La teoria della reazione-diffusione spiega l'ipossia e la crescita eterogenea all'interno dei biofilm microbici associati alle infezioni croniche | npj biofilm e microbiomi

La teoria della reazione-diffusione spiega l'ipossia e la crescita eterogenea all'interno dei biofilm microbici associati alle infezioni croniche | npj biofilm e microbiomi

Anonim

Soggetti

  • biofilm
  • Assistenza sanitaria

Astratto

Sono stati applicati modelli di reazione-diffusione per ottenere informazioni sugli aspetti dell'infezione e della persistenza del biofilm confrontando simulazioni matematiche con i dati sperimentali di vari biofilm batterici. Questi confronti, tra cui tre sistemi in vitro e due indagini cliniche su campioni esaminati ex vivo , hanno sottolineato l'importanza centrale dei gradienti di concentrazione dei substrati metabolici e la conseguente eterogeneità fisiologica dei microrganismi. Modelli unidimensionali e bidimensionali (2D) relativamente semplici hanno catturato: (1) distribuzione determinata sperimentalmente di tassi di crescita specifici misurati nelle cellule di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato da pazienti con fibrosi cistica; (2) modello del tasso di crescita relativo all'interno di aggregati di biofilm streptococcico ospitati in una vegetazione di endocardite; (3) penetrazione incompleta dell'ossigeno in un biofilm Pseudomonas aeruginosa in condizioni di esposizione all'aria ambiente e anche ossigeno puro; (4) localizzazione dell'attività anabolica attorno alla periferia dei cluster di cellule di P. aeruginosa formati in una cella a flusso e attribuzione di questo schema alla limitazione del ferro; (5) tassi di crescita specifici molto bassi, fino a 0, 025 h-1, all'interno dei cluster cellulari all'interno di un biofilm di Klebsiella pneumoniae in un complesso dominio 2D a densità cellulare variabile.

introduzione

L'elenco delle infezioni croniche derivanti dai biofilm continua a crescere, così come la consapevolezza del pedaggio economico e umano causato da queste infezioni debilitanti. La teoria della reazione-diffusione è stata applicata con successo per decenni per comprendere i gradienti chimici su microscala, le nicchie ecologiche e i flussi di substrato nel trattamento delle acque reflue e dei biofilm ambientali. Vi sono molti meno esempi dell'adattamento di questa teoria a sistemi di rilevanza medica. Qui l'utilità generale di questa classe di modelli, che deriva dai primi principi della diffusione di Fickian e della reazione metabolica concordate, è illustrata con casi di studio che comportano limitazioni per ossigeno, glucosio e ferro. Emergono temi ricorrenti di ipossia, eterogeneità fisiologica nella popolazione microbica e tolleranza agli antibiotici risultante da cellule non in crescita. Complessivamente, questi esempi mostrano che la teoria della reazione-diffusione può essere applicata per far luce sull'eterogeneità chimica e fisiologica che probabilmente contribuisce alla patogenesi e alla persistenza delle infezioni da biofilm.

La modellistica matematica dei biofilm ha contribuito alla comprensione del funzionamento di queste comunità microbiche aggregate sin dall'articolo fondamentale di Enrique Lamotta nel 1976. Successivamente sono state pubblicate centinaia di articoli di modellistica di biofilm, di cui citiamo solo alcuni esempi di riferimento . 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Quasi tutti questi studi sono stati motivati ​​da applicazioni nel trattamento delle acque e delle acque reflue. Si rivolgono al funzionamento di sistemi come filtri di gocciolamento, digestori di fanghi anaerobici e tubi di distribuzione dell'acqua potabile.

