Rigenerazione di isole pancreatiche in vivo mediante terapia genica mirata agli ultrasuoni | terapia genetica

Rigenerazione di isole pancreatiche in vivo mediante terapia genica mirata agli ultrasuoni | terapia genetica

Anonim

Soggetti

  • Diabete
  • Isole di Langerhans
  • ultrasuono

Astratto

Questo studio utilizza un nuovo approccio alla terapia genica in cui il DNA del plasmide è mirato al pancreas in vivo usando la distruzione di microbolle (UTMD) mirata agli ultrasuoni per ottenere la rigenerazione delle isole. Le microbolle endovenose che trasportano plasmidi vengono distrutte all'interno della microcircolazione pancreatica mediante ultrasuoni, ottenendo l'espressione genica locale che è ulteriormente indirizzata alle cellule β da un promotore di insulina di ratto modificato (RIP3.1). Una serie di geni implicati nello sviluppo endocrino sono stati consegnati ai ratti 2 giorni dopo il diabete indotto da streptozotocina. I geni, PAX4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 , Ngn3 e Mafa , hanno prodotto iperplasia delle cellule α, ma nessun miglioramento significativo della massa delle cellule β o del livello di glucosio nel sangue 30 giorni dopo UTMD. Al contrario, RIP3.1-NeuroD1 ha promosso la rigenerazione delle isole da cellule β sopravvissute, con normalizzazione dei livelli di glucosio, insulina e peptide C a 30 giorni. In un esperimento a lungo termine, quattro su sei ratti hanno avuto un ritorno del diabete a 90 giorni, accompagnato da apoptosi a cellule β sulla colorazione di Tunel. Il pretrattamento con l'inibitore JNK SP600125 ha bloccato con successo l'apoptosi delle cellule β e ha comportato il ripristino della massa delle cellule β e la normalizzazione del livello di glucosio nel sangue fino a 90 giorni. Questa tecnica consente la rigenerazione in vivo delle isole, il ripristino della massa delle cellule β e la normalizzazione dello zucchero nel sangue, dell'insulina e del peptide C nei ratti senza virus.

introduzione

Il controllo della glicemia è spesso inadeguato nel diabete, poiché la terapia farmacologica, inclusa la sostituzione dell'insulina, non è in grado di replicare la funzione regolatoria del glucosio delle isole normali. Di conseguenza, le nuove strategie di trattamento si sono concentrate sul reintegro della carenza di massa di cellule β che è comune a entrambe le principali forme di diabete mediante trapianto di isole o rigenerazione di cellule β. 1, 2 Il trapianto di isole è stato limitato dalla fornitura di isole donatrici e dalla necessità di una terapia immunosoppressiva. 3 La rigenerazione delle isole ha avuto successo in modelli animali, colpendo principalmente il tessuto epatico utilizzando vettori virali 4, 5, 6, 7 che è improbabile che vengano utilizzati nell'uomo per motivi di sicurezza. Un nuovo approccio alla terapia genica è mirare alla consegna del DNA alle isole pancreatiche usando la distruzione di microbolle con ultrasuoni (UTMD). 8, 9 Le microbolle endovenose che trasportano il DNA plasmidico vengono distrutte all'interno della microcircolazione pancreatica mediante ultrasuoni, ottenendo un'espressione genica locale che può essere ulteriormente indirizzata alle cellule β utilizzando un promotore di insulina-I di ratto modificato. UTMD è stato usato per somministrare betacellulina e PDX1 nei ratti con diabete indotto da streptozotocina (STZ), con inversione del diabete fino a 15 giorni riprogrammando le cellule pancreatiche acinari in cellule produttrici di insulina. 10 Allo stesso modo, è stato dimostrato che l'iniezione diretta di adenoviri che codifica una combinazione di geni PDX1 , neurogenina3 e Mafa nella pancreata di topo riprogramma le cellule esocrine in piccole cellule produttrici di insulina senza formazione di isole. 11 Tuttavia, la rigenerazione delle isole all'interno del pancreas è rimasta un obiettivo sfuggente della terapia genica. Questo studio ha cercato di valutare se la rigenerazione delle isole potesse essere raggiunta nel pancreas di ratto adulto mediante terapia genica usando UTMD.

Lo sviluppo embriologico del pancreas endocrino è associato all'attivazione di numerosi geni che codificano per vari fattori di trascrizione e altre proteine. 12, 13 Riconoscendo che potrebbero esserci importanti differenze tra lo sviluppo endocrino neonatale e la rigenerazione delle isole in un animale adulto con diabete, abbiamo cercato di valutare se quest'ultimo potesse essere realizzato con la terapia genica mirata al pancreas dall'UTMD. Abbiamo appositamente costruito plasmidi che codificano cDNA per Ngn3 , Pax4 , Nkx2.2, Nkx6.1, MafA e NeuroD1 , tutti sotto il controllo del promotore dell'insulina di ratto modificato (RIP3.1). Le microbolle contenenti questi geni sono state infuse per via endovenosa per un periodo di 10 minuti mentre gli ultrasuoni sono stati utilizzati per distruggere le microbolle all'interno del microcircolo pancreatico. UTMD è stato eseguito 48 ore dopo l'induzione del diabete da STZ intraperitoneale (60 mg kg −1 ). I controlli includevano UTMD con un gene marker (RIP3.1-DsRed), STZ solo senza terapia genica, nonché controlli normali che non ricevevano STZ. Sono state effettuate tre diverse ripetizioni degli esperimenti, con eutanizzazione a 10 giorni, 20 giorni e 30 giorni, per valutare la morfologia delle isole e l'espressione genica. I risultati dell'esperimento di 30 giorni sono mostrati nelle figure. Un esperimento a lungo termine è stato eseguito anche utilizzando RIP3.1- NeuroD1, dopo che questo gene ha dimostrato di essere ottimale per la rigenerazione delle isole in questo modello.

