Tgfβ1 secreto dai fibroblasti associati al cancro induce la transizione epiteliale-mesenchimale delle cellule tumorali della vescica attraverso lncrna-zeb2nat | rapporti scientifici

Tgfβ1 secreto dai fibroblasti associati al cancro induce la transizione epiteliale-mesenchimale delle cellule tumorali della vescica attraverso lncrna-zeb2nat | rapporti scientifici

Anonim

Soggetti

  • Cancro alla vescica
  • Microambiente tumorale

Astratto

I pazienti con carcinoma della vescica urinaria (UBC) allo stadio invasivo muscolare hanno scarsi risultati clinici, a causa dell'elevata propensione alle metastasi. I fibroblasti associati al cancro (CAF), uno dei principali costituenti dello stroma tumorale, svolgono un ruolo importante nello sviluppo del tumore. Tuttavia, non è chiaro se i CAF indotti dall'UBC inducano l'invasione cellulare e quale sia la via di segnalazione. Qui, abbiamo scoperto che il mezzo condizionale da CAF UBC (CAF-CM) ha migliorato l'invasione delle cellule UBC. CAF-CM ha indotto la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) regolando i livelli di espressione dei marcatori associati a EMT nelle cellule UBC. Una maggiore concentrazione di TGFβ1 nel CAF-CM, confrontata con il CM del fibroblasto normale adiacente, ha portato alla fosforilazione di Smad2 nelle cellule UBC. Inoltre, l'inibizione della segnalazione TGFβ1 ha ridotto l'espressione genica associata a EMT e l'invasione delle cellule tumorali. È interessante notare che un lungo RNA non codificante, ZEB2NAT, si è dimostrato essenziale per questo processo dipendente dal TGFβ1. L'esaurimento di ZEB2NAT ha invertito l'EMT indotta da CAF-CM e l'invasione delle cellule tumorali, oltre a ridurre il livello di proteine ​​ZEB2. Coerentemente, l'espressione dell'mRNA di TGFβ1 è positivamente correlata con la trascrizione ZEB2NAT e i livelli di proteina ZEB2 nei campioni di carcinoma della vescica umana. I nostri dati hanno rivelato un nuovo meccanismo secondo cui i CAF inducono EMT e invasione di cellule umane UBC attraverso l'asse TGFβ1-ZEB2NAT-ZEB2.

introduzione

Il carcinoma della vescica urinaria (UBC) è uno dei tumori maligni più comuni in tutto il mondo, con 74.690 casi stimati negli Stati Uniti nel 2014 1 . La mortalità stimata del carcinoma della vescica è di 15.580 casi negli Stati Uniti, che non è cambiata molto negli ultimi dieci anni 1 . Esistono circa due carcinomi a cellule transizionali biologicamente diversi del carcinoma della vescica. Uno è il percorso papillare con la mutazione di H-Ras e FGFR3 e l'altro è il percorso invasivo muscolare con frequenti mutazioni di p53 e RB. Quest'ultimo è correlato a una prognosi sfavorevole. È importante sottolineare che circa il 15% dei pazienti con carcinoma della vescica papillare alla fine si svilupperà in tipo 2 invasivo muscolare. La transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) è frequentemente osservata nei fronti di invasione delle cellule tumorali neoplastiche a forma polarizzata, che è considerato uno dei principali fattori di rischio per la metastasi 3, 4, 5 . Tuttavia, pochi studi hanno chiarito in che modo le cellule tumorali della vescica con diverse caratteristiche biologiche sono state indotte a metastasi. Pertanto, è urgente comprendere appieno i meccanismi molecolari comuni alla base dello sviluppo del cancro della vescica.

L'inizio e la progressione del tumore sono complicati processi biologici, con molteplici mutazioni genetiche in modo graduale nelle cellule epiteliali 6 . Recentemente, è stato anche dimostrato che lo stroma tumorale influenza l'aggressività e la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali 7, 8, 9 . Il fibroblasto associato al cancro (CAF) è uno dei principali componenti dello stroma tumorale, che svolge un ruolo critico nella crescita tumorale e nell'angiogenesi 10 . Attraverso la secrezione di varie citochine, i CAF stimolano la crescita e l'invasività delle cellule tumorali. In linea con questo, i livelli di espressione dei marcatori CAF, come FSP1 e FAP, sono stati utilizzati per prevedere gli esiti clinici in più tipi di cancro 11 . Tuttavia, i meccanismi molecolari su come i CAF regolano l'aggressività delle cellule tumorali della vescica, in particolare il modo in cui i CAF regolano l'EMT nel carcinoma della vescica, non sono ben noti.

Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono un gruppo di RNA non codificanti con una lunghezza superiore a 200 nucleotidi. È stato dimostrato che sono coinvolti in vari processi biologici, incluso lo sviluppo del tumore 12. La regolazione degli lncRNA in risposta a stimoli extracellulari può aumentare la capacità di migrazione e invasione delle cellule tumorali. Recenti studi hanno anche dimostrato che lncRNA-ATB è indotto dal trattamento TGFβ1 a lungo termine, promuovendo la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del fegato 13 . Un altro lncRNA MALAT1, indotto dal TGFβ1, è sovraespresso nei campioni di UBC, essenziale per la metastasi delle cellule tumorali 14, 15 . Questi risultati supportano gli lncRNA poiché i giocatori essenziali mediano gli stimoli extracellulari e il comportamento delle cellule tumorali.

