Una rara variante scn5a con perdita di funzione è associata alla fibrillazione ventricolare indotta da lidocaina | il giornale di farmacogenomica

Una rara variante scn5a con perdita di funzione è associata alla fibrillazione ventricolare indotta da lidocaina | il giornale di farmacogenomica

Anonim

Soggetti

  • aritmie
  • Farmacogenetica
  • Varianti rare

Astratto

Il genoma umano contiene oltre 4 milioni di siti varianti, rispetto al genoma di riferimento, comprese rare varianti di sequenza, che hanno il potenziale per esercitare grandi effetti fenotipici, come la suscettibilità alla tossicità dei farmaci. Riportiamo l'identificazione e la caratterizzazione funzionale di una rara variante non sinonimo (p.A1427S) nel gene SCN5A che è stata associata a tachicardia ventricolare incessante e letale e fibrillazione dopo la somministrazione di lidocaina in un paziente con infarto miocardico acuto. La variante, situata in un dominio altamente conservato distinto dal sito di legame alla lidocaina previsto, ha ridotto la densità di corrente di picco del canale del sodio. Con la crescente disponibilità dell'intero esoma e dell'intero genoma di sequenziamento dei dati, sarebbe possibile identificare e caratterizzare rare varianti di SCN5A che potrebbero predisporre alle aritmie ventricolari letali.

introduzione

Il genoma umano contiene oltre 4 milioni di siti varianti, rispetto al genoma di riferimento, tra cui varianti di sequenze di DNA uniche e rare che potrebbero esercitare grandi effetti fenotipici. 1 I recenti progressi tecnologici consentono l'identificazione delle varianti funzionali in ciascun genoma che potrebbero essere clinicamente consequenziali.

La lidocaina, un agente di classe 1B, viene spesso utilizzata come terapia antiaritmica di prima linea nel trattamento delle aritmie ventricolari in pazienti con infarto miocardico acuto (AMI). La lidocaina e i suoi analoghi agenti sono anche un anestetico efficace che viene comunemente utilizzato per la gestione del dolore. Alle dosi comunemente somministrate la lidocaina è un agente antiaritmico e anestetico relativamente sicuro. Tuttavia, anche la somministrazione di lidocaina è stata associata all'induzione o alla propagazione delle aritmie ventricolari, in genere nel contesto della sindrome di Brugada. 2, 3, 4 Le basi molecolari degli effetti diabolicamente opposti della lidocaina dall'essere un efficace antiaritmico a un farmaco pro-aritmico rimangono in gran parte sconosciute ma sono state attribuite a variazioni genetiche nei geni che codificano i canali ionici. 2, 3

Riportiamo l'identificazione e la caratterizzazione di una rara variante di perdita di funzione nel gene SCN5A che alterava la densità di corrente di sodio ed era associata a tachicardia / fibrillazione ventricolare letale incessante dopo la somministrazione di lidocaina in un paziente con AMI.

Materiali e metodi

Questo studio è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale regionale ed è stato condotto in conformità al Codice Etico della World Medical Association (Dichiarazione di Helsinki). È stato ottenuto il consenso informato appropriato per condurre lo studio.

Diagnosi di AMI

La diagnosi di AMI è stata stabilita secondo i metodi convenzionali dalla presenza di dolore toracico, alterazioni elettrocardiografiche e biomarcatori del sangue.

Screening genetico

Il DNA genomico è stato estratto dai linfociti del sangue periferico. Tutti gli esoni e i confini esone-introne dei geni candidati sono stati amplificati dalla reazione a catena della polimerasi, gli ampliconi sono stati purificati con il metodo di purificazione SAP-EXON I e sequenziati in entrambi i filamenti mediante sequenziamento capillare. Inoltre, 200 individui sani di controllo dello stesso gruppo etnico sono stati sequenziati con lo stesso metodo.

Mutagenesi e trasfezione dirette dal sito

Il cDNA SCN5A umano di tipo selvaggio è stato amplificato dalla reazione a catena della polimerasi e clonato in un vettore pcDNA3.1 + (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La mutagenesi sito-diretta è stata eseguita per introdurre il nucleotide variante usando il sistema di mutagenesi sito-diretto GeneTailor (Invitrogen Corp). I cloni sono stati sequenziati completamente su entrambi i filamenti per garantire la presenza della mutazione e l'assenza di altre sostituzioni introdotte dalla reazione a catena della polimerasi.

