Dirottamento virale delle caspasi ospiti: una categoria emergente di interazioni patogeno-ospite | morte cellulare e differenziazione

Dirottamento virale delle caspasi ospiti: una categoria emergente di interazioni patogeno-ospite | morte cellulare e differenziazione

Anonim

Soggetti

  • Malattie infettive
  • proteolisi

Astratto

I virus si evolvono insieme ai loro ospiti e molti virus hanno sviluppato meccanismi per sopprimere o modificare la risposta apoptotica della cellula ospite a proprio vantaggio. Recentemente, sono emerse prove per la strategia opposta. Alcuni virus hanno sviluppato la capacità di cooptare l'attività della caspasi apoptotica per facilitare la propria proliferazione. In queste strategie, le proteine ​​virali vengono scisse dalle caspasi ospiti per creare prodotti di scissione con nuove attività che facilitano la replicazione virale. Ciò rappresenta una nuova e interessante classe di interazioni virale-ospite e rappresenta anche un nuovo gruppo di ruoli non apoptotici per le caspasi. Qui esaminiamo le prove per tali strategie e discutiamo delle loro origini e delle loro implicazioni per la nostra comprensione della relazione tra patogenesi virale e morte cellulare programmata.

Elenco puntato

I fatti

  • Le caspase dei boia hanno molti ruoli non apoptotici.

  • Molti virus modulano la risposta apoptotica della cellula ospite.

  • Alcuni virus utilizzano caspasi per eseguire l'elaborazione proteolitica dei componenti virali.

  • Prevalgono la caspasi-3 e -7, sebbene venga usata anche la scissione della caspasi-6.

Domande aperte

  • Quanto è diffuso questo fenomeno? Non sono stati ancora pubblicati esperimenti sistematici.

  • Questi esempi possono essere classificati in categorie funzionali?

  • Questo "dirottamento" è emerso una o più volte durante l'evoluzione?

  • Altre modalità di morte cellulare vengono manipolate in questo modo?

Le caspasi possono essere classificate in tre grandi categorie (Tabella 1): quelle che funzionano come boia proteolitiche dell'apoptosi (caspasi "killer"; compresi -3 e -7), quelle che servono ad attivare le caspasi del boia (caspase iniziatore; incluso - 8 e -10) e quelli che hanno ruoli nei processi non apoptotici, tra cui caspasi infiammatorie come -1, -5 e -11 (rivisto in Earnshaw et al. 1 e Martinon e Tschopp 2 ).

Tabella a grandezza naturale

Negli ultimi anni è diventato chiaro che le caspasi "killer" hanno ruoli in diversi processi non apoptotici, come la differenziazione cellulare, la migrazione e le metastasi, e nella segnalazione (rivista in altri articoli in questo numero). In questi processi non apoptotici, l'estensione dell'attivazione della caspasi o la sua localizzazione subcellulare è limitata al fine di prevenire la morte cellulare.

È anche importante notare che anche durante l'apoptosi, le caspasi si impegnano non solo nella scissione distruttiva, ma anche nella scissione produttiva: scissione che produce attività de novo della proteina del substrato. Ciò si ottiene attraverso diversi meccanismi (Figura 1), come la rimozione di domini autoinibitori per produrre enzimi costitutivamente attivi, la scissione delle sequenze di localizzazione citoplasmatica per facilitare la transizione della membrana nucleare o la degradazione dei fattori inibitori a monte nelle vie metaboliche per attivare fattori a valle. 3, 4, 5, 6 Tale scissione produttiva consente alle cellule apoptotiche di impegnarsi nei percorsi di segnalazione fino a tardi nel processo di morte cellulare.

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Esempi di eventi di scissione distruttivi e produttivi da parte delle caspasi durante l'apoptosi. Le caspasi dei boia possono impegnarsi in una scissione distruttiva, come lo smontaggio del citoscheletro attraverso la scissione dei filamenti di actina (a sinistra). Tuttavia, le caspasi del carnefice possono anche impegnarsi nella scissione produttiva (a destra), in cui vengono attivati ​​fattori di segnalazione o enzimi. Ciò può avvenire attraverso la degradazione dei partner inibitori legati (ICAD / CAD), attraverso la rimozione di domini autoinibitori (PAK2) o attraverso l'inattivazione di fattori inibitori a monte nelle vie biochimiche (Wee1 / CDK1)

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L'apoptosi delle cellule ospiti è una risposta comune all'infezione virale (rivista in Galluzzi et al. 7 ). L'apoptosi è in genere considerata un meccanismo di difesa che uccide la cellula infetta al fine di proteggere l'organismo nel suo insieme. Di conseguenza, esiste una pressione selettiva a favore dei virus che hanno sviluppato meccanismi per bloccare l'apoptosi. Ad esempio, diversi virus codificano gli omologhi Bcl-2 o gli omologhi di cFLIP che funzionano per inibire l'attivazione di caspasi apoptotiche e bloccare la morte della cellula ospite. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16

È interessante notare che la strategia inversa può anche essere osservata. Alcuni virus sfruttano effettivamente l'attività della caspasi della cellula ospite per facilitare la propria replica. Questi virus codificano i prodotti genici con motivi canonici di scissione della caspasi e la scissione in questi siti produce prodotti con funzioni aggiuntive. Questa scissione della caspasi viene utilizzata, ad esempio, per facilitare la traslocazione nucleare di componenti virali, per attivare modificatori trascrizionali dell'ospite con codifica virale o per eseguire la maturazione finale delle particelle di virione (riassunto nella Tabella 2).