risultati

Effetti dei geni proliferativi endocrini sulla struttura dell'isolotto

La Figura 1 mostra campioni istologici rappresentativi colorati con anticorpi anti-insulina marcati con FITC (verde) e anticorpi anti-glucagone marcati con CY5 (rosso). Queste sezioni sono state ottenute da un gruppo di ratti uccisi 30 giorni dopo l'UTMD. Le isole normali contengono un nucleo centrale di cellule β (verde) circondato da un numero minore di cellule α (rosso) alla periferia dell'isolotto. Dopo STZ, la normale architettura delle isole viene praticamente abolita, con occasionalmente cellule β isolate o piccoli gruppi di β-celle. La terapia genica con Ngn3 , Pax4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 e MafA ha portato alla rigenerazione delle isole, ma con un'architettura anomala delle isole, in cui le cellule α erano predominanti. Al contrario, la terapia genica con NeuroD1 ha portato alla rigenerazione di isole con morfologia relativamente normale. È interessante notare che c'erano alcune cellule che contenevano anti-insulina e anti-glucagone nel gruppo NeuroD1 (Figura 2), ma non nelle isole normali. Questa scoperta è stata precedentemente segnalata come un marker per la proliferazione endocrina. 13 La microscopia confocale ha anche mostrato la colocalizzazione di anti-insulina e anti-Ki67, indicando la proliferazione delle cellule β (dati non mostrati). Rispetto ai gruppi di controllo normali e trattati con STZ, le cellule Ki67 positive erano statisticamente e significativamente più numerose (10 ± 2% di cellule insulino-positive, P <0, 0001) nel gruppo NeuroD1 rispetto ai controlli (solo rare cellule Ki67-positive) . Dato che NeuroD1 era sotto il controllo del promotore RIP3.1, abbiamo ipotizzato che la rigenerazione delle isole osservata fosse dovuta alla replicazione delle cellule β sopravvissute alla STZ. Ciò è stato supportato da tre osservazioni. In primo luogo, non vi erano prove di rigenerazione delle isole quando RIP3.1- NeuroD1 è stato consegnato da UTMD 7 giorni dopo STZ, un punto temporale in cui non sono state identificate cellule β residue nei controlli STZ. In secondo luogo, nessuna delle isole indotte da RIP3.1- NeuroD1 esprimeva CK19 , indicando che le nuove isole non erano derivate da cellule duttali. In terzo luogo, la colocalizzazione di Ki67 e insulina ha suggerito la proliferazione delle cellule β.

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Risultati della microscopia immunofluorescente. Il gruppo di pannelli di imaging a sinistra mostra esempi rappresentativi di isolotti dagli esperimenti di 30 giorni. Le cellule β sono colorate con anti-insulina (verde), mentre le cellule α sono colorate con anti-glucagone (rosso). Il pannello in alto a sinistra mostra un isolotto normale con un nucleo centrale di β-cellule circondato da α-cellule alla periferia dell'isolotto. I controlli trattati con streptozotocina (STZ), ma senza terapia genica attiva, mostrano la perdita di integrità dell'isoletta, con poche cellule molto β circondate da cellule α (in alto al centro e a destra). La terapia genica mirata agli ultrasuoni con Nkx2.2 , Nkx6.1 , Pax4 , Ngn3 e MafA ha portato alla formazione di isole dominanti le cellule α. Al contrario, i ratti trattati con NeuroD1 presentavano un'architettura a isola quasi normale, con cellule β centrali circondate da cellule α periferiche (immagine in basso a destra). I grafici mostrano i livelli di glucosio nel sangue (pannello superiore destro), insulina nel sangue (pannello centrale destro) e C-peptide (pannello inferiore destro) nell'esperimento di 30 giorni. Al giorno 3, tutti i ratti trattati con STZ avevano marcatamente elevati livelli di glucosio nel sangue e diminuzione dell'insulina e del peptide C rispetto ai controlli normali ( P <0, 0001). Tuttavia, entro il giorno 30, solo i ratti trattati con NeuroD1 hanno riportato il glucosio nel sangue, l'insulina e il peptide C a livelli normali o quasi normali.

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I pannelli superiori mostrano un isolotto rappresentativo di un ratto trattato con NeuroD1 . L'anti-insulina (verde) è mostrata nel pannello di sinistra, insieme all'imaging anti-glucagone (al centro) e confocale (a destra). L'immagine confocale mostra la colocalizzazione dell'insulina e del glucagone sono alcune cellule (gialle) che indicano la proliferazione endocrina. Il grafico mostra che la colocalizzazione dell'insulina e del glucagone è molto più comune nei ratti trattati con NeuroD1 rispetto ai controlli ( * P <0, 0001).

