Polimorfismi nel promotore del canale del sodio cardiaco che mostrano una variante dell'attività di espressione in vitro | rivista europea di genetica umana

Polimorfismi nel promotore del canale del sodio cardiaco che mostrano una variante dell'attività di espressione in vitro | rivista europea di genetica umana

Anonim

Astratto

La trascrizione variabile del gene del canale del sodio cardiaco è un meccanismo candidato che determina la suscettibilità all'aritmia. Abbiamo precedentemente clonato e caratterizzato il promotore principale e la regione fiancheggiante di SCN5A , codificando il canale cardiaco del sodio. Nel reported 20% dei pazienti con sindrome di Brugada, sono state riportate mutazioni con perdita di funzione in questo gene, un disturbo ereditario cardiaco associato a un'alta incidenza di aritmie potenzialmente letali. In questo studio, abbiamo identificato le varianti di DNA nella regione del promotore prossimale di 2, 8 kb di SCN5A e abbiamo determinato la loro frequenza in 1121 soggetti. Questa popolazione era composta da 88 pazienti con sindrome di Brugada senza mutazione della regione codificante SCN5A e 1033 soggetti anonimi di varie etnie. L'attività del promotore variante è stata analizzata nelle cellule CHO e nei cardiomiociti neonatali mediante trasfezione transitoria dei costrutti promotore-reporter. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sono stati identificati a coppie di basi ∼ 1/200 che sono: 11 nella regione di fianco 5′, 1 nell'esone 1 e 5 nell'introne 1. Inoltre, un aplotipo costituito da due SNP in totale lo squilibrio di collegamento è stato identificato. Le frequenze minori dell'allele erano> 5% in almeno un pannello etnico in 5/19 siti polimorfici. L' analisi funzionale in vitro nei cardiomiociti ha identificato in modo significativo quattro varianti ( P A, che ha ridotto l'attività del reporter del 62, 8% nelle cellule CHO e del 55% nei cardiomiociti. Da questi risultati, possiamo concludere che il promotore del nucleo SCN5A include polimorfismi multipli del DNA con attività vitro , supportando ulteriormente il concetto di variabilità interindividuale nella trascrizione di questo gene del canale ionico cardiaco.

introduzione

Il gene SCN5A codifica la subunità α del canale del sodio sensibile alla tensione predominante espresso nel muscolo cardiaco. Il canale è una proteina di membrana integrale che consente selettivamente l'afflusso di sodio nella cellula cardiaca, propaga l'innalzamento iniziale del potenziale d'azione e sta alla base di una rapida conduzione nell'atrio e nel ventricolo umani. 1, 2 Il gene umano è stato mappato sul cromosoma 3p21, 3 e le mutazioni di "guadagno di funzione" associate a inattivazione rapida difettosa causano il tipo 3 della sindrome congenita del QT lungo. 4 Sono state anche descritte mutazioni con perdita di funzione e legate a sindromi aritmiche congenite, tra cui insufficienza del sistema di conduzione, 5 sindrome del seno malato, 6 fibrillazione atriale, 7 e sindrome di Brugada (BS), 8 che predispone alla fibrillazione ventricolare (VF); nella BS, le varianti della regione di codifica SCN5A possono essere identificate nel 20-30% dei pazienti affetti. La perdita della funzione del canale del sodio è stata associata ad un aumentato rischio di VF non solo nella BS, ma anche a lesioni acquisite, come ischemia miocardica acuta 9, 10 o terapia con farmaci bloccanti il ​​canale del sodio. 9, 10, 11 Prove sperimentali supportano l'idea che la perdita della funzione del canale del sodio può causare eccitazione rientrante rallentando la conduzione 12 o aumentando l'eterogeneità della ripolarizzazione. 13, 14, 15 Nel loro insieme, quindi, questi dati suggeriscono che la perdita della funzione del canale del sodio è un meccanismo comune che predispone alle aritmie cardiache potenzialmente letali. Per tale motivo, la trascrizione variabile SCN5A potrebbe essere un modulatore candidato del rischio di aritmia, in particolare in presenza di fattori aggiuntivi quali ischemia miocardica, farmaci o mutazioni. Tuttavia, il ruolo delle varianti di DNA all'interno del controllo trascrizionale SCN5A non è stato ancora studiato a fondo. 16, 17

