Concentrazione della proteina della matrice oligomerica della cartilagine sierica o al plasma come marker diagnostico nella pseudoacondroplasia: diagnosi differenziale di una famiglia | rivista europea di genetica umana

Concentrazione della proteina della matrice oligomerica della cartilagine sierica o al plasma come marker diagnostico nella pseudoacondroplasia: diagnosi differenziale di una famiglia | rivista europea di genetica umana

Anonim

Astratto

La pseudoachondroplasia (PSACH) è un'osteocondrodisplasia autosomica dominante dovuta a mutazioni del gene che codifica per la proteina della matrice oligomerica della cartilagine (COMP). La diagnosi clinica di PSACH si basa principalmente sull'anamnesi familiare, sull'esame obiettivo e sulla valutazione radiografica ed è talvolta estremamente difficile, in particolare nei pazienti adulti. La diagnosi genetica basata sul sequenziamento del DNA, d'altra parte, può essere costosa, dispendiosa in termini di tempo e intensiva perché le mutazioni COMP possono essere sparse in tutto il gene. Tuttavia, ci sono prove che una ridotta concentrazione di COMP nel plasma può servire da marker diagnostico in PSACH, in particolare nei pazienti adulti. Qui, riportiamo la diagnosi differenziale basata sulla concentrazione COMP di siero e / o plasma di una famiglia con membri adulti affetti. Le concentrazioni sieriche medie e / o COMP del plasma dei tre membri della famiglia affetti vivi (0, 69 ± 0, 15 e / o 0, 81 ± 0, 08 μ g / ml, rispettivamente) erano significativamente inferiori rispetto a quelle di un gruppo di controllo compatibile con l'età di 21 adulti (1, 52 ± 0, 37 e / o 1, 37 ± 0, 36 μ g / ml, rispettivamente; P G nell'esone 14 del gene COMP , con conseguente sostituzione dell'amminoacido 511 dall'acido aspartico alla glicina in COMP. Pertanto, concentrazione di siero e / o plasma COMP può essere suggerito come marcatore diagnostico aggiuntivo per aiutare i risultati clinici e radiografici in casi sospetti di PSACH.

introduzione

La pseudoachondroplasia (PSACH; MIM 177170) è un'osteocondrodisplasia autosomica dominante che colpisce almeno 1 su 20.000 individui ed è caratterizzata da bassa statura sproporzionata, deformità degli arti inferiori, dita corte, articolazioni allentate e lassità legamentosa. 1, 2, 3 Altre caratteristiche includono il normale aspetto craniofacciale e l'artrosi ad esordio precoce. I suoi reperti radiologici comprendono piccole epifisi irregolari e metafisi irregolari a fungo di tutte le ossa tubulari e appiattimento e / o battito anteriore delle vertebre. La statura degli adulti è stata riportata come 82-130 cm. Sebbene i cambiamenti vertebrali si risolvano con l'età (cioè, dopo la pubertà, le vertebre diventano più normali nell'aspetto), i cambiamenti epifisari delle ossa lunghe diventano più gravi, portando a degenerazione progressiva e grave artrosi.

Il PSACH è causato esclusivamente dalle mutazioni del gene della proteina della matrice oligomerica della cartilagine ( COMP ) situato sul cromosoma 19p13.1 e, ad oggi, tutti i casi di PSACH sono stati attribuiti a mutazioni negli esoni 8–19 di questo gene. 4 COMP è una glicoproteina omopentamerica presente nella cartilagine, tendine, legamenti, muscolatura liscia, sinovia e osteoblasto. 5, 6 COMP è descritto come un componente chiave della matrice extracellulare (ECM) dello scheletro. Il COMP lega i tipi di collagene I, II e IX attraverso il suo dominio globulare C-terminale, 7, 8, 9 formando una grande rete strutturale di macromolecole nell'ECM. La secrezione di COMP mutante dai condrociti è marcatamente ritardata, presumibilmente a causa di una prolungata associazione con chaperoni nel reticolo endoplasmatico ruvido (rER). 10 Pertanto, PSACH sembra essere una malattia da accumulo di RER molto probabilmente causata da un ripiegamento improprio del COMP mutante. Il fallimento della crescita nei pazienti con PSACH può essere spiegato da un aumento della morte cellulare dei condrociti della piastra di crescita.