Con l'aumentare della consapevolezza del ruolo della formazione di biofilm in numerose infezioni persistenti, 10, 11, 12, 13 esiste un'opportunità per migliorare la comprensione della formazione, attività ed ecologia dei biofilm infettivi adattando gli stessi tipi di modelli matematici che hanno avuto un tale successo nell'applicazione dell'ingegneria civile ai sistemi di interesse medico e dentistico. Questa opportunità rimane relativamente inesplorata e sottosviluppata. Esistono alcuni esempi pionieristici della modellizzazione del biofilm applicata ai sistemi medici. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 Questi modelli hanno fornito importanti spunti su argomenti come il meccanismo della carie dentale, 15, 23 la penetrazione degli antibiotici nei biofilm, 14, 17 l'induzione del quorum sensing in un biofilm 19 e il controllo probiotico di un biofilm patogeno. 22

Lo scopo del lavoro riportato in questo articolo è dimostrare l'applicabilità generale della teoria della reazione-diffusione ai problemi di biofilm di rilevanza medica. Ci concentriamo in particolare sulla capacità di questo approccio teorico di prevedere gradienti nella concentrazione di substrati metabolici e, di conseguenza, modelli di crescita microbica che sono spazialmente eterogenei.

risultati

Caso 1: previsione della distribuzione spaziale dell'ossigeno all'interno di un biofilm e in che modo dipende dalla concentrazione di ossigeno applicato sulla superficie del biofilm

Poiché l'ossigeno è moderatamente solubile ed è rapidamente rispettato dai microrganismi aerobici, i gradienti di concentrazione dell'ossigeno sono una caratteristica comune dei sistemi di biofilm. Il profilo di ossigeno misurato in un semplice biofilm P. aeruginosa in vitro descrive una curva la cui forma si adatta ragionevolmente bene dalla soluzione parabolica al problema di reazione-diffusione di ordine zero (Figura 1a). In questo esempio, un valore del modulo Thiele di ϕ o = 2, 82 fornisce una descrizione accettabile dei dati (Figura 1b). Le misurazioni sperimentali tracciate nella Figura 1 provengono da un biofilm a singola colonia che è stato prima profilato in aria, quindi inondato di ossigeno puro e profilato di nuovo in questo ambiente arricchito di ossigeno. Le misurazioni sono state eseguite nella stessa posizione planare esatta nel biofilm. Pertanto, i parametri fisici fisici fissi ( L f, ρ , D e ) e intrinseci ( μ o, Y xs ) che costituiscono ϕ o erano identici. L'unica differenza tra le condizioni dell'aria e dell'ossigeno era dovuta al cambiamento nella concentrazione di ossigeno al confine ( C o ). Prevediamo quindi che il rapporto di ϕ o valori tra questi due casi dovrebbe essere numericamente uguale alla radice quadrata del rapporto delle concentrazioni di ossigeno sfuso (vedi Equazione (4)), che è (28, 5 / 6) 1/2 o 2, 18 . Il rapporto effettivo tra i due valori montati di ϕ o era 4, 78 / 2, 82 o 1, 70. I valori del modulo Thiele determinati in aria e ossigeno erano statisticamente significativamente diversi ( P <10 −4 ).

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Profili sperimentali e teorici di concentrazione di ossigeno in un biofilm di colonie di P. aeruginosa . ( a ) Profili di concentrazione teorica (curve solide) per un substrato metabolico con cinetica di reazione di ordine zero per valori variabili del modulo di Thiele, ϕ o . ( b ) Profili sperimentali di concentrazione di ossigeno in un singolo biofilm di colonie di P. aeruginosa esposto all'aria (cerchi grigi) o gas arricchito di ossigeno (cerchi aperti). Le linee continue sono curve teoriche adatte ai due set di dati.

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Caso 2: calcolo della distribuzione di probabilità di tassi di crescita specifici in un biofilm

Dato che i biofilm ospitano gradienti nella concentrazione del substrato che limita la crescita, ci saranno anche cambiamenti corrispondenti nel tasso di crescita specifico cellulare locale. Nel caso della cinetica di reazione del primo ordine, ciò porta a una variazione del tasso di crescita nello spazio che viene catturato nelle distribuzioni tracciate nella Figura 2a. Quando la diffusione limita solo leggermente ( ϕ 1 = 0, 5) i tassi di crescita sono rapidi e vicini al tasso di crescita che ci si aspetterebbe dalla concentrazione del fluido sfuso del substrato (~ 1 h −1 ). All'aumentare della limitazione della diffusione ( ϕ 1 progressivamente maggiore) la distribuzione diventa più ampia e include valori più bassi del tasso di crescita.