Tabella a grandezza naturale

Il coinvolgimento delle caspasi ospiti nella patogenesi sia virale che batterica è stato precedentemente rivisto. 17, 18 Tuttavia, la presente recensione si concentra esclusivamente su esempi di scissione di caspasi ospite di proteine ​​virali piuttosto che, ad esempio, sull'induzione dell'apoptosi come meccanismo di diffusione della progenie. Questo campo ha continuato a svilupparsi, con nuovi esempi di interazioni virus-caspase pubblicati ad un ritmo maggiore. Pertanto, una revisione dello stato attuale di questa ricerca è tempestiva.

Fenditura per indurre il traffico nucleare-citoplasmatico di componenti virali

Amdovirus

Il parvovirus della malattia del visone aleutiano (AMDV, Amdovirus) è un virus ssDNA piccolo, non avvolto (-). 19 Ospita un genoma di 4, 7 kbp che codifica per due frame di lettura aperti, ORF1 iniziale e ORF2 finale. 20

ADV infetta i visoni sia neonati che adulti, ma con citopatologie piuttosto diverse. Nei visoni neonati, l'infezione porta a una replicazione dilagante e permissiva, causando l'apoptosi della cellula ospite. Nei visoni per adulti, ADV si mantiene attraverso una replica di basso livello più contenuta. 21, 22

Il ciclo di replicazione di ADV è stereotipato dei parvovirus. Dopo l'infezione, il virione si trasloca nel nucleo, dove il genoma non è rivestito. All'ingresso nella fase S, il meccanismo di replicazione del DNA delle cellule ospiti viene utilizzato per convertire il genoma a singolo filamento in un modello dsDNA, da cui vengono trascritti i primi geni. 23 Queste trascrizioni vengono trasportate nel citoplasma, dove si verificano la traduzione e l'assemblaggio virale (rivisto in Luo e Qiu 24 ).

La replicazione ADV dipende dalla caspasi, poiché il pretrattamento delle cellule renali feline CrFK con l'inibitore farmacologico della caspasi-3 Ac-DEVD-CHO provoca una marcata inibizione dell'amplificazione genomica virale, dell'espressione genica e del titolo virale. 25

Una proteina ADV precoce, NS1, coinvolta nella replicazione virale, ha dimostrato di essere scissa dalle caspasi ospiti durante l'infezione. Nelle cellule CrFK, le caspasi-3 e -7 scindono la proteina del residuo 590 in due siti vicini siti (INTD / 227) e (DQTD / 285). 26 Il dominio C-terminale si localizza esclusivamente nel nucleo. Questo evento di scissione è essenziale per il rientro nucleare di NS1 a lunghezza intera, poiché i mutanti ingegnerizzati senza i siti di scissione non si traslocano nel nucleo e tali virus sono in gran parte difettosi nella replicazione. 26

L'NS1 a lunghezza intera ospita una sequenza di localizzazione nucleare vicino al terminale N che viene rivelata dalla scissione della caspasi (Figura 2). Poiché la scissione è incompleta, durante il ciclo di infezione rimane un pool di NS1 non sfaldato. 26 È stato ipotizzato che il frammento di scissione C-terminale portante NLS oligomerizza con NS1 a lunghezza intera e facilita il rientro nucleare di NS1.

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Esempi di scissione della caspasi che induce traslocazione nucleare-citoplasmatica delle proteine ​​virali. A sinistra: l'elaborazione della caspasi di Amdovirus NS1 rivela una sequenza di localizzazione nucleare N-terminale. La scissione di NS1 oligomerizza con NS1 a lunghezza intera e facilita l'ingresso nucleare. Centro: la nucleoproteina influenzale A viene scissa dalla caspasi-3 per rimuovere una sequenza di localizzazione nucleare. Ciò consente l'esportazione di complessi ribonucleoproteici nel citoplasma. A destra: Hepacivirus C NS5A è diviso in due posizioni per rimuovere una sequenza di ritenzione citoplasmatica N-terminale e per rivelare una sequenza di localizzazione nucleare C-terminale, facilitando l'ingresso nucleare di NS5A

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Influenza A

I virus dell'influenza sono membri degli Orthomyxoviridae, una grande famiglia di (-) virus avvolti in ssRNA che infettano uccelli e mammiferi. Esistono attualmente tre sottotipi di influenza riconosciuti, denominati A, B e C. 27 Tutti i sottotipi di influenza condividono una struttura generale simile, costituita da un involucro esterno lipidico, un guscio capside e un complesso genomico di ribonucleoproteine. 28

