettati con veicolo o C1A a 40 mg kg −1 al giorno. ( A ) Espressione di α- tubulina acetilata e H3 nel tempo a seguito di una singola iniezione di C1A a 40 mg kg −1 . ( B ) Tomografia computerizzata (CT; in alto) e corrispondente [ 18 F] -FLT-PET-CT (in basso). Per la visualizzazione, vengono visualizzate immagini cumulative fino a 60 minuti. Il tumore è indicato da una freccia. L'assorbimento quantitativo [ 18 F] -FLT a 24 e 48 h è stato espresso come assorbimento del radiotracciante in tumori normalizzati a quello del cuore a 60 min (NUV 60 ; n = 4). ( C ) sezioni di tumore immunostained Ki-67 dopo il trattamento per 2 giorni. Le cellule proliferative hanno una colorazione marrone. L'indice di etichettatura Ki-67 è stato calcolato da 10 campi di vista casuali per fetta (2 fette per tumore e 3 tumori per gruppo). Le cellule positive al Ki-67 sono state espresse in percentuale delle cellule totali. ( D ) Analisi immunoistochimica del tumore attivo caspase-3 e TUNEL. I tessuti tumorali sono stati rimossi dopo l'imaging PET (dopo il trattamento per 2 giorni) e colorati per la caspasi-3 attiva (scissione) (Δ caspase-3) e la frammentazione del DNA (dosaggio TUNEL). Vengono mostrate immagini rappresentative di sezioni di tumore istologico. Le intensità di colorazione sono state espresse come percentuale di colorazione per campo usando 10 campi visivi casuali per fetta (2 fette per tumore e 3 tumori per gruppo). ( E ) Espressione genica differenziale dei tumori HCT-116 24 h dopo una singola iniezione di C1A a 40 mg kg −1 e confrontata con il veicolo trattato ( n = 3).

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Firma dell'espressione genica dopo trattamento C1A in vivo

Sebbene l'HDAC6 sia stato descritto come prevalentemente citoplasmatico, è stato anche suggerito di agire come cofattore nucleare (Palijan et al, 2009). Per valutare se il meccanismo di risposta a C1A in vivo era correlato almeno in parte all'attivazione trascrizionale, direttamente o indirettamente tramite i suoi substrati, è stata eseguita una matrice genetica nel modello di xenotrapianto HCT-116. Dei 20.000 geni testati, solo 13 sono stati deregolamentati (0, 065%) a 24 ore dopo una singola iniezione di C1A (40 mg kg −1 ) in linea con l'effetto di classe II (HDAC6) di C1A (ovvero, effetto minore nel regolazione dei geni; Figura 5E) in contrasto con SAHA (LaBonte et al, 2009). I seguenti geni sono stati sovraregolati: BST2 , FHL1 , NBPF (8-11, 14-16) , XAF1 , PIP5KL1 , BAX , SRD5A1 , DHCR24 , TAPBP , PTPRG , IPO7 e RAD23B ; HIST2H2AC è stato down- regolato . Tra questi, i fattori pro-apoptotici XAF1 (gene che codifica per il fattore 1 associato a XIAP, un antagonista dell'inibitore legato all'X della proteina dell'apoptosi) e BAX (gene che codifica per la proteina X associata alla Bcl-2) sono stati sovraregolati, il che potrebbe spiegare in parte l'attività antitumorale. Degna di nota è l'upregulation di RAD23B che è stato recentemente proposto come marker predittivo di risposta agli HDACI in generale (Fotheringham et al, 2009). Per confermare i cambiamenti nell'espressione proteica, è stata eseguita un'analisi Western Blot sui tumori asportati. I livelli di XAF1, PIP5KL1 e RAD23B erano effettivamente più alti dopo il trattamento con C1A (Figura supplementare S8).

Discussione

Il cancro rimane un'esigenza medica insoddisfatta con una persona su tre affetta dalla malattia. Sono necessarie nuove terapie con efficacia migliorata e profilo degli effetti collaterali ridotto. Abbiamo dimostrato che un potente inibitore di piccole molecole di HDAC, in particolare HDAC6, inibisce la proliferazione e induce la morte cellulare nelle linee di cellule tumorali da diversi background istologici.

