La struttura di una sinaptotagmina estesa legata ai lipidi indica un ruolo nel trasferimento dei lipidi | natura

La struttura di una sinaptotagmina estesa legata ai lipidi indica un ruolo nel trasferimento dei lipidi | natura

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Prove crescenti suggeriscono che strette attrezzature tra il reticolo endoplasmatico (ER) e altre membrane, comprese le disposizioni con la membrana plasmatica (PM), mediano lo scambio di lipidi tra questi due strati. I meccanismi di tale scambio, che consente il trasferimento dei lipidi indipendentemente dal trasporto vescicolare, rimangono scarsamente compresi. La presenza di un dominio di proteina mitocondriale-lipid-binding (SMP) simile a sinaptotagmina, un modulo di legame lipidico proposto, in diverse proteine ​​localizzate in siti di contatto con la membrana ha sollevato la possibilità che tali domini possano essere implicati nel trasporto lipidico 1, 2 . Le proteine ​​contenenti SMP includono componenti del complesso ERMES, un legame mitocondriale ER 3 e i sinaptotagmin estesi (noti come tricalbine nel lievito), che sono agganci ER-PM 4, 5, 6 . Qui presentiamo a risoluzione 2, 44 Å la struttura cristallina di un frammento di synaptotagmin 2 umano esteso (E-SYT2), incluso un dominio SMP e due domini C2 adiacenti. Il dominio SMP ha una struttura a β-barile come i moduli proteici nella superfamiglia tubolare-lipid-binding (TULIP). Si dimmerizza per formare un cilindro lungo circa 90 Å attraversato da un canale interamente rivestito di residui idrofobici, con i due frammenti C2A – C2B che formano strutture ad arco collegate in modo flessibile al dominio SMP. È importante sottolineare che l'analisi strutturale integrata dalla spettrometria di massa ha rivelato la presenza di glicerofosfolipidi nel canale SMP E-SYT2, indicando un ruolo diretto degli E-SYT nel trasporto lipidico. Questi risultati forniscono una forte evidenza di un ruolo delle proteine ​​contenenti dominio SMP nel controllo del trasferimento lipidico nei siti di contatto con la membrana e hanno ampie implicazioni oltre il campo delle apparecchiature ER-PM.

Principale

Si ritiene che i siti di contatto ER-PM, presenti in tutti gli eucarioti, abbiano molteplici funzioni 7, 8, 9, incluso un ruolo evolutivamente conservato nella regolazione della composizione lipidica e del metabolismo nel PM 8, 9, 10, 11 . Gli E-SYT sono proteine ​​residenti in ER che agiscono come attacchi che collegano le membrane ER e PM in stretta apposizione 4, 5, 6 . Esistono tre E-SYT (E-SYT1, 2 e 3) nelle cellule di mammifero, che omo- o eterodimerizzano 6 . Ogni E-SYT ha un ancoraggio a membrana ER amminico-terminale, seguito da una regione di linker corto, un dominio SMP e tre o più domini C2 6 (Fig. 1a). L'ancoraggio della membrana ER e i domini C2 sono necessari per il tethering, mentre il ruolo del dominio SMP non è chiaro 6 . Le analisi bioinformatiche che suggeriscono che i domini SMP appartengono alla superfamiglia TULIP erano quindi intriganti perché sono note diverse proteine ​​TULIP che legano i lipidi e partecipano al trasferimento lipidico 1, 2 .

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a, architettura di dominio E-SYT2. I confini del dominio sono indicati come numeri di residui. b, Sinistra, i monomeri nel dimero E-SYT2 sono verdi o blu. Gli archi C2A – C2B (vedi anche Fig. 3) entrano in contatto con il cilindro SMP come nel cristallo. A destra, E-SYT2 è colorato dal blu (N terminus) al rosso (C terminus) e gli archi C2A – C2B vengono estratti dal dimero SMP. La 'cucitura' lungo il lato del dimero SMP è parzialmente visibile. Le molecole detergenti e lipidiche sono rosa. c, rappresentazione superficiale del dimero SMP. I residui idrofobici (blu) rivestono il canale. Le frazioni di acidi grassi lipidici sono rappresentazioni che riempiono lo spazio. d, Diagrammi della barra multifunzione per l'adesione BPI (Protein Data Bank (PDB) 1BP1), E-SYT2 e CTEP (accessione PDB 2OBD). Gli elementi strutturali in BPI o CTEP non presenti in E-SYT2 sono ciano.

