Recettore 1 della sfingosina-1-fosfato nel linfoma hodgkin classico: valutazione dell'espressione e del ruolo nella migrazione cellulare | indagine di laboratorio

Recettore 1 della sfingosina-1-fosfato nel linfoma hodgkin classico: valutazione dell'espressione e del ruolo nella migrazione cellulare | indagine di laboratorio

Anonim

Soggetti

  • Migrazione cellulare
  • Segnalazione cellulare
  • Linfoma di Hodgkin

Astratto

Il linfoma di Hodgkin classico (CHL), una neoplasia di linfociti B anormali (cellule di Hodgkin – Reed – Sternberg (HRS)), è stato descritto per avere un tipico schema di presentazione e diffusione clinica che spesso coinvolge linfonodi funzionalmente contigui. Nonostante i progressi compiuti nella comprensione della fisiopatologia della CHL, i fattori che regolano la diffusione delle cellule di linfoma nella CHL sono scarsamente compresi. La sfingosina-1-fosfato (S1P), uno sfingolipide bioattivo presente ad alte concentrazioni nel plasma e nel fluido linfatico, è noto per avere un ruolo critico nella regolazione del traffico di linfociti principalmente attraverso il recettore della sfingosina-1-fosfato 1 (S1PR1). In questo studio, esploriamo il ruolo dell'asse S1P – S1PR1 nella migrazione cellulare del linfoma di Hodgkin e l'espressione di S1PR1 nelle linee cellulari CHL e nei casi clinici. Abbiamo scoperto che S1PR1 è presente nelle linee cellulari di linfoma di Hodgkin KM-H2 e SUP-HD1 a livello di mRNA e proteine. Inoltre, funzionalmente, S1P ha stimolato potentemente la migrazione di entrambe le linee cellulari. La migrazione indotta da S1P è stata inibita dall'antagonista S1PR1, VPC44116, e dall'antagonista funzionale S1PR1, FTY720-P, ma è stata potenziata dall'antagonista specifico di S1PR2, JTE013. Abbiamo anche determinato che S1PR1 ha indotto la migrazione nelle cellule KM-H2 e SUP-HD1 attraverso la proteina G eterotrimerica G i e la via fosfatidilinositolo-3-chinasi. La valutazione immunoistochimica del tessuto dai campioni di CHL ha rivelato che un sottogruppo di casi (7/57; 12%) mostra una colorazione forte e membranosa per S1PR1 nelle cellule HRS. Complessivamente, i nostri dati indicano che S1PR1 è un recettore funzionale sulle cellule HRS, che regola la migrazione delle cellule tumorali ed è espresso in un sottogruppo di casi CHL. Data la disponibilità di antagonisti di S1PR1, alcuni dei quali utilizzati clinicamente per la modulazione del sistema immunitario, questi risultati suggeriscono che S1PR1 potrebbe essere un futuro bersaglio terapeutico nel trattamento di quei casi di CHL positivi, refrattari / ricorrenti a S1PR1.

Principale

Il recettore 1 della sfingosina-1-fosfato (S1PR1) è un recettore accoppiato alle proteine ​​G (GPCR), che lega lo sfingolipide bioattivo, sfingosina-1-fosfato (S1P), come un ligando ad alta affinità. S1P è presente ad alti livelli (nel raggio di diverse centinaia di nanomolari) nel sangue e nella linfa e ha un ruolo critico nell'omeostasi dei sistemi vascolare e immunitario. S1PR1 è stato originariamente identificato come una trascrizione abbondante nelle cellule endoteliali 1 e ha un ruolo importante nella regolazione della struttura citoscheletrica delle cellule endoteliali, nella migrazione, nella formazione di reti simili a capillari e nella maturazione vascolare. 2, 3, 4, 5, 6, 7 Altri GPCR della famiglia S1PR sono stati anche descritti e caratterizzati come S1P vincolante. 8, 9 È interessante notare che alcuni S1PR hanno effetti opposti sulla funzione cellulare; ad esempio, mentre S1PR1 promuove la migrazione cellulare e l'integrità vascolare, 5, 10 S1PR2 inibisce la motilità cellulare e promuove la permeabilità vascolare. 11, 12, 13, 14, 15 Più specificamente, S1PR1 si accoppia a G i 8, 16 e attiva la via fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) 17 e la piccola GTPase Rac, 3 mentre S1PR2, attraverso l'attivazione di G 12 - La via Rho-Rho chinasi (ROCK) -PTEN, 14, 18, 19 può antagonizzare la segnalazione i -PI3K di S1PR1-G.