L'attività della caspasi è richiesta per la replicazione di diversi ceppi patogeni H7N7, H3N2 e H1N1. 29, 30, 31 L'inibizione dell'attività della caspasi mediante z-DEVD.FMK provoca significative carenze di replicazione nel ceppo A / Bratislava / 79 (H7N7) altamente patogeno propagato nelle cellule epiteliali renali. 29 Allo stesso modo, il knockdown di siRNA della caspasi-3 o l'espressione ectopica dell'inibitore della caspasi XIAP attenua fortemente anche il titolo virale. Al contrario, la sovraespressione di procaspase-3 nelle cellule infette aumenta i raccolti di replicazione di 30 volte. 29

Inoltre, la sovraespressione di Bcl-2 anti-apoptotico nelle cellule MDCK infette ostacola la sintesi delle proteine ​​virali NP, HA e NS1 e causa errata glicosilazione della superficie virale. 32 L' abbattimento del Bax o Bik pro-apoptotico porta anche a una riduzione del titolo virale, a causa di un difetto nell'esportazione nucleare di complessi ribonucleoproteici. 33, 34 Insieme, questi dati suggeriscono che il percorso mitocondriale dell'attivazione della caspasi viene sfruttato per la replicazione dell'influenza A.

L'influenza A nucleoprotein (NP) è scissa da caspase-3 a (METD / 16). 30, 31, 35 Questo motivo è altamente conservato tra i ceppi patogeni H1N1, H3N2 e H2N2 patogeni umani. Cleavage produce un frammento N-terminale di 3 kDa. Porti NP e NLS all'interno di questo frammento N-terminale (residui 3–13). 36 Pertanto, sembra probabile che la rimozione della NLS mediata dalla caspasi dell'ospite consenta il trasporto del complesso RNP assemblato nel citoplasma (Figura 2). La diminuzione dell'efficienza della replicazione dopo l'inibizione della caspasi è attribuita alla ritenzione dei complessi ribonucleoproteici nel nucleo. 29

È interessante notare che i ceppi di influenza A simili a quelli aviari mancano del motivo della caspasi NP, ma ospitano una sostituzione D 16 > G. È stato suggerito che questa differenza è importante per la determinazione del range dell'ospite, in quanto la sostituzione della sequenza aviaria in un isolato di mammifero H1N1 ha ridotto la letalità di 68 volte nelle cellule MDCK. 37

L'influenza B NP (64 kDa) ospita anche un motivo di scissione simile alla caspasi-3 (MDID / 7) che è altamente conservato. Questa proteina viene anche suddivisa in cellule infette dal ceppo B / HK / 72, producendo un troncamento C-terminale di 55 kDa. 30, 38 Ciò può suggerire che la scissione di NP mediata dalla caspasi non è limitata ai ceppi di influenza A.

Virus dell'epatite C.

Il virus dell'epatite C (HCV) è un membro dei Flaviviridae, una famiglia di virus ssRNA non avvolti (+). L'HCV non è trasmesso da vettori, ma trasmesso direttamente attraverso fluidi corporei. Il virus non si integra e può causare patologie sia acute che croniche. È un agente causale dell'epatite virale e può portare a insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare. 39

Il genoma è codificato su un singolo filamento di RNA di ~ 10 kbp. Questo viene tradotto direttamente come una grande polipoteina, che viene trasformata in singole proteine ​​dalle proteasi sia ospite che virale. 40

L'HCV ottiene l'accesso all'epatocita bersaglio attraverso l'endocitosi mediata dalla clatrina. La replica ha luogo in compartimenti lipidici nel citoplasma. L'RNA polimerasi virale trascrive un modello dsRNA del genoma, dal quale è possibile effettuare copie di filamenti positivi. Il virione è assemblato sulla superficie della membrana della fabbrica virale. Dopo l'assemblaggio, il virus viene rilasciato tramite un meccanismo non litico. 41, 42

L'espressione della proteina core HCV induce l'attività della caspasi ospite. 43, 44 Caspase-3 attivato quindi scinde la proteina non strutturale 5A (NS5A). 45 La scissione viene ablata dal trattamento delle cellule con l'inibitore della pan-caspasi z-VAD.FMK e migliorata nelle cellule trattate con gli stimoli apoptotici TNF- α e cicloesossimide.