L'attuale diagnosi clinica di PSACH si basa principalmente sull'anamnesi familiare, sull'esame obiettivo e sulla valutazione radiografica. Tuttavia, la presentazione clinica varia sostanzialmente tra i singoli casi e dipende dall'età dei pazienti. La maggior parte dei cambiamenti radiografici non è specifica della malattia, portando a diagnosi errate, in particolare nei pazienti adulti. 11 È stato riferito che i reperti caratteristici della colonna vertebrale si risolvono nel tempo e si normalizzano durante l'adolescenza, rendendo la diagnosi ancora più difficile. 12 Inoltre, la diagnosi radiologica è più difficile in età adulta a causa dei cambiamenti associati derivanti dall'osteoartrite. 11 La diagnosi genetica basata sul sequenziamento del DNA, d'altra parte, può essere costosa e ad alta intensità di manodopera perché le mutazioni COMP possono essere sparse in tutto il gene contenente 19 esoni. 4 Tuttavia, ci sono prove che una ridotta concentrazione di COMP nel plasma può servire da marker diagnostico in PSACH, in particolare nei pazienti adulti. 12 Mabuchi et al. 12 hanno presentato prove che la COMP circolante è diminuita nei pazienti con PSACH portatori di mutazioni COMP rispetto ai controlli.

Qui, riportiamo la diagnosi differenziale basata sulla concentrazione COMP di siero e / o plasma di una famiglia con membri adulti affetti in due generazioni. Tutti e tre i membri colpiti vivi erano adulti con caratteristiche radiologiche e cliniche non caratteristiche.

Materiali e metodi

Caso storico

I soggetti sono i tre membri nani (individui II-4, II-6 e III-1) di una famiglia (vedi pedigree nella Figura 1). I nonni del probando (individuo III-1) erano cugini di primo grado. Hanno avuto cinque figlie, di cui quattro sono state colpite e due figli sani. Due delle quattro figlie colpite (individui II-2 e II-3) sono morte rispettivamente all'età di 78 e 45 anni. L'individuo II-4 è una delle due figlie colpite vive. Ha 80 anni, 100 cm di altezza e soffre di osteoartrosi grave. L'individuo II-6, l'altra figlia colpita viva, d'altra parte, ha 60 anni, 90 cm di altezza e la madre del probando. Soffre anche di grave osteoartrosi. Il probando, 36 anni e 119 cm di altezza, è l'unica figlia dell'individuo II-6 da un possibile matrimonio consanguineo all'individuo II-5. È una donna intelligente con il normale aspetto craniofacciale. Una bassa statura, arti sproporzionatamente corti e dita corte sono i suoi unici problemi medici noti (Figura 2). Il suo esame scheletrico radiologico ha mostrato l'accorciamento delle ossa lunghe e l'ampliamento delle sue epifisi (Figura 3). Falangi, metacarpali e metatarsali erano corti e spessi con epifisi a forma di cono (Figura 3a e d). Il radiogramma del torace mostrava clavicola e costole spatolate di qualità superiore con marcate calcificazioni costocondrali (Figura 3c). La radiografia laterale della colonna vertebrale ha rivelato il raddrizzamento della cifosi dorsale con un ridotto diametro antero-posteriore del torace e piccole depressioni della placca terminale centrale di alcune vertebre dorsali (Figura 3b). Vi era un normale allargamento delle distanze interpedicolari dalla parte superiore alla parte inferiore della colonna vertebrale (Figura 3b). Il radiogramma del bacino mostrava teste femorali appiattite, irregolari e frammentate con collo accorciato, angoli acetabolari aumentati e sinfisi pubica allargata (Figura 3e). Il cranio era normale.