Vi è un crescente interesse per HDAC6 come bersaglio terapeutico. Sebbene siano stati riportati inibitori dell'HDAC6, tra cui tubacina e tubastatina A (Haggarty et al, 2003; Butler et al, 2010), la mancanza di inibitori con un profilo PK favorevole ha frenato i progressi nel campo. Più recentemente, un nuovo inibitore dell'ACD-12 ACAC-1215 è stato segnalato come inibitore della crescita cellulare di mieloma multiplo quando combinato con bortezomib (Santo et al, 2012). La struttura chimica di ACY-1215 non è disponibile per il confronto e l'effetto di ACY-1215 sui tumori solidi non è stato valutato in quello studio. Riportiamo il meccanismo d'azione e le proprietà inibitorie della crescita di un nuovo HDACI, C1A in un modello di tumore solido. È stato scelto il modello di xenotrapianto HCT-116 perché rappresentava la massima espressione di HDAC6, ha una sensibilità intermedia a C1A (quindi i dati non sono distorti solo per i tumori ad alta sensibilità) ed è stato ampiamente utilizzato come modello per altri HDACI, inclusi genomica e imaging studi (Leyton et al, 2006a; Witter et al, 2008; LaBonte et al, 2009). Inoltre, è necessario sviluppare terapie per il cancro del colon-retto, che rappresenta il 10-15% di tutti i tumori ed è la seconda causa di decessi per cancro nei paesi occidentali. Utilizzato tradizionalmente per quasi 50 anni, il 5-fluorouracile (5-FU) ha portato a un piccolo beneficio nella sopravvivenza (Buyse et al, 1988). Più recentemente, sono stati usati regimi di combinazione che comprendono 5-FU leuvorin irinotecan, cetuximab o oxiloplatino per migliorare l'efficacia clinica. Quando testati come monoterapia in modelli preclinici di carcinoma del colon, questi composti dimostrano solo un'attività modesta. Abbiamo ipotizzato che il trattamento con C1A potesse offrire benefici rispetto alla chemioterapia convenzionale.

C1A è stato progettato per avere una durata prolungata dell'attività inibitoria dell'HDAC attraverso una porzione di senape azotata aromatica. È interessante notare che abbiamo scoperto che C1A aveva un'attività HDAC6 preferenziale in vitro . L'analisi di modellistica molecolare ha suggerito un'interazione favorevole tra C1A e HDA6cdII rispetto al legame sfavorevole della senape di anilina di C1A a una scanalatura esposta a solvente all'interno di HDAC1cd. Queste proprietà fisico-chimiche di C1A probabilmente spiegano l'acetilazione preferenziale di substrati noti di HDAC6, α- tubulina e HSP90 in vitro , rispetto a SAHA, che è un pan-HDACI. Facendo confronti con SAHA (essendo un HDACI attualmente clinicamente approvato, oltre ad avere un profilo di selettività sufficientemente diverso (Bradner et al, 2010)), mostriamo che C1A è meccanicamente nuova con un meccanismo d'azione più in linea con l'inibitore selettivo HDAC6 tubastatina a composto di strumento A. Effetti fenotipici del knockdown dell'HDAC6 con shRNA sovrapposti a quelli del trattamento con C1A, tra cui inibizione della proliferazione, aumento della frazione sub-G1, aumento dell'acetilazione dell'α- tubulina e riduzione dell'espressione di CDK4 con cambiamenti insignificanti nell'acetilazione dell'istone H3 fornisce ulteriore fiducia nella specificità di C1A rispetto a HDAC6.