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Effetti dei geni proliferativi endocrini sulla glicemia, sull'insulina e sul peptide C.

La Figura 1 mostra anche i livelli di glicemia (in alto a destra), insulina (in mezzo a destra) e C-peptide (in basso a destra) al basale, 3 giorni dopo STZ e 30 giorni dopo STZ. Il livello di glucosio nel sangue è aumentato drammaticamente al terzo giorno in tutti i ratti trattati con STZ (circa 400 mg per 100 ml) e è rimasto elevato al giorno 30, ad eccezione dei ratti trattati con NeuroD1 . Al giorno 30, il livello di glucosio nel sangue era di 101 ± 11 mg per 100 ml nei ratti trattati con NeuroD1 , che era statisticamente e significativamente inferiore a quello di tutti gli altri gruppi trattati con STZ ( P <0, 0001), ma non dei normali controlli. Negli esperimenti a breve termine, il livello di glucosio nel sangue era normale anche nei giorni 10 e 20 nei ratti trattati con NeuroD1 (dati non mostrati). I livelli di insulina e C-peptide erano marcatamente depressi al terzo giorno in tutti i ratti trattati con STZ. Al giorno 30, i livelli di insulina e C-peptide erano quasi normali nei ratti trattati con NeuroD1 , essendo statisticamente e significativamente più alti di quelli al giorno 3 o superiori a quelli di tutti gli altri gruppi trattati con STZ ( P <0, 0001).

Effetti dei geni proliferativi endocrini sulla conta delle isole e sulla massa delle cellule β

Morfometria delle isole 30 giorni dopo che UTMD è mostrato nella Figura 3. I pannelli superiori sono sezioni rappresentative a bassa potenza colorate con ematossilina (blu) e anti-insulina (marrone) dai normali controlli (a sinistra), ratti trattati con Ngn3 (al centro) e NeuroD1 ratti trattati (a destra). Il numero di isole nei vari gruppi di trattamento è mostrato nel grafico in basso a sinistra della Figura 3. Nei controlli normali, c'erano 61 ± 6 isole per vetrino, rispetto a solo 3 ± 2 dopo il solo trattamento STZ. NeuroD1 ha prodotto 37 ± 4 isolotti per vetrino, un numero statisticamente e significativamente superiore a quello di tutti gli altri gruppi, ad eccezione dei normali controlli ( P <0, 0001). La massa delle cellule β è mostrata nel grafico in basso a destra della Figura 3. La massa delle cellule β era 1, 49 ± 0, 17% nei controlli normali ed è stata notevolmente ridotta nei controlli trattati con STZ (0, 04 ± 0, 01%) e nei controlli DsRed (0, 05 ± 0, 01 %). Nei gruppi trattati con PAX4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 , Ngn3 e Mafa , la massa delle cellule β era simile (0, 20 ± 0, 04%). Tuttavia, nei ratti trattati con terapia genica NeuroD1 , la massa di cellule β è stata ripristinata a circa la metà di quella dei controlli normali (0, 76 ± 0, 07%). La massa di cellule β era statisticamente e significativamente più alta per i ratti trattati con NeuroD1 rispetto a tutti gli altri geni e controlli ( P <0, 0001), ma era inferiore a quella dei controlli normali ( P = 0, 0006).

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Risultati della morfometria delle isole. Il pannello superiore mostra isolotti rappresentativi a bassa potenza dopo la colorazione con ematossilina e anti-insulina (colore marrone). Le isole di controllo normali (a sinistra) mostrano nuclei β-cellule ben formati e densi colorati con anti-insulina (marrone). Dopo la terapia genica Ngn3 (al centro), sono presenti cellule β disperse, ma senza nuclei di isole ben formati. Dopo la terapia genica NeuroD1 , i nuclei delle isole hanno un aspetto quasi normale. Il pannello in basso a sinistra mostra il conteggio delle isole per diapositiva per i diversi gruppi. Sia i controlli normali che i ratti trattati con NeuroD1 avevano significativamente più isole per vetrina rispetto a tutti gli altri gruppi ( * P <0, 0001 di ANOVA). Il pannello in basso a destra mostra la massa delle cellule β. I ratti trattati con NeuroD1 avevano una massa di cellule β che era la metà di quella dei controlli normali ( P <0, 0001). Sia i controlli normali che i ratti trattati con NeuroD1 avevano una massa di cellule β significativamente più elevata rispetto a tutti gli altri gruppi ( * P <0, 0001 per ANOVA).