Attualmente, pochi studi si sono concentrati su se e come i CAF modulano l'aggressività delle cellule tumorali della vescica attraverso gli lncRNA. In questo studio, abbiamo studiato se i CAF inducono EMT e invasività delle cellule tumorali della vescica attraverso l'effetto paracrino. Abbiamo anche riferito che lncRNA-ZEB2NAT media l'invasione delle cellule tumorali della vescica, che è indotta dal TGFβ1. Infine, abbiamo esaminato le loro correlazioni cliniche nei campioni di cancro alla vescica umana.

risultati

Caratterizzazione di NF e CAF primari

I CAF e gli NF sono stati isolati da tre tessuti tumorali della vescica e da mucose vescicali normali adiacenti. Al fine di testare la purezza di CAF e NF, abbiamo esaminato biomarcatori di fibroblasti in queste cellule. Come mostrato in Fig. 1A e Suppl. Fig. 1A, livelli di espressione di mRNA di quattro geni specifici del CAF, tra cui la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP), la proteina 1 specifica dei fibroblasti (FSP1), l'actina del muscolo alfa-liscio (ACTA2) e il CD90, erano significativamente aumentati nei CAF, rispetto ai NF e UBC 5637 cellule (un controllo epiteliale delle cellule). Il saggio Western blot ha mostrato che: 1) marker di cellule epiteliali (E-caderina) è stato rilevato solo in 5637 cellule tumorali della vescica; 2) marcatore di cellule mesenchimali (Vimentin) era altamente espresso sia in NF che in CAF; e 3) il marker miofibroblasto (α-SMA) è stato sovraespresso solo nei CAF (Fig. 1B e Suppl. Fig. 1B). La colorazione immunocitochimica ha ulteriormente confermato che le popolazioni di fibroblasti in coltura primaria (NF e CAF) esprimono solo Vimentin, ma non E-Cadherin. L'espressione di α-SMA era maggiore nei CAF rispetto alle cellule NF e 5637 (Fig. 1C). Complessivamente, questi dati hanno indicato che abbiamo isolato con successo CAF con elevata purezza da campioni di cancro alla vescica.

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A : I livelli di espressione dell'mRNA di geni specifici del CAF, inclusi FAP, FSP1, ACTA2 e CD90, in 5637 cellule (un controllo delle cellule epiteliali), NF e CAF mediante qRT-PCR usando il gene della β-actina come controllo di normalizzazione. B : I livelli di espressione proteica di E-Cadherein, Vimentin e α-SMA in 5637 cellule, NF e CAF sono stati rilevati mediante immunoblotting. C : La colorazione di immunofluorescenza ha mostrato la posizione subcellulare e l'espressione di E-caderina, Vimentina e α-SMA in 5637 cellule, NF e CAF. Barra della scala, 10 μM.

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Il mezzo condizionale da CAF (CAF-CM) ha indotto la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali della vescica

Al fine di valutare se il CAF-CM può aumentare la motilità delle cellule tumorali della vescica, abbiamo trattato tre diverse cellule tumorali umane della vescica (5637, T24 e J82) con terreno di coltura, NF-CM e CAF-CM. Il trattamento con CAF-CM ha indotto sorprendentemente cambiamenti morfologici in tutte e tre le cellule tumorali, tra cui un minor numero di giunzioni cellulari, pseudopodi allungati in cellule sparse e forme più simili a quelle del fuso (Fig. 2A e Suppl. Fig. 1C, D). È stato eseguito un test di guarigione delle ferite per esaminare se i CM di CAF e NF potevano influenzare il tasso di migrazione cellulare. Come mostrato nella Figura 2B, C, NF-CM non ha avuto effetti significativi sul tempo di guarigione della ferita rispetto al mezzo di controllo. Tuttavia, il trattamento con CAF-CM ha accelerato notevolmente i tassi di migrazione cellulare, 3, 5 volte in 5637 cellule, 2, 0 volte in cellule T24 e 1, 5 volte in cellule J82, rispetto al mezzo di controllo (Fig. 2B, C). Il saggio Transwell è stato quindi utilizzato per valutare sia la migrazione cellulare sia l'invasione cellulare. CAF-CM ha aumentato la migrazione cellulare più di due volte in tutte e tre le cellule tumorali della vescica, il che è coerente con i risultati del test di guarigione della ferita (Fig. 2D, E). Inoltre, la stimolazione CAF-CM ha anche aumentato notevolmente il numero di cellule invase che si attaccano sulla camera inferiore (Fig. 2F, G, Suppl. Fig. 1E – H). Sopra tre diversi test hanno indicato che alcune molecole secrete dai CAF nel CAF-CM possono indurre la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali della vescica in modo paracrino.

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A : Caratteristiche morfologiche delle linee cellulari tumorali della vescica sotto terreno di coltura, rispettivamente NF-CM e CAF-CM. B, C : l'abilità di migrazione cellulare è stata misurata mediante un test di guarigione delle ferite. La percentuale relativa della chiusura della ferita è stata calcolata a 24 ore in 5637 cellule, 36 ore in cellule T27 e 18 ore in cellule J82, rispettivamente, prima che il completo si chiudesse. D - G : la migrazione cellulare ( D, E ) e l'invasione cellulare ( F, G ) sono state misurate dal test di migrazione / invasione cellulare Transwell. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

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EMT indotta da CAF-CM in tre linee cellulari UBC