La scissione della proteina NS5A residua 447 si verifica in due siti, uno vicino al terminale N (TELD / 154) e l'altro vicino al terminale C (SAVD / 389). 46 Questa scissione rimuove sia una sequenza di ritenzione citoplasmatica N-terminale (1-21), sia espone una sequenza di localizzazione nucleare C-terminale (354-362), risultando nella traslocazione nucleare di NS5A 45, 46 scissione (Figura 2). Questa traslocazione nucleare indotta dalla scissione è necessaria per la replicazione dell'HCV. 47

L'NS5A nucleare altera la trascrizione delle cellule ospiti attraverso la modulazione dell'attività del fattore di trascrizione. L'attività di NS5A porta alla repressione p21 WAF1 e all'espressione dell'antigene nucleare a cellule proliferanti umane (PCNA), che insieme inducono la proliferazione delle cellule ospiti. 48 Nuclear NS5A si lega anche alle sequenze dei promotori di geni ospiti che sono noti per essere importanti per la replicazione dell'HCV, come IL-8, LTβ e NUAK2. 47 È interessante notare che l'NS5A nucleare smorza anche la risposta apoptotica delle cellule ospiti inibendo l'espressione di p53 e Bax, attivando al contempo Bcl-2 anti-apoptotico. 49, 50, 51

Emerge un modello in cui l'attività della caspasi indotta da HCV viene utilizzata per facilitare la traslocazione nucleare di NS5A. Nel nucleo, NS5A altera l'espressione genica dell'ospite per forzare la cellula ospite in uno stato di proliferazione, interrompendo anche la risposta apoptotica dell'ospite. Ciò rappresenta un meccanismo elegante in cui un virus induce l'attività della caspasi per facilitare la replicazione, solo per poi arrestare la risposta apoptotica per prevenire la morte della cellula ospite.

Scissione che influenza la replicazione del DNA e la trascrizione genica

Papilloma-virus umano

Il papillomavirus umano (HPV) è un virus dsDNA non avvolto di significativo interesse clinico. Esistono più di 100 sottotipi di HPV, sebbene solo un sottoinsieme di queste cause sia patogeno. 52 Le varianti patogene sono raggruppate in due categorie; sottotipi a basso rischio (LR) che causano papillomi benigni o squamosi e sottotipi ad alto rischio (HR) che possono causare tumori maligni. 53

L'HPV codifica sette prime proteine ​​non strutturali (E1 – E7), nonché due proteine ​​strutturali tardive (L1 e L2). 54 Le proteine ​​non strutturali comprendono un apparato per la replicazione genomica virale e l'incapsulamento virale, nonché per arrestare il ciclo cellulare ospite, induzione del differenziamento cellulare e regolazione dell'apoptosi. 55 Il genoma virale è in grado di auto-replicarsi e regola questa attività per mantenere una carica virale di ~ 100 copie per cellula. 56, 57

È stato dimostrato che le caspasi-3, -7 e -9 dell'ospite sono indotte durante l'infezione del sottotipo HPV-31 ad alto rischio. 58 A questa attivazione della caspasi è impedito di passare a un fenotipo apoptotico completo attraverso l'attività anti-apoptotica di E6, che inattiva p53, FADD e procaspase-8. 59, 60, 61 L' attività della caspasi indotta dall'HPV è necessaria per l'amplificazione del genoma virale, poiché il trattamento con l'inibitore della caspasi z-DMQD.FMK ha fortemente inibito l'amplificazione dell'episodio virale. 58

La proteina E1 dell'elicasi HPV-31 viene scissa dall'ospite caspase-3 a (DMVD / 49), sia in un sistema privo di cellule con caspasi-3 ricombinante, sia in cellule apoptotiche trasfettate con E1. 58 Le cellule trasfettate con genomi mutevoli E1 non sfaldabili hanno mostrato una sostanziale inibizione nella replicazione genomica, simile agli effetti dell'inibizione della caspasi, suggerendo che la scissione E1 è un evento chiave nella replicazione virale.

È interessante notare che il sito di scissione DMVD è conservato tra i ceppi di HPV genitali ad alto rischio, inclusi i ceppi ad alto rischio −16, −18, −31, −45, ma non si trova tra i ceppi a basso rischio. Ciò può suggerire che questo evento di scissione della caspasi è selettivamente importante per la patogenesi di ceppi ad alto rischio. La presenza di un sito di scissione della caspasi può essere utile come marker diagnostico per differenziare i ceppi ad alto e basso rischio.

adenovirus

Gli adenovirus sono virus dsDNA non avvolti che infettano una vasta gamma di animali. Nell'uomo, l'infezione da adenovirus può provocare febbre, faringite, congiuntivite, bronchite e polmonite. 62 Esistono più di 50 sottotipi patogeni noti di adenovirus umano, classificati in sette specie, A – G. 63

Il genoma è costituito da un singolo cromosoma lineare di ~ 36 kbp. Il genoma dell'adenovirus codifica per i geni della replicazione precoce e per i geni di confezionamento e maturazione del capside in ritardo. Lo splicing alternativo viene utilizzato per produrre oltre trenta peptidi. 64

L'adenovirus ottiene l'accesso alla cellula ospite attraverso l'endocitosi mediata dal recettore. Il virione fuoriesce dall'endosoma durante l'acidificazione e migra verso il nucleo, dove il genoma del DNA non è rivestito e transita attraverso il complesso dei pori nucleari. 65