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Pedigree familiare. I coniugi non necessari sono stati omessi dal pedigree originale per semplificare la presentazione della famiglia. Cerchi pieni, pseudoacondroplasia (PSACH); cerchi e quadrati vuoti, non influenzati; ( * ), proband.

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Fotografia di proband.

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Rilievo scheletrico radiologico della probanda che mostra l'accorciamento delle ossa lunghe e l'ampliamento delle sue epifisi. Le mani e i piedi erano piccoli. Falangi, metacarpali e metatarsali erano corti e spessi con epifisi a forma di cono ( a e d ). Le tibia e le fibule sono state leggermente accorciate con metafisi ed epifisi distese ( d ). La carenza di raggi e ulna era più evidente con epifisi allargate e nei raggi prossimali era presente un lieve inchino (dati non mostrati). Il radiogramma del torace mostrava clavicole con curvatura superiore e costole spatolate con marcate calcificazioni costocondrali ( c ). La radiografia laterale della colonna vertebrale ha rivelato il raddrizzamento della cifosi dorsale con un diametro anteroposteriore ridotto del torace e piccole depressioni della placca terminale centrale di alcune vertebre dorsali ( b ). Vi era un normale allargamento delle distanze interpedicolari dalla parte superiore alla parte inferiore della colonna vertebrale ( b ). Il radiogramma del bacino mostrava teste femorali appiattite, irregolari e frammentate con collo accorciato, aumento degli angoli acetabolari e sinfisi pubica allargata ( e ).

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Questi risultati nell'età adulta non erano caratteristici di una data osteocondrodisplasia, ma erano suggestivi di PSACH o displasia acromiomelica, tipo Maroteaux (AMDM, MIM 602875). La revisione di questa famiglia da parte della Rete europea di displasia scheletrica (ESDN) ha supportato la nostra diagnosi (numero di caso ESDN-00490) e ha suggerito l'analisi delle mutazioni COMP come la prima scelta di azione per la diagnosi definitiva.

Test COMP per siero e / o plasma

Tutte le donne che hanno partecipato a questo studio come gruppo di controllo sono state selezionate a caso (cioè, in termini di una determinata condizione di salute) dai policlinici dell'ospedale universitario di Pamukkale e hanno dato il consenso informato informato prima del prelievo di sangue. I partecipanti selezionati del gruppo di controllo sono stati abbinati alla fascia di età di tre pazienti analizzati per le mutazioni COMP in questo studio. Tre millilitri di sangue periferico sono stati raccolti in una provetta contenente EDTA per la separazione del plasma e 5 ml di sangue periferico sono stati raccolti in una provetta semplice che non contiene anticoagulanti per la separazione del siero. I campioni di sangue sono stati centrifugati a 3000 g per 10 minuti e il plasma e il siero sono stati accuratamente rimossi dalle rispettive provette e trasferiti in normali provette di polipropilene. I campioni sono stati conservati a -80 ° C fino a ulteriore elaborazione.

Le concentrazioni sieriche e / o plasmatiche di COMP di 3 pazienti e 21 controlli sono state analizzate sulla base di un kit di test immunoenzimatici (Wieslab, Lund, Svezia), secondo il protocollo del produttore e come descritto altrove. 12

Estrazione del DNA e rilevazione delle mutazioni COMP

Il DNA genomico è stato estratto da campioni di sangue di tutti e tre i soggetti colpiti, cioè II-4, II-6 e III-1, usando metodi standard. Il sequenziamento bidirezionale del DNA fluorescente è stato impiegato per identificare le mutazioni negli esoni 8–19 del gene COMP .

analisi statistica

Sono state eseguite analisi statistiche per le concentrazioni sieriche e / o plasmatiche di COMP usando il test U- test di Mann – Whitney non parametrico e P <0, 05 è stato considerato statisticamente significativo.

risultati

Concentrazioni sieriche e / o plasmatiche di COMP

Le concentrazioni sieriche medie e / o COMP del plasma di tre membri della famiglia affetti vivi (0, 69 ± 0, 15 e / o 0, 81 ± 0, 08 μ g / ml, rispettivamente) erano significativamente inferiori rispetto a quelle di un gruppo di controllo compatibile con l'età di 21 adulti (1, 52 ± 0, 37 e / o 1, 37 ± 0, 36 μ g / ml, rispettivamente; P <0, 0001; Tabella 1). Non vi è stata alcuna sovrapposizione nella distribuzione della concentrazione sierica e / o plasmatica di COMP tra pazienti e controlli PSACH (Figura 4).