È stato riportato che l'EMT è correlato all'invasione e alle metastasi delle cellule tumorali. Poiché sono stati osservati cambiamenti morfologici durante il trattamento con CAF-CM (Fig. 2A e Suppl. Fig. 1C, D), abbiamo studiato se questi cambiamenti di forma cellulare erano EMT testando i livelli di espressione dei geni associati a EMT. L'analisi Western blotting (Fig. 3A e Suppl. Fig. 1I) ha mostrato che in tre diverse linee cellulari di carcinoma epiteliale della vescica, il trattamento con tutti e tre i CAF-CM ha portato alla diminuzione dell'espressione di E-caderina (marcatore di cellule epiteliali) insieme a l'aumento di espressione di Vimentin (marcatore cellulare mesenchimale), ZEB1 e ZEB2 (fattore di trascrizione associato a EMT). RT-PCR quantitativa ha verificato che il gene CDH1, codificante per E-Cadherin, è stato soppresso a livello di mRNA; mentre due marcatori mesenchimali (vimentina e fibronectina) erano significativamente sovraregolati nelle cellule 5637, T24 e J82 trattate con CAF-CM (Fig. 3B). Inoltre, anche i geni MMP-2 e -9 correlati all'invasione sono aumentati nel gruppo di trattamento CAF-CM (Fig. 3C). Inoltre, i livelli di mRNA dei fattori di trascrizione che regolano EMT, come SNAI1, SNAI2, TWIST1, ZEB1 e ZEB2, sono stati anche analizzati mediante RT-PCR quantitativa (Fig. 3D). Sovraespressione di trascrizioni SNAI1 e ZEB1 sono state rilevate in tutte e tre le linee cellulari tumorali della vescica stimolate con CAF-CM. Questi dati implicavano che l'EMT rappresentava un potenziale meccanismo per la migrazione e l'invasione cellulare indotto da CAF-CM.

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A : I livelli di espressione proteica di E-caderina, Vimentin, ZEB1 e ZEB2 nelle linee cellulari di carcinoma della vescica trattate CAF-CM mediante immunoblotting. La proteina β-actina è stata usata come controllo del carico. B : I livelli di espressione mRNA di marker epiteliali (CDH1, codifica E-Cadherin), marker mesenchimali (VIM e FN1) ( B ) marker di invasione (MMP2 e MMP9) ( C ) e fattori di trascrizione associati a EMT ( D ) nel CAF -CM ha trattato le linee cellulari tumorali della vescica mediante qRT-PCR usando il gene β-actina come controllo di normalizzazione. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

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Effetto paracrino di TGFβ1 in CAF-CM

Al fine di identificare quali citochine secernenti CAF possono indurre EMT e invasione di cellule tumorali della vescica, abbiamo confrontato i livelli di mRNA TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 in NF rispetto a CAF e abbiamo scoperto che TGFβ1 era la citochina più espressa in CAF rispetto a NF (Suppl. Fig. 2). Abbiamo anche esaminato il CAF-CM, NF-CM e il mezzo di condizione da 5637 cellule (CTRL) usando un ELISA citochinico e nel CAF-CM (328, 8 pg / ml) sono stati rilevati livelli più alti di TGFβ1 rispetto a quelli nell'NF-CM ( 116, 9 pg / ml) e CTRL (12, 6 pg / ml; Fig. 4A). I dati ELISA hanno anche confermato una maggiore quantità di TGFβ1 in CM da altri due CAF, rispetto a quella nei loro NF-CM (Suppl. Fig. 3A). qRT-PCR ha anche confermato che le trascrizioni dell'mRNA TGFβ1 erano le più abbondanti nei CAF, rispettivamente circa 2, 7, 7, 7, 22, 6 e 4, 3 volte la quantità in NF, 5637, T24 e J82 (Fig. 4B). Sono stati ulteriormente testati gli obiettivi a valle della segnalazione TGFβ1 in tre linee di cellule tumorali della vescica sotto stimolazione CAF-CM. Il saggio Western Blot ha mostrato che Smad2 era fosforilato ma l'espressione totale di Smad2 è rimasta invariata (Fig. 4C), indicando l'attivazione della segnalazione canonica TGFβ sotto il trattamento CAF-CM.

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A : TGFβ1 in mezzi condizionati secreti da 5637 (CTRL), cellule NF e CAF sono stati quantificati da ELISA. B : I livelli di espressione di mRNA di TGFβ1 in CAF, NF e tre linee cellulari di carcinoma della vescica mediante qRT-PCR usando il gene β-actina come controllo di normalizzazione. C : Espressione di Smad2 fosforilato e proteina Smad2 totale nelle linee cellulari di carcinoma della vescica trattate con CAF-CM mediante immunoblotting. La proteina β-actina è stata usata come controllo del carico. D : I livelli di espressione di TGFβ1 e TGFβRII nelle linee cellulari di cancro alla vescica coltivate con CAF-CM sono stati rilevati da qRT-PCR usando il gene β-actina come controllo di normalizzazione. *** P <0, 001.

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Per dimostrare l'attivazione della segnalazione TGFβ nelle cellule epiteliali del carcinoma della vescica è innescato principalmente dal TGFβ1 secreto dai CAF (attivazione paracrina), dai livelli di espressione di TGFβ1 e TGFβRII nelle cellule 5637, T24 e J82, con e senza trattamento CAF-CM, sono stati valutati da qRT-PCR. Come mostrato nella Fig. 4D, né l'espressione TGFβ1 né TGFβRII è stata modificata in modo significativo nel gruppo di trattamento CAF-CM, il che implica che l'attivazione della segnalazione TGFβ indotta da CAF-CM non era dovuta a meccanismi autocrini o paracrini inversi.