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Durata della rigenerazione delle isole dopo la terapia genica RIP3.1-NeuroD1

La Figura 4 mostra le isole colorate con anti-insulina (verde), anti-NeuroD1 (rosso) e immagini confocali in isole da controlli normali, controlli trattati con STZ e il gruppo NeuroD1 in due punti temporali, 2 e 4 settimane dopo UTMD. Nessun segnale NeuroD1 è presente nelle isole di ratti normali o trattati con STZ. Nei ratti trattati con terapia genica NeuroD1 , NeuroD1 è presente a 2 settimane, ma non a 4 settimane dopo UTMD. Ciò è coerente con il nostro precedente rapporto secondo cui l'espressione del DNA plasmidico da UTMD raggiunge i picchi 4-7 giorni dopo il trattamento ed è praticamente scomparsa di 4 settimane. Pertanto, l'espressione genica transitoria da parte dell'UTMD innesca la rigenerazione delle isole che persiste dopo la clearance del gene erogato e della proteina espressa. Per determinare la durata della rigenerazione delle isole e il controllo della glicemia dopo UTMD, un gruppo di sei diversi ratti sono stati trattati con terapia genica NeuroD1 2 giorni dopo la STZ e uccisi 90 giorni dopo. I risultati di questo esperimento sono mostrati nella Figura 5. Tutti e sei i ratti erano profondamente iperglicemici al basale (2 giorni dopo la STZ). Ai giorni 20 e 30, tutti e sei i ratti avevano livelli normali di glucosio nel sangue (grafico, pannello di sinistra). Tuttavia, al giorno 90, quattro dei sei ratti hanno avuto un ritorno di grave iperglicemia, mentre due ratti sono rimasti normoglicemizzanti. La microscopia confocale ha mostrato una sostanziale perdita di cellule β nel centro dell'isola dei ratti iperglicemici (in alto a destra), rispetto ai ratti normoglicemizzanti (in basso a destra), che avevano conservato l'architettura dell'isolotto.

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Immunocolorazione per la presenza della proteina NeuroD1 nei controlli normali (pannelli superiori), ratti trattati con STZ (secondo pannello), 2 settimane dopo la terapia genica NeuroD1 (terzo pannello) e 4 settimane dopo la terapia genica NeuroD1 (pannelli inferiori). I pannelli di sinistra sono colorati con FITC anti-insulina (verde); pannelli centrali con anti-NeuroD1 CY5 (rosso); e i pannelli giusti sono confusi. Livelli rilevabili di NeuroD1 sono osservati nelle cellule β 2 settimane, ma non 4 settimane dopo la distruzione delle microbolle mirate agli ultrasuoni (UTMD).

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Durata della terapia genica NeuroD1 dopo diabete indotto da STZ. Il grafico mostra i livelli individuali di glicemia nel tempo in sei ratti trattati con UTMD 2 giorni dopo STZ (BSL). L'iperglicemia profonda viene ripristinata alla normalità in tutti e sei i ratti dalla terapia genica NeuroD1 ai giorni 20 e 30. Al giorno 90, due ratti rimangono normoglicemizzanti e quattro ratti sono tornati al diabete grave. Immagini microscopiche confocali da isolotti rappresentativi sono mostrate nei pannelli giusti, colorate con anti-insulina (verde) e anti-glucagone (rosso). I ratti diabetici hanno poche cellule β presenti (in alto a destra), mentre i ratti normoglicemizzanti hanno conservato l'architettura delle isole (in basso a destra).

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Prolungamento della vitalità delle isole mediante inibizione della chinasi N-terminale c-Jun

Abbiamo ipotizzato che questa perdita tardiva di isole fosse dovuta all'apoptosi. Pertanto, l'esperimento è stato ripetuto dal pretrattamento con SP600125, un inibitore della N-terminale N-terminale (JNK) c-Jun che ha dimostrato di bloccare l'apoptosi mediata dal JNK nelle isole. 14 La Figura 6 mostra i risultati della colorazione di Tunel nei controlli normali ( n = 3), nei ratti diabetici trattati con STZ ( n = 3) e nei ratti STZ trattati con terapia genica NeuroD1 con ( n = 6) e senza SP600125 ( n = 6). L'apoptosi (segnale verde) è stata abolita nel gruppo UTMD NeuroD1 che ha ricevuto il pretrattamento con SP600125. La Figura 7 mostra le misurazioni della morfometria e della glicemia nelle isole 90 giorni dopo la terapia genica NeuroD1 con e senza SP600125. I pannelli di sinistra mostrano isolotti rappresentativi nei ratti che non hanno ricevuto SP600125 (in alto) rispetto a quelli che sono stati ritirati con SP600125 (in basso). Grandi isole ben formate sono state osservate nel gruppo SP600125, rispetto ai piccoli gruppi di cellule β presenti nei controlli (No SP600125). La massa delle cellule β era 0, 61 ± 0, 07% nel gruppo SP600125 rispetto allo 0, 37 ± 0, 07% nei controlli ( P <0, 0001; grafico in alto a destra). I livelli di glucosio nel sangue a 90 giorni sono mostrati nel grafico in basso a destra della Figura 7. Il livello di zucchero nel sangue era significativamente più basso nel gruppo SP600125 trattato con NeuroD1 rispetto al gruppo NeuroD1 che non ha ricevuto SP600125 ( P <0, 05), ma era più alto di quello dei normali controlli ( P <0, 05). Ciò è dovuto al ritorno dell'iperglicemia in due dei sei ratti trattati con SP600125.

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Colorazione di Tunel (verde) dai normali controlli (in alto a sinistra), controlli STZ solo (in alto a destra) e ratti trattati con NeuroD1 senza pretrattamento SP600125 (in basso a sinistra) e con pretrattamento SP600125 (a destra). I nuclei sono colorati con DAPI (blu) e cellule β con anti-insulina (rosso); le cellule apopotiche sono verdi. Il pretrattamento con SP600125 protegge le isole rigenerate dall'apoptosi (in basso a destra).