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Per ottenere approfondimenti sulla funzione E-SYT, abbiamo determinato la struttura cristallina di un frammento di E-SYT2 umano (residui 163–634) comprendente i domini SMP, C2A e C2B (Tabella dati estesi 1). La porzione carbossi-terminale di E-SYT2, che consiste in una regione di linker estesa seguita da un terzo dominio C2 (C2C) che interagisce con fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PI (4, 5) P 2 ) al PM 6, non era nel costrutto.

Questo frammento E-SYT2 si dimerizza sia in soluzione, come valutato dalla cromatografia di esclusione dimensionale, sia nel cristallo. Ogni dominio SMP è un barile β (Fig. 1b), comprendente un foglio β altamente attorcigliato e due eliche α, H1 e H3. Una terza elica, H2, ricopre parzialmente un'estremità della canna. L'altra estremità della canna si associa all'estremità corrispondente del secondo dominio SMP per formare un cilindro lungo 90 Å. I residui all'interfaccia dei due domini SMP sono tra i più altamente conservati (Extended Data Fig. 1), coerenti con la rilevanza fisiologica del dimero e probabilmente mediano l'omo e l'eterodimerizzazione degli E-SYT 6 . Un canale di circa 10 mm di diametro rivestito esclusivamente con residui idrofobici attraversa il cilindro (Fig. 1c). Si collega con il solvente ad entrambe le estremità e tramite una cucitura stretta lungo la lunghezza del cilindro.

Non vi è alcuna somiglianza significativa tra le sequenze primarie del dominio SMP E-SYT2 e le proteine ​​della piega nota. Tuttavia, come previsto dagli studi di bioinformatica 1, 2, la nostra struttura stabilisce fermamente il dominio SMP come membro della superfamiglia TULIP. Nelle proteine ​​TULIP precedentemente caratterizzate come la proteina battericida / che aumenta la permeabilità (BPI) e la proteina di trasferimento dell'estere colesterolo (CETP) (Fig. 1d), i moduli simil-SMP formano anche strutture tubolari che ospitano un canale idrofobo allungato 12, 13 . BPI e CETP non si dimmerizzano, tuttavia, poiché ciascun monomero comprende due domini simili a SMP anziché uno, con i due moduli disposti in tandem e collegati da un foglio β non presente in E-SYT.

All'interno del canale SMP, le mappe di densità elettronica mostrano chiare densità per due molecole lipidiche per monomero E-SYT2 (Fig. 2a, b). Una densità è coerente con un lipide diacilglicerolo, mentre l'altra ricorda il Triton X-100, un detergente usato nella purificazione delle proteine. Triton X-100 è stato modellato in questa densità con il suo gruppo 4- (1, 1, 3, 3 tetrametilbutil) -fenile sepolto nel canale idrofobo e la sua catena idrofila in polietilene estesa attraverso la giuntura nel solvente (Fig. 2). Un'analisi di spettrometria di massa (MS) non denaturazione 14 di E-SYT2 ricombinante purificata in assenza di Triton X-100 mostra che sono presenti proteine ​​legate al ligando e che due molecole lipidiche possono legarsi per monomero (Extended Data Fig. 2), quindi probabilmente una seconda molecola lipidica si lega al posto del detergente in un contesto fisiologico. La denaturazione dell'analisi MS e MS / MS ad alta risoluzione a ionizzazione negativa ha ulteriormente identificato i ligandi dell'E-SYT2 ricombinante come due componenti principali della membrana batterica, il fosfatidilglicerolo e la fosfatidilletanolamina (PE) (Extended Data Fig. 3 e Extended Data Table 2).