Gli elementi cisattivi sono generalmente conservati tra le specie e organizzati funzionalmente in moduli in cui ciascun modulo integra input da un insieme specifico di fattori di trascrizione per dirigere un corrispondente modello di espressione spazio-temporale. 18, 19 Mentre molte regioni del DNA possono includere funzioni regolatorie, gli elementi promotori sono siti di assemblaggio per fattori di trascrizione attraverso un processo di selezione del sito che svolge un ruolo centrale nella regolazione trascrizionale. 20, 21 Un recente screening del promotore e uno studio funzionale hanno indicato che circa un terzo delle varianti del promotore può alterare l'espressione genica in misura funzionalmente rilevante. 22 Abbiamo precedentemente clonato e caratterizzato il promotore centrale e la regione fiancheggiante di geni SCN5A umani e di topo e riportato un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), c.-225−92 C> A (numerazione vedi Tabella 2), presente in 6 / 142 alleli normali, che hanno aumentato l'attività trascrizionale del ∼ 50% nei cardiomiociti. 23 Inoltre, abbiamo riportato una variante di aplotipo a sei cambiamenti all'interno di questa regione, comune nelle popolazioni dell'Asia orientale, che riduce l'attività trascrizionale ed è associata al rallentamento della conduzione nelle popolazioni umane. 24 Per valutare ulteriormente l'effetto funzionale delle varianti di DNA in questa regione, abbiamo esaminato le varianti di DNA in 88 pazienti con BS ma senza mutazioni codificanti per SCN5A e 1033 soggetti di controllo di diverse etnie. Riportiamo qui la frequenza di queste varianti e la loro caratterizzazione funzionale, rispetto al tipo selvaggio, negli esperimenti promotore-giornalista.

metodi

Popolazioni di studio

pazienti

La BS è stata diagnosticata in 88 pazienti secondo i criteri standard pubblicati. 25, 26 I casi provengono da più centri medici che includono il Vanderbilt University Medical Center ( n = 13), il Academic Medical Center, l'Università di Amsterdam ( n = 38), l'University Hospital Münster ( n = 27) e l'Università LMU Cliniche Großhadern, Monaco ( n = 10). Un campione di sangue è stato ottenuto da ciascun paziente per l'estrazione del DNA dai linfociti. Il DNA è stato quindi raccolto e archiviato. L'indagine è conforme ai principi delineati nella Dichiarazione di Helsinki e il consenso informato è stato ottenuto da tutti gli individui. Tutti i pazienti erano stati precedentemente sottoposti a screening per le mutazioni della regione codificante per SCN5A e nessuna mutazione era stata identificata.

Popolazioni di riferimento

Sono state studiate quattro popolazioni di riferimento:

  1. Un insieme di individui caucasici olandesi selezionati casualmente e non correlati ( n = 98).

  2. Individui scelti casualmente e non correlati dalla popolazione generale che vive nella Germania meridionale, intervistati nel 2002 e nel 2003 ( n = 702, dal sondaggio KORA S4, un sotto-sondaggio basato sulla popolazione proveniente dal progetto OMS MONICA). 27

  3. Un insieme di individui casualmente selezionati, non correlati con etnie che rappresentano quelli dell'area centrale del Tennessee ( n = 71; 48 bianchi e 23 neri).