Elettrofisiologia cellulare

Le cellule HEK 293 sono state trasfettate con costrutti SCN5A wild-type o mutanti usando Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) seguendo il protocollo del produttore. La corrente di membrana è stata misurata mediante patch patch a cella intera con amplificatore EPC 10 (strumenti HEKA, Bellmore, NY, USA). La soluzione di pipetta contenuta (mmol 1 - 1): CsF 110, CsCl 20, HEPES 10, NaF 10, EGTA10 (pH 7, 35 aggiustato con CsOH). La soluzione da bagno consisteva in (mmol 1 - 1): NaCl 145, KCl 4, HEPES 10, MgCl2 1.0, CaCl2 1.8, glucosio 10 (pH 7, 35 aggiustato con NaOH). Le registrazioni sono state fatte a temperatura ambiente. Le correnti di sodio dipendenti dalla tensione registrate a vari potenziali di membrana da -80 a 60 mv con incrementi di 10 mv per 50 ms, il potenziale di mantenimento era di -120 mv. L'attivazione dello stato stazionario è stata stimata misurando le correnti di picco del sodio. La conduttanza G ( v ) è stata calcolata dall'equazione: G ( v ) = I / ( V m - E rev ) ( I : correnti di picco, V m : potenziali di membrana, E rev : i potenziali di inversione misurati). L'inattivazione dello stato stazionario è stata stimata da un protocollo prepulse, che varia i potenziali di membrana da -140 a -50 mv per 500 ms, seguito da depolarizzazione a -20 mv per 20 ms. I dati per l'attivazione dello stato stazionario e l'inattivazione dello stato stazionario sono stati forniti con l'equazione di Boltzmann.

Registrazione dei dati e statistiche

Tutti i segnali sono stati acquisiti a 20 kHz con il software Patchmaster (strumenti HEKA). I dati sono stati analizzati con Fitmaster, Sigmaplot 10.0 ed EXCEL. I risultati sono presentati come media ± errori standard della media (sem). I valori medi e sem sono stati confrontati dal T- test.

risultati

VT / VF associata alla lidocaina

Una donna di 56 anni con una storia nota di malattia coronarica a tre vasi e una normale frazione di eiezione ventricolare sinistra del 60% presentava un AMI di elevazione del segmento ST (Figura 1a). Ha rifiutato gli interventi invasivi ed è stata trattata con eparina, aspirina, clopidogrel, metoprololo, benazepril cloridrato, isosorbide mononitrato e fluvastatina. Aveva battiti ectopici ventricolari polimorfici ed episodi di VT non sostenuta (Figura 1b). Gli esami del sangue di routine comprendenti livelli sierici di calcio, magnesio e potassio erano normali. Le è stata somministrata una dose di bolo di lidocaina da 50 mg per via endovenosa. Entro tre minuti dalla somministrazione di lidocaina, il paziente sviluppò incessante VT / VF polimorfico e morì. Non si è lamentata del dolore toracico o dei sintomi simili all'angina e non ha avuto nuove anomalie dell'ECG o un aumento dei livelli sierici di troponina cardiaca I precedente all'evento terminale.

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Tachicardia / fibrillazione ventricolare associata a lidocaina. a ) elettrocardiogramma a 12 derivazioni all'ammissione che mostra onde Q patologiche, elevazione del segmento ST, ritardo di conduzione intraventricolare e un QTc normale. ( b ) Eletcrocardiogramma che mostra un episodio di VT / VF polimorfico. ( c ) Elettroferogramma che mostra una trasversione c.1427G> T (freccia, filo anti-senso) nel gene SCN5A . ( d ) Rappresentazione schematica della posizione della variante p.A1427S nella proteina SCN5A.

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Identificazione della mutazione SCN5A

Il sequenziamento dei geni KCNQ1 , KCNH2 , KCNE1 , KCNE2 e SCN5A ha portato all'identificazione di una nuova trasversione c.4279 G> T nel gene SCN5A , che codifica per la proteina SCN5A, la subunità α del canale del sodio (Figura 1c). La mutazione corrisponde alla variazione di p.A1427S (codone G CT / T CT) nella proteina (Figura 1c). La variante interessa un dominio altamente conservato della proteina SCN5A (Figura 1d). La variante era assente in 200 individui sani dello stesso gruppo etnico e nel database del progetto NHome Exome Sequencing Project. La frequenza di questa variante (rs200034939 o rs199473244) nel "1000 genomi - un profondo catalogo di variazioni genetiche umane" era <0, 01 (//browser.1000genomes.org/).