L'attivazione paracrina di TGFβ1 da parte di CAF-CM è stata ulteriormente confermata dai test di blocco TGFβ1 utilizzando un anticorpo TGFβ1 neutralizzante o un inibitore TGFβRI a piccole molecole (SB-431542). La Western blotting ha mostrato sia l'abrogazione del legame TGFβ1 con il suo recettore cognato (Fig. 5A) sia l'inibizione della via di segnalazione TGFβ (Fig. 5B) hanno soppresso l'espressione di Vimentin indotta da CAF-CM e hanno aumentato leggermente l'espressione di E-Cadherin nel 5637 e J82 le cellule. I risultati sono stati confermati in altre due coppie di CAF / NF, quando il blocco del TGFβ1 è stato segnalato da SB-431542 (Suppl. Fig. 3B, C). Coerentemente, l'anticorpo neutralizzante TGFβ1 o SB-431542 ha soppresso gli effetti CAF-CM sull'espressione dei geni associati a EMT, tra cui Vimentin (VIM), Fibronectin (FN1), SNAI1, ZEB1 e ZEB2, a livello di mRNA (Fig. 5C, D ). Inoltre, la migrazione cellulare indotta da CAF-CM (Fig. 5E) e l'invasione (Fig. 5F) potrebbero anche essere inibite dall'anticorpo neutralizzante TGFβ1 nelle cellule 5637, T24 e J82. Gli effetti inibitori sull'invasività sono stati confermati anche in altre due coppie di CAF / NF, quando il blocco della segnalazione TGFβ1 da parte di SB-431542 (Suppl. Fig. 3D – G). Inoltre, il trattamento di tre linee cellulari UBC con TGFβ1 per 48 ore ha indotto l'invasione delle cellule tumorali (Suppl. Fig. 4A, B) e livelli proteici associati a EMT (Suppl. Fig. 4C), indicando che TGFβ1 da solo è sufficiente per indurre EMT in Linee cellulari UBC testate.

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A, B : I livelli proteici di E-caderina e Vimentina nelle cellule CAF-CM trattate 5637 e J82 su cellule bloccando un anticorpo neutralizzante ( A ) o un inibitore TGFβR1, SB-431542, ( B ) mediante immunoblotting. C, D : i livelli di mRNA dei marcatori mesenchimali e dei fattori di trascrizione associati a EMT nelle cellule 5637 e J82 trattate con CAF-CM sul blocco di un anticorpo neutralizzante ( C ) o di un inibitore TGFβR1 (SB-431542) ( D ) da qRT -PCR. La migrazione cellulare ( E ) e la capacità di invasione ( F ) nelle cellule 5637, T24 e J82 trattate dal CAF-CM al blocco di un anticorpo neutralizzante mediante il test di migrazione / invasione delle cellule di Transwell. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

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TGFβ1 nell'invasione cellulare indotta da CAF-CM parzialmente attraverso un aumento dell'asse del fattore di trascrizione ZEB2NAT lncRNA-ZEB2 nelle cellule tumorali della vescica

Evidenze cumulative supportano il fatto che gli lncRNA siano coinvolti in più fasi dello sviluppo del cancro. Per analizzare il modo in cui CAF-CM regola gli lncRNA, insieme ai geni associati all'EMT, abbiamo eseguito un array di PCR per esaminare 72 lncRNA correlati al cancro (Suppl. Fig. 5A). Abbiamo convalidato l'array PCR di lncRNA in diverse linee cellulari e per ciascun set di primer è stato osservato un solo prodotto RT-PCR (Suppl. Fig. 5B). Up-regolazione di 3 lncRNA e down-regolazione di 6 lncRNA mediante variazione di 1, 5 volte sono state identificate in entrambe le cellule 5637 e J82 trattate con CAF-CM (Fig. 6A; Tabella supplementare S1). In particolare, ZEB2NAT, una trascrizione antisenso naturale al gene ZEB2, era tra gli lncRNA correlati. Per verificare se ZEB2NAT è regolato da TGFβ1 in CAF-CM, abbiamo usato l'anticorpo TGFβ1 neutralizzante (Fig. 6B) e l'inibitore SB-431542 (Fig. 6C) per bloccare la segnalazione di TGFβ1 e abbiamo scoperto che entrambi i trattamenti hanno diminuito il CAF-CM indotto Espressione ZEB2NAT nelle celle 5637 e J82. Gli effetti inibitori sull'espressione di ZEB2NAT indotta da CAF-CM sono stati confermati anche in altre due coppie di CAF / NF, quando il blocco della segnalazione TGFβ1 da parte di SB-431542 (Suppl. Fig. 3H, I). Coerentemente, il trattamento del TGF β1 induce la trascrizione di ZEB2NAT in entrambe queste due cellule UBC (Suppl. Fig. 4D). La sovraespressione di ZEB2NAT è stata quindi stabilita in 5637 cellule (Fig. 6D). L'espressione forzata di ZEB2NAT ha indotto l'invasione delle cellule UBC di circa 1, 5 volte, confrontando le cellule vuote trasfettate da vettori (vettore) (Fig. 6E, F). Inoltre, la sovraespressione di ZEB2NAT ha aumentato leggermente la proteina ZEB2 e ha represso i livelli di proteina E-caderina, senza modificare il livello di proteina ZEB1 (Fig. 6G). Inoltre, per esaminare se ZEB2NAT è coinvolto nell'EMT indotta da CAF-CM e nell'invasione cellulare, d'altra parte, l'interferenza dell'RNA, che coinvolge due siRNA rivolti a regioni diverse, è stata impiegata per abbattere l'espressione di ZEB2NAT. L'efficienza knockdown è stata raggiunta più del 65% di uno dei due RNA di siZEB2NAT (Fig. 6H). Il saggio di invasione di Transwell ha rivelato che l'esaurimento di ZEB2NAT ha ridotto significativamente l'invasione cellulare indotta da CAF-CM (Fig. 6IJ). I dati di western blot hanno inoltre dimostrato che i livelli di proteina ZEB2 erano ridotti in due gruppi knockdown di ZEB2NAT, mentre i livelli di proteina E-Cadherin erano aumentati (Fig. 6K).