  4. Un sottoinsieme di individui definiti in base all'etnia ma altrimenti anonimizzati ( n = 162, pannelli multietnici di Coriell Polymorphism Discovery Resource disponibili presso il National Human Genome Research Institute). 28 I campioni Coriell utilizzati in questo studio includevano quattro diversi gruppi etnici, costituiti da individui non correlati e apparentemente sani. I pannelli proiettati in questo studio erano i seguenti: (a) il pannello caucasico (autodichiarati caucasici), n = 47; (b) il gruppo afroamericano (individui di origine africana auto-dichiarata o 3/4 nonni con origine africana), n = 45; (c) Han Chinese di Los Angeles Panel (persone con tutti e quattro i nonni nati a Taiwan, Cina o Hong Kong), n = 26; e (d) la Commissione Messicano-Americana di Los Angeles (soggetti con tre o quattro nonni nati in Messico), n = 44.

Pertanto, sono stati studiati un totale di 2066 alleli di controllo e 176 alleli in pazienti con BS.

Screening per varianti

Identificazione del polimorfismo

L'identificazione del polimorfismo è stata effettuata nel gruppo di pazienti con BS ( n = 88) e nel gruppo di Coriell ( n = 162). Il segmento schermato includeva 2, 1 kb di 5 'sequenza a monte dell'esone 1, dell'esone 1 (che è 173 bp e non codificante) e le regioni dell'introne prossimale 1 che sono relativamente ricche di GC (contenuto di GC del 60, 6%) e altamente conservate rispetto topo e topo. L'introne prossimale 1 di 439 bp è stato sottoposto a screening nel gruppo di pazienti, mentre nel gruppo Coriell lo screening è stato esteso a 708 bp dell'introne prossimale 1. Un frammento di PCR da 2, 8 kb che racchiude queste regioni è stato amplificato con la coppia di primer 1F / 1R (Tabella 1 ), utilizzando il metodo LA-PCR (kit LA PCR, TaKaRa). Le condizioni di ciclo termico erano 94 ° C per 1 minuto, seguite da 40 cicli di 94 ° C per 30 secondi, 64 ° C per 30 secondi e 68 ° C per 3 minuti. Il frammento di introne 1 è stato amplificato con la coppia di primer 9F / 9R (Tabella 1), utilizzando AmpliTaq Gold (Roche). Le condizioni di ciclo termico erano di 95 ° C per 10 minuti, seguite da 36 cicli di 95 ° C per 1 minuto, 64 ° C per 40 secondi, 72 ° C per 40 secondi, seguito da 72 ° C per 10 minuti. Dopo la purificazione (QiaQuick PCR purification kit, Qiagen), il prodotto PCR è stato sequenziato utilizzando i primer 1F-8R e 9R e il kit ABI BigDye Terminator Sequencing (Applied Biosystems), secondo i protocolli standard.

Tabella a grandezza naturale

Genotipizzazione del polimorfismo

I genotipi del polimorfismo per la popolazione KORA ( n = 702) sono stati determinati mediante PCR seguita da reazioni di estensione del primer e analisi spettrometrica di massa MALDI-TOF (Sequenom, San Diego, CA, USA) utilizzando il dosaggio omogeneo MassEXTEND ® (Sequenom). La PCR è stata eseguita utilizzando primer che fiancheggiano i relativi SNP. Prima della reazione di estensione del primer, i primer non incorporati e i dNTP sono stati rimossi dal prodotto PCR mediante trattamento con fosfatasi alcalina di gambero 0, 2 U (20 minuti a 37 ° C, 10 minuti a 85 ° C). L'estensione del primer è stata eseguita aggiungendo un mastermix contenente il primer di estensione, dNTP / ddNTPs e Thermosequenase (Amersham) a 7 μ l di prodotto PCR defosforilato, seguito da un protocollo di ciclo termico come segue: 94 ° C per 2 minuti, 55 cicli di 94 ° C per 5 secondi, 52 ° C per 5 secondi e 72 ° C per 10 secondi. I campioni sono stati dissalati aggiungendo la resina SpectroClean. Quindici nanolitri di campione sono stati quindi individuati sul pad del bioarray 384-SpectroCHIP ™ e successivamente sottoposti ad analisi spettrometriche di massa.

