Struttura e dinamica dell'autoassemblaggio otticamente diretto delle nanoparticelle | rapporti scientifici

Struttura e dinamica dell'autoassemblaggio otticamente diretto delle nanoparticelle | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Autoassemblaggio molecolare
  • nanoparticelle
  • Ottica e fotonica

Astratto

L'autoassemblaggio di nanoparticelle che porta alla formazione di cluster colloidali spesso serve come analogo rappresentativo per la comprensione dell'assemblaggio molecolare. Svelare la struttura e la dinamica in situ di tali cluster in sospensioni liquide è estremamente impegnativo. Attualmente i cluster colloidali vengono prima isolati dal loro ambiente di generazione e quindi le loro strutture vengono sondate con metodi di diffusione della luce. Al fine di misurare la struttura e la dinamica in situ dei cluster colloidali, li abbiamo generati utilizzando la pinzetta ottica a impulsi laser a femtosecondi ad alta frequenza di ripetizione. Poiché il componente dei nostri cluster dimero, trimero o tetramero sono nanosfere rivestite con fluoroforo a due fotoni con risonanza del raggio di 250 nm sotto la trappola ottica, producono intrinsecamente fluorescenza a due fotoni, che subiscono il trasferimento di energia a fluorescenza all'interno della nanosfera. Questa firma unica del trasferimento di energia, a sua volta, ci consente di visualizzare le strutture e gli orientamenti di questi cluster colloidali durante il processo della loro formazione e le successive dinamiche in una sospensione liquida. Mostriamo anche che a causa della birifrangenza della forma, l'orientamento e il controllo strutturale di questi cluster colloidali sono possibili poiché la polarizzazione del laser di intrappolamento viene modificata da lineare a circolare. Segnaliamo quindi importanti progressi nel campionamento dei più piccoli aggregati possibili di nanoparticelle, dimeri, trimeri o tetrameri, formati all'inizio del processo di autoassemblaggio.

introduzione

Le strutture colloidali derivano dalla coagulazione o dall'autoassemblaggio di nanoparticelle. Lo studio dei cluster colloidali svolge un ruolo importante nella comprensione dell'assemblaggio macromolecolare che porta all'aggregazione e al raggruppamento delle proteine 1, 2 . Tuttavia, la dinamica di formazione in situ dell'ammasso colloidale rimane da chiarire. Gli studi condotti in condizioni isolate, cioè quando i colloidi vengono estratti dal loro ambiente di generazione, mostrano che i conformatori più stabili per i colloidi aggregati hanno una baderna cubica centrata sul corpo e centrata sulla faccia 3 . Qui presentiamo un approccio diretto per misurare la dinamica di formazione in situ del cluster colloidale usando l'assemblaggio ottico orientato al campo di forza del gradiente di nanosfere colloidali rivestite con fluoroforo in cluster che mostrano un tipo onnipresente di trasferimento di energia. Questa firma del trasferimento di energia, a sua volta, ci consente di determinare la struttura dei cluster colloidali. Poiché questi cluster colloidali presentano birifrangenza delle forme, proponiamo che le forme dei cluster colloidali possano essere dettate dalla polarizzazione del raggio laser incidente.

L'intrappolamento di più particelle può verificarsi in caso di intrappolamento ottico in ambienti densi come sospensioni colloidali dense 4 o all'interno delle celle 5 a causa delle forze ottiche del gradiente generate dal raggio laser ben focalizzato. Man mano che le forze ottiche del gradiente trascinano tutti gli oggetti intrappolati verso il centro della trappola, si verifica la formazione di ammassi otticamente legati (mostrati schematicamente in Fig. 1). Dimostriamo in modo specifico il campionamento di aggregati più piccoli possibili di nanoparticelle, dimeri, trimeri o tetrameri, formati all'inizio del processo di autoassemblaggio. Generiamo cluster colloidali costituiti da un massimo di quattro nanosfere di polistirene con rivestimento colorante, ciascuna del raggio di 250 nm, sotto una pinzetta ottica, che forniscono il campo di forza ottico gradiente ottico necessario 6, 7 . Le strutture dei cluster colloidali sono in genere studiate usando i metodi di diffusione della luce 8, 9, 10, 11 . Allo stesso modo, utilizziamo anche il segnale backscatter dalla trappola ottica. Tuttavia, mentre tutti gli altri approcci di dispersione della luce sono utilizzati per caratterizzare i cluster isolati, la nostra misurazione del segnale di backscatter indaga specificamente il processo di autoassemblaggio in situ .

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In caso di più strutture possibili, abbiamo scelto di mostrare qui solo due rappresentanti. È interessante notare che qui mostriamo che il nostro approccio può fornire informazioni anche sulle strutture più probabili.