L'attività della caspasi è richiesta per la replicazione dell'adenovirus. Il trattamento delle cellule HeLa infette con l'inibitore della pan-caspasi z-VAD.FMK ha aumentato sostanzialmente la produzione virale, causando anche un difetto nel rilascio di progenie virale. 8 L' inibizione della caspasi rallenta anche il tasso di infezione, poiché si osserva un'infezione completa dopo 72 ore nelle cellule trattate con z-VAD, rispetto alle 48 ore nelle cellule di controllo. 8

Meccanicamente, è stato dimostrato che i grandi prodotti del gene E1A adenovirale, 12S e 13S, sono suddivisi in caspase-3. La scissione si verifica prima su (HLVD / 24), rimuovendo una sequenza N-terminale, quindi su (FQLD / 150). Questa seconda scissione produce due grandi frammenti. Il frammento N-terminale viene rapidamente degradato, mentre il frammento C-terminale subisce un'ulteriore scissione in (STLD / 205) e (SILD / 243). 66

I prodotti del gene E1A hanno diversi ruoli durante l'infezione da adenovirus. Uno di questi ruoli è modulare la trascrizione del gene ospite. È stato dimostrato che la scissione della caspasi dei prodotti E1A interrompe il legame di E1A con l'ospite degli attivatori trascrizionali CBP e TBP. 66 Cleavage migliora anche il legame di E1A al repressore trascrizionale ospite CtBP1. 66 In base ai siti target, la scissione probabilmente interrompe anche il legame E1A con partner di interazione noti come p21 e p27, 67 sebbene questi non siano ancora stati sperimentalmente testati. Insieme, ciò suggerisce che l'attività della caspasi indotta da virus altera l'attività di legame del fattore di trascrizione delle proteine ​​E1A e che ciò è necessario per la replicazione virale.

Fenditura per facilitare il rilascio virale

Astrovirus

Gli Astroviridae sono una famiglia di (+) virus ssRNA descritti per la prima volta nel 1975. 68 Sono divisi in due generi; gli Avastroviridae che infettano gli uccelli e i Mamastroviridae che infettano i mammiferi. 69 Sono l'agente eziologico di alcune forme di gastroenterite virale. 70

Il genoma è costituito da un singolo filamento di RNA non segmentato di 6, 8–7 kbp. Il genoma contiene tre ORF sovrapposti, che codificano una proteasi serinica (Nsp1a), una RNA polimerasi (Nsp1ab) e una proteina capside strutturale (VP90). 71

La strategia di infezione è simile a quella di altri virus RNA non inviluppati (rivista in Mendez et al. 72 ). Il virus entra nella cellula ospite attraverso endocitosi mediata dal recettore. Nel citoplasma, il virus si stacca e il genoma viene rilasciato. Le fabbriche virali sono prodotte utilizzando vescicole di membrana di derivazione ER. Il genoma dell'RNA a filamento positivo viene tradotto direttamente, mentre il genoma viene replicato mediante un intermedio dsRNA. 73 Il virus assemblato viene rilasciato attraverso un meccanismo non litico. 67

L'attività della caspasi dell'ospite è richiesta durante il ciclo di vita dell'Astrovirus. Nelle cellule di adenocarcinoma epiteliale Caco-2 infettate con Astrovirus-8 umano, vengono rilevate le attività sia delle caspasi iniziatori-4, -8 e -9, sia delle caspasi −3 e −7 ~ 12 ore dopo l'infezione e il knockdown del siRNA della caspasi -3 o l'inibizione con Ac-DEVD-CHO attenua fortemente il rilascio virale. 74

È stato dimostrato che l'ospite caspase-3 è responsabile del trattamento proteolitico della proteina capside VP90 nella sua forma matura, VP70. 75 Questa scissione si verifica in (TYVD / 657). Il blocco dell'attività della caspasi mediante z-VAD.FMK inibisce questo evento di scissione, mentre il trattamento con lo stimolo apoptotico TRAIL migliora l'elaborazione di VP90. L'inibizione dell'attività della caspasi porta all'accumulo di particelle virali all'interno della cellula e ad un difetto nel rilascio virale. 75 L'elaborazione di VP90 mediata dalla caspasi è un passaggio essenziale nella maturazione dell'Astrovirus, sebbene al momento non sia chiaro se questa scissione faciliti il ​​rilascio di virioni dalla membrana della fabbrica virale o faciliti un passaggio successivo nel rilascio di virioni dalla cellula. (Figura 3). 71

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Esempi di scissione della caspasi per facilitare il rilascio di progenie virale. ( a ) Modello di rilascio di Astrovirus dalla cellula ospite. Caspase-3 scinde la proteina capside VP90. Ciò facilita il rilascio virale dalle fabbriche virali citoplasmatiche o facilita l'uscita cellulare delle particelle virali mature. ( b ) Modello di rilascio di reovirus aviario dalla cellula ospite. La scissione della caspasi di μNS induce la dissoluzione delle fabbriche di inclusione del viroplasma nel citoplasma, portando alla formazione di virioni maturi e all'uscita virale