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Risultati degli esperimenti SP600125 dopo 90 giorni. Sezioni istologiche rappresentative di ratti trattati con terapia genica NeuroD1 senza SP600125 (in alto a sinistra) e con SP600125 (in basso a sinistra). Le cellule β sparse colorate con anti-insulina (marrone) sono presenti 90 giorni dopo UTMD in assenza di SP600125. I nuclei di isole ben formati sono presenti 90 giorni dopo UTMD in presenza di SP600125. La massa delle cellule β è significativamente maggiore nel gruppo SP600125 ( P <0, 0001; grafico in alto a destra). Il livello di glucosio nel sangue è più basso nei ratti trattati con NeuroD1 che hanno ricevuto SP600125 rispetto a quelli che non hanno ricevuto SP600125 ( P <0, 05), ma è superiore a quello dei controlli normali ( P <0, 05).

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Discussione

Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio che mostra la rigenerazione in vivo delle isole pancreatiche con recupero dal diabete senza utilizzare un vettore virale. In particolare, NeuroD1 è stato mirato al pancreas dei ratti trattati con STZ con conseguente rigenerazione di isole quasi normali e ripristino dei livelli ematici normali di glucosio, insulina e peptide C a 30 giorni. L'espressione di picco dei geni reporter rilasciati come plasmidi dall'UTM è stata osservata in 4 giorni, con conseguente rapido degrado. 8 Pertanto, l'espressione genica transitoria con questo metodo è in grado di indurre la rigenerazione delle isole minimizzando teoricamente il rischio di mutagenesi inserzionale che potrebbe essere associata all'espressione prolungata della terapia genica esogena. Pretrattando i ratti con SP600125 che hanno dimostrato di bloccare l'apoptosi a cellule β, siamo stati in grado di estendere la durata della rigenerazione delle isole e della normoglicemia a 90 giorni nel modello di ratto del diabete indotto da STZ.

NeuroD1 è un fattore base di trascrizione elicoidale-elica che si trova nel pancreas, nell'intestino e nel sistema nervoso centrale. 15 NeuroD1 è presente nello sviluppo delle gemme pancreatiche e rimane rilevabile in tutti i tipi di cellule di isole mature. Nei topi knockout NeuroD1 si sviluppano tutti i tipi di cellule endocrine, ma c'è un numero ridotto di isole e un aumento dell'apoptosi a cellule β. 16 Si ritiene che NeuroD1 non sia essenziale per la differenziazione precoce, ma abbia un ruolo importante nella differenziazione e nel mantenimento in fase successiva delle cellule β e nella determinazione del destino cellulare. 17, 18 Questa visione del ruolo di NeuroD1 nello sviluppo endocrino, sebbene basata principalmente su studi su topi transgenici, è coerente con la scoperta osservata della rigenerazione delle isole nei ratti adulti in questo studio.

Anche altri fattori di trascrizione, in particolare Ngn3, Pax4, Nkx2.2, Nkx6.1 e MafA, hanno determinato la rigenerazione delle isole, ma le isole erano costituite prevalentemente da cellule α e i livelli di glucosio nel sangue, insulina e peptide C non erano normalizzati. È interessante notare che i topi transgenici che esprimono Ngn3 sotto la regolazione di un promotore di Pdx1 mostrano principalmente cellule positive al glucagone, 19 simili ai nostri risultati dopo la consegna in vivo di Ngn3 . Quando Ngn3 è sovraespresso nello sviluppo dell'intestino del pollo, produce anche prevalentemente cellule α. 20 Sembra probabile che il ruolo di questi fattori di trascrizione quando consegnato esogeno ad animali adulti con diabete possa differire dal loro ruolo nello sviluppo embriologico. È anche possibile che varie combinazioni di geni con fattore di trascrizione o altri geni implicati nello sviluppo del pancreas o nel ciclismo cellulare provochino una rigenerazione delle isole ancora più robusta di quella osservata in questo studio. Ad esempio, Chen et al. 10 hanno mostrato che la produzione di insulina da parte delle cellule acinose potrebbe essere indotta nei ratti trattati con STZ dalla combinazione di betacellulina e plasmidi Pdx1 somministrati in vivo con ripristino dei normali livelli di glucosio nel sangue e insulina per un massimo di 15 giorni. Più recentemente, Zhou, et al. 11 hanno riferito che la combinazione di Ngn3 , MafA e Pdx1 , erogata mediante iniezione diretta di adenovirus nel pancreas di topi immunodeficienti, ha portato alla riprogrammazione delle cellule esocrine in un fenotipo a cellule β. Queste nuove cellule beta sono state isolate in singole cellule o piccoli gruppi di sole poche cellule, anziché aggregarsi in isolotti. I livelli di glucosio nel sangue, insulina e peptide C sono stati migliorati, ma non riportati ai livelli normali. Quando sono stati consegnati fattori a trascrizione singola, nuove cellule β non sono state osservate in numero significativo. Questo studio differisce in due aspetti potenzialmente importanti. Innanzitutto, abbiamo utilizzato un metodo di consegna genica non virale che, a differenza dell'iniezione diretta, prende di mira l'intero pancreas. In secondo luogo, abbiamo utilizzato il promotore RIP3.1 per indirizzare selettivamente l'espressione genica al pancreas endocrino. Il promotore del citomegalovirus più comunemente usato è più efficace nel pancreas esocrino che nel pancreas endocrino. 21 Allo stesso modo, l'adenovirus è più robusto nell'esocrino che nel pancreas endocrino. 22 La rigenerazione delle isole è stata raggiunta nel diabete mediato da STZ usando l'adenovirus per fornire vari geni al fegato, con un conseguente ripristino del normale livello di glucosio nel sangue. 4, 5 Tuttavia, è probabile che l'adenovirus non venga utilizzato nell'uomo per motivi di sicurezza. Sebbene il fegato sia un organo adatto per la rigenerazione e il trapianto di isole, la nostra tecnica utilizza la distruzione di microbolle mediata dagli ultrasuoni per fornire cDNA plasmidico all'intero pancreas con una specificità relativamente potente dell'organo. Ciò offre un vantaggio teorico per la rigenerazione e il mantenimento delle isole, poiché il pancreas è il normale ambiente fisiologico per le isole. Come nei nostri precedenti studi sulla consegna genica da UTMD, 8, 9, 10 non abbiamo trovato alcuna prova di danno pancreatico da UTMD, né da siero amilasi o lipasi, né da istologia.