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A : Riepilogo dell'espressione alterata di lncRNA nelle cellule 5637 e J82 trattate con CAF-CM, rispetto a quelle trattate con NF-CM. 1, 5 volte del livello di mRNA relativo usando qRT-PCR, normalizzato dal gene β-actina, è stato usato come soglia per cambiamenti significativi. B e C : livelli di espressione di ZEB2NAT nelle cellule 5637 e J82 trattate con CAF-CM sui trattamenti di un anticorpo neutralizzante TGFβ1 ( B ) e di un inibitore TGFβRI (SB-431542) ( C ), rispettivamente. D : Espressione esogena di lncRNA di ZEB2NAT in 5637 cellule, rilevata da qRT-PCR usando il gene β-actina come controllo di normalizzazione. E - G : Effetti della sovraespressione di lncRNA di ZEB2NAT sull'invasione cellulare mediante il test di invasione di Transwell ( E, F ) e livelli proteici di E-caderina, ZEB1 e ZEB2 mediante immunoblotting ( G ) in 5637 cellule. H: Knockdown di ZEB2NAT da parte di RNAi utilizzando due siRNA destinati a diverse regioni dell'ncncNA (siZEB2NAT-1 e siZEB2NAT-2) in 5637 cellule. I livelli di espressione ZEB2NAT relativi erano a 48 ore dopo la trasfezione di siRNA e determinati da qRT-PCR usando il gene della β-actina come controllo di normalizzazione. I, J, K : Effetti del lncRNA degli ZEB2NAT che abbattono sull'invasione cellulare dal saggio di invasione Transwell ( I, J ) e sui livelli proteici di E-caderina e ZEB2 mediante immunoblotting ( K ) nelle 5637 cellule trattate con CAF-CM. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

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Correlazione positiva di TGFβ1, ZEB2 e ZEB2NAT in campioni UBC

Le correlazioni tra TGFβ1, ZEB2 e ZEB2NAT sono state studiate in 30 campioni UBC umani. RT-PCR quantitativa ha rivelato che ZEB2NAT e TGFβ1 sono significativamente aumentati di 1, 5 volte ( P = 0, 010) e 1, 4 volte ( P = 0, 001) nei campioni UBC umani, rispettivamente (Fig. 7A, B). I dati di western blot hanno anche dimostrato che il livello di proteine ​​ZEB2 è aumentato significativamente in 26 campioni UBC umani su 30 (Fig. 7C). È interessante notare che abbiamo osservato i significativi livelli aumentati di mRNA TGFβ1 (2, 3 volte, P = 0, 019), trascrizione ZEB2NAT (2, 12 volte, P = 0, 026) e proteina ZEB2 (1, 45 volte, P = 0, 012) nel gruppo invasivo muscolare (MI), rispetto al gruppo invasivo non muscolare (NMI; Suppl Fig. 6). Le correlazioni tra i livelli di mRNA di ZEB2NAT e TGFβ1 mediante saggio qRT-PCR più i livelli di proteina ZEB2 mediante saggio Western blot sono state anche analizzate dall'analisi di correlazione di Pearson. Il livello di mRNA di ZEB2NAT era altamente correlato con il livello di mRNA di TGFβ1 (r = 0, 521, P = 0, 003, Fig. 7D) e livello di proteina ZEB2 (r = 0, 692, P <0, 001, Fig. 7E). Il livello di mRNA di TGFβ1 è anche associato al livello di proteina ZEB2 (r = 0, 497, P = 0, 005, Fig. 7F). Questi dati indicano l'elevata incidenza di attivazione dell'asse TGFβ1-ZEB2NAT-ZEB2 nei pazienti con carcinoma della vescica umana, offrendo elevate capacità di migrazione e invasione alle cellule tumorali della vescica.

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I livelli di espressione delle trascrizioni ZEB2NAT ( A ) e TGFβ1 ( B ) e della proteina ZEB2 ( C ) in 30 tessuti di carcinoma della vescica umana (tumore o T) e dei tessuti normali accoppiati (normali o N) dello stesso paziente. I livelli relativi di mRNA di ZEB2NAT e TGFβ1 sono stati valutati mediante qRT-PCR e normalizzati dal gene β-actina. D - F : Le correlazioni tra ZEB2NAT, TGFβ1 e ZEB2 sono state decise dall'analisi di correlazione di Pearson. I valori di ΔCT in qRT-PCR sono stati usati come livelli di espressione delle trascrizioni ZEB2NAT e TGFβ1. Le bande proteiche ZEB2 su Western blot sono state quantificate dal software Image J. P <0, 05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Discussione

Evidenze emergenti confermano che lo stroma tumorale è attivamente coinvolto nello sviluppo del cancro 16 . I CAF sono una delle cellule più abbondanti nello stroma tumorale, fornendo un microambiente di supporto per e inducono comportamenti più aggressivi delle cellule tumorali 17, 18, 19, 20 . I pazienti con MIBC di solito hanno una prognosi sfavorevole, con elevata propensione alla metastasi 21, 22 . In questo studio, abbiamo confermato che i CAF allo stadio MIBC hanno caratteristiche tipiche dei miofibroblasti, con l'espressione di α-SMA, FAP, FSP e CD90 23, 24, mentre livelli di espressione molto bassi o non rilevabili negli NF. Siamo i primi a dimostrare che i CAF del paziente MIBC inducono la migrazione e l'invasione di tre cellule tumorali della vescica con caratteristiche diverse. CAF-CM può indurre in modo prominente EMT nelle cellule tumorali della vescica simili all'epitelio (5637 e T24) o promuovere EMT nelle cellule tumorali della vescica simil-mesenchimali (J82), indicando che esistono effetti paracrini sulle cellule tumorali della vescica. Gli effetti di supporto del tumore dei CAF sono stati identificati anche in diversi tipi di cancro, come carcinoma mammario, carcinoma prostatico e carcinoma gastrico 25, 26, 27 . Nel loro insieme, l'induzione di EMT nelle cellule tumorali da parte dei CAF nello stroma tumorale è un meccanismo comune alla base dell'acquisizione del potenziale metastatico delle cellule tumorali.