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Reovirus aviario

Il reovirus aviario (ARV) appartiene alla famiglia dei virus dsRNA Reoviridae. L'ARV in genere infetta i polli da carne, causando una serie di patologie tra cui la malattia dell'ala blu. 76 Una volta infetto, il virus si diffonde rapidamente in tutti i tessuti, in particolare la pelle e la muscolatura, inducendo emorragie focali della pelle, artrite e crescita stentata. 76, 77

Il genoma di ARV è composto da dieci segmenti di dsRNA, con una dimensione combinata di 23, 5 kbp, che codificano dieci proteine ​​strutturali e cinque proteine ​​non strutturali. 78 La replicazione virale ha luogo nel citoplasma e l'assemblaggio del virione avviene in inclusioni viroplasmatiche simili a fabbrica contenenti le proteine ​​non strutturali e l'RNA genomico (Figura 3). 79 Il rilascio di Progeny è facilitato da un meccanismo litico guidato dall'apoptosi. 80

Nei fibroblasti embrionali di pulcino e nelle cellule HeLa infettate con il ceppo S1133 di ARV, la proteina non strutturale μNS viene scissa dalle caspasi ospiti (DSPD / 154), rimuovendo un dominio N-terminale. 80 Il trattamento con l'inibitore della pan-caspasi Q-VD-OPh impedisce questa elaborazione μNS. La scissione viene eseguita esclusivamente da caspase-3 e non da caspase-7, come indicato da esperimenti senza cellule. 80 Come nell'esempio di Astrovirus sopra, l'inibizione della caspasi porta a un titolo virale extracellulare drasticamente ridotto, suggerendo un difetto nel rilascio virale.

μNS è una proteina non strutturale conservata tra i reovirus. Il μNS di ARV ha un ruolo importante nella formazione di fabbriche viroplasmatiche. 81, 82 Poiché l'elaborazione del μNS avviene relativamente tardi nel ciclo di infezione, è possibile che l'elaborazione del μNS sia responsabile della dissociazione delle fabbriche virali dopo il completamento del montaggio del virione (Figura 3). A sostegno di ciò, è stato dimostrato che le forme scisse di μNS si associano meno fortemente alle inclusioni virali rispetto alla forma intatta. 80 Sono necessari ulteriori lavori per testare il significato funzionale della scissione del μNS nella patogenesi dell'ARV.

Decolleté con funzioni sconosciute

Virus della peste suina classica

Come il virus dell'epatite C discusso in precedenza, il virus della peste suina classica (CSFV) appartiene ai Flaviviridae. Il CSFV è endemico nei suini allevati e l'infezione provoca sintomi simili alla febbre e lesioni cutanee, che spesso portano alla morte rapida dell'animale infetto. L'infezione da CSFV è altamente contagiosa e si diffonde attraverso la trasmissione diretta da animale ad animale, nonché attraverso l'aerosol e le fomiti. 83

Come altri flavivirus, il genoma (+) ssRNA viene tradotto come un singolo grande polipeptide che viene successivamente trasformato in proteine ​​precoci e tardive. La proteina nostrutturale 5A (NS5A) ospita un tipico motivo di scissione della caspasi a (DTTD / 272), che viene scisso dalla caspasi-6 nelle cellule dei testicoli suini. 84

Questa scissione è bloccata dall'inibitore specifico della caspasi-6 z-VEID.FMK, e anche dalla downregulation mediata da shRNA della caspasi-6. L'interruzione di questo evento di scissione attraverso il trattamento z.VEID.FMK ha ridotto la resa virale di 7, 9 volte, mentre l'inibizione dello shRNA del caspase-6 ha causato una riduzione di 21, 5 volte del titolo virale extracellulare. Anche il titolo virale intracellulare è stato ridotto di 10 volte, suggerendo che il difetto di replicazione non si verifica a livello di rilascio virale, ma a un certo punto della produzione di virioni intracellulari. Insieme, queste osservazioni suggeriscono che, analogamente all'HCV, è necessaria la scissione del CSFV NS5A per una corretta replicazione virale.

Caspase-6 è atipico nel fatto che non viene attivato direttamente dalle caspasi dell'iniziatore a monte durante l'apoptosi, ma si basa sull'attivazione da parte delle caspasi effettrici-3 e -7. 85 Il fatto che la caspasi-6 attiva sia presente nelle cellule infette da CSFV può suggerire che anche le caspasi-3 o -7 sono attive o che la caspasi-6 è indotta attraverso un meccanismo non canonico.

La funzione della scissione NS5A non è ancora nota. Questa proteina ha ruoli nella traduzione e nella replicazione genomica virale e ha dimostrato di interagire con il fattore di allungamento della traduzione dell'ospite 1A. Sembra anche essere coinvolto nel ripiegamento delle proteine ​​tradotte attraverso la sua interazione con Hsp70. Forse, come l'HCV NS5A, la scissione altera le interazioni tra questa proteina e i fattori di trascrizione dell'ospite.