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Inoltre, nel nostro approccio particolare, poiché abbiamo nanosfere rivestite con fluoroforo, abbiamo l'ulteriore vantaggio di confrontare i risultati di diffusione della luce con il loro segnale di fluorescenza a due fotoni (TPF) 12 . In effetti, mostriamo che c'è un decadimento intrinseco presente nel segnale TPF che ci consente di determinare le strutture e le dinamiche in situ dei nostri cluster colloidali in modo più accurato. Quando le dimensioni dei cluster intrappolati diventano più grandi delle dimensioni del punto focale, si verifica l'illuminazione parziale delle nostre nanosfere rivestite con fluoroforo (Fig. 1). Ciò provoca un decadimento del segnale di fluorescenza osservato, ridimensionando quantitativamente in termini di rapporto tra la superficie illuminata e quella non illuminata delle nanosfere colloidali parzialmente illuminate 12 . Poiché il decadimento del segnale di fluorescenza è quantitativo rispetto al rapporto sopra, le costanti del tempo di decadimento forniscono informazioni sulla struttura di questi cluster intrappolati. Quando si utilizza il laser a polarizzazione lineare per il trapping, il cluster associato otticamente si allinea con la polarizzazione laser mentre con l'inserimento dell'ellitticità nella polarizzazione laser, i cluster associati otticamente ruotano in base alla quantità di ellitticità laser 13, 14 . La rotazione di questi cluster otticamente legati a causa della modifica della polarizzazione laser porta a diverse strutture e / o orientamenti che si manifestano in cambiamenti nelle costanti di decadimento TPF. Usando questo principio, siamo in grado di sondare la struttura e la dinamica dei cluster colloidali all'interno della sospensione colloidale. Pertanto, dimostriamo grandi progressi nella manipolazione colloidale (ovvero, aggregato di nanoparticelle) ed estrazione di informazioni spaziali.

Formazione di cluster colloidali

Misuriamo sia la luce di retrodiffusione che il segnale TPF dalla nanosfera di polistirene trasparente ricoperto di colorante da 250 nm intrappolato sotto l'influenza di un singolo laser Ti: Sapphire, che può funzionare sia in condizioni continue che bloccate in modalità. Questo ci ha permesso di utilizzare questo singolo laser come sorgente di intrappolamento ottico sia continuo che pulsato. La dimensione del punto focale nelle nostre condizioni sperimentali è ~ 700 nm 12, il che indica che siamo in grado di osservare l'intrappolamento di più nanosfere. Siamo in grado di osservare fino a un massimo di quattro di queste nanosfere intrappolate quando sono state intrappolate in modo sequenziale. Queste nanosfere sono studiate in condizioni così tamponate da avere la minor propensione all'aggregazione, che è stata confermata in modo indipendente attraverso esperimenti di diffusione della luce differenziale condotti a diversi intervalli di tempo. La formazione di cluster si verifica solo nelle condizioni di pinzatura ottica presentate qui.

La luce di retrodiffusione proveniente dalle nanosfere intrappolate mostra un segnale caratteristico di salto di fase sul fotodiodo di silicio indicativo del loro autoassemblaggio e aggregazione (Fig. 2a). L'evoluzione temporale della luce backscatter dalle nanosfere di polistirene intrappolate otticamente mostra i salti di gradino nel segnale backscatter. Sia il segnale di retrodiffusione sul fotodiodo che il segnale di fluorescenza sul fotomoltiplicatore (PMT) sono raccolti in funzione del tempo. Con un aumento del numero di oggetti intrappolati, aumenta il numero corrispondente di scatterer, che, a sua volta, aumenta la quantità di segnale backscatter di conseguenza in modo graduale 7, 16 . Ogni salto nel segnale di backscatter indica l'intrappolamento di una nanosfera aggiuntiva. La superficie della nanosfera di polistirene trasparente con raggio di 250 nm è anche rivestita con molecole di fluoroforo che hanno massimi di assorbimento di un singolo fotone a ~ 580 nm e massimi di emissione di fluorescenza a ~ 605 nm (Fig. 2b). Quando eccitati con i nostri impulsi laser di ~ 120 fs a 780 nm, le sfere rivestite con fluoroforo mostrano TPF al fuoco. Il segnale TPF deriva solo dalle nanosfere intrappolate otticamente a causa della natura confocale intrinseca della tecnica di imaging TPF. Come mostrato in Fig. 2c, d, l'intrappolamento di una nanosfera mostra un forte aumento del segnale del rivelatore PMT rispetto al rumore di fondo che indica TPF. La successiva aggiunta di ciascuna nanosfera nella regione di intrappolamento provoca un aumento iniziale del segnale TPF di una quantità corrispondente a quella del segnale a singola nanosfera 12, 15, 16, 17, 18 . Questo aumento iniziale del segnale TPF sul PMT si correla bene con i dati del backscatter del fotodiodo e, quindi, conferma in modo indipendente i dati del salto di step del backscatter.