C1A era potente nella bassa gamma micromolare attraverso una vasta gamma di linee cellulari tumorali. La presenza di una popolazione sub-G1 insieme all'induzione di caspase-3/7 ha suggerito che il farmaco può agire attraverso un meccanismo apoptotico. Sono necessari ulteriori studi per chiarire l'esatto meccanismo che porta all'apoptosi. Noi ipotizziamo che il profilo di potenza del farmaco potrebbe essere dovuto, in parte, all'acetilazione delle proteine ​​citoplasmatiche, tra cui HSP90 e α- tubulina, che hanno ruoli cardine nella progressione del tumore. HSP90 è coinvolto nella maturazione di diverse proteine ​​oncogeniche del cliente, il cui degrado potrebbe abrogare la crescita cellulare e indurre l'apoptosi (Maloney and Workman, 2002). L'acilazione di α- tubulina, che favorisce la stabilizzazione dei microtubuli, può distorcere la mitosi e innescare l'apoptosi (Matsuyama et al, 2002); può anche influenzare i cambiamenti nella motilità cellulare e, quindi, l'invasione e la metastasi delle cellule tumorali (Hubbert et al, 2002). Sono necessari ulteriori lavori per collegare direttamente l'inibizione degli obiettivi C1A all'inibizione della crescita. È possibile che la presenza di una frazione di senape azotata aromatica possa indurre indipendentemente la morte cellulare. Abbiamo esaminato questa possibilità in linee cellulari competenti e carenti nella riparazione del DNA. Questi studi (Figura 2F) hanno suggerito che la parte di senape in C1A non induce alchilazione del DNA non specifica e, quindi, è improbabile che contribuisca in modo significativo alla morte cellulare dipendente da alchilazione del DNA. Ci siamo chiesti se l'espressione di HDAC6 nelle diverse linee cellulari potesse prevedere la sensibilità a C1A. Ciò non sembra essere il caso poiché l'HDAC6 è stato espresso in modo ubiquitario senza differenze significative tra le linee cellulari. Inoltre, le differenze nella sensibilità di crescita tra le linee cellulari erano solo ∼ 10 volte. Studi futuri in una più ampia coorte di linee cellulari potrebbero fornire la possibilità di confermare questo risultato.

A differenza dei composti dello strumento HDAC6 come la tubastatina A, la C1A presentava PK favorevoli in vivo e la somministrazione sistemica del farmaco inibiva la crescita dei tumori del colon in vivo fino al 78%. Coerentemente con il meccanismo d'azione proposto, abbiamo osservato un'induzione dipendente dal tempo dell'α- tubulina nei tumori dei topi trattati con C1A, senza alterazioni dell'istone H3 nei tumori. Studi futuri che studieranno in modo specifico livelli di dose multipli tollerabili nei topi portatori di xenotrapianto - HCT-116 e altri tipi di tumore - confermeranno o confuteranno la rilevanza biologica dell'α- tubulina come biomarcatore farmacodinamico nei tumori. I biomarcatori di imaging forniscono anche un mezzo per estendere i risultati preclinici nella progettazione di studi clinici innovativi di nuovi agenti. A questo proposito, il trattamento con C1A ha ridotto l'assorbimento di FLT del tumore [ 18 F] di 1, 7 volte a 48 ore, suggerendo che l'imaging molecolare potrebbe fornire valore negli studi futuri di questo composto. [ 18 F] L'assorbimento di FLT-PET era precedentemente dimostrato di essere modificato solo in momenti successivi con HDACI LAQ-824 ad ampio spettro (Leyton et al, 2006a). L'output di imaging era coerente con la riduzione osservata nell'immunocolorazione Ki-67 nei campioni di tumore asportato.

In linea con l'attività preferenziale dell'HDAC6, il farmaco ha mostrato un'attività limitata sull'espressione genica in vivo con <0, 065% dei geni modulati durante 24 ore di trattamento. In particolare, tuttavia, sebbene la modulazione HDAC6 sia stata osservata in vivo , non possiamo attribuire interamente i cambiamenti nell'espressione genica osservati dopo il trattamento con C1A a un meccanismo HDAC6, poiché non possiamo escludere completamente l'accumulo di C1A nelle cellule tumorali a livelli abbastanza alti da inibire anche altre classi HDAC. La mancanza di un aumento dell'acetilazione dell'istone H3 insieme all'assenza di un tipico profilo di espressione genica caratteristica dell'inibizione HDAC di classe I, ad esempio l'attivazione di CDKNIA che codifica p21WAF1 / CIP1, suggerisce che il profilo di espressione genica osservato non era dovuto all'inibizione della classe I HDAC. Secondo gli studi in vitro , l'osservazione che C1A ha indotto geni pro-apoptotici tra cui XAF1 e BAX richiede ulteriori studi.

In conclusione, C1A inibisce preferibilmente l'HDAC6 e modula gli obiettivi a valle dell'HDAC6, portando all'inibizione della crescita di una serie diversificata di linee cellulari tumorali. Questa proprietà, unita alle PK favorevoli e all'efficacia in vivo, la rende candidata per un ulteriore sviluppo preclinico e clinico. Acetil- α- tubulina e [ 18 F] FLT-PET promettono come biomarcatori farmacodinamici ed di efficacia nei test clinici di C1A. Questi risultati interessanti forniscono una logica per lo sviluppo futuro degli inibitori dell'HDAC6 per il trattamento di pazienti con tumori solidi.

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