Un circuito di rilevazione visiva del movimento suggerito dalla drosofila connectomics | natura

Un circuito di rilevazione visiva del movimento suggerito dalla drosofila connectomics | natura

Anonim

Soggetti

  • Rilevazione del movimento
  • Neuroscienza

Astratto

Il comportamento animale deriva da calcoli nei circuiti neuronali, ma la nostra comprensione di questi calcoli è stata frustrata dalla mancanza di mappe di connessione sinaptiche dettagliate o connettomi. Ad esempio, nonostante indagini approfondite per oltre mezzo secolo, l'implementazione neuronale della rilevazione del movimento locale nel sistema visivo degli insetti rimane sfuggente. Qui sviluppiamo una pipeline semi-automatizzata usando la microscopia elettronica per ricostruire un connettoma, contenente 379 neuroni e 8.637 contatti chimici sinaptici, all'interno del midollo ottico della Drosophila . Abbinando i neuroni ricostruiti agli esempi della microscopia ottica, abbiamo assegnato i neuroni ai tipi di cellule e abbiamo assemblato un connettoma del modulo ripetitivo del midollo. All'interno di questo modulo, abbiamo identificato i tipi di cellule che costituiscono un circuito di rilevamento del movimento e mostrato che le connessioni ai singoli neuroni sensibili al movimento in questo circuito erano coerenti con la selettività della loro direzione. I nostri risultati identificano obiettivi cellulari per future indagini funzionali e dimostrano che i connettomi possono fornire spunti chiave sui calcoli neuronali.

Principale

La visione negli insetti è stata soggetta a intense indagini comportamentali 1, fisiologiche 2 e anatomiche 3, ma la nostra comprensione dei suoi calcoli neurali sottostanti è ancora lungi dall'essere completa. Uno di questi calcoli, etologicamente molto rilevante, è il rilevamento del movimento, che si pensa faccia affidamento sul confronto tra segnali offset nello spazio e tempo 4, 5, 6 (Fig. 1a, b). Tuttavia, nonostante sia al centro di indagini teoriche e sperimentali per oltre mezzo secolo 7, l'esatto meccanismo alla base di questo calcolo rimane un mistero. Un impedimento centrale per svelare questo meccanismo è stata la nostra conoscenza incompleta dei neuroni e delle sinapsi rilevanti.

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a, Componente di movimento verso destra del modello Hassenstein – Reichardt EMD 4 . L'ingresso di luce (fulmine) nel canale sinistro (magenta) viene trasmesso con un ritardo aggiuntivo, τ , rispetto a quello nel canale destro (ciano). Per un oggetto che si muove verso destra, i segnali provenienti da entrambi i canali arriveranno all'unità di moltiplicazione più vicini nel tempo tra loro, e quindi diventeranno non linearmente migliorati (e viceversa per gli oggetti che si muovono verso sinistra). Di conseguenza, il modello risponde preferenzialmente al movimento verso destra. b, modello EMD 6 alternativo di Barlow-Levick, preferendo anche il movimento verso destra. Si noti che gli ingressi sono combinati con segni opposti e il ritardo è ora nel canale destro (ciano). c, sezione orizzontale macchiata di argento Bodian 45 del sistema visivo Drosophila melanogaster che rivela le quattro neuropille del lobo ottico. La regione di interesse midollare (rettangolo solido, espanso in d ) e il più ampio volume di immagine (rettangolo tratteggiato) utilizzato per tracciare nella placca della lobula sono mostrati schematicamente. d, La regione di interesse del midollo 37 μm × 37 μm è centrata sulla colonna di riferimento (rossa) e su sei colonne vicine più vicine (blu). Il midollo allungato ha dieci strati (M1 – M10) definiti dalle arborizzazioni dei suoi tipi di cellule. Barre di scala, 50 μm ( c ) e 10 μm ( d, in tutte e tre le direzioni).

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Al volo, l'elaborazione visiva inizia nel lobo ottico, composto da quattro neuropili retinotopicamente organizzati. Ciascuno è un array di moduli ripetuti corrispondenti al reticolo esagonale di ommatidia nell'occhio composto (Fig. 1c). Ogni modulo del primo neuropilo, la lamina, contiene un circuito ripetuto 8, 9 che riceve input da sei fotorecettori che rilevano la luce dalla stessa posizione nel campo visivo. Le celle di uscita di ciascun modulo di lamina proiettano su un modulo corrispondente del secondo neuropilo, il midollo (Fig. 1c). Si pensa che ogni modulo midollare, chiamato colonna (Fig. 1d), contenga circuiti stereotipati 10 . Queste colonne, a loro volta, innervano due neuropili a valle, la lobula e la placca di lobula (Fig. 1c).

Le risposte al movimento locale devono essere calcolate almeno in parte all'interno dei circuiti stereotipati delle colonne del midollo. Infatti, il midollo è il primo neuropilo con attività specifica del movimento 11 e, direttamente a valle del midollo, le cellule tangenziali della piastra della lobula (LPTC) integrano i segnali di movimento locale per produrre una risposta di movimento ad ampio campo 12, 13 . Tuttavia, fino ad ora, la mancanza di un connettoma midollare ha frustrato le indagini sulla rilevazione del movimento locale.