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( a ) Evoluzione temporale del segnale di retrodiffusione proveniente dalle nanosfere di polistirene otticamente intrappolate con raggio di 250 nm intrappolate con un treno di femtosecondi di impulsi laser. Ogni salto nel segnale indica l'intrappolamento di una nanosfera aggiuntiva. La natura dei dati di backscatter è simile per la luce polarizzata lineare e circolare. ( b ) Eccitazione di singoli fotoni e spettri di fluorescenza a due fotoni delle nanosfere. La linea spezzata corrisponde allo spettro di eccitazione e la linea continua corrisponde allo spettro TPF. ( c ) Evoluzione temporale della fluorescenza a due fotoni (TPF) da nanosfere di polistirene otticamente intrappolate di raggio di 250 nm quando intrappolate usando luce polarizzata linearmente. ( d ) Evoluzione temporale della fluorescenza a due fotoni (TPF) da nanosfere di polistirene otticamente intrappolate di raggio di 250 nm quando intrappolate usando luce polarizzata circolarmente. Ogni salto nel segnale TPF indica l'intrappolamento di una singola nanosfera.

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Come si evince dalla figura 2a, il segnale di retrodiffusione proveniente dal rivelatore a fotodiodo contiene un valore di fondo elevato (~ 920 conteggi). Quando la singola nanosfera è stata intrappolata a ~ 8 s, il segnale è aumentato a ~ 1080 (salto del segnale di 160). L'intrappolamento di una seconda nanosfera (a ~ 9, 5 s) formerebbe un dimero, che aumenta il segnale di retrodiffusione a ~ 1200 (salto del segnale di 120). Tali dati di backscatter possono essere adattati a un modello di salto con funzione di passo costante, in cui ogni salto corrisponde a un'ulteriore nanosfera intrappolata (Fig. 2a). Ulteriore intrappolamento della terza nanosfera si verifica a ~ 17, 5 s con conseguente formazione di un trimero. Ciò può essere visto dall'aumento del valore del segnale backscatter a ~ 1400 (salto del segnale di 200). A ~ 19 s, il segnale backscatter sale a ~ 1530 (salto del segnale di 130) a causa dell'ulteriore intrappolamento della quarta nanosfera per formare un tetramero. Infine, a ~ 20, 5 s, un grande ammasso elimina il ammasso tetramero. A ~ 25 se ~ 29 s, l'intrappolamento della singola nanosfera si verifica per brevi periodi provocando picchi nel segnale di retrodiffusione.

Il diagramma di TPF con il tempo è mostrato in Fig. 2c per intrappolare nanosfere di polistirene rivestite con fluoroforo di raggio 250 nm sotto luce laser polarizzata linearmente. La sequenza degli eventi di intrappolamento ha mostrato che la prima nanosfera era intrappolata a ~ 10 s, seguita dalla seconda nanosfera a ~ 13 s per formare un dimero, quindi la terza nanosfera a ~ 20 s per formare un trimero e infine la quarta nanosfera a ~ 27 s per formare un tetramero. L'intrappolamento di ogni nanosfera ha portato ad un aumento del segnale TPF di ~ 2, 5 mV. Tutte queste nanosfere intrappolate escono dalla trappola a ~ 47 s, il che è mostrato da una forte diminuzione del segnale TPF (Fig. 2c).

Quando intrappolato con luce laser a polarizzazione circolare, il diagramma di TPF con tempo di intrappolamento di nanosfere di polistirene di raggio 250 nm è mostrato in Fig. 2d. L'intrappolamento sequenziale di quattro nanosfere si è verificato ai seguenti intervalli di tempo: la prima nanosfera a ~ 8 s, la seconda nanosfera a ~ 9, 3 s per formare un dimero, la terza nanosfera a ~ 23 s per formare un trimero e la quarta nanosfera a ~ 26 s per formare un tetramero. Una forte caduta del segnale TPF al valore del segnale di fondo iniziale a ~ 56 s indica che il tetramero intrappolato sta uscendo dalla trappola. Abbiamo potuto osservare fino a un massimo di quattro nanosfere intrappolate contemporaneamente, come nel caso dell'intrappolamento ottico di queste nanosfere di polistirene usando la luce polarizzata linearmente. Qui l'intrappolamento di ogni nanosfera corrisponde a un aumento di ~ 2, 1 mV del segnale TPF. Il segnale TPF generato dalla luce a polarizzazione circolare dovrebbe idealmente essere ~ 0, 7 volte del segnale TPF generato dalla luce a polarizzazione lineare 19, tuttavia, nei nostri esperimenti questo rapporto è risultato essere ~ 0, 8. Questa deviazione dall'aspettativa può essere attribuita al rimescolamento della piccola polarizzazione derivante dalla stretta condizione di messa a fuoco impostata dall'obiettivo NA (apertura numerica) 20 elevato. I grandi picchi del segnale TPF presenti in Fig. 2c, b indicano la diffusione distorta di cluster di grandi dimensioni attraverso la regione focale 21 .