Tabella a grandezza naturale

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Distribuzioni di concentrazione di proteine ​​di matrice oligomerica della cartilagine al plasma ( a ) e siero ( b ) nei pazienti con pseudoacondroplasia (PSACH) (quadrati chiari) rispetto ai controlli (diamanti scuri).

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Rilevazione di mutazione COMP

Tutti e tre i membri della famiglia affetti erano eterozigoti per il cambiamento nucleotidico c.1532A> G nell'esone 14 del gene COMP (Figura 5; la numerazione dei nucleotidi è secondo la sequenza di cDNA con il numero di accesso Genbank XM_009336. Il nucleotide 1 è stato considerato il primo nucleotide di il codone di inizio della traduzione). Si prevede che questa variazione di sequenza comporti una sostituzione dell'amminoacido 511 dall'acido aspartico alla glicina in COMP (p.Asp511Gly).

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Il sequenziamento bidirezionale del DNA fluorescente degli esoni 8–19 del gene della proteina della matrice oligomerica della cartilagine ( COMP ) in tutti e tre i membri della famiglia affetti ha rivelato lo stesso cambiamento nucleotidico (c.1532A> G) nell'esone 14, risultando in una sostituzione dell'amminoacido 511 da acido aspartico a glicina in COMP (p.Asp511Gly). Erano eterozigoti per la mutazione. Le informazioni sulla sequenza degli individui III-1 e II-6, insieme a un controllo, sono mostrate in questa figura. Le sequenze sottolineate, incluso il cambio nucleotidico, sono dettagliate a destra. In peso, tipo selvaggio; Mutato, mutato.

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Discussione

La diagnosi accurata di una data osteocondrodisplasia è un processo che richiede tempo e spesso complicato, che coinvolge la valutazione clinica e radiografica del probando e di altri membri della famiglia. In generale, le valutazioni cliniche e radiografiche vengono utilizzate per determinare una diagnosi differenziale prima di un test molecolare di conferma. Questo studio mirava a testare il valore della concentrazione di siero e / o plasma COMP come possibile marker diagnostico nel differenziare il PSACH da altre osteocondrodisplasia prima di un test molecolare di conferma più costoso e ad alta intensità di lavoro.

L'indagine scheletrica del probando ha rivelato un nanismo a arti corti con predominanza acromesomelica, un coinvolgimento epifisario e metafisario generalizzato e incerti cambiamenti vertebrali. Questi risultati radiologici da soli non hanno permesso una chiara differenziazione tra AMDM e PSACH, che si riteneva fossero le diagnosi più probabili. La sospetta diagnosi clinica di PSACH in famiglia è stata supportata da una riduzione della concentrazione sierica e / o del plasma COMP, e, successivamente, confermata dal sequenziamento del DNA del COMP e dall'identificazione di una potenziale mutazione patogena.

Il cambiamento di nucleotidi eterozigoti (c.1532A> G) nell'esone 14 del gene COMP , che si prevede porti a una sostituzione dell'amminoacido 511 dall'acido aspartico alla glicina non è stato pubblicato in precedenza. Tuttavia, è probabile che sia la causa del PSACH di proband poiché l'acido aspartico 511 è un amminoacido conservato nella ripetizione finale della regione ripetitiva TSP-3 (simile alla calmodulina) legante Ca 2+ . 4 Inoltre, è stata segnalata una mutazione dell'acido aspartico 511 in istidina patogena in un paziente non correlato a PSACH. 13 Il test della madre affetta e della zia materna del probando, entrambi testati anche eterozigoti positivi per il cambiamento nucleotidico 1532A> G, è un'ulteriore prova che è probabile che questo cambiamento di sequenza sia la causa del PSACH del probando. D'altro canto, il pedigree di questa famiglia (Figura 1) è molto interessante poiché i nonni del probando erano apparentemente fenotipicamente normali. Pertanto, si dovrebbe postulare un significativo mosaicismo germinale per avere 4 bambini su 7 affetti da un disturbo autosomico dominante.