Altre interazioni caspase-virali

In questo articolo, ci siamo concentrati su esempi di scissione produttiva di caspasi di proteine ​​virali. È interessante notare che un'altra strategia distinta di dirottamento virale può essere osservata. Numerosi virus utilizzano l'attività della caspasi ospite come strumento per penetrare nella membrana nucleare. Il parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) induce l'attività dell'ospite caspase-3. Questa attività viene utilizzata per permeare transitoriamente l'involucro nucleare attraverso la scissione del laminato, che consente l'ingresso nucleare di capside MVM. 86, 87

Allo stesso modo, l'attività della caspasi indotta dall'influenza A porta alla scissione della nucleoporina 153 e all'allargamento dei pori nucleari, facilitando l'esportazione nucleare dei complessi ribonucleoproteici. 88 Questa sembra essere una strategia complementare all'esportazione NP mediata dalla scissione della caspasi descritta sopra.

Un terzo esempio di questa strategia si verifica con Simian Virus 40 (SV40). All'infezione, la proteina capside SV40 induce l'attività della caspasi della cellula ospite. Questa attività porta alla perforazione della lamina nucleare con caspase-6, permettendo l'ingresso nucleare del capside SV40. 89, 90

Caspasi con codifica virale

Ci sono anche esempi di virus che codificano per i propri caspase. Gli ascovirus sono una famiglia di grandi virus dsDNA che infettano le falene notturne. Ciascuno dei quattro membri di questa famiglia codifica una proteina simile alla caspasi.

La caspasi di Spodoptera frugiperda ascovirus (SfAV-1a) si esprime in caso di infezione e induce una risposta apoptotica modificata. Si formano 91 corpi apoptotici, ma anziché disgregarsi, questi vengono convertiti in grandi vescicole portatrici di virus. Queste vescicole facilitano la diffusione virale attraverso il sangue. SfAV codifica anche diverse proteine ​​simili a IAP e queste possono contribuire a modificare la risposta apoptotica indotta dalla caspasi virale. 92

La caspasi Heliothis virescens ascovirus (HvAV-3e) non induce apoptosi, ma è necessaria per la replicazione virale. 93 Durante l'infezione da HvAV, la rete in fibra di actina ospite viene riorganizzata in strutture simili a bleb. 94 Questi ricordano il rimodellamento del citoscheletro guidato dalla caspasi durante l'apoptosi. Questo processo è necessario per la vescicolazione e la citopatologia delle cellule ospiti. È possibile che la caspase HvAV sia responsabile della guida di questa riorganizzazione dell'actina.

Discussione

Storicamente sono stati osservati diversi tipi di interazione tra virus e caspasi di cellule ospiti. I virus possono inibire l'attivazione della caspasi al fine di bloccare la morte apoptotica della cellula ospite e prolungare la finestra di replicazione. Ciò può avvenire attraverso l'espressione di ortologi delle proteine ​​anti-apoptotiche Bcl o FLIP. 11, 95 In alternativa, è noto che i virus inducono l'apoptosi delle cellule ospiti al fine di facilitare la diffusione del virus della progenie, ad esempio attraverso la diffusione di corpi apoptotici carichi di virus. 96

In questa recensione, vengono presentate prove dell'esistenza di una terza classe emergente di interazione virus-caspasi. In queste strategie, i virus 'dirottano' l'attività di scissione proteolitica delle caspasi ospiti per scindere le proteine ​​virali al fine di facilitare la replicazione virale.

Categorie funzionali che emergono dagli esempi presentati

Diversi tipi di strategia possono essere osservati dagli esempi presentati qui. Nel primo, l'attività della caspasi viene utilizzata per facilitare il traffico nucleare-citoplasmatico di proteine ​​virali, ottenuto attraverso la rimozione o l'esposizione di sequenze di localizzazione nucleare o sequenze di ritenzione citoplasmatica. Degli esempi qui presentati, questi sono i più robusti e meglio supportati da dati sperimentali. Una seconda strategia è la scissione delle proteine ​​virali che influenzano la replicazione del DNA e la trascrizione genica attraverso la modifica delle proteine ​​non strutturali. Una terza strategia è l'uso dell'attività della caspasi ospite per eseguire le fasi finali di maturazione nell'assemblaggio e nel rilascio virali.

Clivaggio di eventi con funzioni sconosciute o criptiche

Con alcuni esempi, la conseguenza funzionale della scissione della caspasi è sconosciuta. Il virus della peste suina classica NS5A è diviso dall'ospite caspase-6 e l'inibizione di questo evento porta a una forte inibizione della replicazione virale intracellulare, ma la ragione di ciò è ancora oscura.