La genotipizzazione del polimorfismo nelle restanti popolazioni di controllo ( n = 169) è stata eseguita mediante sequenziamento diretto o analisi degli enzimi di restrizione secondo i protocolli standard.

Costruzione di plasmidi

Per studiare le conseguenze funzionali delle varianti di DNA nella regione schermata, sono stati usati 0, 5 μ g di DNA genomico umano come modello per amplificare un frammento che conteneva il segmento da -2190 a +613, usando le coppie di primer 1F e 1R (Tabella 1). Questo prodotto PCR è stato designato come P1 come nel nostro rapporto precedente. 23 Dopo aver clonato il frammento P1 nel vettore pGEM-T Easy, il plasmide è stato digerito con Nco I e Sac I e l'inserto è stato subclonato nel vettore pGL3-Basic (Promega), che contiene la sequenza di codifica luciferase lucciola per generare un costrutto di fusione SCN5A promotore-luciferasi di tipo selvaggio designato come pGL-P1 WT. Tutti i costrutti contenenti mutazioni nella regione a monte di 5 'sono stati successivamente generati usando pGL-P1 WT come modello. Per estendere la caratterizzazione funzionale su quelle varianti di DNA identificate nell'esone 1 e fiancheggiando le regioni introne 1, è stato generato un costrutto che comprende il segmento da -261 a +613 (indicato P + 613 WT nel nostro precedente rapporto 23 ) e successivamente è servito da modello per generare costrutti mutati contenenti varianti nell'esone 1 e introne laterale 1.

Le varianti sono state generate dalla mutagenesi diretta al sito usando il kit di mutagenesi diretta al sito QuikChange (Stratagene) usando pGL-P1 WT o pGL-P + 613 WT come modello, seguendo le istruzioni del produttore. Tutti i costrutti sono stati verificati mediante sequenziamento diretto.

Saggi di transfezione transitoria

Le analisi di transfezione transitoria sono state eseguite come precedentemente riportato. 23 In breve, l'attività giornalistica è stata analizzata nei cardiomiociti di topo neonatali e nelle cellule CHO. Topi B6D2 di un giorno sono stati anestetizzati e uccisi. I cuori neonatali sono stati rimossi e collocati in una soluzione PBS 1 ×. I segmenti ventricolari sono stati digeriti da Tripsina-Versene (Biofluids Inc.) e le cellule sono state coltivate nel terreno di Eagle modificato di Dulbecco integrato con 15% (v / v) NuSerum (Beckton Dickinson), 2, 5 m M timidina e penicillina – streptomicina (10 U / ml e 10 mg / ml rispettivamente) in atmosfera di CO 2 umidificata al 5% a 37 ° C. Le cellule sono state autorizzate ad attaccarsi per 48 ore prima di essere utilizzate. Le cellule di ovaio cinese K1 (CHO-K1) di criceto sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) e coltivate come precedentemente descritto. 23

I costrutti di fusione SCN5A promotore-luciferasi (1 μ g di DNA) sono stati trasfettati nelle cellule cardiache del topo neonatale usando Fugene 6 (Roche) e nelle cellule CHO usando il reagente lipofectamina (Invitrogen). In ogni esperimento, il plasmide pRL-TK (0, 05 μ g; Promega), codificante per la renilla luciferasi, è stato co-trasfettato per normalizzare la variabilità sperimentale causata da differenze nella vitalità cellulare o nell'efficienza della trasfezione. La luminescenza è stata misurata 48 ore dopo la trasfezione utilizzando il sistema di test Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega). Il plasmide pGL3-Basic (senza promotore) è stato testato in ogni esperimento e il suo livello di attività è servito da base.