I CAF nelle regioni tumorali non solo sono in grado di supportare la crescita delle cellule tumorali, ma anche di promuovere l'invasione e le metastasi attraverso la secrezione di citochine e mediatori infiammatori. Ad esempio, uPA secreto dai CAF come attivatore di proteasi degradanti la matrice può scindere i pro-MMP per sovraregolare l'attività degli MMP, che contribuisce all'angiogenesi e alla metastasi 28, 29 . Oltre a rimodellare l'ECM, i CAF secernono anche varie citochine, come FSP1 e fattore di crescita degli epatociti, per indurre metastasi tumorali, che non si trovano nei normali fibroblasti 30, 31 . Nel carcinoma ovarico, la downregulation di miR-214 nei CAF porta ad aumentare la produzione e la secrezione di chemiochine CCL5 nel microambiente tumorale 32 . Nel nostro studio, abbiamo scoperto che i CAF esprimono e secernono TGFβ1 a un livello superiore rispetto a NF. TGFβ1 secreto induce EMT e invasione di cellule tumorali in tutte e tre le linee cellulari tumorali della vescica. In particolare, il trattamento dell'inibitore neutralizzante di TGFβ1 o TGFβR1, SB431542 ha invertito l'invasione di cellule tumorali indotta da CAF-CM e EMT. Non abbiamo trovato l'induzione dell'espressione di TGFβ1 o TGFβR1 nelle cellule tumorali sotto trattamento CAF-CM, supportando ulteriormente l'idea che TGFβ1 secreto dai CAF è un fattore importante per indurre l'invasione delle cellule tumorali della vescica.

TGFβ1 è un fattore di promozione del cancro per la progressione del cancro, che regola una batteria di geni bersaglio coinvolti in EMT e metastasi 33, 34 . Nel nostro studio, CAF-CM ha attivato la via di segnalazione canonica TGFβ attraverso Smad2 fosforilante in 5637 e cellule J82. Inoltre, anche i fattori di trascrizione associati a EMT, come Snail e ZEB2, sono stati indotti nel gruppo di trattamento CAF-CM, mentre i loro livelli di espressione sono stati abrogati a vari gradi mediante pretrattamento con anticorpo neutralizzante TGFβ1 o inibitore TGFβR1.

Oltre ai geni codificanti, gli lncRNA, mostrati come una nuova dimensione per i processi biologici 35, 36, 37, possono anche essere regolati dal TGFβ1. I nostri dati identificati con successo tre lncRNA (lncRNA-ATB, SPRY4-IT1 e ZEB2NAT) sono stati sovraregolati in entrambe le due linee cellulari UBC, 5637 e J82. LncRNA-ATB è stato identificato come trascrizione sovraespressa nelle cellule tumorali epatiche con trattamento TGFβ1 a lungo termine. La sovraespressione di lncRNA-ATB promuove la metastasi delle cellule tumorali epatiche inducendo EMT e invasione. Meccanicamente, lncRNA-ATB induce ZEB1 e ZEB2 attraverso un legame competitivo con e bloccando la funzione della famiglia miR-200. In concomitanza, induce anche l'espressione di IL11, innescando la segnalazione STAT3 38 . Un altro lncRNA, SPRY4-IT1, è stato implicato nel melanoma, nel carcinoma esofageo a cellule squamose e nella progressione del carcinoma renale 39, 40 . La sovraespressione di SPRY4-IT1 promuove la proliferazione e l'invasione delle cellule di melanoma, almeno attraverso la regolazione della lipogenesi 41 . Pertanto, utilizzando il microarray PCR, abbiamo identificato con successo gli lncRNA correlati all'invasione delle cellule tumorali.

ZEB2, uno dei principali fattori di trascrizione coinvolti nell'EMT, reprime direttamente l'E-caderina durante l'EMT 42 . I nostri dati hanno mostrato che CAF-CM induce ZEB2 nelle cellule 5637 e J82 a livello di mRNA (Fig. 3D) e proteine ​​(Fig. 3A). Tuttavia, nelle cellule T24 l'induzione di ZEB2 non è significativa a livello di mRNA (Fig. 3D), mentre il livello di proteina ZEB2 è indotto da CAF-CM, suggerendo che la regolazione di ZEB2 nelle cellule T24 potrebbe avvenire attraverso un approccio indipendente dalla trascrizione ( Fig. 3D). Gli RNA non codificanti sono stati implicati nella regolazione post-trascrizionale. Pertanto, selezionando 72 lncRNA, abbiamo scoperto che lncRNA ZEB2NAT è sovraregolato dal CAF-CM, mentre tale upregolazione è abrogata dal pretrattamento del neutralizzante anticorpo TGFβ1 o inibitore TGFβR1, indicando che ZEB2NAT è regolato da TGFβ1. ZEB2NAT è una trascrizione antisenso naturale conservata corrispondente al 5′UTR di ZEB2 42 . La regolazione di ZEB2 da parte di ZEB2NAT è attraverso la prevenzione del trattamento di un introne di grandi dimensioni situato in ZEB2 5′UTR, con il risultato di mantenere un sito interno di ingresso ribosomiale (IRES) per la traduzione della proteina 43 ZEB2. In uno studio, il knockdown di ZEB2NAT ha invertito il livello della proteina ZEB2 indotta da CAF-CM e inibisce parzialmente l'invasione delle cellule tumorali indotta da CAF-CM, indicando che ZEB2NAT è uno dei componenti a valle TGFβ1 essenziali coinvolti nell'EMT e nell'invasione delle cellule tumorali. Complessivamente, esistono almeno due meccanismi regolatori per regolare l'espressione di ZEB2: uno è a livello trascrizionale e l'altro a livello post-trascrizionale da lncRNA ZEB2NAT. L'associazione clinica di TGFβ1, trascrizioni ZEB2NAT e proteina ZEB2 è stata ulteriormente confermata in 17 campioni di carcinoma della vescica umana.