Non abbiamo eseguito studi complessi sulla discendenza cellulare. Tuttavia, diverse osservazioni suggeriscono che le isole rigenerate osservate dopo RIP3.1- NeuroD1 derivano dalla replicazione di cellule beta sparse sopravvissute alla STZ. La colorazione immunofluorescente con CK19, un marcatore cellulare duttale, non ha mostrato alcun assorbimento significativo nelle isole rigenerate (dati non mostrati). La rigenerazione delle isole si è verificata solo quando la consegna del gene è stata somministrata immediatamente dopo il trattamento STZ o entro 48 ore dal trattamento. Quando gli esperimenti sono stati ripetuti con la consegna del gene 7 giorni dopo la STZ, un periodo di tempo in cui non erano rilevabili cellule coloranti dell'insulina nei ratti di controllo STZ, la rigenerazione delle isole non è stata osservata e vi è stata una progressione di grave iperglicemia e perdita di peso. La colocalizzazione di Ki67 e insulina era presente nelle isole rigenerate, suggerendo la proliferazione delle cellule β. Abbiamo usato una modifica del promotore dell'insulina-I di ratto, che è fortemente specifico per le cellule β, in particolare in condizioni di iperglicemia, 8, 9 e non ci si aspetterebbe che abbia una sostanziale attività nel pancreas esocrino. Queste considerazioni sono coerenti con la visione prevalente secondo cui la replicazione delle cellule β è il meccanismo predominante per aumentare la massa delle cellule β. 13, 23, 24

Il concetto di utilizzare la terapia genica per promuovere la rigenerazione delle isole negli umani diabetici è plausibile. Meier et al. ha mostrato che l'88% dei campioni di autopsia di soggetti adulti con diabete di tipo 1 di lunga data presentava un numero considerevole di cellule β, nonché di apoptosi a cellule β e infiltrazione di linfociti T. 25 Pertanto, le cellule β esistenti sono un potenziale bersaglio per la terapia genica rigenerativa con NeuroD1, da sola o in combinazione con altri fattori di trascrizione. Tuttavia, qualsiasi strategia per rigenerare le isole dovrà anche tenere conto della potenziale distruzione di nuove isole da parte dell'apoptosi, dell'infiammazione o dell'autoimmunità. 2 Abbiamo usato SP600125 per ridurre l'apoptosi delle cellule β e prolungare la durata dell'efficacia dopo la terapia genica NeuroD1 . Dovrebbe essere possibile combinare geni rigenerativi con geni o farmaci che inibiscono l'apoptosi, 14, 26, 27, 28 e / o la risposta autoimmune. Per quanto riguarda quest'ultimo, recenti prove suggeriscono che tacrolimus e sirolimus potrebbero avere effetti tossici diretti sulle cellule β. 29 Pertanto, potrebbe non essere ancora stato stabilito il regime immunosoppressivo ottimale per la protezione delle isole. Infine, ci sono importanti differenze tra biologia dei roditori e delle isole umane; 2 quindi, questi risultati devono essere confermati negli animali di ordine superiore prima che possano essere contemplati studi umani.