analisi statistica

Le frequenze alleliche tra la popolazione di pazienti (caucasici) BS e la popolazione di controllo (caucasica) KORA sono state confrontate usando statistical 2 analisi statistiche. L'attività di espressione del costrutto mutante è stata divisa per quella di tipo selvaggio ottenuta dallo stesso esperimento di trasfezione per generare attività relativa al tipo selvaggio. Per ogni costrutto analizzato, i dati ottenuti erano basati su almeno sei esperimenti di transfezione transitoria separati. I dati sono presentati come media ± SE. Le attività di espressione genica del reporter sono state confrontate tra sequenze di tipo selvaggio e mutanti. Il livello di significatività statistica è stato esaminato con il test t di Student. Nel complesso, un valore di P <0, 05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche sono state condotte con il software SPSS (versione: SPSS 13.0).

risultati

Identificazione del polimorfismo

Diciassette SNP e un aplotipo costituito da due SNP (c. [−225−1823 C> T; −225−834 T> C]) in completo disequilibrio di collegamento sono stati identificati nella regione schermata da 2, 8 kb (Tabella 2). Sette SNP (c. − 225−1790 G> A, c. − 225−1657 A> G, c. − 225−1294 T> G, c. − 225−988 G> T, c. − 225−667 A > G, c. − 53 + 167 G> T, c. − 53 + 274 G> A) sono stati identificati solo nella popolazione di controllo e con bassa frequenza di allele minori (<2%). Sei SNP e aplotipo 2-SNP sono stati identificati in entrambe le popolazioni di casi e di controllo (Tabella 2). Tra tutte le varianti identificate, le più comuni erano c.-225-2038 G> T, c. − 53 + 114 C> T, c. − 53 + 708 G> A e l'aplotipo 2-SNP, con frequenze alleliche minori di> 5% in almeno una popolazione studiata (Tabella 2). Gli alleli più rari erano spesso rappresentati in un singolo gruppo etnico. Ad esempio, c.-225−1790 G> A, c.-225−1657 A> G, e la variante intronica c. − 53 + 649 G> T sono stati identificati solo nel pannello di controllo afroamericano Coriell con frequenze di allele minori di ∼ 1, ∼ 1 e ∼ 3% rispettivamente. Nella regione a monte 5 ', 8 dei 11 polimorfismi sono stati identificati nella regione da -1 a -2 kb, mentre solo tre si sono verificati all'interno della regione dal sito di inizio della trascrizione fino a -1 kb. La frequenza complessiva delle 19 varianti qui descritte e di quelle precedentemente riportate 24, 23 all'interno della regione schermata era di was 1/200 coppie di basi. I cambiamenti nucleotidici delle nuove varianti e varianti precedentemente descritte sono stati il ​​50% di transizione (pirimidina in pirimidina o purina in purina), il 46, 2% di trasversalità (purina in pirimidina o viceversa) e il 3, 8% di inserimento / eliminazione. Ciò è in accordo con le relazioni precedenti che indicano che le transizioni sono più comuni delle transizioni. 29

Tabella a grandezza naturale

Non sono state rilevate differenze nelle frequenze alleliche tra la popolazione di pazienti BS (caucasica) e la popolazione di controllo KORA (caucasica).

Saggi funzionali in vitro

La Tabella 3 e la Figura 1 mostrano gli effetti di 12 dei 17 SNP e l'aplotipo identificato in questo studio sulle attività del promotore SCN5A . Due rare varianti, c.-225−1790 G> A, e la variante intron 1 c. − 53 + 167 G> T hanno ridotto significativamente le attività di espressione sia nei miociti cardiaci che nelle cellule non cardiache (CHO). Rispetto al tipo selvaggio, l'attività del promotore in c.- 225–1790 G> A era 0, 45 ± 0, 08 nei cardiomiociti e 0, 37 ± 0, 06 nelle cellule CHO; l'attività del promotore di c.-53 + 167 G> T era 0, 47 ± 0, 09 nei cardiomiociti e 0, 58 ± 0, 09 nelle cellule CHO. Il c.-225−1790 G> Una variante è stata identificata solo nel campione afroamericano Coriell, e c.-53 + 167 G> T è stata identificata nella popolazione di controllo del Middle Tennessee (Tabella 2).