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Distribuzione prevista dei tassi di crescita batterica in un biofilm. a ) Distribuzioni del tasso di crescita per un biofilm a lastra piana governato dalla cinetica di reazione del primo ordine per valori variabili del modulo di Thiele, ϕ 1 . ( b ) Confronto della distribuzione del tasso di crescita misurata di P. aeruginosa nei polmoni espiantati di tre pazienti CF 25 (barre nere) con la distribuzione prevista per ϕ 1 = 5 (barre grigie).

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Kragh et al. 25 hanno recentemente riportato misurazioni a singola cellula del tasso di crescita specifico di P. aeruginosa nell'espettorato di tre pazienti con fibrosi cistica. Abbiamo unito queste 63 misurazioni e creato una distribuzione quadripartita. La distribuzione teorica per un valore di ϕ 1 = 5 corrisponde bene a questo risultato sperimentale (Figura 2b).

Caso 3: visualizzazione e quantificazione di un gradiente del tasso di crescita all'interno di un biofilm e identificazione del substrato che limita la crescita come ferro

Un modo per visualizzare i gradienti nell'attività anabolica all'interno di un biofilm consiste nell'utilizzare un ceppo batterico contenente una proteina fluorescente inducibile. Una sequenza video di microscopia time-lapse di un simile esperimento può essere visualizzata nel film supplementare S1. In questo esperimento, un biofilm di P. aeruginosa contenente una proteina fluorescente verde inducibile isopropiltio-β-D -galattoside (GFP) è stato coltivato per 5 giorni in assenza dell'induttore. Il biofilm era scuro a questo punto. L'agente induttore è stato quindi aggiunto al mezzo, in flusso continuo ininterrotto. Nelle prossime ore, il colore verde si è sviluppato nel cluster cellulare corrispondente all'espressione locale di GFP. Più GFP è stato espresso alla periferia del cluster rispetto al centro del cluster. Questo gradiente riflette il tasso di crescita relativa dei batteri nelle diverse regioni del cluster.

Il processo di quantificazione del modello di crescita all'interno di un esperimento come quello sopra descritto è illustrato nella Figura 3. Un cluster di biofilm ripreso in modalità di trasmissione aveva un diametro di ~ 126 μm (Figura 3a). Dopo l'induzione di GFP e controcolorazione con un colorante rosso, è stato osservato un modello di espressione GFP simile a quello descritto sopra: verde più chiaro vicino ai bordi del cluster e verde più scuro verso il centro (Figura 3b). La macchia rossa rivela la distribuzione della biomassa indipendente dall'attività metabolica. I profili di concentrazione calcolati (equazione (18)) di un substrato reagente in un cluster emisferico sono riportati nella Figura 3c per diversi valori del modulo di Thiele, ϕ 1 . Si noti che poiché il tasso di crescita in questo caso è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato locale, si prevede che i modelli spaziali calcolati nella Figura 3c si applichino al tasso di crescita specifico microbico e alla concentrazione del substrato stessa. L'analisi dell'immagine dell'intensità della fluorescenza verde all'interno di un cluster di biofilm può essere confrontata con i modelli teorici come quelli della Figura 3c per estrarre una stima quantitativa del modulo di Thiele. Un esempio di tale adattamento è mostrato nella Figura 3d.

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Andamento del tasso di crescita relativo in cluster rotondi di biofilm di P. aeruginosa . ( a ) Immagine di trasmissione di un cluster di celle. ( b ) Pattern di induzione GFP (verde) e controcolore di biomassa (rosso) nello stesso cluster di cellule. aeb sono stati ripresi attraverso la superficie di attacco del vetro nel piano delle barre di scala del substrato sono 50 micron. ( c ), Profili teorici di concentrazione del substrato in un cluster emisferico soggetto a cinetica di reazione del primo ordine per valori variabili del modulo di Thiele, ϕ 1 . ( d ) Curva teorica ( ϕ 1 = 4.5) adattata a un'intensità di fluorescenza GFP sperimentale ottenuta mediante analisi dell'immagine da un esperimento come quello mostrato in b . ( e ) Modulo tiele determinato dall'adattamento ai dati sperimentali tracciati rispetto al raggio del cluster (simboli). La linea è una regressione dei minimi quadrati la cui pendenza ha il valore ( k 1 / D e ) 1/2 ; vedi equazione (17).

