Sf3b1, un fattore di giunzione è spesso mutato nell'anemia refrattaria con sideroblasti ad anello | leucemia

Sf3b1, un fattore di giunzione è spesso mutato nell'anemia refrattaria con sideroblasti ad anello | leucemia

Anonim

Foci di deposizione di ferro nei mitocondri perinucleari di precursori eritroidi, chiamati sideroblasti ad anello (RS), possono essere osservati in casi acquisiti e congeniti di anemia. In molti pazienti con neoplasia mielodisplastica / mieloproliferativa (MDS / MPN) e sindrome mielodisplastica (MDS), si possono trovare varie frequenze di RS quando colorate con blu di Prussia. 1 La scoperta di> 15% di RS insieme ai criteri morfologici e citogenetici appropriati è coerente con la diagnosi di anemia refrattaria con RS (RARS). 2 RS può anche essere trovato in una forma di MDS / MPN chiamata anemia refrattaria con RS associata a marcata trombocitosi (RARS-T). I pazienti con RARS e RARS-T hanno anche trovato mutazioni in JAK2 , MPL , TET2 e ASXL1 . 3, 4, 5, 6, 7, 600 × 109 / L) e sideroblasti ad anello più del 15% considerati MDS / MPD, non classificabili. Blood 2007; 109: 1334–1335. "Href = / articles / leu2011232 # ref8 aria-label =" Riferimento 8 "traccia-dati = clic etichetta-traccia-dati = collegamento> 8 Tuttavia, la rilevanza clinica e l'eziologia della RS in MDS e MDS / MPN rimangono poco chiari a causa della mancanza di specifici difetti molecolari, tra cui anomalie o mutazioni cromosomiche ricorrenti.Il sequenziamento di prossima generazione ad alto rendimento (HT-NGS) viene ampiamente utilizzato per identificare eventi mutazionali nella leucemia e altri tumori. 9 Abbiamo applicato questa tecnologia a pazienti con varie forme di MDS; usando questo approccio, abbiamo trovato una mutazione somatica in SF3B1 , un gene situato nel cromosoma 2q in un paziente con RARS e conta piastrinica elevata. SF3B1 , fattore di giunzione 3b, subunità 1 , è un componente del Complesso ribonucleoproteico nucleare U2-piccolo (U2-snRNP) Il complesso U2-snRNP è uno dei due spliceosomi unici presenti nelle cellule eucariotiche. È costituito da proteine ​​specifiche per SF3b, SF3a e U2-snRNP. 10 Circa il 95% degli RNA messaggeri ( Gli mRNA) hanno regioni introniche che richiedono ulteriore r modifica da parte degli spliceosomi per produrre mRNA normali. Nel cancro sono stati descritti splicing aberranti e mutazioni di questi meccanismi di splicing. 11, 12

Il presente studio descrive mutazioni ricorrenti di un nuovo gene, SF3B1 in RARS. Sono stati analizzati campioni di 14 pazienti con RARS, 18 pazienti con RARS-T e 24 pazienti con caratteristiche morfologiche simili ma senza RS. Abbiamo applicato la tecnologia HT-NGS per interrogare il genoma di un gruppo di 11 pazienti con MDS con varie caratteristiche patomorfologiche tra cui pazienti con RARS-T, CMML-1, RAEB-1/2, RCMD e AML. In un paziente con RARS-T, abbiamo trovato un possibile gene candidato, SF3B1 , un membro integrale del complesso spliceosoma (paziente n. 13; Tabella 1 e Figura 2b). È stata rilevata una mutazione missenso specifica nella posizione dell'amminoacido 700, che ha portato alla sostituzione dell'acido glutammico con lisina (K700E) (Figura 1a). La natura somatica di questa mutazione è stata confermata dal sequenziamento delle cellule CD3 + non clonali con il metodo Sanger (Figura 1b). L'analisi degli altri 10 pazienti studiati da HT-NGS non ha rivelato alterazioni clonali della sequenza SF3B1 . Nessuno di questi pazienti ha mostrato RS tranne uno con <15% di RS. Sulla base di questo risultato, abbiamo deciso di concentrarci su una più ampia coorte di pazienti con RARS. Abbiamo trovato che 9/14 (64%) pazienti con RARS e 13/18 (72%) pazienti con RARS-T hanno mutazioni in SF3B1 (Figura 2a). Le caratteristiche cliniche e molecolari dei casi mutanti sono riassunte nella Tabella 1. Da notare che le mutazioni di SF3B1 erano tutte eterozigoti e il 50% dei pazienti con RARS e il 44% dei pazienti con RARS-T presentano una comune mutazione missenso, K700E, già riportata nelle cellule tumorali pancreatiche (//www.sanger.ac.uk) e rilevate dall'HT-NGS nel caso indice (paziente n. 13, Tabella 1). Tutte le altre mutazioni erano nuove e la natura somatica è stata confermata nelle cellule CD3 + non clonali (Figura 1c). Due mutazioni (R625L, paziente n. 12 e R625C, paziente n. 15) (Tabella 1) non potevano essere confermate a causa della mancanza di DNA germinale, ma erano assenti nei controlli normali e nei database SNP. Abbiamo anche sottoposto a screening SF3B1 in un gruppo eterogeneo di 24 pazienti con MDS e MPN senza RS e <15% RS non ha trovato mutazione in SF3B1 (Figura 2a). La citogenetica basata su array Affymetrix 6.0 è stata utilizzata in 430 pazienti con MDS per rilevare la presenza di delezioni e disomia uniparentale che coinvolgono il locus SF3B1 . L'algoritmo di rilevazione ha indicato una possibile perdita di eterozigosi in una vasta regione del cromosoma 2q in due pazienti non-MDS senza RS, ma il sequenziamento bidirezionale non ha rivelato mutazioni in nessuno degli esoni di SF3B1. Quando abbiamo sequenziato un paziente con anemia sideroblastica congenita con numerosi livelli di RS e piastrine di 541 × 10 9 / L, non abbiamo trovato mutazioni in nessuno degli esoni. Da notare, abbiamo anche identificato un paziente con mielofibrosi post-policitemica con RS occasionale, conta piastrinica di 727 × 10 9 / L e JAK2 negativo, che era mutato (K700E). Complessivamente queste osservazioni ci portano a ipotizzare che SF3B1 sia altamente specifico nella patogenesi di RARS.