Tabella a grandezza naturale

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Analisi funzionale delle varianti di DNA identificate nel promotore e nelle regioni fiancheggianti nei miociti cardiaci del mouse neonatale e nelle cellule CHO. Le attività trascrizionali per costrutti mutanti sono mostrate in relazione al tipo selvaggio (vedi Metodi). I livelli di espressione della luciferasi di lucciola, che riportano le attività della sequenza SCN5A inserita, sono stati normalizzati con le attività di luciferasi Renilla co-espresse per controllare l'efficienza della trasfezione. I dati sono presentati come media ± SEM e ogni punto di dati è stato derivato da almeno sei esperimenti di trasfezione separati.

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L'attività del promotore in c.-225−775 T> A, identificata in 1/176 alleli nella popolazione BS e nei controlli olandese e KORA, è stata significativamente ridotta nei cardiomiociti (0, 76 ± 0, 04 rispetto al tipo selvaggio). L'attività del promotore di questa variante è stata leggermente ma non statisticamente significativamente ridotta nelle cellule CHO (0, 82 ± 0, 04 rispetto al tipo selvaggio). In uno schema cardio-specifico simile, l'attività del promotore in c.-225-1313 G> T identificata in 1/176 alleli nella popolazione BS e nei controlli KORA era significativamente ridotta nei cardiomiociti (0, 55 ± 0, 07 rispetto al tipo selvaggio). La variante c.-206 G> A, identificata anche in 1/176 alleli nella popolazione BS e nei controlli olandesi e KORA, riduceva solo l'attività del promotore nelle cellule CHO (0, 78 ± 0, 03).

Circa la metà delle varianti caratterizzate (7/12 SNP e aplotipo) hanno mostrato un'attività simile al tipo selvaggio nel test funzionale (Tabella 3, Figura 1). La Figura 2 riassume i risultati di questo e di studi precedenti. 24, 23 L' analisi funzionale in vitro delle varianti in questo studio ha identificato cinque nuove varianti con attività giornalistica ridotta del> 20% ( P A. Inoltre, la variante 23 precedentemente riportata nella regione del promotore centrale (c.-225−92 C> A) ha mostrato un aumento dell'attività di> 20% ( P <0, 05) e l'aplotipo a sei cambi ha prodotto circa il 62% di riduzione dell'attività del reporter nei cardiomiociti.

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Riepilogo dei polimorfismi del promotore SCN5A . Il diagramma indica la struttura genomica del promotore SCN5A e le regioni fiancheggianti e le posizioni delle varianti di DNA identificate in questo studio. * Indica una frequenza minore dell'allele> 4% nella popolazione con screening ≥1; ^ indica l'attività reporter variante 120% del controllo wild-type nei miociti.

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Discussione

Questo studio ha analizzato sistematicamente varianti di DNA all'interno del promotore SCN5A in pazienti con BS e un ampio set di dati di popolazioni di controllo. Dimostriamo che le varianti di DNA sono comuni nelle regioni regolatorie della trascrizione e che cinque nuove varianti hanno un impatto significativo sull'espressione del canale del sodio in vitro .