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a, 2 F o - F c densità elettronica (1, 0 σ ) in cui sono stati modellati il ​​detergente Triton X-100 e il lipide fosfoglicerolo; i modelli dopo il raffinamento sono sovrapposti. I gruppi di testa lipidica non sono stati modellati. b, densità 2 F o - F c finale per molecole lipidiche. Sono indicati gli atomi di proteine ​​entro 8 Å dal lipide. c, spettro di massa di ionizzazione elettrospray non denaturazione (ESI) in modalità positiva, E-SYT2 espresso in cellule di mammifero. In condizioni native (acetato di ammonio 20 mM, pH 6, 9) una conformazione di apo E-SYT2 centrata attorno allo stato di carica +16 è lo stato monomerico più abbondante (indicato come P); peso molecolare = 57.032, 4 ± 1, 6 Da. Le specie più rappresentate in condizioni native sono dimeri contenenti almeno quattro molecole lipidiche (P 2 L 4 ) con uno stato di carica centrato attorno a +24. m / z , rapporto massa / carica. d, un costrutto E-SYT2 che include il dominio SMP lega NBD – PE fluorescente, mentre l'arco C2A – C2B da solo non lo fa. Le proteine ​​sono state incubate con lipidi fluorescenti, quindi analizzate mediante PAGINA nativa, che è stata esaminata per fluorescenza (in alto) e colorata con Coomassie (in basso). La banda con la proteina contenente SMP co-migra con PE fluorescente. e, E-SYT2 precaricato con NBD-PE, quindi ulteriormente purificato, è stato incubato con fosfatidilcolina (PC), sfingomielina (SM), ceramide (CER) o colesterolo (CH). I campioni sono stati visualizzati su gel nativi mediante fluorescenza e colorazione di Coomassie. Il segnale di fluorescenza è stato normalizzato alla quantità di proteine ​​in ciascuna corsia, valutata mediante colorazione di Coomassie. L'esperimento è stato eseguito cinque volte; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. PC, ma nessuno degli steroli, sposta NBD-PE. (Vedi anche Dati estesi Fig. 7.)

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Le mappe della densità elettronica mostrano che le frazioni di acidi grassi lipidici si trovano nel canale idrofobo, mentre il gruppo della testa polare sporge attraverso la giuntura ed è solvato. Non c'è densità per il gruppo principale, il che implica che non ha contatti estesi con E-SYT2 ed è disordinato. Ciò suggerisce che il dominio SMP potrebbe legare una varietà di glicerofosfolipidi. BPI e CETP legano diversi lipidi in modo simile, con porzioni idrofobe sepolte nel canale idrofobo e gruppi idrofili esposti al solvente lungo la giuntura 12, 13 .

Per identificare i lipidi legati a E-SYT2 nelle cellule di mammifero, un frammento di E-SYT2 marcato 3 × Flag comprendente i domini SMP e C2A – C2B è stato espresso in cellule Expi293 e purificato mediante immunoprecipitazione anti-Flag. La denaturazione della SM di questo costrutto e l'analisi lipidomica quantitativa hanno rivelato la presenza di glicerofosfolipidi fosfatidilcolina (PC; 67%), PE (21%), fosfatidilinositolo (7%) e fosfatidilserina (3%) (dati estesi Fig. 4, 5 e dati estesi Tabella 3). Queste quantità relative dei maggiori fosfolipidi riflettono approssimativamente la loro relativa abbondanza nelle membrane delle cellule animali 15, suggerendo una mancanza di specificità rispetto a particolari ligandi glicerofosfolipidi. Abbiamo cercato ma non abbiamo rilevato altre specie lipidiche come lisofosfatidilcolina, sfingosina o sfingosina-1-fosfato, sfingomielina, eventuali fosfoinositidi o notevoli quantità di ceramide. Né sono stati rilevati esteri di colesterolo, che sono legati da CETP 13, o colesterolo.

Quando analizzato da MS non denaturante, E-SYT2 è risultato essere sia monomero che dimero (Fig. 2c). La distribuzione dello stato di carica centrata attorno a +16 rappresenta i monomeri principalmente nella forma apo, corrispondente a un peso molecolare di 57.030 dalton (Da) dopo la deconvoluzione (Extended Data Fig. 6a). Solo una bassa percentuale dei monomeri (∼ 10%) era legata a una o due molecole lipidiche, con masse corrispondenti alle principali specie lipidiche identificate in precedenza. La maggior parte della proteina era dimerica con una distribuzione dello stato di carica centrata attorno a +24. Dopo la deconvoluzione di questo spettro (Extended Data Figs 6b, ce 7), il peso molecolare del dimero è ∼ 117.500 Da, suggerendo la presenza di almeno quattro molecole lipidiche legate (ipotizzando una massa media di 750-800 Da per lipide) . Quasi nessun dimero è stato rilevato nella forma apo. Questi risultati indicano che è necessaria la dimerizzazione per il legame stabile dei lipidi.