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Quando questo processo di analisi dell'immagine è stato applicato a più cluster di biofilm ( n = 22) da diversi esperimenti, sono stati determinati un intervallo di valori di ϕ 1 (Figura 3e). Il modulo Thiele stimato è aumentato con il raggio misurato del gruppo cellulare (Figura 3e). Questa dipendenza lineare è prevista dalla definizione del modulo di Thiele. La pendenza della linea adattata ai dati nella Figura 3e fornisce l'accesso a una stima quantitativa del valore del coefficiente della velocità di reazione del primo ordine, k 1 .

Questa discussione non ha finora affrontato l'identità del substrato che limita la crescita. In effetti, l'osservazione di un gradiente di attività all'interno di un biofilm non fornisce di per sé alcun indizio sulla natura della limitazione. È possibile accedere alla probabile identità del substrato che limita la crescita confrontando i valori di k 1 derivati ​​dall'esperimento (ovvero, Figura 3e) e calcolati a priori da stime indipendenti dei parametri costituenti. Questi confronti sono riassunti nella Tabella 1. Tutte le stime teoriche hanno fatto uso dello stesso valore del tasso di crescita dei batteri in condizioni di fluido sfuso ( μo ). Il tasso di crescita a 23 ° C di questo ceppo di P. aeruginosa nel mezzo minimo utilizzato è stato misurato in coltura batch per essere 0, 16 h −1 . Le stime teoriche hanno anche usato lo stesso valore costante della densità cellulare nel biofilm ( ρ ) di 10 4 mg l −1 . I coefficienti di rendimento ( Y xs ) sono stati stimati in base alla composizione tipica della biomassa e al riferimento ai valori misurati. 26 La concentrazione di fluido sfuso del substrato limitante ( C o ) è stata determinata dalla composizione media per carbonio e azoto e dalla solubilità dell'ossigeno in acqua alla tipica pressione barometrica a Bozeman, nel Montana. La concentrazione di ferro è stata stimata come limite di solubilità del fosfato di ferro (III). 27 I coefficienti di diffusione nel biofilm sono stati stimati come descritto altrove. 28, 29 Il confronto dei valori sperimentali di k 1 con i valori teorici calcolati rivela una discrepanza per carbonio, azoto e ossigeno di due ordini di grandezza o più. Solo per il ferro esiste una corrispondenza ragionevole. Il ferro è quindi il substrato che probabilmente limita la crescita in questo caso.

Tabella a grandezza naturale

Caso 4A: calcolo della variazione spaziale del tasso di crescita all'interno di un biofilm eterogeneo in vitro

Wentland et al. 30 hanno riportato una visualizzazione sperimentale del tasso di crescita relativo all'interno di un biofilm K. pneumoniae cresciuto in vitro in un reattore a flusso continuo. Questo risultato è riprodotto nella Figura 4a. Il biofilm variava in spessore e densità cellulare locale. C'era una banda di crescita attiva (indicata dal colore arancione o rosso) che tracciava l'interfaccia del fluido sfuso di biofilm. Laddove il biofilm era più sottile e meno denso, l'intero spessore del biofilm cresceva rapidamente come indicato dai colori più caldi. Laddove il biofilm era localmente più spesso, l'interno dei cluster suggeriva tassi di crescita più bassi, come indicato dai colori più freddi di giallo e verde.

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Modelli spaziali simulati di tasso di crescita specifico in una struttura biofilm eterogenea 2D rispetto a un risultato in vitro . ( a ) Sezione congelata macchiata di arancio di acridina che mostra regioni di crescita relativamente rapida (rosso / arancione) e lenta (verde / giallo) (ristampata con il permesso di rif. 30). ( b ) Concentrazione di glucosio calcolata (mg l −1 ) per una concentrazione di glucosio nel fluido sfuso di 30 mg l −1 . ( c - e ) Il tasso di crescita specifico previsto (h −1 ) per concentrazioni di glucosio nel fluido sfuso di 10 mg l −1, ( c ); 25 mg l −1, ( d ); e 40 mg l −1, ( e ). Bar = 100 μm.