Nel sistema immunitario, la segnalazione S1PR1 è importante nella regolazione della migrazione e del traffico di linfociti. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 I linfociti normali viaggiano lungo un gradiente S1P tra organi linfoidi e linfa o sangue. L'inibizione di S1PR1 o l'interruzione del gradiente S1P provoca il sequestro dei linfociti negli organi linfoidi. 29, 30 Infatti, FTY720 fosforilato (FTY720-P), l'immunosoppressore e l'analogo strutturale di S1P, che lega e attiva potentemente la segnalazione S1PR1, 10, 20, 22, 31, 32, 33 è un antagonista funzionale di S1PR1 come induce internalizzazione e degradazione irreversibili di S1PR1. 34, 35 Di recente, FTY720 è stato approvato negli Stati Uniti come opzione terapeutica in alcuni casi di sclerosi multipla. 36, 37, 38 Sono stati caratterizzati composti aggiuntivi destinati a S1PR; questi includono JTE013, un antagonista specifico di S1PR2, 12, 13 e VPC44116, un antagonista di S1PR1. 39 Questi sviluppi evidenziano il fatto che S1PR stanno diventando candidati interessanti per la progettazione mirata di farmaci nei disturbi cardiovascolari e immunologici.

Nonostante la nostra comprensione del ruolo di S1PR1 nel traffico di linfociti normale, l'espressione di S1PR1 e il suo ruolo nella regolazione della biologia delle cellule tumorali nel linfoma sta appena iniziando a essere chiarita. Il linfoma di Hodgkin classico (CHL), una neoplasia di linfociti B anormali (cellule di Hodgkin – Reed – Sternberg (HRS)), presenta uno schema tipico di presentazione e diffusione clinica che spesso coinvolge linfonodi funzionalmente contigui; 40, 41 tuttavia, i fattori che regolano la diffusione delle cellule di linfoma di Hodgkin sono capiti male. Pertanto, per migliorare la nostra comprensione in quest'area, abbiamo deciso di valutare l'espressione di S1PR1 in due linee cellulari di CHL (KM-H2 e SUP-HD1) e determinare il ruolo che S1PR1 può avere nella migrazione delle cellule tumorali di CHL. Qui, segnaliamo che S1PR1 è espresso nelle linee cellulari KM-H2 e SUP-HD1 CHL e che S1P stimola la migrazione di entrambe le linee cellulari, che può essere inibita dagli antagonisti S1PR1 (VPC44116 e FTY720-P), ma non da S1PR2 antagonista (JTE-013). Inoltre, la migrazione indotta da S1P dipendeva dal percorso G i -PI3K. Infine, la valutazione immunoistochimica del tessuto dai casi di CHL rivela che un sottoinsieme mostra una colorazione forte e membranosa per S1PR1 nelle cellule HRS. In sintesi, dimostriamo che S1PR1 può regolare la migrazione delle cellule HRS e che S1PR1 è espresso in entrambe le linee cellulari HRS e in un sottogruppo di casi CHL. Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che sono giustificate ulteriori indagini sul ruolo di S1PR1 in CHL e sulla possibilità di scegliere come target S1PR1 nella terapia di CHL positivi, refrattari / ricorrenti a S1PR1.

MATERIALI E METODI

reagenti

D -erythro-S1P è stato acquistato da Enzo Life Sciences Inc. (Farmingdale, NY, USA). JTE013 e FTY720-P provenivano da Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA). VPC44116 è stato gentilmente fornito dal Dr. Kevin R Lynch (University of Virginia Charlottesville, VA, USA). La paraformaldeide e l'albumina sierica bovina priva di acidi grassi (BSA) sono state acquistate da Sigma (St Louis, MO, USA). La tossina della pertosse e Y-27632 provenivano dalla EMD Millipore Chemicals Inc. (San Diego, California, USA). LY-294002 è stato acquistato da Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA).