Discussione

Quando una singola nanosfera è intrappolata, sotto la luce polarizzata sia linearmente che circolarmente, il segnale TPF non decade con il tempo: invece oscilla attorno al suo valore medio (Fig. 2c, d). Questa osservazione può essere spiegata dal fatto che la singola nanosfera risiede interamente all'interno della regione focale (Fig. 3a), dove è completamente illuminata; da qui l'assenza di decadimento nel segnale TPF. Quando una seconda nanosfera si trova nelle vicinanze del centro della trappola, a causa delle forti forze del gradiente ottico, viene anche intrappolata in aggiunta alla nanosfera intrappolata esistente. A causa delle forti forze del gradiente ottico, entrambe le nanosfere preferirebbero essere posizionate ai minimi del pozzo del potenziale ottico risultando nella formazione di un cluster otticamente legato in cui le due nanosfere intrappolate si toccano. La Figura 3b mostra la struttura e la dinamica del cluster di due nanosfera otticamente legato, in cui la luce laser viaggia lungo l'asse z e l'asse radiale (r) si trova sul piano xy. Quando intrappolato sotto una luce polarizzata linearmente, il cluster a due nanosfere è allineato con la direzione di propagazione del campo (asse z) 22, come mostrato in Fig. 3b (i), previsto sia teoricamente 23 che sperimentalmente 10 . I nostri attuali risultati sperimentali lo confermano anche dal fatto che in questa configurazione, nessuna parte del cluster otticamente legato rimane al di fuori della regione illuminata dal laser e quindi il segnale TPF sotto luce linearmente polarizzata non decade con il tempo. Poiché questo grappolo è a forma di manubrio, ha una forma di birifrangenza, che lo farà ruotare tra (ii) e (iii) orientamenti della Fig. 3b lungo l'asse z, a causa del trasferimento del momento spin-angolare quando intrappolato sotto polarizzato circolarmente luce. La lunghezza di questo cluster è 2 × (2 × 250 nm) = 1000 nm, che è maggiore della dimensione del punto focale. Pertanto, quando questo cluster, a causa della rotazione, avrà la configurazione di Fig. 3b (ii), una parte di esso rimarrà non illuminata. Dalla figura 2b si può vedere che esiste una regione di sovrapposizione tra gli spettri di assorbimento e di emissione delle molecole di fluoroforo. Pertanto, in questa configurazione, si verifica un processo di trasferimento di energia a fluorescenza (FET) tra le molecole di fluoroforo presenti nella superficie illuminata a quelle presenti nella superficie non illuminata, portando a un decadimento del segnale TPF. Infatti, sotto la luce polarizzata circolarmente, troviamo un lento decadimento temporale esponenziale singolo controintuitivo nel segnale TPF (costante di decadimento, τ ~ 23, 5 s). Ciò implica che il cluster a due nanosfere (dimero) legato otticamente sta effettivamente ruotando tra le configurazioni (ii) e (iii) di Fig. 3b.

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( a ) Trapping di una singola nanosfere di polistirene con raggio di 250 nm (i) usando un approccio a diagramma di raggio rispetto a (ii) visualizzando il singolo trapping di nanosfera con raggio di 250 nm. L'alto obiettivo NA produce un angolo di incidenza, θ = 23 ° nel piano focale e fuori. ( b ) L'intrappolamento di due nanosfere di polistirene con raggio di 250 nm può comportare due possibilità, come mostrato nel diagramma a raggi, (i) in cui una configurazione è mostrata in solido e l'altra in linea tratteggiata. Lo stesso viene visualizzato esplicitamente in (ii) e (iii). Per il laser a trapping polarizzato linearmente, (ii) è meno stabile rispetto a (iii) in cui l'intero dimero del tallone è contenuto nel volume focale (700 nm).

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Se una terza nanosfera si avvicina abbastanza alla regione focale mentre due nanosfere sono intrappolate, nella trappola può formarsi un cluster (trimer) otticamente legato costituito da tre nanosfere. La Figura 4 mostra le possibili strutture e orientamenti per questo cluster, in base alla convenzione che la propagazione del laser è lungo la direzione z mentre la polarizzazione si trova sul piano xy. Per il laser polarizzato linearmente, la polarizzazione è lungo l'asse x. In analogia al caso di due nanosfera, la struttura e l'orientamento previsti del trimer sarebbero la configurazione (a) di Fig. 4. Tuttavia, non è così poiché la forza del gradiente ottico lungo la direzione assiale è il minimo tra i tre assi 24, 25 . A causa della predominanza di una forte forza di gradiente ottico, tutte queste nanosfere intrappolate provano ad avvicinarsi al punto focale e quindi formano una struttura chiusa tridimensionale, che sarebbe un ammasso triangolare planante con tre nanosfere seduto ai vertici di un equilatero triangolo. Pertanto le strutture lineari (configurazioni (a) e (b) di Fig. 4) non sono possibili per questo cluster sotto luce polarizzata linearmente.