Il legame con glicerofosfolipidi è stato anche dimostrato in vitro testando la capacità dei lipidi purificati di spostare 7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-il-1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina fluorurati precaricati (NBD – PE) da E-SYT2 (Fig. 2d, e). L'incubazione di E-SYT2 precaricato con NBD-PE spostato dal PC, come rivelato dalla perdita di fluorescenza nella banda corrispondente a E-SYT2 nell'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (PAGINA; Fig. 2e). Al contrario, in linea con i risultati della SM, il colesterolo, la sfingomielina e la ceramide non hanno sostituito il PE, suggerendo che non sono legati da E-SYT2 anche se abbondantemente presenti. La maggiore rigidità di questi lipidi rispetto ai glicerofosfolipidi può impedire il loro ingresso nel sito di legame lipidico E-SYT2.

C2A e C2B si piegano entrambi in domini C2 di tipo II e sono rigidamente collegati in un arco che attraversa ∼ 70 Å (la Figura 3 mostra la vista migliore dell'arco), come recentemente descritto 16 . Nella struttura cristallina, entrambi i moduli C2A – C2B del dimero E-SYT2 entrano in contatto con lo stesso dominio SMP, con diversi residui C2A – C2B che interagiscono con patch differenti sull'SMP (Fig. 1a, a sinistra). I residui sulle interfacce non vengono conservati (Extended Data Fig. 1), suggerendo che le interazioni C2 – SMP sono contatti cristallini e che C2A – C2B non interagisce con il dimero SMP in soluzione (Fig. 1b, a destra). Piuttosto, il frammento E-SYT2 C2A – C2B interagisce con i doppi strati lipidici in modo dipendente da Ca 2+ 17 . Di conseguenza, i residui di coordinazione del calcio sono stati identificati in anelli alla fine della struttura ad arco in C2A 16 .

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a, Schema di una cella con un sito di contatto ER-PM. b, 'Modello di tunnel' di E-SYT2, in cui E-SYT2 collega ER e PM per trasferire i lipidi tra di loro. Il dimero E-SYT2 SMP è lungo ∼ 90 Å, quindi ER e PM non possono essere più distanti se E-SYT2 funge da tunnel. E-SYT2 è ancorato all'ER tramite la sua regione N-terminale e al PM tramite il dominio C2C (accesso PDB 2DMG). C2A – C2B interagisce con la membrana tramite anelli alle estremità dell'arco e potrebbe interagire con ER, PM o entrambi, a seconda della distanza tra le membrane. Il modello è in scala. c, "modello shuttle" di E-SYT2 che lega ER e PM e disegnato in scala. La lunghezza delle regioni di collegamento non strutturate è indicata tra i residui. A distanze ER-PM maggiori, come mostrato qui, C2A – C2B (C2AB) non può raggiungere il PM. Il dimero SMP può trasferire i lipidi tra ER e PM, potenzialmente insieme alle proteine ​​partner (etichettate con un punto interrogativo).

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La distanza tra le membrane ER e PM nei siti di contatto è stimata in 100–300 Å (rif 8, 18, 19). E-SYT2 si estende su questo spazio con un ancoraggio a membrana N-terminale inserito nell'ER e il suo dominio C2C legato al PM tramite un'interazione con PI (4, 5) P 2, che è arricchito lì 6 (Fig. 3). Sebbene C2C, quando espresso da solo, sia reclutato nel PM 6, 17, noi e altri 17 non abbiamo osservato alcuna associazione di C2A-C2B con un particolare organello nelle cellule viventi. Dati i vincoli geometrici imposti dalle dimensioni del dominio e dalle lunghezze del linker, un'interazione tra C2A – C2B e la superficie citosolica dell'ER è plausibile e coerente con le sue interazioni di membrana indipendenti precedentemente acido-fosfolipide-acido 17 . Tuttavia, è plausibile anche un'interazione tra C2A – C2B e il PM a contatti ER-PM molto stretti (meno di ∼ 100 Å), dove può raggiungere il PM.