Le sequenze regolatorie della trascrizione costituiscono solo una piccola parte del 95% circa del genoma umano che non codifica per le proteine, ma determina il livello, la posizione e la cronologia dell'espressione genica. I polimorfismi funzionali nelle regioni regolatorie trascrizionali possono influenzare numerosi processi nella biogenesi e nel metabolismo dell'mRNA, tra cui elaborazione, traffico, stabilità e controllo traslazionale. Le varianti di sequenza nelle regioni regolatorie sono quindi candidati logici per modulare la fisiologia umana, la suscettibilità alle malattie e la risposta a fattori di stress ambientale. I polimorfismi del DNA in 5 regioni regolatorie sono stati collegati a una varietà di disturbi umani tra cui il cancro ai polmoni, la depressione 30, 31, 32 e la ridotta attività del CYP3A4. 33 Precedenti studi dal nostro laboratorio e altrove 34 hanno caratterizzato i componenti modulanti del promotore di base SCN5A nell'uomo e nel ratto e hanno convalidato tre scatole GC conservate che assomigliano al sito di riconoscimento Sp1 di consenso. Sebbene i siti di legame Sp1 siano stati implicati come "punti caldi" associati alla malattia, 35, 36, 37, 38, gli sforzi di screening della variante del DNA in questo studio non hanno identificato alcun polimorfismo funzionale che si verifica in questi siti di legame Sp1 e nella regione del promotore principale . L'assenza di varianti di DNA con perdita di funzione nel promotore principale di SCN5A suggerisce che i componenti funzionali nel promotore principale di SCN5A sono fortemente selettivamente vincolati.

Si ritiene che i cambiamenti negli elementi di risposta con effetto cis che portano a differenze nell'abbondanza di proteine ​​alterino il legame delle proteine ​​di transazione (fattori di trascrizione). Identificare i fattori di trascrizione che si legano a specifiche regioni del DNA per generare attività trascrizionale in vivo rimane una grande sfida in questo settore. Un approccio è quello di analizzare i potenziali siti di legame usando programmi basati su sequenze. Di conseguenza, abbiamo esaminato i siti variante identificati qui in SCN5A utilizzando MatInspector, uno strumento software che utilizza una libreria di siti di legame del fattore di trascrizione per prevedere le corrispondenze in specifiche sequenze di DNA. 39, 40 È interessante notare che 2/15 e l'aplotipo a due cambiamenti sono stati previsti per alterare i siti di legame del fattore di trascrizione (Tabella 3). Tra questi, abbiamo osservato che la variante c.-225-1790 G> A, che riduceva significativamente l'attività di espressione, porta alla generazione di un sito di legame GATA1 e all'eliminazione di un sito ZIC2 putativo. ZIC2 appartiene al potente attivatore trascrizionale Cys 2 - La sua famiglia di 2 fattori di trascrizione zinco-dito. 41, 42 L' eliminazione di questo sito potrebbe quindi ipoteticamente portare alla perdita dell'espressione di SCN5A . L'aplotipo a sei cambiamenti precedentemente riportato porta all'eliminazione di un sito di legame E2F previsto e alla generazione di tre nuovi siti WT1 e due siti ZF5, che è anche coerente con i dati sull'attività di espressione in vitro e il fenotipo di perdita di funzione osservato in individui portatori di questo allele aplotipo (Tabella 3). Saranno necessarie ulteriori indagini su queste interazioni DNA-proteina previste " in silico " per convalidare il loro significato biologico.

I polimorfismi che identifichiamo qui possono essere associati alla variabilità degli indici elettrocardiografici basali come la durata del QRS, una manifestazione della velocità di conduzione ventricolare; questo è stato un grande effetto della variante di aplotipo a sei cambi che abbiamo recentemente riportato. 24 D'altra parte, tali varianti possono essere clinicamente silenti allo stato basale, ma modulare comunque la fisiologia correlata ai canali del sodio di fronte a fattori di stress ambientale come l'ischemia miocardica transitoria o l'esposizione a farmaci che bloccano i canali del sodio. Alcune delle varianti identificate qui non hanno alterato l'attività del promotore in vitro e quindi possono essere semplicemente polimorfismi non funzionali.

In sintesi, i polimorfismi del DNA che mostrano una variante dell'attività in vitro sono stati identificati nella regione del promotore del gene del canale del sodio cardiaco: 2/88 (2, 3%) pazienti con BS e 11/1033 (1, 1%) soggetti di controllo hanno alleli in questa regione di SCN5A che alterano la funzione del canale del sodio. I dati rafforzano ulteriormente il concetto che la funzione del canale del sodio varia a livello trascrizionale anche tra soggetti apparentemente normali.