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Probabili strutture e orientamenti di tre cluster di nanosfera da 250 nm otticamente intrappolati (strutture ( a - f )).

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Considerando che il semplice modello di oscillatore armonico per una trappola ottica è formato dal raggio laser gaussiano, si presume che il centroide del cluster a tre nanosfera si sovrapponga al potenziale minimo di energia del centro della trappola. Al livello più semplice, si può presumere che il punto focale sia il minimo potenziale di energia della trappola ottica. Poiché il laser è polarizzato linearmente lungo l'asse x, la forza del gradiente lungo gli assi x, ye z è dell'ordine: F x > F y > F z 24, 25 . Quindi due tra tre nanosfere sarebbero posizionate lungo l'asse x e quindi le configurazioni (c) e (d) della Fig. 4 non sono possibili. Allo stesso modo, non sono possibili tutte le altre configurazioni, in cui due nanosfere sono posizionate lungo l'asse y. Pertanto, la struttura e l'orientamento di questo cluster di tre nanosfera sono (e) o (f). Tra le configurazioni (e) e (f), si potrebbe sostenere che la configurazione (e) sarebbe più favorita dalle forze gravitazionali. Tuttavia, poiché la forza gravitazionale è molto più debole delle forze ottiche del gradiente 26, non possiamo a priori discutere per questo gruppo tra (e) e (f), qual è la configurazione corretta. Entrambi nelle configurazioni (e) o (f) di Fig. 4, si può vedere che alcune parti del cluster intrappolato non sono illuminate. Ciò potrebbe portare nuovamente al verificarsi del processo FET tra le molecole di fluoroforo presenti sulla superficie illuminata a quelle presenti sulla superficie non illuminata delle nanosfere intrappolate a causa delle fluttuazioni browniane del cluster di tre nanosfera intrappolato anche sotto il laser polarizzato lineare condizione di intrappolamento. Questo FET provoca un decadimento esponenziale osservato nel segnale sperimentale TPF con una costante di decadimento di ~ 5, 1 s (Fig. 2c).

La dimensione del cluster intrappolato a tre nanosfera realizzabile è sempre maggiore della dimensione del punto focale. Di conseguenza, sotto la luce polarizzata circolarmente, il cluster di tre nanosfera intrappolato ruoterà nel piano xy (cioè, piano radiale) a causa del trasferimento del momento di spin-angolare 5, 27, 28 . Sperimentalmente, troviamo che la costante di decadimento FET del segnale TPF per il cluster a tre nanosfera è di ~ 0, 5 s (Fig. 2d). Questo rapido decadimento del segnale TPF indica che, durante la rotazione, il cluster subisce un cambiamento di forma e diventa lineare lungo l'asse radiale (configurazione (b) di Fig. 4) a causa della forza centrifuga derivante dalla rotazione. Dato che il tempo di decadimento del TPF dovuto all'ombreggiatura FET è quantitativo con il rapporto tra la superficie illuminata e quella non illuminata delle nanosfere colloidali parzialmente illuminate (M) 12, calcoliamo il valore M per le configurazioni (b) ed (e) o (f) di Fig. 4. La FET che si verifica in tali condizioni è solo di natura intra-particellare 12 e le nanosfere completamente illuminate non contribuiscono al processo FET. Le due nanosfere parzialmente illuminate in ciascuna configurazione risultano ugualmente parzialmente illuminate. I valori calcolati di M per le configurazioni (e) e (f) sono ~ 17, 93 e quello per la configurazione (b) è ~ 2, 27. Di conseguenza, il rapporto tra i valori M tra le configurazioni (e) e (b) [o (f) e (b)] è ~ 7, 90. Questo può essere confrontato con il rapporto ~ 10 per le costanti di decadimento sperimentale del cluster di tre nanosfera sotto luce polarizzata lineare e circolare. Questa deviazione del 20% circa nel rapporto tra M dal nostro modello e quello delle costanti di decadimento dai risultati sperimentali può essere attribuita al fatto che la posizione del cluster non è esattamente sul piano focale e al possibile aumento del divario tra il Le nanosfere intrappolate a causa dell'effetto della forza centrifuga non sono incluse.