Coltura di cellule e trasfezione di cDNA

La linea cellulare di linfoma KM-H2 Hodgkin è stata acquistata dal Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Germania) e sono state coltivate in terreno RPMI integrato con FBS al 10%, L -glutamina e antibiotici. Le cellule SUP-HD1 sono state gentilmente fornite dal dott. B Chapuy e dal dott. M. Shipp (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA). Sono stati coltivati ​​nel terreno di McCoy, integrato con FBS al 20%, L -glutamina e antibiotici. Le cellule renali embrionali umane (HEK-293T) sono state trasfettate con solo PCDNA 3.1, S1PR1-pcDNA 3.1 o S1PR2-pcDNA 3.1 usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA), come precedentemente descritto. 10, 14

Isolamento dell'RNA, trascrizione inversa e analisi quantitativa della PCR

L'RNA totale è stato preparato utilizzando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) con trattamento DNasi privo di RNasi (Qiagen) per rimuovere il DNA genomico. Per generare cDNA, 100 ng di RNA sono stati trascritti inversi usando primer casuali e polimerasi a trascrizione inversa (RT) SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). I primer sono stati progettati utilizzando il software del programma di progettazione oligo Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tutti i set di primer sono stati sottoposti a rigorose ricerche nel database per identificare potenziali corrispondenze di trascrizioni in conflitto con pseudogeni o domini omologhi all'interno di geni correlati. Le sequenze di primer PCR per molecole target sono mostrate nella Tabella 1. Gli ampliconi generati dal set di primer sono stati analizzati per le temperature del punto di fusione usando il primo software derivato per la curva di fusione del primer fornito da Applied Biosystems. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando il test SYBR Green I sul sistema ABI 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems) presso il centro di profilatura trascrizionale multi-gene nel Centro di ricerca sulla biologia vascolare. Le reazioni PCR per ciascun campione di cDNA sono state eseguite in duplicato e i numeri delle copie sono stati calcolati utilizzando curve standard generate da un modello master come descritto in precedenza. 42

Tabella a grandezza naturale

Test di migrazione cellulare

La migrazione delle cellule KM-H2 e SUP-HD1 è stata analizzata in una camera Boyden a 96 pozzetti modificata (Neuro Probe Inc., Gaithersburg, MD, USA) utilizzando filtri in policarbonato con dimensione dei pori di 3 μ m, come descritto in precedenza. 10, 14, 43 Prima dell'assemblaggio della camera, le cellule erano affamate di siero per 1 ora in terreno normale. I pozzetti nella metà inferiore della camera sono stati riempiti con 85 μl di 0, 1% di BSA RPMI o 0, 1% di BSA McCoy's plus veicolo o S1P in presenza o in assenza degli antagonisti S1PR, tossina della pertosse, LY-294002 o Y-27632. Una sospensione di 0, 5 × 10 6 –1 × 10 6 cellule è stata aggiunta alla camera superiore in presenza o in assenza degli antagonisti S1PR.

Per gli studi di preincubazione su FTY720-P, le cellule sono state incubate per 30 minuti a 37 ° C con veicolo o FTY720-P, sono state lavate e contate prima di aggiungere alla camera superiore. La camera completamente assemblata è stata lasciata incubare a 37 ° C per 5-6 h. Dopo lo smontaggio della camera, le cellule non migranti sulla superficie del filtro sono state spazzate via dal filtro con una garza imbevuta di O 2, e il filtro è stato fissato in paraformaldeide al 4% e colorato con 0, 1% di viola cristallo. Per la quantificazione, le cellule colorate di cristallo viola sono state eluite in acido acetico al 10% e l'assorbanza a 575 nm è stata misurata utilizzando un lettore di piastre Spectramax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

L'immunoistochimica

I campioni di pazienti con diagnosi di CHL sono stati identificati attraverso il database patologico di Brigham and Women's Hospital (BWH). Gli studi di immunohistochemical sono stati approvati dal BWH Institutional Review Board (IRB n. 2010P002736).

Sezioni (spessore 4 μ m) di pellet di cellule fissate in paraffina (FFPE) fissate in formalina (KM-H2 e SUP-HD1) o sezioni di tessuto intero (57 casi clinici) sono state utilizzate per immunoistochimica (IHC) sull'autostainer Ventana Discovery XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA) con recupero dell'antigene indotto dal calore utilizzando un tampone a base di Tris con pH leggermente basico (tampone CC1) e anticorpo anti-S1PR1 (numero di catalogo sc-25489; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, Stati Uniti) ad una concentrazione finale di circa 0, 9 μ g / ml, seguita da incubazione con reagenti di rilevazione basati su anticorpi secondari standard e diaminobenzidina (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA).

Analisi statistiche

Per esperimenti in vitro , ANOVA a senso unico seguito dal test Tukey – Kramer è stato condotto utilizzando il prisma di GraphPad. Tutti gli esperimenti sono stati condotti 3-5 volte e viene mostrato un esperimento rappresentativo. La percentuale di inibizione della migrazione da parte dei modulatori farmacologici S1PR è stata calcolata in ciascun singolo esperimento e la media ± sem di tutti gli esperimenti è riportata nel testo.