La struttura del dominio SMP E-SYT2 e l'identificazione dei lipidi nel suo canale idrofobo stabiliscono definitivamente questo dominio come modulo di legame lipidico. La somiglianza strutturale di E-SYT2 con le proteine ​​della superfamiglia TULIP, molte delle quali funzionano nel trasferimento lipidico extra citosolicamente 2, 12, 13, suggerisce inoltre un ruolo nel trasporto lipidico. Inoltre, la presenza di questo modulo nelle proteine ​​che si localizzano ai contatti tra ER e altre membrane 4, 5, 6, 20 indica fortemente un ruolo nel trasferimento dei lipidi dal loro sito di sintesi nell'ER a queste membrane, come il PM nel caso di E-SYT2. In risposta a come può avvenire un tale trasferimento, i dimeri SMP potrebbero in linea di principio formare un ponte tra le membrane apposte lungo le quali vengono trasferiti i lipidi ("modello a tunnel"; Fig. 3), con le loro frazioni idrofobiche che scorrono lungo il canale idrofobo e il loro idrofilo gruppi di testa solventi esposti alla giuntura. CETP è stato proposto di funzionare esattamente in questo modo per incanalare gli esteri di colesterolo tra le particelle di lipoproteine 21 . Tuttavia, poiché è lungo solo 90 Å, il dimero E-SYT2 SMP potrebbe essere troppo corto per coprire lo spazio inter-membrana. Un'altra possibilità, plausibile per distanze ER-PM inferiori a ∼ 200 Å, è che il dimero SMP si sposta tra le membrane, estraendo i lipidi da uno e consegnandolo al secondo ("modello a navetta"; Fig. 3). In un terzo modello, non reciprocamente esclusivo, E-SYT2 funziona di concerto con altre proteine ​​di trasferimento lipidico per effettuare il trasporto. Questo modello è interessante perché non richiede preferibilmente E-SYT per legare lipidi specifici, che potrebbero invece essere selezionati dalle proteine ​​partner. Le proteine ​​di trasferimento del fosfatidilinositolo (PITP) e le proteine ​​della famiglia OSH sono candidati interessanti perché possono interagire con lipidi specifici 22, 23 e si ritiene che funzionino nel trasferimento dei lipidi nei siti di contatto 8, 9 .

L'identificazione di E-SYT come proteine ​​di trasferimento lipidico rappresenta un importante passo avanti nella dissezione della biologia dei siti di contatto ER-PM. Tuttavia, il nostro lavoro è anche più in generale applicabile ad altri siti di contatto, come i contatti mitocondriali ER, in cui si prevede che il complesso tethering ERMES contenga tre moduli SMP 1, 2 . Sospettiamo che questi eterodimeri si faccia a faccia, come osservato nell'omodimero SMP E-SYT2, per formare uno o più moduli portatori lipidici con canali lipofobici idrofobici.

Riepilogo dei metodi

E-SYT2 umano ricombinante nativo o sostituito con selenometionina (residui 163–634) sono stati sovraespressi e purificati da Escherichia coli . La proteina è stata cristallizzata con il metodo della goccia sospesa, equilibrando contro liquore madre comprendente 100 mM di acido malonico, imidazolo e acido borico (MIB) tampone a pH 4, 3–4, 6 e 12, 5-14% PEG 1500 e inoltre 0, 1 M NaI per la selenometionina -sostituita proteina. Abbiamo usato il metodo di dispersione anomala a più lunghezze d'onda con i cristalli sostituiti con selenometionina per il phasing (Extended Data Table 1). La struttura è stata perfezionata rispetto ai dati provenienti da cristalli nativi (tabella dati estesi 1). Determinazione della struttura, analisi della SM e saggi di legame lipidico in vitro sono descritti in maggior dettaglio nei Metodi.

Metodi online

Clonazione, espressione proteica e purificazione

E-SYT2 umano (residui 163–634) è stato clonato in un vettore pCDF modificato, che codifica per un tag N-terminale glutatione S- transferasi (GST) e un sito di scissione proteasi di precisione. Il plasmide è stato trasformato in cellule BL21 (DE3) di Escherichia coli . Le cellule sono state cresciute fino a un OD 600 nm 0, 7, quindi spostate a 20 ° C e l'espressione proteica è stata indotta aggiungendo 1 mM di isopropil-β-d-tiogalattoside (IPTG). Le cellule sono state raccolte 20 ore dopo l'induzione. E-SYT2 sostituito con selenometionina è stato prodotto in modo simile a come descritto precedentemente 24 . Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione, risospese in tampone di lisi (20 mM Tris pH 8, 0, 500 mM di NaCl, 5 mM di ditiotreitolo (DTT), 10 mM di EDTA) integrate con inibitori della proteasi (senza EDTA completo; Roche) e lisate mediante un disgregatore cellulare (Avestin). E-SYT2 è stato isolato con resina di glutatione separosio, lavato una volta con tampone di lisi integrato con Triton X-100 all'1% e due volte in tampone di lisi, tranne senza EDTA. Il tag GST è stato rimosso usando la proteasi di precisione e la proteasi marcata con hexahistidine è stata rimossa passando la soluzione proteica sulla resina Ni-NTA. La proteina è stata ulteriormente purificata mediante filtrazione su gel (Superdex 200; GE Healthcare), eluita in tampone contenente 20 mM Tris (pH 8, 0), 300 mM di NaCl e 5 mM di DTT, e concentrata a circa 8 mg ml −1 .