Materiali e metodi

Promotori di insulina di ratto e costrutti di plasmidi

Il DNA genomico di ratto Sprague-Dawley è stato estratto dal sangue periferico di ratto con un kit QIAamp Blood (Qiagen Inc., Valencia, California, USA) secondo le istruzioni del produttore. Frammenti di promotore del gene I dell'insulina di ratto (da -412 a +165) sono stati amplificati dal DNA genomico di ratto Sprague-Dawley usando la PCR. I frammenti di DNA risultanti sono stati subclonati nel vettore reporter pDsRed1-1 (Clonetech, Mountain view, CA, USA). hMafA cDNA e criceto Nkx6.1 cDNA sono stati donati o cordialmente donati dal laboratorio Olson (East Lansing, MI, USA) presso la Michigan State University e dal laboratorio Newgard (Durham, NC, USA) presso il Duke University Medical Center. I cDNA di ratto Ngn3 , NeuroD1 , Pax4 e Nkx2.2 erano prodotti PCR del pool di cDNA del pancreas di ratto neonato Sprague – Dawley che sono stati invertiti dal loro RNA totale secondo le istruzioni del produttore. I campioni pancreatici di ratto appena nati sono stati congelati istantaneamente in azoto liquido e conservati a -86 ° C. I campioni congelati sono stati scongelati in 1 ml di soluzione di RNA-STAT e immediatamente omogeneizzati usando un omogeneizzatore di politroni a 10.000 giri / min per 30 s. L'RNA totale (30 ng) è stato trascritto inverso in 20 μl usando un kit Sensiscript RT (Qiagen Inc.) con oligo (dT) 16. La miscela di reazione è stata incubata a 42 ° C per 50 minuti, seguita da un'ulteriore incubazione a 70 ° C per 15 minuti. La PCR è stata eseguita per tutti i campioni usando un sistema GeneAmp PCR 9700 (PE ABI, Foster City, CA, USA) in un volume di 50 μl contenente 2 μl di cDNA, 25 μl di Master Mix HotStarTaq (Qiagen Inc.) e 20 pmol di ciascun primer . I corrispondenti prodotti PCR sono stati verificati mediante elettroforesi su gel di agarosio e purificati con un kit di estrazione gel QIAquick (Qiagen Inc.). Per confermare le sequenze, i prodotti PCR sono stati sequenziati direttamente utilizzando un kit di sequenziamento del ciclo Terminator dRhodamine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) su un analizzatore genomico ABI 3100 (Van Allen Way, Carlsbad, CA, USA). Tutti i cDNA del gene fattore trascrizionale sono stati sottoposti a clonazione nel vettore guida RIP3.1. La digestione, la legatura, il subclone, l'isolamento e la purificazione dei plasmidi sono stati eseguiti con procedure standard e ancora una volta sequenziati per confermare che non erano presenti mutazioni artefattuali.

Protocolli animali e UTMD

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del National Institute of Health (NIH) e dopo aver ottenuto l'approvazione del nostro IACUC locale. L'addome sinistro e il collo dei ratti Sprague-Dawley maschi (230–270 g) anestetizzati con chetamina intraperitoneale (60 mg kg −1 ) e xilazina (5 mg kg −1 ) sono stati rasati e un tubo di polietilene (PE 50, Becton Dickinson, Franklin Lakes, TN, USA) è stato inserito nella vena giugulare interna destra per taglio.

Un totale di 45 ratti ha ricevuto uno dei nove trattamenti: (1) nessun trattamento (ratti di controllo normali, n = 3); (2) trattamento con STZ (60 mg kg −1 per intraperitoneale, Sigma, St Louis, MO, USA) da solo senza UTMD ( n = 3); (3) trattamento con STZ e UTMD con DsRed ( n = 3); (4) con STZ e UTMD con ngn3 ( n = 6); (5) STZ e UTMD con NeuroD1 ( n = 6); (6) STZ e UTMD con Pax4 ( n = 6); (7) STZ e UTMD con Nkx2.2 ( n = 6); (8) STZ e UTMD con Nkx6.1 ( n = 6); (9) con STZ e UTMD con MafA ( n = 6). Tutti i geni sono stati consegnati come cDNA plasmidico sotto il controllo del promotore RIP3.1. Il livello di glucosio nel sangue è stato misurato 12 ore dopo l'iniezione di STZ. Gli animali con un livello di glicemia a digiuno superiore a 250 mg per 100 ml sono stati considerati modelli di diabete di tipo 1 di successo e successivamente sottoposti a UTMD entro 48 ore dal trattamento con STZ. Microbolle o soluzioni di controllo (0, 5 ml diluite con 0, 5 ml di soluzione tamponata con fosfato (PBS)) sono state infuse per oltre 10 minuti usando una pompa (Genie, Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Durante l'infusione, l'ecografia è stata diretta al pancreas utilizzando un trasduttore di ultrasuoni disponibile in commercio (S3, Sonos 5500, Philips Ultrasound, Bothell, WA, USA). La sonda è stata bloccata in posizione. L'ultrasuono è stato quindi applicato in modalità ultraarmonica (trasmissione 1, 3 MHz / ricezione 3, 6 MHz) con un indice meccanico di 1, 4. Quattro esplosioni di ultrasuoni sono state attivate su ogni quarta sistole terminale mediante elettrocardiogramma usando un ritardo di 45-70 ms dopo il picco dell'onda R. Queste impostazioni hanno dimostrato di essere ottimali per la consegna di plasmidi da UTMD usando questo strumento. 8 La distruzione delle bolle era visivamente evidente in tutti i ratti. Dopo l'UTMD, la vena giugulare è stata legata, la pelle è stata chiusa e gli animali sono stati autorizzati a guarire. I campioni di sangue sono stati prelevati dopo un digiuno di 12 ore durante la notte al basale e in diversi giorni dopo il trattamento. Questo protocollo è stato ripetuto tre volte con 135 ratti uccisi ai giorni 10 ( n = 45), 20 ( n = 45) e 30 ( n = 45) usando un sovradosaggio di sodio pentobarbital (120 mg kg −1 ). Pancreas, fegato, milza e reni sono stati raccolti per esame istologico. Il livello di glucosio nel sangue è stato misurato usando una striscia reattiva per glicemia (Precision, Abbott, Abbott Park, IL, USA); i livelli di insulina nel sangue e di peptidi C sono stati misurati usando un kit RIA (Linco Research, Radioimmunoassay, Billerica, MA, USA).