Il test esatto di Fisher (valore P bilaterale) è stato utilizzato per confrontare le percentuali relative di recidiva tra i casi S1PR1 positivi e S1PR1 negativi.

RISULTATI

Abbiamo testato due linee cellulari CHL per l'espressione di S1PR1 mediante analisi quantitativa RT-PCR e abbiamo scoperto che S1PR1 era espresso in modo robusto in entrambe le celle KM-H2 (14, 4 ± 2, 7 copie per 10 6 18S, che equivale a circa 14, 4 ± 2, 7 copie per cella 42 ) e celle SUP-HD1 (9, 2 ± 1, 4 copie per 10 6 18 S) (Figure 1a e b). Inoltre, nelle cellule KM-H2 (Figura 1a), sono stati rilevati bassi livelli di trascrizione S1PR2 (2, 0 ± 0, 4 copie per 10 6 18 S), mentre le altre tre isoforme S1PR non erano presenti a livelli significativi (<0, 1 copie per cella) . In SUP-HD1 (Figura 1b), sono stati rilevati bassi livelli di S1PR2 (1, 4 ± 0, 1 copie per 10 6 18 S), S1PR3 (1, 0 ± 0, 4 copie per 10 6 18 S) e S1PR4 (1, 5 ± 0, 7 copie per 10 6 18 S), mentre S1PR5 non era presente a livelli significativi (<0, 1 copie per cella).

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Espressione del recettore 1 della sfingosina-1-fosfato (S1PR1) nelle linee cellulari di linfoma di Hodgkin KM-H2 e SUP-HD1. La reazione quantitativa a catena della trascrizione-polimerasi inversa (RT-PCR) mostra un'espressione S1PR1 rilevabile nelle cellule KM-H2 ( a ) e SUP-HD1 ( b ); si noti che le altre isoforme S1PR mostrano livelli di espressione molto più bassi rispetto a S1PR1. I dati sono media ± sem, n = 4. L'immunoistochimica per S1PR1 dimostra l'espressione della proteina membranosa S1PR1 nelle cellule KM-H2 ( c ) e SUP-HD1 ( d ). Le immagini sono mostrate con ingrandimento × 60.

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Successivamente, usando un anticorpo anti-S1PR1 che è stato usato in pubblicazioni precedenti 44 e la cui specificità abbiamo confermato da esperimenti transitori di trasfezione (Figura 1 aggiuntiva), abbiamo valutato l'espressione di S1PR1 nelle linee cellulari KM-H2 e SUP-HD1 a livello proteico da IHC. Abbiamo trovato colorazione membranosa per S1PR1 in entrambe le linee cellulari di linfoma di Hodgkin testate (Figure 1c ed d).

Avendo dimostrato l'espressione di S1PR1 in entrambe le linee cellulari di linfoma di Hodgkin con due metodi diversi, abbiamo rivolto la nostra attenzione alla valutazione delle risposte funzionali (cioè migratorie) di queste linee cellulari al ligando per S1PR (cioè S1P). Utilizzando un test di migrazione della camera Boyden standard, modificato in vitro , abbiamo scoperto che S1P ha indotto potentemente la migrazione delle cellule KM-H2 e SUP-HD1 (Figura 2). Le risposte migratorie massime si sono verificate a 1–10 nM S1P, che sono concentrazioni fisiologicamente rilevanti coerenti con la costante di dissociazione nota di S1P per S1PR1 (8, 1 nM) 2 e gradiente di concentrazione noto di S1P tra tessuti e plasma o fluidi linfatici. Nelle cellule KM-H2, S1P ha indotto un'induzione di 6, 5 ± 2, 0 e 7, 7 ± 1, 0 volte della migrazione cellulare a 1 e 10 nM, rispettivamente (Figura 2a). S1P ha indotto la migrazione cellulare SUP-HD1 in misura simile (induzione 4, 8 ± 0, 8 e 7, 1 ± 0, 5 volte) rispettivamente a 1 e 10 nM (Figura 2b).