Per la purificazione da cellule di mammiferi, E-SYT2 umano (residui 163–634) è stato clonato in pCDNA 3.1 con un tag 3 × Flag N-terminal. Le cellule Expi293 sono state trasfettate per 3 giorni prima della raccolta. Le cellule sono state lisate in tampone (20 mM Tris pH 8, 0, NaCl 250 mM, EDTA 10 mM) integrato con inibitori della proteasi (senza EDTA completo; Roche) con il metodo del congelamento-scongelamento usando azoto liquido cinque volte. Le proteine ​​sono state purificate con resina M2 anti-bandiera (Sigma) ed eluite in tampone (20 mM Tris pH 8, 0, NaCl 250 mM) contenente 100 µg ml −1 peptide 3 × Flag. Ulteriore purificazione era mediante cromatografia di esclusione dimensionale, come descritto in precedenza.

Cristallizzazione, raccolta dei dati e determinazione della struttura

I cristalli di proteine ​​native sono stati coltivati ​​a temperatura ambiente con il metodo della goccia sospesa. Volumi uguali di soluzione proteica e liquore madre (1, 3 µl) sono stati miscelati e sospesi sul liquore madre (tampone di acido malonico 100 mM, imidazolo e acido borico (MIB) (Qiagen) a pH 4, 3, PEG 1500 12, 5%). I cristalli appartengono al gruppo spaziale P 2 1 2 1 2 1, con a = 74.3, b = 88.4, c = 167.2 Å. I cristalli sostituiti con selenometionina sono stati coltivati ​​in condizioni simili, tranne per il fatto che il liquore madre conteneva inoltre ioduro di sodio (100 mM MIB (Qiagen) a pH 4, 6, 14% PEG 1500, 0, 1 M NaI). I cristalli sono stati trasferiti al liquore madre integrato con glicole etilenico al 16%, montato su anello e congelato in azoto liquido. Per i cristalli sostituiti con selenio, i dati sono stati raccolti a due lunghezze d'onda scelte per massimizzare i segnali anomali di selenio e iodio. Tutti i dati sono stati raccolti sulla linea di luce NE-CAT 24-ID-C presso la sorgente di fotoni avanzati ed elaborati utilizzando XDS 25 . Le fasi sono state calcolate in Phenix 26 con il metodo di dispersione anomala a più lunghezze d'onda usando i dati dei cristalli sostituiti con selenio, e le mappe di densità degli elettroni sono state ulteriormente migliorate mediante appiattimento con solvente e doppia media non cristallografica. Abbiamo usato COOT 27 per la costruzione di modelli. Man mano che la costruzione del modello procedeva, abbiamo combinato iterativamente fasi calcolate da modelli parziali con fasi sperimentali per migliorare le mappe in regioni ancora non costruite. Il modello è stato perfezionato a 2, 44 Å rispetto ai dati provenienti da cristalli nativi utilizzando Phenix 26 . I primi round di perfezionamento sono stati effettuati utilizzando le opzioni di ricottura con minimi quadrati, spazio reale, fattore B individuale e angolo di torsione e sono stati alternati alla ricostruzione manuale in COOT 27 . Le molecole di detersivo e lipidico e le acque sono state modellate nelle fasi finali del raffinamento, per le quali abbiamo usato il minimo quadrato, il fattore B individuale e le opzioni di raffinamento TLS. Le figure sono state preparate utilizzando il software PyMol 28 . Il modello ha una buona geometria Ramachandran (il 96%, il 4% e lo 0, 1% dei residui si trovano rispettivamente nelle regioni consentite, generosamente ammesse e non autorizzate).