Per gli esperimenti di 90 giorni, solo RIP3.1- NeuroD1 è stato somministrato da UTMD ( n = 6), insieme a tre controlli normali, in cui non è stato somministrato STZ, e tre controlli STZ. Questo esperimento è stato quindi ripetuto con pretrattamento di ratti con SP600125 ( n = 6) prima di UTMD con RIP3.1- NeuroD1 e senza tale pretrattamento ( n = 6).

Fabbricazione di microbolle stabilizzate con lipidi contenenti plasmidi

Sono state preparate microbolle stabilizzate sui lipidi come precedentemente descritto nel nostro laboratorio. In breve, viene preparata una soluzione madre contenente 270 mg di 1, 2-dipalmitoil-sn-glicerero-3-fosfatidilcolina (Sigma), 30 mg di 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (Sigma) e 1 g di glucosio. Questi ingredienti vengono sciolti in un bagno di acqua bollente per 20-30 minuti, con pipettaggio del contenuto su e giù fino a quando non rimangono particelle visibili. Questa soluzione madre viene conservata a 4 ° C. Le microbolle contenenti plasmidi vengono preparate miscelando 2 mg di plasmide essiccato con 50 μl di lipefectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e incubando a temperatura ambiente per 15 minuti. Questa miscela di DNA liposomiale o plasmidico viene aggiunta a 250 ml di soluzione madre lipidica, 50 ml di glicerolo puro e 5 ml di soluzione di albumina al 10%, miscelati bene con una pipetta e quindi posti in ghiaccio. Aliquote di 0, 5 ml di questa soluzione fosfolipide-plasmide sono state poste in flaconcini trasparenti da 1, 5 ml; l'aria nello spazio di testa dei flaconcini viene sostituita con gas perfluoropropano (Air Products and Chemicals Inc., Allentown, Pennsylvania, USA). Each vial was incubated at 4 °C for 30 min and then mechanically shaken for 30 s by a dental amalgamator (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA, USA). The lipid-stabilized microbubbles appear as a milky white suspension floating on the top of a layer of liquid containing unattached plasmid DNA. The subnatant was discarded and the microbubbles were washed three times with PBS to remove unattached plasmid DNA. The mean diameter and concentration of the microbubbles in the upper layer were measured by a particle counter (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA; Multisizer III).

L'immunoistochimica

Cryostat sections 5–8 μm in thickness were fixed in 4% paraformaldehyde for 15 min at 4 °C and quenched for 5 min with10 m M glycine in PBS. Sections were then rinsed in PBS three times, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 10 min. Sections were blocked with 10% goat serum at 37 °C for 1 hr and washed with PBS three times. The primary antibody (mouse anti-insulin antibody, 1:500 dilution (Sigma); rabbit anti-glucagon, 1:500; rabbit anti-somatostatin, 1:500; rabbit anti-pancreatic polypeptide, 1:500; rabbit anti-NeuroD1, 1:500; rabbit anti- Ki-67, rabbit anti-BrDu, 1:500; mouse anti-ck19, 1:2000 dilution (Chemicon, Temecula, CA)) was added and incubated for 2 hrs at room temperture. After washing with PBS three times for 5 min, the secondary antibody (Sigma; anti-mouse IgG conjugated with FITC; anti-rabbit lgG conjugated with Cy5, 1:500 dilution in block solution) was added and incubated for 1 hr at room temperature. Sections were rinsed with PBS for 10 min, five times, and then mounted.

Tunel staining

Tunel staining for detection and quantification of apoptosis in rat pancreas slides was performed using a commercially available kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) according to a standard protocol. DNA strand breaks at the single-cell level were labeled with fluorescein and imaged by fluorescence microscopy.

β-cell mass calculation

β-cell mass was evaluated by the method of Terauchi et al. 30 Sections of rat pancreas were immunostained with monoclonal mouse anti-insulin (1:500 dilution) and a second antibody, peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG (1:500 dilution), and developed in liquid DAB. Images from six consecutive pancreas sections were captured on a monitor screen of a digital imaging system (Olympus BX60, Nikon digital camera DXM1200C and NIS-Elements F2.30, Miami, FL, USA). The total areas of islet β-cells and whole pancreas were measured using NIH ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA). β-cell mass was calculated as the ratio of β-cells to whole pancreas for six consecutive pancreatic slides from each rat.

Analisi dei dati

Data were analyzed with Statview software (SAS, Cary, NC, USA). The results are expressed as mean±1s.d. Differences were analyzed by repeated measures ANOVA with Fisher's post hoc test and considered significant at P <0.05.