Quando una quarta nanosfera di raggio di 250 nm si avvicina al centro della trappola, mentre tre nanosfere sono già intrappolate, abbiamo scoperto che è di nuovo possibile intrappolare la quarta nanosfera a causa della forte forza del gradiente ottico. Continuando con le discussioni sulla struttura del cluster a tre nanosfera (trimero), possiamo facilmente concludere che anche la struttura lineare per il cluster a quattro nanosfera (tetramero) non è possibile quando sono intrappolati otticamente sotto luce polarizzata linearmente. Le strutture più fattibili insieme ai loro orientamenti in condizioni di luce polarizzata linearmente sono mostrate in Fig. 5. Il tetramero intrappolato può formare strutture bidimensionali o tridimensionali. Nel caso di strutture bidimensionali, la struttura più stabile e strettamente compatta è la struttura rombica formata dalla fusione di due triangoli equilateri (pannello (a) di Fig. 5). Poiché F x > F y > F z 24, 25, la diagonale corta sarebbe lungo l'asse xe la diagonale lunga sarebbe lungo l'asse y. Nel caso della struttura tridimensionale, la struttura più stretta sarebbe la struttura triangolare destra piramidale (pannello (b) e (c) di Fig. 5). L'orientamento del cluster tridimensionale sarebbe: due nanosfere posizionate lungo l'asse xe le altre due nanosfere posizionate lungo l'asse y come: F x > F y > F z 24, 25 . Entrambi i panel (b) e (c) soddisfano questo criterio e quindi entrambi sono ugualmente probabili.

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Varie possibili strutture e orientamenti di quattro cluster di nanosfera da 250 nm in trappola ottica (strutture ( a - c )).

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Tutte le configurazioni più probabili del cluster a quattro nanosfera, come mostrato in Fig. 5, sono parzialmente illuminate e quindi mostrerebbero un decadimento esponenziale nel loro diagramma TPF rispetto al tempo (che, in effetti, può essere visto in Fig. 2c). Il fatto che il tempo di decadimento del segnale TPF sia direttamente proporzionale al valore M può essere utilizzato in modo efficace per scoprire che, tra i tre pannelli di Fig. 5, è la configurazione effettiva di questo cluster di quattro nanosfere. Sperimentalmente, il tempo di decadimento esponenziale singolo per il cluster di quattro nanosfere sotto luce polarizzata linearmente è ~ 7, 3 s. Considerando la struttura rombica (pannello (a) di Fig. 5), otteniamo un valore M di ~ 7, 23, mentre il valore M per ciascuna delle strutture triangolari di destra piramidale (pannello (b) e (c) di Fig. 5) è ~ 25.93. Poiché il tempo di decadimento TPF corrisponde direttamente al valore M, il rapporto tra il tempo di decadimento del cluster a quattro nanosfera e quello del cluster a tre nanosfera (trimero) sotto luce polarizzata linearmente (~ 1.43) dovrebbe essere uguale al rapporto della M valori delle configurazioni corrispondenti. Il rapporto tra i valori M per il pannello (a) di Fig. 5 e il pannello (e) [o (f)] di Fig. 4 è ~ 0.40, mentre il rapporto tra i valori M per il pannello (b) [o (c)] di Fig. 5 e il pannello (e) [o (f)] di Fig. 4 è ~ 1, 45. Questo confronto evidenzia chiaramente il fatto che la struttura triangolare tridimensionale della piramide destra avente due orientamenti favorevoli (mostrati nel pannello (b) e (c) di Fig. 5) è la corretta rappresentazione del cluster di quattro nanosfera sotto luce linearmente polarizzata . Sotto luce polarizzata circolarmente, la costante di decadimento TPF è ~ 8, 4 s. Ciò trasmette il fatto che, durante la rotazione, il cluster a quattro nanosfera (tetramero) si allenta a causa della forza centrifuga con conseguente aumento del valore M, che porta ad un aumento del valore del tempo di decadimento TPF osservato sperimentalmente.

Inoltre, queste comprensioni strutturali possono anche essere giustificate dai nostri risultati di backscatter: L'aumento del segnale di backscatter per il trapping di una singola nanosfera è di ~ 160 conteggi. Per il dimero, il segnale di retrodiffusione è aumentato di ~ 120 conteggi rispetto a quello della singola nanosfera intrappolata. Questo perché il dimero è allineato lungo l'asse di propagazione del raggio laser (Fig. 3b (i)) 12, 22, 23 e la nanosfera inferiore maschera in qualche modo la nanosfera superiore. L'inserimento della terza nanosfera nella regione di intrappolamento per formare un trimer provoca un aumento del segnale di retrodiffusione di circa 200 conteggi. Ciò è dovuto al fatto che nell'orientamento stabile del trimmer (Fig. 4e, f), una nanosfera è posizionata al centro del raggio laser e le altre due nanosfere sono lungo l'asse x e tutti e tre si toccano altro. Infine, quando la formazione di tetramero si verifica dal trimero quando un'altra nanosfera è intrappolata, il segnale di retrodiffusione aumenta di un valore di ~ 130 conteggi. Tuttavia, è importante notare che la natura del segnale di retrodiffusione è simile indipendentemente dal fatto che la polarizzazione del laser di tweezing sia lineare o circolare. Tuttavia, in caso di rilevamento TPF, esiste una distinzione tra il laser a trapping lineare e quello polarizzato circolarmente. Pertanto, le congetture per determinare la struttura dei cluster colloidali sono meglio confermate dai grafici di decadimento TPF.