Non sono state identificate altre varianti potenzialmente patogene.

Elettrofisiologia cellulare

Gli studi di patch clamp su cellule intere, all'espressione della proteina SCN5A di tipo selvaggio e mutante nelle cellule HEK293, hanno mostrato una riduzione significativa della densità di corrente di picco (Figure 2a e b). L'inattivazione allo stato stazionario della corrente di sodio è rimasta invariata (Figura 2c). La variante mutante ha anche mostrato un potenziale positivo di spostamento a destra nella dipendenza dalla tensione di picco di conduttanza (Figura 2d).

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Effetti della perdita di funzione della mutazione sulla densità della corrente di sodio. ( a ) Relazioni corrente-tensione per la variante wild-type (WT) e p.A1427S. ( b ) Valore di picco della corrente di sodio per mutazione WT e p.A1427S. ( c ) Inattivazione allo stato stazionario per mutazione WT e p.A1427S, le correnti normalizzate sono state tracciate in funzione dei potenziali di membrana. ( d ) Dipendenza dalla tensione della conduttanza di picco per mutazione WT e p.A1427S, la conduttanza di picco normalizzata è stata tracciata rispetto ai potenziali di membrana. * P <0, 01 rispetto a WT. # P <0, 05 rispetto a WT.

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Discussione

Il caso presenta gli effetti diabolicamente opposti della lidocaina dall'essere una terapia antiaritmica a un agente pro-aritmico maligno in presenza di ischemia miocardica e una rara variante di perdita della funzione missenso nel gene SCN5A . La variante p.A1427S si trova sul linker extracellulare S5-S6 del dominio III nella proteina SCN5A. Il dominio interessato è altamente conservato tra i membri della famiglia delle subunità alfa del canale sodico in tensione e tra le specie dal pollo all'uomo (Figura 1d). La lidocaina blocca la corrente di sodio modificando i sensori di tensione del canale del sodio principalmente associati all'attivazione del canale. 5, 6 L'effetto porta all'apertura del canale e si traduce in un accoppiamento allosterico dei siti di legame della lidocaina ai sensori di tensione formati dai segmenti S4 nei domini III e IV. 5, 6 La variante p.A1427S si trova all'esterno del sito di legame alla lidocaina 7 previsto e impartisce effetti distinti su gating e inattivazione intermedia. Gli effetti dovrebbero accentuare l'effetto bloccante della lidocaina sui canali del sodio.

Le mutazioni del gene SCN5A causano le sindromi di Brugada e Long QT. 8, 9 È stato scoperto che la lidocaina smaschera il modello elettrocardiografico della sindrome di Brudada in un paziente con un polimorfismo composto nel gene SCN5A . 2 Il nostro paziente non ha mostrato modelli elettrocardiografici della Brugada o delle sindromi QT lunghe. Inoltre non aveva una storia di tachiaritmie ventricolari. Pertanto, i risultati presagiscono un nuovo fenotipo associato alle varianti SCN5A .

Il paziente presentava battiti ectopici ventricolari polimorfici ed episodi di VT non sostenuta prima della somministrazione di lidocaina. Pertanto, nonostante l'effetto funzionale della variante p.A1427S sia in accordo con gli effetti elettrofisiologici della lidocaina, l'associazione temporale dell'episodio VT / VF con la somministrazione di lidocaina e la plausibilità biologica dei risultati, non possiamo escludere il verificarsi accidentale di VT / VF nel contesto dell'ischemia miocardica, indipendente dalla somministrazione di lidocaina. Sebbene il paziente non avesse prove di ischemia attiva che precede anche il terminale, il ruolo dell'ischemia miocardica silenziosa nel perpetuare VT / VF indotta da lidocaina in presenza di p.A1427S non poteva essere escluso. Pertanto, se la variante SCN5A da sola in assenza di altri fattori di suscettibilità o dopo somministrazione di lidocaina come agente anestetico, predispone alle aritmie ventricolari maligne rimane sconosciuta. Nonostante queste carenze, i risultati aumentano la consapevolezza dei potenziali effetti pro-aritmici dei farmaci in presenza di rare varianti nei geni coinvolti nelle proprietà elettrofisiologiche cardiache.

Concludiamo che rare varianti SCN5A missenso a perdita di funzione potrebbero predisporre a VT / VF dopo somministrazione di lidocaina nel contesto dell'ischemia miocardica. I risultati offrono uno sguardo alle potenziali implicazioni cliniche delle varianti rare e funzionali nei genomi personali.