Analisi MS

Campioni di proteine ​​purificate sono stati dissalati con un dispositivo Vivaspin da 10.000 MWCO (GE Healthcare) per scambiare il tampone iniziale con acetato di ammonio 20 mM, pH 6, 8 e per eliminare eventualmente piccole molecole contaminanti presenti. Il campione è stato quindi direttamente infuso ad un flusso di 1 μl min −1 e una concentrazione di 0, 4 mg ml −1 in uno spettrometro di massa Agilent quadruplo a tempo di volo (QTOF) 6550 dotato di un sistema Agilent serie 1200. Analisi non denaturanti sono state eseguite in modalità a ioni positivi con tensione nanoelettrospray impostata a 1.400 V (Vcap), temperatura 280 ° C, flusso di gas di essiccazione 11 l min −1 e frammento 175 V. I campioni sono stati iniettati in 20 mM di acetato di ammonio, pH 6, 8 e spettri acquisiti con una frequenza di scansione di 1 spettri s −1 . I dati sono stati raccolti in un intervallo di massa di 1.000-10.000 m / z e deconvoluti utilizzando il software Bioconfirm (Agilent) e l'algoritmo di deconvoluzione di Entropia massima. La denaturazione della sclerosi multipla, per identificare i possibili ligandi e confermare la massa teorica di apo E-SYT2, è stata eseguita in modalità ioni positivi e negativi usando condizioni che potrebbero spezzare il complesso proteina-ligando (soluzioni acide ad alto vapore contenenti acido acetico al 5% in acetato di ammonio 20 mM). Le stesse condizioni acide furono usate anche per dissociare i dimeri nativi e per confermare che la loro presenza non era un artefatto strumentale. I dati sono stati acquisiti tra 100 e 1.000 m / z (sia in modalità positiva che negativa) per identificare i ligandi e tra 1.000 e 10.000 m / z (modalità positiva) per monitorare gli stati conformazionali delle proteine. L'identità strutturale dei ligandi è stata confermata dalla dissociazione indotta dalla collisione (CID) in modalità ioni positivi e negativi dopo la selezione di ioni precursori in modalità MS / MS e frammentazione con un valore di energia di collisione di 25 eV.

Per migliorare l'identificazione dei lipidi, è stato raccolto un estratto lipidico ottenuto mediante sonicazione (10 min) della proteina (4 μg) in 100 μl di metanolo (o cloroformio / metanolo per l'estrazione di lipidi neutri) dopo centrifugazione del campione e precipitazione proteica. Il campione è stato quindi risospeso nel solvente B (vedi più avanti) e analizzato mediante cromatografia liquida (LC) -MS / MS con lo stesso spettrometro di massa dotato di un sistema ChipLC e un chip HILIC (Amide 80, Agilent) per la separazione cromatografica del lipidi isolati. L'HPLC Agilent serie 1200 utilizzava una pompa capillare per l'iniezione del campione nella colonna Arricchimento e una pompa Nano per la separazione. Solventi utilizzati per HPLC HILIC: 50% acetonitrile in acqua contenente 25 mM di ammonio formiato pH 4.6 aggiustato con acido formico (solvente A), 95% acetonitrile contenente 25 mM di ammonio formiato pH 4.6 aggiustato con acido formico (solvente B). Gradiente LC usato: 100% B da 0 a 1, 5 min, 100% a 85% B da 1, 5 a 3 min, 85-80% B da 3 a 11, 5 min, 100% B da 11, 5 a 13, 5 min, 100% B da 13, 6 a 19 min. Lo spettrometro di massa Agilent 6550 QTOF era utilizzato in modalità ioni positivi e ioni negativi; la tensione dell'elettrospray è stata impostata a 1.580 V (Vcap), temperatura 185 ° C, gas di essiccazione 14 l min −1, tensione frammentatore 175 V. Lo strumento è stato utilizzato in modalità MS / MS automatica con una velocità di acquisizione MS di 2 spettri s −1 e velocità di acquisizione MS / MS di 4 spettri s −1 .