Dato che l'upregolazione dei fattori di trascrizione associati a EMT ( ad es . SNAIL e ZEB2) e lncRNA associati a EMT (lncRNA-ATB e ZEB2NAT) da parte di CAF-CM, CAF-CM induce una riprogrammazione EMT completa nelle cellule tumorali della vescica a più livelli. Coerentemente, la sovraespressione dei livelli di ZEB2 e di proteine ​​della lumaca è associata negativamente al carcinoma della vescica e prevede uno scarso esito clinico 43, 44, 45, 46 . Nel loro insieme, questi dati indicano inoltre che TGFβ1 induce EMT e invasione attraverso un complicato meccanismo regolatorio a più livelli. Inoltre, il targeting del percorso TGFβ1 può essere utile per la terapia UBC, specialmente per i pazienti MIBC.

Materiali e metodi

Linee cellulari, trasfezione e campioni umani

Le linee cellulari di carcinoma della vescica umana, T24, 5637 e J82 sono state ottenute dalla Collezione di colture di banche cellulari di tipo, Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina). Le cellule sono state mantenute in RPMI1640 integrate con FBS al 10%, 100 unità / ml di penicillina e 100 μg / ml di streptomicina a 37 ° C. Le cellule tumorali della vescica sono state trattate con CM di NF e CAF, nonché un volume uguale di terreno di coltura completo. 50 μg / ml di anticorpo bloccante TGFβ1 (R&D Systems, MAB240, Minneapolis, MN, USA) sono stati aggiunti ai media per neutralizzare TGFβ1, mentre 20 nM SB431542 (Selleckchem, S1067, Boston, MA, USA) è stato aggiunto 1 ora prima della condizione trattamento medio per bloccare la segnalazione del TGFβ nelle cellule tumorali della vescica. Le cellule UBC sono state anche trattate con 2 nM TGF β1 per 48 ore. Per l'interferenza dell'RNA, due siRNA (Genepharma, Shanghai, Cina) destinati a ZEB2NAT (5′-CAGAAAUGGUGAGAAGAAAtt-3 ′ e 5′-GAACAGUUUGGCCAGAAAtt-3 ′), nonché controllo negativo (5′-UUCUCCGAACGUGUCACG) nelle cellule usando il reagente Lipofectamine® 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), rispettivamente secondo le istruzioni del produttore. Per la sovraespressione genica, il plasmide di espressione ZEB2NAT è stato costruito nel vettore pcDNA3.1 (Invitrogen) utilizzando i primer PCR: Forward: 5′-GGGGTACCCTCAATAAAACTTTTCCTGGGCT-3 ′ e Reverse: 5′-TGCTCTAGAACAAAGATAGGTG. Sia i vettori vuoti che i plasmidi sovraespressi ZEB2NAT sono stati trasfettati in cellule usando Lipofectamine® 3000. L'mRNA e le proteine ​​sono state raccolte 48 ore dopo la trasfezione.

Campioni di cancro alla vescica umana e tessuti normali adiacenti, che sono a 3 cm di distanza dalle lesioni del cancro, sono stati ottenuti dall'ospedale Drum Tower affiliato all'Università di Nanchino. I protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico del Drum Tower Hospital per la raccolta dei campioni di tessuto e il consenso informato è stato ottenuto da tutte le materie. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate. I pazienti con carcinoma della vescica non avevano trattato con radioterapia o chemioterapia prima dell'intervento. Il campione di cancro alla vescica utilizzato per l'isolamento dei fibroblasti stromali è stato diagnosticato come carcinoma della vescica invasivo muscolare con grado istologico II. La colorazione H&E e la colorazione immunoistochimica per E-Cadherin e α-SMA hanno confermato che i CAF circondavano i nidi tumorali. I campioni freschi sono stati tagliati in piccoli pezzi e digeriti con 160 μg / ml di collagenasi I (Sigma, C9891, St. Louis, MO, USA) e 25 μg / ml di ialuronidasi (Sigma, H4272) a 37 ° C per 2 ore. La miscela è stata filtrata attraverso il filtro (BD Biosciences, San Jose, California, USA). Quindi le cellule sono state raccolte e coltivate in DMEM / F12 integrato con FBS al 10%, 100 unità / ml di penicillina e 100 μg / ml di streptomicina. Dopo 2-3 passaggi, si formò un monostrato confluente e omogeneo di fibroblasti stromali. Per preparare un mezzo condizionato di CAF e NF in coltura, i fibroblasti normali e i fibroblasti associati al cancro sono stati coltivati ​​per 48 ore e quindi il mezzo è stato raccolto e centrifugato per 10 minuti a 3.000 giri / min per rimuovere i detriti cellulari. Tutti i fibroblasti utilizzati negli esperimenti erano a meno di 10 passaggi.

Test di guarigione delle ferite

Le cellule sono state seminate in piastre da 6 pozzetti con 5 × 10 5 cellule per pozzetto e coltivate con mezzi diversi. Quindi, è stata fatta una ferita usando una punta di pipetta da 100 μl sul monostrato cellulare e sono state scattate fotografie al momento opportuno per stimare l'area occupata dalle cellule migratorie.