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Abbiamo simulato la distribuzione del substrato che limita la crescita, il glucosio, all'interno di una rappresentazione bidimensionale del biofilm usando i valori dei parametri riassunti nella Tabella Supplementare S2. Un esempio della prevista concentrazione di glucosio è mostrato nella Figura 4b. Questa simulazione mostra che le concentrazioni di glucosio sono diminuite all'interno dei tre cluster di biofilm più grandi. Poiché la concentrazione di glucosio nel fluido sfuso era variata (questo è l'unico parametro per il quale non era disponibile una stima sperimentale indipendente), il modello previsto dei tassi di crescita all'interno del biofilm è cambiato. Ad una concentrazione apparente relativamente bassa di 10 mg l −1, anche i tassi di crescita nel biofilm erano relativamente lenti, come indicato da una predominanza di tonalità verde e gialla (Figura 4c). Alla massima concentrazione di glucosio alla rinfusa simulata, 40 mg l-1, i tassi di crescita erano più alti e si prevedeva che gran parte del biofilm crescesse rapidamente (Figura 4e). Poiché la concentrazione di glucosio influenzante il reattore era di 40 mg l −1, ciò costituisce un limite superiore alla concentrazione effettiva sperimentata dal biofilm. La simulazione a una concentrazione di glucosio nel fluido sfuso di 25 mg l −1 (Figura 4d) ricorda il modello sperimentale (Figura 4a). I tassi di crescita previsti si sono manifestati come un gradiente spaziale chiaro all'interno del biofilm che varia da 0, 71 h −1 (84% del tasso di crescita massimo) a appena 0, 025 h −1 (3% del massimo).

Caso 4B: calcolo della variazione spaziale del tasso di crescita all'interno di un biofilm eterogeneo ex vivo

Analizziamo qui il modello di attività trovato in un biofilm infettivo a propulsione per fluorescenza in situ (FISH) recuperato dalla vegetazione della valvola cardiaca di un paziente con endocardite (Figura 5a). Il microrganismo è stato determinato come Streptococcus equinus usando il sequenziamento genico di 16S rRNA (RNA ribosomiale). Il contenuto ribosomiale relativo come rivelato dall'intensità del segnale di fluorescenza associato alla quantità di sonda FISH ibridata (colore rosso) indicava un'attività localizzata associata ai confini sinistro e superiore del biofilm. I modelli spaziali di crescita batterica all'interno di questa struttura sono stati simulati usando i valori dei parametri riassunti nella Tabella Supplementare S3. Le simulazioni che modellavano solo la fornitura di glucosio dal solo limite superiore o sinistro (figure 5b, c, rispettivamente) non erano in grado di produrre rappresentazioni qualitativamente accurate del modello di attività osservato. Piuttosto, è stato necessario modellare la fornitura del nutriente che limita la crescita, il glucosio, sia dai confini sinistro che superiore (Figure 5d-f).

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Modelli spaziali simulati di tasso di crescita specifico in una struttura di biofilm eterogenea 2D rispetto a un risultato ex vivo . a ) Campione di endocardite clinica umana sondato con FISH che mostra cellule con attività relativamente rapida (rossa), intermedia (magenta) o lenta o assente (blu), come indicato dal relativo contenuto ribosomiale. ( b - f ) Il tasso di crescita specifico previsto (h −1 ) per concentrazioni di glucosio nel fluido sfuso di 100 mg l −1, ( b, c, e ); 500 mg l −1, ( d ); e 50 mg l −1, ( f ). Il glucosio è stato fornito al limite sinistro ( b ), al limite superiore ( c ) o su entrambi i confini sinistro e superiore ( d - f ).