La quantificazione delle specie lipidiche rilasciate da E-SYT2 espressa in cellule di mammiferi è stata eseguita mediante LC-MS / MS (modalità MRM) dopo aver spigolato gli standard lipidici nel campione prima dell'estrazione e usando uno spettrometro di massa 6460 QQQ (Agilent), dotato di un Sistema cromatografico serie 1290. Standard lipidici: 1, 2-dimiristoil- sn -glicerero-3-fosfocolina (DMPC), 1, 2-dimiristoil -sn -glicero-3-fosfoetanolammina (DMPE), 1, 2-dimiristoil- sn -glicero-3-fosfo - l -serina (DMPS), 1, 2-dimiristoil- sn -glicerero-3-fosfo- (1′-rac-glicerolo) (DMPG), 1, 2-diesadecanoil- sn -glicerero-3-fosfato (DPPA), 1-eptadecanoil-2-idrossi- sn -glicero-3-fosfato (LPA), N -eptadecanoil-d-eritro-sfingosina (Cer) sono stati acquistati da lipidi polari Avanti, dioctanoil fosfatidilinositolo (PI) è stato acquistato da Echelon Biosciences. Le condizioni sperimentali e le transizioni monitorate per quantificare le specie lipidiche sono riportate insieme nei Metodi Supplementari.

Test di legame lipidico in vitro , caricamento lipidico

SMP-C2A – C2B con filtrazione su gel (19 µl a ∼ 2 mg ml −1 ) o C2A – C2B (a ∼ 3 mg ml −1 ) in 20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl e 5 mM DTT sono stati miscelati con 1 µl di NBD – PE 16: 0 a 1 mg ml −1 in metanolo. Il controllo lipidico era di 19 µl del tampone sopra con 1 µl di NBD – PE 16: 0. Sono stati incubati su ghiaccio per 1 ora e visualizzati su un gel PAGE nativo contenente DTT. La fluorescenza è stata visualizzata usando Imagequant LAS4000 e le proteine ​​tramite colorazione Coomassie. Solo il costrutto contenente SMP lega NBD-PE.

Saggio sulla concorrenza lipidica

La proteina precaricata NBD – PE è stata ottenuta incubando GST – SMP – C2A – C2B con NBD – PE come descritto in precedenza. Per separare E-SYT2 dall'eccesso di PE, GST – SMP – C2A – C2B è stato rimbalzato sulla resina di glutatione, lavato e rimosso mediante proteasi di precisione.

I lipidi sono stati essiccati sotto azoto e risospesi a 6, 4 mM in metanolo. La ceramide è stata riscaldata a 42 ° C per sciogliere il lipide. Lipid (1 µl) è stato aggiunto a SMP – C2A – C2B precaricato con NBD – PE (19 µl a ∼ 1 mg ml −1 ). I campioni sono stati incubati per 1 ora a temperatura ambiente, quindi visualizzati su gel nativi come descritto in precedenza. Le immagini su gel sono state quantificate usando imageJ 29 . Il segnale fluorescente è stato normalizzato alla quantità di proteine ​​in ciascuna corsia, valutata mediante colorazione di Coomassie.

Cambiare la storia

adesioni

Accessioni primarie

Banca di dati proteici

  • 1BP1)
  • 1BP1) vista 3d
  • 2DMG)
  • 2DMG) vista 3d
  • 4P42
  • 4P42 vista 3d

Depositi di dati

Coordinate e fattori strutturali sono stati depositati nella banca dati delle proteine ​​con il numero di adesione 4P42.

Dati estesi

Dati estesi

  1. 1.

    Analisi della struttura E-SYT2.

  2. 2.

    Legame di fosfolipidi mediante E-SYT2 espresso nei batteri.

  3. 3.

    Spettri di frammentazione MS / MS in modalità negativa di due glicerofosfolipidi rappresentativi abbondanti rilasciati da E-SYT2 espresso battericamente in condizioni di denaturazione della SM.

  4. 4.

    Spettri MS in modalità negativa di glicerofosfolipidi rilasciati da E-SYT2, espressi in cellule di mammiferi, in condizioni di denaturazione della SM.

  5. 5.

    Spettri di frammentazione MS / MS in modalità positiva e negativa di glicerofosfolipidi abbondanti rappresentativi rilasciati da E-SYT2 espressi in cellule di mammiferi, in condizioni di denaturazione della SM.

  6. 6.

    Spettri deconvoluti di E-SYT2.

  7. 7.

    Saggio sulla concorrenza lipidica.

Tabelle dati estese

  1. 1.

    Raccolta dati e statistiche di perfezionamento

  2. 2.

    I fosfolipidi presenti come ligandi in E-SYT2 purificati da E. coli e osservati dopo denaturazione della SM in modalità a ionizzazione negativa

  3. 3.

    Un approccio lipidomico quantitativo mirato basato su LC-MS / MS è stato utilizzato per quantificare le diverse specie lipidiche rilasciate da E-SYT2 dopo l'estrazione di solventi organici

Commenti

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