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La sfingosina-1-fosfato (S1P) induce la migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin in modo dose-dipendente. Il trattamento S1P delle linee cellulari di linfoma di Hodgkin KM-H2 ( a ) e SUP-HD1 ( b ) porta ad un aumento dose-dipendente della migrazione cellulare a dosi fisiologicamente rilevanti di S1P, con risposte massime che si verificano a 1–10 nM. Le linee cellulari di linfoma di Hodgkin, KM-H2 ( a ) e SUP-HD1 ( b ), erano affamate di siero per 1 ora e sono stati condotti esperimenti di migrazione usando S1P come chemioattrattore nella camera inferiore alle dosi indicate. Viene mostrato l'induzione di piega rispetto al veicolo. I dati sono media ± sem di triplicati. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di n = 5. * P <0, 05, S1P vs veicolo.

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Per studiare ulteriormente il ruolo di S1PR1 nella migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin, abbiamo testato gli effetti degli antagonisti di S1PR sulle risposte migratorie a S1P. Abbiamo scoperto che l'antagonista S1PR1 noto, VPC44116, ha inibito le risposte migratorie a 1 e 10 nM S1P nelle cellule KMH2 (inibizione media% su tutti gli esperimenti: 84, 04 ± 11, 9 e 46, 23 ± 13, 54%, rispettivamente; Figura 3a) e cellule SUPHD1 (media % di inibizione su tutti gli esperimenti: 68, 5 ± 7, 1 e 71, 2 ± 6, 3%, rispettivamente; Figura 3b). D'altra parte, l'antagonista specifico di S1PR2, JTE-013, non ha compromesso la migrazione indotta da S1P e, di fatto, ha potenziato la migrazione verso S1P (Figure 3a e b); questo potenziamento della migrazione indotta da S1P in presenza dell'antagonista S1PR2 è coerente con il fatto che S1PR2 è un regolatore negativo noto della migrazione cellulare. 14, 19, 45

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Il blocco della segnalazione del recettore 1 della sfingosina-1-fosfato (S1PR1) inibisce la migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin indotta da S1P. Le linee cellulari di linfoma di Hodgkin, KM-H2 ( a ) e SUP-HD1 ( b ), erano affamate di siero per 1 ora prima di condurre saggi di migrazione verso S1P alle dosi indicate. Le cellule sono state pretrattate con il veicolo, l'antagonista specifico S1PR1 VPC44116 (VPC) o l'antagonista specifico S1PR2 JTE013 (JTE) per 30 minuti alle dosi indicate. Questi trattamenti erano presenti anche nella camera superiore e inferiore durante la migrazione. Viene mostrato l'induzione di piega rispetto al pretrattamento del veicolo (no S1P). I dati sono media ± sem di triplicati. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di n = 3. È stata calcolata la percentuale di inibizione della migrazione da VPC 44116 da ciascun esperimento e nel testo è riportata la media ± sem di tutti e tre gli esperimenti. * P <0, 05 S1P contro no S1P. # P <0, 05 antagonista S1PR trattato contro veicolo trattato.

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Successivamente, abbiamo testato gli effetti di FTY720-P, la forma attiva di FTY720, un antagonista funzionale clinicamente approvato di S1PR1. Abbiamo scoperto che la preincubazione con FTY720-P porta ad un'inibizione dose-dipendente della migrazione indotta da S1P in entrambe le linee cellulari (Figura 4). Nelle cellule KM-H2, la preincubazione FTY720-P da 10 nM ha comportato una compromissione della migrazione indotta da S1P (inibizione media% in tutti gli esperimenti: 67, 25 ± 12, 8% verso 1 nM S1P e inibizione 63 ± 12, 6% verso 10 nM S1P; Figura 4a). Il pre-trattamento con FTY720-P 100 nM ha comportato un'ulteriore inibizione della migrazione cellulare indotta da S1P (inibizione media% in tutti gli esperimenti: 90, 8 ± 4, 6 e 90, 25 ± 3, 3% verso 1 e 10 nM S1P, rispettivamente; Figura 4a). Analogamente, nelle cellule SUP-HD1, il pretrattamento con FTY720-P 10 nM ha inibito la motilità indotta da S1P (inibizione media% su tutti gli esperimenti: 57, 6 ± 1, 8% per 1 nM S1P e 31, 6 ± 1, 9% per 10 nM S1P; Figura 4b ) e il pretrattamento con FTY720-P 100 nM ha comportato un'ulteriore inibizione della migrazione indotta da S1P (inibizione% media su tutti gli esperimenti: 88, 6 ± 2, 1 e 69, 5 ± 6, 8%, rispettivamente; Figura 4b). Questi risultati indicano che la preincubazione con FTY720-P desensibilizza S1PR1 e rende le cellule non rispondenti al gradiente S1P. 34, 35 Nel loro insieme, questi dati sulla migrazione dimostrano che S1PR1 espresso nelle linee cellulari KM-H2 e SUP-HD1 è in grado di regolare attivamente la funzione delle cellule migratorie in risposta alla stimolazione S1P e che questo effetto può essere efficacemente compromesso dal trattamento con S1PR noto antagonisti.