Esistono altri esempi di proteine ​​virali che vengono scisse dalle caspasi ospiti, ma la conseguenza della cui scissione non è completamente compresa. La proteina nucleocapside del virus della febbre emorragica Crimea-Congo, un mortale bunyavirus, viene scissa dalla caspasi-3 e la scissione limita la replicazione virale. 97

Le proteine ​​del capomero del pentone del virus dell'encefalomielite murina di Theiler (TMEV) sono scisse dall'attività della caspasi-3, ma l'effetto diretto di questa scissione sulla replicazione virale non è chiaro. 98

La nucleoproteina (NP) del virus Junin è suddivisa in caspase-3. È interessante notare che l'espressione di NP sopprime l'attività della caspasi-3 nelle cellule trattate con camptothecin. Questo è usato per indicare che NP può agire come substrato di esca per caspase-3, intercettando e bloccando la risposta apoptotica all'infezione. 99

Le origini delle strategie di dirottamento della caspasi

Un'analisi tassonomica degli esempi qui presentati mostra che questo fenomeno non è limitato a nessun particolare gruppo di virus, ma si trova distribuito tra i virus ssRNA, dsRNA, ssDNA e dsDNA. Per questo motivo, la strategia di sfruttamento del meccanismo di morte delle cellule ospiti per facilitare la replicazione virale è emersa probabilmente più volte durante l'evoluzione.

La morte cellulare è una risposta comune all'infezione virale negli organismi pluricellulari. È quindi uno stato cellulare a cui sono esposti molti virus e ai quali devono adattarsi. Data la natura prolifica e sfrenata dell'attività della caspasi killer all'interno delle cellule apoptotiche, forse non sorprende che molti virus si siano adattati per utilizzare questa attività proteolitica a proprio vantaggio.

Virus latenti: un equilibrio tra inibizione dell'apoptosi e attivazione della caspasi

I virus possono generalmente essere classificati in due gruppi: quelli che sono in grado di rimanere all'interno della cellula ospite in uno stato persistente e latente; e quelli che sono costitutivamente litici. La latenza si verifica spesso attraverso l'integrazione nel genoma ospite. I virus latenti generalmente prevengono la morte della cellula ospite, spesso attraverso l'espressione di fattori anti-apoptotici. Molti dei virus descritti in questa recensione; vale a dire HPV, KSHV e SV40, sono in grado di persistere in stati latenti e integrati,

Una domanda si presenta; come possono i virus latenti prevenire la morte delle cellule ospiti, sfruttando contemporaneamente l'attività della caspasi? In altri sistemi, è stato dimostrato che l'attivazione sub-letale della caspasi può essere utilizzata per ottenere risultati non apoptotici come la differenziazione cellulare (rivista in Connolly et al. 100 ). A similar mechanism of restricted caspase activation may be used by persistent viruses. Through the activity of viral anti-apoptotic factors, host caspase activity may be restricted spatially or temporally, in magnitude.

Viral hijacking of non-apoptotic forms of cell death

Interestingly, other modalities of cell death are also 'hijacked' to facilitate viral replication. Treatment of HIV-1-infected Jurkat cells with the necroptosis inhibitors Nec-1 (RIPK) or necrosulfamide (MLKL) strongly inhibits host cell syncytium formation, 101 while siRNA depletion of RIPK1, RIPK3 and MLKL also reduces cell fusion. 101 This suggests that necroptotic processes are utilized for this aspect of HIV-1 pathogenesis.

Autophagy, although not in itself a form of cell death, 102 is a component of some true cell death processes, such as entosis. 103 Some viruses have evolved to exploit autophagy to facilitate their own replication. Upon infection, encephalomyocarditis virus (EMCV) induces the formation of LC3-II + autophagic vesicles. 104 Autophagy is required for viral replication, as treatment with 3-methyladenine or siRNA-mediated inhibition of Atg7 or LC3 suppresses viral replication. Fascinatingly, it appears that EMCV uses these autophagic vesicles as a scaffold upon which viral genomic replication is performed. 104

Conclusione

These strategies of caspase 'hijacking' could offer new avenues to explore towards understanding and controlling viral pathogenesis. The individual reports are encouraging, but sporadic. A systematic survey of caspase cleavage of viral proteins is warranted. As a start, we have performed an in silico screen for canonical caspase cleavage motifs within the proteomes of viruses of medical interest (Table 3). Many of these sites, of course, will not turn out to be cleaved in infected cells, as the presence of a caspase motif does not guarantee a cleavage event, let alone a functionally significant one. Nevertheless, the inverse is true; a cleavage event requires the present of a cleavage motif, so this survey may include some true positives among the false positives.

Tabella a grandezza naturale

In vitro , the most basic criteria for identification of a caspase-dependent viral process are:

  1. A reduction or defect of intracellular viral replication under caspase inhibition.

  2. The existence of one or more viral proteins which undergo caspase-dependent cleavage.

Based on these simple criteria, a screen for novel caspase cleavage events will be a relatively straightforward task.