Sia il backscatter che il TPF supportano il possibile orientamento del cluster di tetrameri previsto dagli studi di decadimento del TPF come per il cluster di tetramero, al suo centro c'è uno spazio vuoto, che riduce l'aumento del segnale del backscatter dall'aumento del segnale di intrappolamento della singola nanosfera (~ 160). Ma il segnale backscatter non può distinguere tra le strutture rombiche (Fig. 5a) e triangolari di destra piramidale (Fig. 5b, c), poiché entrambe queste strutture contengono spazio vuoto al loro centro. Ma il decadimento del TPF dovuto alla tecnica di ombreggiatura a trasferimento di energia a fluorescenza può facilmente determinare la struttura e l'orientamento del cluster di tetrameri.

Tutte le strutture dei cluster colloidali possono anche essere supportate, semplicemente dai valori del segnale TPF iniziale per questi monomeri, dimeri, trimeri e tetrameri intrappolati in quanto corrispondono bene al segnale di backscatter appena discusso. Pertanto, per il trapping con luce polarizzata linearmente, l'aumento del gradino del segnale TPF per singola nanosfera è di 2, 28 mV, che con il trapping simultaneo di una seconda nanosfera aumenta di 2, 32 mV. Poiché entrambe le nanosfere sono allineate verticalmente e completamente illuminate, l'aumento dei segnali TPF è simile. Ma quando la terza particella entra nella regione di intrappolamento, l'innalzamento iniziale del segnale TPF di 2, 98 mV è relativamente più alto. Ciò è dovuto al fatto che, per un trimer intrappolato, sono possibili possibili configurazioni (e) e (f) di Fig. 4, in cui una nanosfera è completamente illuminata mentre anche le altre due sono illuminate al massimo il più possibile geometricamente. Ciò porta ad un aumento maggiore del segnale TPF rispetto all'aumento del segnale TPF da nanosfere singolarmente e doppiamente intrappolate. Ma quando la quarta nanosfera viene intrappolata simultaneamente, ciascuna delle due strutture più possibili, come mostrato nelle configurazioni (b) e (c) di Fig. 5, ha un grande vuoto rispetto alle possibili configurazioni del trimer intrappolato. Pertanto, l'aumento del segnale TPF iniziale di 2, 45 mV è inferiore al segnale TPF iniziale del cluster di tre nanosfera. La presenza di parti non illuminate a causa di vincoli geometrici porta al decadimento dei segnali TPF iniziali per trimer e tetrameri intrappolati.

In caso di intrappolamento con laser a polarizzazione circolare, l'aumento del segnale TPF per una singola nanosfera intrappolata è di 1, 9 mV mentre quello per un dimero intrappolato, l'aumento del segnale iniziale è di 2, 39 mV. Ciò può essere spiegato dal fatto che durante la rotazione tra le configurazioni (ii) e (iii) di Fig. 3b, vengono illuminate nuove porzioni di seconda nanosfera, con conseguente aumento iniziale del segnale per il dimero. Ma, con l'intrappolamento simultaneo della terza nanosfera, si ottiene la configurazione mostrata nella Figura 4 (b), dove solo una nanosfera è completamente illuminata mentre le altre due sono meno illuminate, il che giustifica un aumento del segnale TPF minore di 2, 13 mV . Infine, nel caso del tetramero intrappolato, c'è un grande vuoto dovuto alla rotazione, che si traduce in un aumento del segnale TPF iniziale di 2, 24 mV che è paragonabile al caso del trimer intrappolato.

In conclusione, abbiamo generato cluster colloidali contenenti fino a quattro nanosfere di raggio di 250 nm utilizzando la forte forza di gradiente ottico di una trappola ottica a raggio singolo. Allo stesso tempo abbiamo rilevato il processo di formazione del cluster in situ utilizzando TPF generato dalle nanosfere intrappolate rivestite con fluoroforo. Il nostro approccio fornisce chiaramente informazioni dettagliate su più eventi di intrappolamento che portano alla formazione del cluster colloidale otticamente legato. Abbiamo anche studiato le strutture e gli orientamenti delle nanosfere parzialmente illuminate sfruttando il processo di shadowing FET, che si verifica tra i fluorofori presenti sulla superficie illuminata a quelli presenti sulla superficie non illuminata. La dinamica di questi cluster sotto luce circolare polarizzata ha fornito un'ulteriore elaborazione del processo. Inoltre, con questo metodo è stato analizzato il cambiamento di struttura di questi cluster sotto luce polarizzata linearmente e circolarmente. Così dimostriamo la forza ottica del gradiente diretta alla manipolazione dei cluster colloidali ed abbiamo estratto le loro informazioni spaziali e le loro dinamiche attraverso l'ombreggiamento FET.