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La preincubazione FTY7720-P inibisce la migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin verso il gradiente sfingosina-1-fosfato (S1P) in modo dose-dipendente. Le linee cellulari di linfoma di Hodgkin, KM-H2 ( a ) e SUP-HD1 ( b ), erano affamate di siero per 1 ora in presenza o in assenza di FTY720-P alle dosi indicate. Quindi, le cellule sono state lavate e contate e sono stati condotti esperimenti di migrazione verso il gradiente S1P come descritto. Viene mostrata l'induzione della piega rispetto al pretrattamento del veicolo (no S1P). I dati sono media ± sem di triplicati. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di n = 3. È stata calcolata la percentuale di inibizione della migrazione da parte di FTY720-P da ciascun esperimento e nel testo è riportata la media ± sem di tutti e tre gli esperimenti. * P <0, 05 S1P contro no S1P. # P <0, 05 FTY720-P pretrattato vs veicolo pretrattato.

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Per ottenere informazioni meccanicistiche sulla regolazione della migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin da parte di S1PR1, abbiamo testato il ruolo del percorso G i -PI3K, che in precedenza ha dimostrato di essere attivato da S1PR1 in modo sensibile alla tossina della pertosse. 16, 17 Abbiamo usato la tossina della pertosse per inibire le proteine ​​G i e LY-294002 per inibire l'attività PI3K. Come mostrato nella Figura 5a, sia la tossina della pertosse (200 ng / ml) che LY-294002 (50 μ M) hanno inibito potentemente la capacità di S1P di indurre la migrazione delle cellule KM-H2. L'inattivazione delle proteine ​​G i ha comportato l'inibizione del 67 ± 4% della migrazione a 1 nM S1P e l'inibizione del 69 ± 7, 5% verso 10 nM S1P. Il trattamento con LY-294002 ha determinato un'inibizione del 60, 3 ± 9 e 57, 7 ± 3% della migrazione a 1 e 10 nM S1P, rispettivamente (Figura 5a). Al contrario, la migrazione indotta da S1P non dipendeva dalle chinasi Rho, poiché l'inibitore ROCK, Y-27632, non influiva sulla migrazione indotta da S1P. Allo stesso modo, la migrazione delle cellule SUP-HD1 indotta da S1P dipendeva dalla via G i -PI3K (Figura 5b) (inibizione 75 ± 1 e 89 ± 0, 9% da tossina pertosse e 61 ± 2, 4 e 72, 5 + 11% da LY-294002) e non è stato alterato dall'inibitore ROCK. Complessivamente, questi dati indicano che la migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin indotta da S1P è mediata dalla via i -PI3K S1PR1-G ma non dalla via Rho-ROCK.

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La migrazione delle cellule di linfoma di Hodgkin indotta dal recettore 1 della sfingosina-1-fosfato è mediata dalla via G i -PI3K. Le linee cellulari di linfoma di Hodgkin, KM-H2 ( a ) e SUP-HD1 ( b ), erano affamate di siero per 1 ora prima di condurre saggi di migrazione verso S1P alle dosi indicate. Le cellule sono state pretrattate con veicolo, tossina da pertosse 200 ng / ml (PTx), 50 μ M LY-294002 (LY) o Y-27632 (10 μ M) durante il periodo di fame nel siero. Questi trattamenti erano presenti anche nella camera superiore e inferiore durante la migrazione. Viene mostrato l'induzione di piega rispetto al veicolo pretrattato (no S1P). I dati sono media ± sem di triplicati. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di n = 3-4. È stata calcolata la percentuale di inibizione della migrazione da ciascun esperimento e nel testo è riportata la media ± sem di tutti e tre gli esperimenti. * P <0, 05 S1P contro no S1P. # P <0, 05 inibitore trattato contro veicolo trattato.