Test di transwell

Transwell (Costar, New York, NY, USA) sono stati usati per valutare le capacità di invasione e migrazione delle cellule UBC in vitro . Dopo il trattamento con media diversi, 1 × 10 5 cellule in 500 μl di terreno privo di siero sono state inoculate nella camera superiore, rivestite con (test di invasione) o senza (test di migrazione) il fattore di crescita ha ridotto Matrigel® e il terreno contenente FBS al 10% era aggiunto nella camera inferiore come chemioattrattore. Dopo l'incubazione per il tempo appropriato, le cellule sulla superficie superiore della membrana sono state rimosse pulendo con Q-tip, e le cellule invase sono state fissate con formaldeide e colorate con 0, 5% di violetto cristallino (Sigma). Il numero di cellule invase e migrate è stato contato al microscopio in cinque campi randomizzati ad alta potenza.

Isolamento di RNA e PCR quantitativa di trascrizione quantitativa inversa (qRT-PCR)

Total RNAs were extracted using TRIzol® (Invitrogen, 15596018) as manufactures' instruction. Reverse transcription was conducted by using random primers in Takara system (Dalian, China). The expression of relative genes were measured by qRT-PCR using SYBR Green in an ABI 7500 StepOne Plus Real Time PCR instrument (Applied Biosystem, USA). The expression of target genes were calculated based on the cycle threshold (Ct) values comparative with a reference geneusing formula 2 −ΔΔCt . La β-actina è stata usata come controllo interno. qRT-PCR was performed in triplicate for each sample in a 10 μl reaction mixture, which was consisted of template cDNA (0.2 μl), primers (0.4 μl, l.0 M), ROX Reference Dye II (0.2 μl), dH 2 O (4.2 μl) and SYBR Premix Ex Taq (5 μl, SYBR® Premix Ex Taq Kit, Takara). Primer sequences used in our study were listed in Supplementary Table S2. As for lncRNA profiling, we used Human lncRNA Discover PCR array/TGFβ pathway (Bio-Serve Company, BS-lncRNA002, Shanghai, China), which consisting of 72 lncRNAs, derived from the lncRNA database (www.lncRNAdb.org) and several positive genes which are regulated by TGFβ, such as Vimentin. Total RNA was isolated from J82 and 5637 cells treated with and without CAF-CM for 48 h, respectively. The values were normalized by the β-actin, which was the internal control. ΔΔCt values (with CAF-CM versus without CAF-CM) were used as fold changes.

immunoblotting

Cells were lyzed in RIPA buffer containing phosphatase inhibitor cocktail I (Sigma) and protease inhibitor cocktail mini-tablet (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). The proteins in the lysates (20 μg) were separated by SDS-PAGE and transferred onto polyvinylidenedifluoride (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA, USA). After blocking with 5% non-fat milk in PBST, the primary antibodies for E-cadherin (Bioworld Technology, BS1098, Louis Park, MN, USA), Vimentin (Proteintech Group, 10366-1-AP, Chicago, IL, USA), α-SMA (DAKO, M0851, Copenhagen, Denmark), ZEB1 (ProteinTech, 21544-1-AP), ZEB2 (Santa Cruz Biotechnology, sc-271984, Santa Cruz, CA, USA), p-Smad2 (Phospho-Ser467, Signalway Antibody, 11322, College Park, MA, USA), Smad2 (Bioworld Technology, AP0444) and β-actin (AbMax, 05–0079, Beijing, China) were used. The membranes were then washed with PBST three times and incubated with horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody. The Western blots were visualized using the enhanced chemiluminescence reagents (Millipore, WBKLS0100). Western blots were semi-quantified by Image J software (NIH, USA).

immunofluorescenza

Cells were seeded on the coverslips in 24-well plates and cultured for proper cell density. After fixing by 4% paraformaldehyde for 15 min, cells were washed with PBS, and then blocked with 5% BSA in PBS for 60 min. Primary antibodies targeting E-cadherin (Bioworld Technology), Vimentin (Proteintech) and α-SMA (DAKO) were used overnight at 4 °C. The cells were than washed with PBS and incubated with fluorescein isothiocyanate or phycoerythrin-conjugated secondary antibodies (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). DAPI (BBI, D6584, Cambridge, MA, USA) was used for counterstaining. The images were captured by a fluorescence microscope (Olympus DP72, Japan).

ELISA assay

The concentrations of TGFβ1 in different media were measured using human TGFβ1 ELISA kit (BOSTER, EK0513, Wuhan, China), according to the manufacturer's instructions. Briefly, after incubation with media for 90 min at 37 °C, the plates were tapped dry and 100 μl biotin labeling TGFβ1 antibody were added for 60 min at 37 °C. The plates were then washed three times using TBS and 100 μl avidin-biotin-pcroxidasecomplex (ABC) were added. Following incubation on an orbital shaker for 30 min at 37 °C, plates were washed by TBS five times and tetramethylbenzidine (TMB) color-substrate solution was added to each well. After incubation in the dark for 30 min at 37 °C, 100 μl TMB stop buffer was used to stop reaction. Then, the plates were read at 450 nm on a tunable microplate reader (Versa Max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

analisi statistica

Data are presented as mean ± standard deviation (SD) from three independent experiments unless special notification. Paired t test was used to analyze the difference of ZEB2NAT level between cancer tissues and corresponding normal tissues. Other differences between two groups were analyzed using Student's t test. Un valore P inferiore a 0, 05 è stato considerato statisticamente significativo.

Informazioni aggiuntive

How to cite this article : Zhuang, J. et al. TGFβ1 secreted by cancer-associated fibroblasts induces epithelial-mesenchymal transition of bladder cancer cells through lncRNA-ZEB2NAT. Sci. Rep. 5, 11924; doi: 10.1038/srep11924 (2015).

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