Materiali e metodi

La configurazione sperimentale per i nostri esperimenti è mostrata in Fig. 6a. Abbiamo utilizzato un laser Ti: Sapphire a stato solido che può funzionare sia in condizioni continue che bloccate in modalità (MIRA 900F, Coherent Inc., USA) come fonte di intrappolamento ottico. Per ottenere il TPF dagli oggetti intrappolati a bassa potenza del laser, il laser è stato operato nella condizione di blocco della modalità (larghezza dell'impulso ~ 120 fs con frequenza di ripetizione 76 MHz con lunghezza d'onda centrale ~ 780 nm). Il microscopio con pinzette utilizzato per l'esperimento è un microscopio rovesciato costruito in casa che è stato descritto in dettaglio in precedenza [12, 15, 16, 17, 18]. Ancora più importante, il raggio laser di intrappolamento è stato prima espanso e poi collimato utilizzando disposizioni telescopiche per riempire eccessivamente l'apertura posteriore dell'obiettivo in modo da ottenere dimensioni del punto focale limitate quasi di diffrazione. Ciò garantisce la massima focalizzazione stretta in condizioni sperimentali. La potenza media del laser di intrappolamento è stata mantenuta a 20 mW nella fase di campionamento. Per cambiare la polarizzazione del laser da lineare a circolare, è stata posizionata una piastra a quarto d'onda nel percorso del raggio laser collimato. Un obiettivo microscopico ad alta apertura numerica (NA) (UPlanSApo, 100XO, 1.4 NA, Olympus Inc., Giappone) è stato utilizzato per ottenere la condizione di messa a fuoco ridotta e, di conseguenza, una forza di gradiente ottico molto elevata. Questo stesso obiettivo ha anche raccolto l'immagine del campo luminoso e la fluorescenza dall'oggetto intrappolato. Uno specchio dicroico che riflette vicino alla luce IR e trasmette uno spettro visibile di luce è stato posizionato proprio sotto l'obiettivo per immagini in campo chiaro e TPF. L'evento di cattura è stato catturato utilizzando una videocamera CCD (350 K pixel, e-Marks Inc.). A causa della scarsa risoluzione delle immagini dei file video, non siamo riusciti a determinare la struttura, gli orientamenti e le dinamiche di questi cluster intrappolati. È un dato di fatto, questo è uno dei motivi per cui usiamo la fluorescenza a due fotoni come indicatore del verificarsi dell'evento di intrappolamento ottico. I segnali di fluorescenza a due fotoni dalle nanosfere intrappolate sono stati raccolti utilizzando un tubo foto moltiplicatore (PMT) (1P28, Hamamatsu) collegato a un oscilloscopio digitale (waveRunner 6100A, LeCroy). Gli spettri TPF delle nanosfere intrappolate sono stati raccolti utilizzando una fibra ottica multimodale collegata a uno spettrometro portatile (HR2000, Ocean Optics).

Image

( a ) Schema del Setup Sperimentale usato nei nostri esperimenti, in cui le abbreviazioni indicano gli elementi chiave del setup che è espanso nel blocco legenda. Inset mostra l'equilibrio delle forze di scattering e gradiente che è fondamentale nella formazione di una trappola ottica stabile. ( b ) Diffusione della luce differenziale misurata attraverso la nostra soluzione tampone di nanosfera campione che mostra (i) la dimensione media della distribuzione delle particelle da 496 nm e (ii) il diametro delle particelle misurato in momenti diversi.

Immagine a dimensione intera

Per l'intrappolamento sono state utilizzate nanosfere di polistirene rivestite con fluoroforo con raggio di 250 nm sospeso in acqua (F-8887, sonde molecolari). La soluzione del campione è stata preparata diluendo 100 volte la soluzione madre originale (concentrazione 2 mM) usando una soluzione salina tamponata con fosfato. La concentrazione finale del nostro campione sperimentale è di 20 μM. Ciò ha assicurato che i granuli di polistirene sviluppino una leggera repulsione tra loro e rimangano individualmente nella soluzione, che è stata confermata mediante diffusione della luce differenziale eseguita sulla nostra soluzione di campione preparata dopo averli conservati a 22 ° C per un paio di giorni (Fig. 6b) . Tutti gli esperimenti sono stati condotti a 295 K. La variazione di temperatura nella regione focale dovuta all'assorbimento del laser è <1 K 29, 30, che a sua volta ha un effetto trascurabile (<2%) nella viscosità locale del mezzo 31 . Tutti i dati sono stati analizzati, adattati e tracciati utilizzando il software Origin 8.5 (Origin Inc.). Solo sotto le pinzette ottiche, si verifica la formazione di cluster. Il software Autodesk Inventor ® Professional 2011 (Autodesk Inc.) è stato utilizzato per l'analisi delle strutture e degli orientamenti dei cluster colloidali.

Informazioni aggiuntive

Come citare questo articolo : Roy, D. et al . Struttura e dinamica dell'autoassemblaggio otticamente diretto delle nanoparticelle. Sci. Rep. 6, 23318; doi: 10.1038 / srep23318 (2016).

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