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Infine, per valutare ulteriormente la potenziale rilevanza clinica di questi risultati, abbiamo eseguito un'analisi immunoistochimica per valutare l'espressione di S1PR1 nel tessuto da casi clinici di CHL. Abbiamo trovato colorazione membranosa S1PR1 nel 25–90% delle cellule HRS in 7 su 57 casi testati (12%; Figura 6). I dati clinici erano disponibili per sei di questi sette pazienti (Tabella 2). Tre pazienti (3/6) sono deceduti per la loro malattia dopo più (due o più) recidive. Due pazienti (2/6) rimangono vivi dopo ripetute recidive che hanno richiesto molteplici approcci terapeutici, incluso il trapianto allogenico di cellule staminali del midollo osseo. Un paziente (1/6) è entrato in remissione completa dopo la chemioterapia di induzione, indicando che la positività S1PR1 non è uniformemente associata alla recidiva della malattia. I dati di follow-up erano disponibili per 45 dei 50 pazienti le cui cellule HRS erano negative per l'espressione S1PR1. Quattro di questi pazienti sono deceduti per malattia (4/45) dopo ripetute recidive. Complessivamente, 16 pazienti rimangono vivi (16/45) ma presentavano una malattia ricorrente, 12 dei quali hanno avuto recidive multiple (12/45). I restanti 25 pazienti sono entrati in remissione completa con chemioterapia standard appropriata (25/45). È interessante notare che, sebbene la prevalenza complessiva della positività S1PR1 in tutti i casi di studio sia stata del 12% (7/57), la prevalenza della positività S1PR1 nel sottogruppo comprendente tutti i casi di CHL che presentavano recidive multiple è stata del 24% (5/21). Tuttavia, la proporzione relativa di casi con qualsiasi recidiva tra i gruppi S1PR1 positivi (5/6) e S1PR1 negativi (20/45) non era statisticamente diversa ( P = 0, 099, test esatto di Fisher).

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Il recettore 1 della sfingosina-1-fosfato (S1PR1) è espresso nelle cellule di Hodgkin – Reed – Sternberg in un sottogruppo di casi di cHL. Immagini rappresentative dell'immunoistochimica S1PR1 nei casi di linfoma di Hodgkin classico. Per la colorazione immunoistochimica di S1PR1 sono state utilizzate sezioni di tessuto fissate in paraffina e fissate in formalina, come descritto nella sezione Materiali e metodi. Le immagini mostrano una colorazione membranosa per S1PR1 nelle cellule di Hodgkin – Reed – Sternberg nel caso 1 ( a ), caso 2 ( b ), caso 3 ( c ) e caso 7 ( d ). Le immagini sono mostrate con ingrandimento × 60.

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Tabella a grandezza naturale

Per valutare la possibile modulazione dell'espressione di S1PR1 durante le diverse fasi della malattia (diagnosi iniziale, trattamento, recidiva, ecc.), Abbiamo testato materiale bioptico aggiuntivo per 10 dei pazienti negativi a S1PR1 con malattia ricorrente che avevano altre biopsie disponibili da altre volte punti durante il decorso della malattia (cioè, biopsie prima o dopo la biopsia prima testata per l'espressione di S1PR1). Abbiamo scoperto che le biopsie aggiuntive erano S1PR1 negative, simili alle biopsie originali testate per ciascun paziente.

DISCUSSIONE

S1PR1 ha dimostrato di essere importante nel traffico fisiologico di linfociti. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Tuttavia, la nostra comprensione del ruolo che ha nei linfomi a cellule B è limitata. Recenti lavori hanno dimostrato che S1PR1 è espresso in alcuni linfomi a cellule B. 44 Nishimura et al 44 hanno scoperto che S1PR1 era costantemente espresso nei linfomi a cellule del mantello ed era espresso in un sottoinsieme di leucemie linfocitiche croniche / piccoli linfociti (CLL / SLL) e in un sottogruppo di linfomi diffusi a grandi cellule B (DLBCL) ; tuttavia, hanno scoperto che l'espressione di S1PR1 era negativa nei casi di linfoma follicolare e linfoma di zona marginale. Questi dati di espressione suggeriscono che S1PR1 può regolare le funzioni delle cellule tumorali in alcuni tipi di linfoma a cellule B. In questo senso, il recente lavoro di Liu et al. 46 ha fatto luce sul ruolo funzionale che S1PR1 può avere nel linfoma; più specificamente, usando un modello di tumore allo xenotrapianto DLBCL, Liu et al. 46 hanno dimostrato che l'inibizione dell'espressione S1PR1 trasduttore del segnale e l'attivatore dell'attività della trascrizione 3, che porta all'inibizione della crescita delle cellule tumorali del linfoma in vitro e in vivo .