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Un punto di partenza per impostare la concentrazione di glucosio ai limiti era la concentrazione di glucosio nel plasma umano, ~ 900 mg l −1 (rif. 31). Quando sono state assunte alte concentrazioni di glucosio lungo i confini sinistro e superiore dell'aggregato, è stata prevista una rapida crescita microbica in tutto il biofilm (Figura 5d). Solo quando la concentrazione di glucosio nelle condizioni al contorno era ridotta a ~ 100 mg l −1 o meno (Figure 5e ed f), i modelli previsti si conformavano al modello osservato. Questo risultato mostra che questo aggregato di biofilm è stato probabilmente esposto a concentrazioni più basse di nutrienti rispetto a quelle disponibili nel plasma, probabilmente a causa delle limitazioni esterne del trasferimento di massa.

Discussione

La teoria della reazione-diffusione può essere applicata per far luce sull'eterogeneità chimica e fisiologica che probabilmente contribuisce alla patogenesi e alla persistenza delle infezioni da biofilm. Qui abbiamo analizzato i problemi elementari che illustrano la propensione all'ipossia in prossimità di un biofilm, il potenziale di limitazione di diversi substrati dall'ossigeno al glucosio al ferro e la realtà degli stati di crescita distribuiti nella popolazione microbica che vanno dalla rapida crescita a dormiente.

Il confronto riportato nella Figura 1b può essere considerato come un test del potenziale dell'ossigenoterapia iperbarica per migliorare la penetrazione dell'ossigeno in un biofilm. Si prevede che la profondità di penetrazione dell'ossigeno aumenti come radice quadrata della concentrazione di ossigeno applicata. Ad esempio, quadruplicando la tensione di ossigeno si raddoppia solo la profondità di penetrazione dell'ossigeno. Questo risultato evidenzia una possibile limitazione all'efficacia dell'erogazione di ossigeno in un biofilm infettivo con ossigenoterapia iperbarica. 32 Questa limitazione potrebbe non essere ampiamente riconosciuta in campo medico anche se la dipendenza dalla concentrazione della penetrazione del substrato è nota da decenni nel contesto del processo di trattamento delle acque reflue del biofilm. 33

L'ipossia è un tema ricorrente nelle infezioni da biofilm. 34, 35, 36 Influisce sulla guarigione, sull'esplosione ossidativa dei neutrofili e sulla tolleranza agli antibiotici batterici. 37 I modelli di reazione-diffusione sono un approccio appropriato nell'analisi dell'ipossia, anche se dovranno andare oltre i semplici modelli qui presentati per incorporare il trasporto di ossigeno nella vascolarizzazione e il consumo di ossigeno da parte del tessuto ospite e dei leucociti.

I risultati quantitativi derivati ​​da un'analisi di reazione-diffusione ci hanno permesso di diagnosticare un esempio di limitazione del ferro (Figura 3). Il ferro non è stato precedentemente identificato come substrato limitante per la crescita del biofilm a nostra conoscenza. La limitazione del ferro è abbastanza plausibile in vivo , tuttavia, dove la maggior parte del ferro è sequestrata. 38 Il mezzo minimale molto semplice usato in questo esperimento, a differenza di molti mezzi di laboratorio, non conteneva oligoelementi aggiunti. L'unico ferro presente probabilmente è entrato come contaminante nei sali costituenti. A causa della concentrazione relativamente elevata di fosfato, il ferro sarebbe precipitato come fosfato di ferro. Il ferro precipitato che rimane in sospensione sarà accessibile alle cellule planctoniche, ma nel biofilm solo il ferro disciolto sarebbe in grado di accedere all'interno di un ammasso cellulare per diffusione.

I nostri calcoli mostrano che l'eterogeneità biologica in microscala nel tasso di crescita specifico può essere prevista dai primi principi di reazione e diffusione (Figure 2, 4 e 5). Questa eterogeneità è evidente nella variazione del tasso di crescita tra le singole cellule in una popolazione (Figura 2) e nei modelli spaziali attraverso aggregati multicellulari di batteri (Figure 4 e 5). In questi tre esempi - espettorato di fibrosi cistica, un biofilm enterobatterico in vitro e una vegetazione di endocardite battericamente colonizzata - il biofilm non solo ospita cellule batteriche in crescita, ma anche cellule che crescono lentamente o per niente. Questo risultato può aiutare a comprendere la tolleranza agli antibiotici derivante dai biofilm che ospitano una percentuale significativa di batteri non in crescita. 39

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