Tabella a grandezza naturale

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Il sequenziamento di prossima generazione ad alto rendimento in un paziente con RARS-T rivela una mutazione somatica in SF3B1 . ( a ) Il sequenziamento dell'intero esoma è stato eseguito sul DNA genomico derivato dalle cellule del midollo osseo (BM) e dalle cellule CD3 + non clonali di un paziente con RARS-T (paziente n. 13; Tabella 1) e dalle rispettive cellule CD3 + non clonali. È stato disegnato uno screenshot rappresentativo per illustrare letture mappate di SF3B1 . I fili avanti e indietro sono rappresentati da rettangoli blu e verdi. I rettangoli rossi evidenziano la regione nucleotidica in cui si verifica la mutazione. ( b ) Le sequenze nucleotidiche in avanti e indietro descrivono il cambiamento nucleotidico rispetto alla sequenza di riferimento (citosina al posto della timidina). L'analisi del set di dati è stata eseguita sulla piattaforma DNAnexus (//dnanexus.com). Le tracce della sequenza nucleotidica con il metodo Sanger hanno confermato la presenza di una mutazione missenso in SF3B1 . Le sequenze di andata (cromatogramma superiore) e inversa (cromatogramma inferiore) per l' esone 15 di SF3B1 mostrano una mutazione missenso (2098 A> G, producendo una sostituzione di acido glutammico per lisina, K700E) nel BM del paziente con RARS-T (paziente no 13; Tabella 1). Le linee e le frecce nere indicano le triplette e la sostituzione dei nucleotidi. Il sequenziamento in avanti e indietro è presentato anche per linfociti positivi non clonali CD3 isolati dallo stesso paziente, dimostrando che il cambiamento nucleotidico osservato nel BM è appena visibile nei linfociti e confermando la natura somatica della mutazione. ( c ) La rappresentazione schematica della distribuzione topografica delle mutazioni di SF3B1 (NM_012433) è rappresentata per 13 pazienti con RARS-T (parte superiore) e 9 pazienti con RARS (parte inferiore). Ogni paziente è rappresentato con un cerchio. Sono mostrate sei mutazioni missenso e tre mutazioni missenso e una delezione situata in prossimità dell'esone 14 e dell'esone 15 di SF3B1 (600–700 bp) per i pazienti con RARS-T e RARS, rispettivamente. I colori azzurro e rosso indicano rispettivamente mutazioni missense e cancellazione. Le mutazioni sono state confermate come somatiche. A, adenina; C, cisteina; C, citosina; CTD SF3B1 , database di toxigenomics comparativo per SF3B1 ; D, acido aspartico; E, acido glutammico; G, guanina; H, istidina; HSH155, nome alternativo di SF3B1 ; K, lisina; L, leucina; M, metionina; Q, glutammina; R, arginina; SF3B1 , fattore di giunzione 3b, subunità 1 isoforma 1 ; T, treonina; T, timidina.

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Frequenza di SF3B1 e costellazione di mutazioni in pazienti con RARS e RARS-T. ( a ) L'istogramma a barre mostra la frequenza di tutte le mutazioni rilevate in SF3B1 in tre gruppi, RARS ( n = 14), RARS-T ( n = 18) e MDS e MDS / MPN ( n = 24: CMML-1, n = 2; RAEB-1, n = 2; RAEB-2, n = 4; RCMD, n = 5; RCUD, n = 2, RA, n = 1; AML, n = 5; MDS / MPN-U, n = 3). Le barre bianche indicano pazienti wild-type mentre le barre scure indicano rispettivamente pazienti mutanti. Il gruppo di MDS; MDS / MPN comprende pazienti con assenza, occasionale e <15% di RS. ( b ) Diagramma schematico tridimensionale dello stato mutazionale dei pazienti con RARS-T ( n = 18). I geni mutati sono rappresentati da cubi con colori diversi (giallo, SF3B1 ; blu scuro, JAK2 ; magenta, MPL ; rosso, TET2 ; verde, DNMT3A ; rosa, ASXL1 ; nero, LNK ). I cerchi di luce blu indicano pStat5. Per i pazienti n. 3, 7 e 16, le informazioni di pStat5 non erano disponibili. Le linee nere (paziente n. 17 e paziente n. 18) indicano pazienti non mutati per nessun gene ( n = 2).