Dato che la presentazione clinica e il / i modello / i di diffusione nella CHL sono in qualche modo diversi dagli altri tipi di linfomi a cellule B 40, 41 e che i fattori che regolano la diffusione delle cellule di linfoma di Hodgkin sono scarsamente compresi, abbiamo concentrato i nostri studi sull'espressione e ruolo funzionale di S1PR1 in CHL. Abbiamo scoperto che S1PR1 era la principale isoforma S1PR espressa in due diverse linee cellulari di linfoma di Hodgkin (KM-H2 e SUP-HD1) mediante analisi quantitativa RT-PCR. L'espressione di S1PR1 è stata confermata a livello di proteine ​​usando IHC. Inoltre, la rilevanza funzionale di S1PR1 espressa in queste linee cellulari è stata dimostrata dalla sua capacità di regolare la migrazione indotta da S1P, coerentemente con il ruolo chiave che S1PR1 è noto avere nel traffico fisiologico di linfociti normali. Coerentemente con studi precedentemente pubblicati in altri sistemi cellulari, la migrazione mediata da S1PR1 nelle linee cellulari HRS è risultata essere dipendente dalla proteina G eterotrimerica, G i -PI3K. Infine, gli antagonisti di S1PR1 testati, tra cui FTY720-P, il noto antagonista funzionale per S1PR1, che induce l'interiorizzazione e la desensibilizzazione di S1PR1, 34, 35, sono risultati efficaci nel compromettere la migrazione indotta da S1P. Da notare che FTY720, il precursore di FTY720-P, è approvato come opzione terapeutica per alcuni casi di sclerosi multipla. 36, 37, 38

La potenziale rilevanza patofisiologica dei nostri risultati è supportata dal significato noto di S1PR1 nel regolare il traffico di linfociti normali, l'importanza nota dei gradienti di concentrazione di S1P in vivo tra vari compartimenti tissutali 29, 30 e dalla nostra scoperta che S1PR1 membranoso è rilevabile da immunohistochemical analisi in cellule HRS in un piccolo sottoinsieme di casi clinici di CHL (7/57 casi, 12%). Inoltre, il recente lavoro di Liu et al . 46 utilizzando un modello di xenotrapianto della crescita e dell'invasione del tumore DLBCL umano, ha dimostrato che la downregulation di S1PR1 da parte dello shRNA inibiva la crescita del tumore e riduceva la diffusione del linfoma come evidenziato dalla formazione di un minor numero di noduli polmonari . 46

La valutazione del potenziale significato clinico dell'espressione di S1PR1 nella CHL è limitata dalle dimensioni ridotte della nostra coorte di casi clinici e dalle informazioni cliniche e patologiche incomplete disponibili per i casi testati. Inoltre, a differenza dell'alta prevalenza della positività S1PR1 che è stata riportata nel linfoma a cellule del mantello, esiste una prevalenza relativamente bassa della positività S1PR1 tra i casi CHL testati qui, il che può essere un riflesso del fatto che in alcuni tipi di linfoma, solo un sottoinsieme di casi sarà positivo per S1PR1, come riportato per DLBCL e CLL / SLL. 44 Sarà necessaria un'ulteriore analisi immunoistochimica di S1PR1 su una serie più ampia di casi di CHL con annotazione clinica e patologica più completa per caratterizzare meglio la prevalenza dell'espressione di S1PR1 in CHL. Tali studi possono chiarire se l'apparente bassa prevalenza della positività di S1PR1 osservata nella CHL è dovuta, in parte, a una downregulation aberrante di S1PR1 nelle cellule HRS e / o se la prevalenza dell'espressione di S1PR1 varia in base allo stadio clinico / patologico della malattia. Infine, la relazione, se presente, tra l'espressione di S1PR1 e il tasso / esito di ricorrenza in CHL resta da determinare in modo definitivo.

In conclusione, dimostriamo che (i) S1PR1 è un recettore funzionale sulle cellule HRS, che regola la migrazione delle cellule tumorali, (ii) gli antagonisti di S1PR1 compromettono efficacemente la migrazione indotta da S1P nelle cellule HRS e (iii) S1PR1 è espresso in un sottoinsieme di casi clinici di CHL. Questi risultati suggeriscono che ulteriori studi sul ruolo / i di S1PR1 nella CHL sono giustificati e potrebbero far luce sulla potenziale utilità delle terapie mirate a S1PR1 nel futuro trattamento dei casi positivi di S1PR1 di CHL ricorrenti / refrattari.

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