La diagnosi di PSACH, usando il sequenziamento del DNA di COMP, non è sempre facile da eseguire poiché le mutazioni possono essere disperse in 12 esoni di COMP (esoni 8–19). 4, 14 Questo test può quindi essere costoso e ad alta intensità di manodopera ed è offerto solo in alcune strutture specializzate in tutto il mondo. Il tempo medio di risposta per lo screening delle mutazioni del gene COMP (esoni 8–19) mediante sequenziamento del DNA può essere compreso tra 2 e 15 settimane, mentre le cariche di un laboratorio commerciale possono arrivare a € 1500. L'analisi della concentrazione di siero e / o plasma COMP, d'altra parte, offre un'alternativa veloce (ovvero, i risultati si ottengono il giorno successivo) e meno costosa (ovvero, 15 € per test) che può aiutare nella selezione dei pazienti che sono adatti per un test molecolare di conferma.

Lo studio del produttore del kit di test immunoenzimatici per COMP ha rilevato che la concentrazione sierica media di COMP in un gruppo di 80 donatori di sangue non selezionati (età 22-59) era 1, 35 ± 0, 40 μ g / ml (intervallo: 0, 99–2, 54). Mabuchi et al. 12 hanno riportato la concentrazione plasmatica media di COMP in un gruppo di 47 donatori di sangue di controllo (età 0–81) come 1, 42 ± 0, 35 μ g / ml (intervallo: 0, 85-2, 24). In questo studio, la concentrazione sierica media di COMP di 21 donatori di sangue a controllo femminile (età 24–70 anni) è stata trovata come 1, 52 ± 0, 37 μ g / ml (intervallo: 0, 97-2, 35), mentre la concentrazione COMP media nel plasma dello stesso controllo il gruppo è stato trovato come 1, 37 ± 0, 36 μ g / ml (intervallo: 0, 95–2, 17).

È stato riferito che i livelli di COMP nel liquido sinoviale o nel siero aumentano significativamente in condizioni patologiche, come l'artrite reumatoide e l'artrosi, caratterizzate dalla distruzione della cartilagine. 15, 16 Al contrario, come accennato in precedenza, la secrezione di COMP mutante dai condrociti è notevolmente ritardata in PSACH. Pertanto, si prevedono bassi livelli di COMP nei campioni di siero di pazienti con mutazioni del gene COMP . A sostegno di questa idea sono i risultati di Mabuchi et al 12 e questo studio presentato. Mabuchi et al. 12 hanno riportato la concentrazione COMP media nel plasma di sei pazienti PSACH con mutazioni COMP pari a 0, 62 ± 0, 13 μ g / ml (intervallo: 0, 50-0, 84), mentre questo studio riporta la concentrazione sierica media COMP di tre pazienti PSACH con mutazioni COMP come 0, 69 ± 0, 15 μ g / ml (intervallo: 0, 59-0, 87) e concentrazione media COMP del plasma degli stessi pazienti di 0, 81 ± 0, 08 μ g / ml (intervallo: 0, 73-0, 88). Tutte queste diminuzioni rilevate erano statisticamente significative ( P <0, 0001). Inoltre, Mabuchi et al. 12 hanno riferito che lo stesso approccio rivela anche una riduzione significativa dei livelli plasmatici di COMP di pazienti con displasia epifisaria multipla portatori di mutazioni COMP.

In conclusione, l'analisi della concentrazione di COMP nel siero e / o nel plasma può essere suggerita come marker diagnostico aggiuntivo nel tempo e in termini di costi ai risultati clinici e radiografici nelle osteocondrodisplasie causate da mutazioni nel gene COMP .

adesioni

GenBank / EMBL / DDBJ

  • XM_009336