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Successivamente abbiamo notato che i pazienti che presentano mutazioni di SF3B1 sono principalmente RARS con conta piastrinica normale ed elevata. Abbiamo trovato una frequenza statisticamente significativamente più elevata di eventi trombotici arteriosi e venosi in pazienti portatori di mutazioni di SF3B1 . Per 15 pazienti con informazioni cliniche complete sugli eventi trombotici, 6 pazienti su 10 con mutazioni hanno avuto eventi trombotici ( P = 0, 04). Nessuno dei quattro pazienti wild-type studiati ha avuto eventi trombotici. La maggior parte dei pazienti è ancora in vita senza alcuna differenza statisticamente significativa nella sopravvivenza mediana tra portatori di mutanti e casi wild-type, un fatto non sorprendente a causa della buona prognosi generale dei pazienti con RARS.

Abbiamo anche osservato che in RARS-T, SF3B1 era associato a JAK2 V617F (4/13; 30%), MPL (3/13; 23%) e pSTAT5 (7/11; 64%). Un paziente RARS-T (n. 1) ha mostrato una mutazione missenso nell'esone 2 LNK (una sostituzione di isoleucina per una serina, S186I, 557 G> A) che si verificano contemporaneamente con JAK2 V617F e SF3B1 in questo paziente. 13 DNMT3A è già stato associato a pazienti con RARS, 14 e abbiamo anche trovato mutazioni DNMT3A in 3/18 (17%) pazienti con RARS-T e 6/14 (42%) pazienti con RARS; 4/6 presentavano mutazioni concomitanti di SF3B1 (dati non mostrati). Un paziente con RARS (paziente n. 17) ha mostrato una mutazione missenso in IDH1 (R132C, 394 C> T) senza altre mutazioni simultanee (dati non mostrati). La costellazione di tutte le mutazioni riscontrate in questa coorte è illustrata nella Figura 2b. Data la bassa incidenza di eventi mutazionali in JAK2 e MPL in pazienti con RARS, non possiamo correlare queste mutazioni con SF3B1 in questo gruppo di pazienti.

L'espressione genica è un processo complesso che richiede l'escissione di regioni introniche dal pre-mRNA attraverso un sofisticato componente spliceosoma, U2-snRNP. 10 SF3B1 (chiamato anche SAP155) si trova nel sito catalitico spliceosoma U2-snRNP e ha un ruolo importante nell'assemblaggio prespliceosomico e nella catalisi di giunzione. È stato riferito che SF3B1 è l'unico componente ad essere fosforilato in spliceosomi funzionali. L'alterazione del processo di giunzione può portare a prodotti proteici aberranti e questo può essere di rilevanza clinica in altre malattie umane. 11 Le nostre scoperte sulle mutazioni delle proteine ​​coinvolte nella giunzione dell'RNA aprono una nuova strada di indagine sulla patogenesi della RARS. Sebbene esistano ampie prove che implicano un'espressione anormale di geni coinvolti nella biosintesi dell'eme, nell'elaborazione del ferro e nella alterata funzione mitocondriale nella patogenesi della RARS, nessuno è stato tradotto in terapie mirate e migliorate per queste malattie. 15, 16 È possibile che il ruolo dello spliceosoma in RARS e malattie correlate non sia limitato a SF3B1 e possa coinvolgere altri componenti del macchinario di giunzione. Questo ci ha spinto a eseguire anche il sequenziamento genomico di altri due componenti spliceosomi associati a SF3B1 : SF3B14 e SF3B4 . Inoltre, il cariotipo SNP-A ha identificato la disomia uniparentale in due pazienti con RARS-T (paziente n. 11 e paziente n. 15, Figura 2b) nella regione di SF3B14 . Tuttavia, non sono state trovate mutazioni di SF3B14 in entrambi i pazienti. Allo stesso modo, nessuna mutazione è stata trovata in un altro fattore di giunzione, subunità b, SF3B4 . Sono in corso indagini su altri componenti del macchinario spliceosoma, compresi i componenti prossimali dei fattori di giunzione, la subunità b e infine le proteine ​​bersaglio.

Concludiamo che i pazienti con RARS presentano difetti unici nel macchinario spliceosoma che possono causare alterazioni della giuntura pre-mRNA e portare infine al fenotipo classico di RS osservato in questi pazienti. SF3B1 può essere un potenziale nuovo marker nella diagnosi di RARS e nella previsione di eventi trombotici in pazienti con RARS-T.