Ricostruzione semiautomatica del connettoma

Per fornire una base affidabile per la modellazione computazionale e identificare gli obiettivi per le registrazioni elettro / optofisiologiche, abbiamo tentato una ricostruzione completa e densa della connettività chimica sinaptica all'interno del midollo utilizzando la microscopia elettronica, il gold standard della neuroanatomia 14 . Data la natura che richiede tempo di tali ricostruzioni, volevamo determinare il volume di midollo più piccolo, la cui ricostruzione ci avrebbe permesso di identificare un circuito alla base del calcolo del movimento locale. Sia le risposte di rotazione direzionali 15 che le risposte elettrofisiologiche negli LPTC 16 possono essere suscitate nelle mosche mediante stimolazione sequenziale di due fotorecettori corrispondenti a punti adiacenti in qualsiasi punto del campo visivo 17 . Ciò suggerisce che alcuni componenti ripetitivi del circuito di rilevazione del movimento devono essere presenti all'interno di due colonne midollari adiacenti. Abbiamo quindi deciso di ricostruire tutte le connessioni sinaptiche tra i neuroni all'interno di una singola colonna di riferimento, così come tutte le connessioni tra la colonna di riferimento e i neuroni all'interno di sei colonne più vicine (Fig. 1d).

Poiché la ricostruzione manuale anche di un volume a sette colonne richiederebbe in modo proibitivo 18, abbiamo sviluppato una pipeline di ricostruzione semi-automatizzata 19 e l'abbiamo applicata al volume midollare (Fig. 2, Metodi e dati supplementari 1), ricostruendo 379 cellule ( Supplementary Fig. 1 e Supplementary Video 1).

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a, Una microfotografia rappresentativa, una delle 2.769 della serie di microscopia elettronica. b, segmentazione di correzione della microfotografia in a in profili di neuriti (colori singoli). c, le sinapsi comprendono un processo presinaptico contenente un nastro a T (freccia rossa) e neuriti associati con densità post-sinaptica (PSD) (punte di freccia blu) adiacenti alla barra a T. Un processo non sinaptico (cerchio verde) manca di un PSD (sia in questo che in altri piani di sezione contenenti questa barra a T). d, i neuriti vengono ricostruiti collegando i profili in sezioni consecutive (a sinistra), per costruire un oggetto 3D (a destra). e, Un esempio di un neurone ricostruito dalla microscopia elettronica (a sinistra), identificato dal confronto con la cellula impregnata di Golgi (centro) 20 come tipo Mi1 e validato in modo incrociato da un neurone marcato con una singola cellula genetica (GSC) corrispondente (a destra) (Metodi supplementari). f, uguale a e per il tipo di cella Tm3. Barre di scala, 500 nm ( a, b ), 250 nm ( c ) e 10 μm ( e, f ).

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Per mappare la nostra ricostruzione sul corpus esistente di conoscenze, abbiamo assegnato queste cellule ai tipi di cellule 20 precedentemente proposti confrontando le forme dei perni ricostruiti (Figura 1 complementare) con quelle riportate dalla microscopia ottica utilizzando l'impregnazione del Golgi o l'etichettatura genetica di singole cellule ( Fig. 2e, f e metodi supplementari). Poiché c'erano diversi esempi ricostruiti per quasi tutti i tipi di neuroni (Figura 1 e Tabella supplementare 2), è stato possibile caratterizzare le caratteristiche strutturali comuni di ciascun tipo. In molti casi, questo ci ha permesso di abbinare inequivocabilmente una cellula ricostruita con un impregnato di Golgi 20, per il quale è stato poi chiamato (Metodi Supplementari). Tuttavia, c'era anche un sottoinsieme di tipi di cellule per i quali non è stato possibile trovare una controparte del Golgi, ma che abbiamo convalidato utilizzando isomorfi dall'etichettatura genetica di singole cellule. Abbiamo chiamato questi tipi di celle Mi13, Mi14, Mi15, TmY14, Dm9 e Dm10 (Figura 2 aggiuntiva). In totale, dalla raccolta di 379 cellule ricostruite (Figura 1 complementare) siamo stati in grado di classificarne 290 in 56 tipi di cellule (Tabella 2 supplementare).

Per rivelare le connessioni tra i 379 neuroni ricostruiti, abbiamo identificato i siti pre e post-sinaptici e li abbiamo assegnati alle loro rispettive cellule madri. All'interno della colonna di riferimento e del suo circostante immediato, abbiamo annotato 10.093 siti presinaptici e 38.465 siti postsinaptici associati (3, 8 ± 1, 2 (media ± sd) per sito presinaptico) (Fig. 2c e Tabella supplementare 1). Sebbene le barre a T presinaptiche tipicamente cadessero sui profili di correzione dei neuroni, i siti postsinaptici di solito cadevano su profili isolati, non assegnati a nessun neurone. Pertanto, è stato necessario rintracciare il dendrite contenente ciascun sito postsinaptico in una cella madre. Questa traccia post-sinaptica è stata estremamente impegnativa poiché i dendriti neuronali di Drosophila si ramificano in modo elaborato e, in effetti, possono essere più sottili dello spessore della sezione.

La stimolante tracciamento postsinaptico ha portato a (1) alcuni contatti sinaptici identificati erroneamente, e (2) un'alta frazione (∼ 50%) di contatti che non potevano essere rintracciati al neurone genitore e non erano pertanto identificati. Per aumentare la nostra fiducia nei contatti identificati (1), abbiamo avuto due correttori di bozze tracciare ogni sito postsinaptico (Metodi) e abbiamo accettato nel collegamento solo quei contatti che entrambi i correttori di bozze hanno identificato in modo indipendente. Al contrario, non è stato possibile ridurre sperimentalmente il numero di contatti non identificati (2). Tuttavia, siamo ancora riusciti a costruire un connettoma prezioso per dedurre la funzione perché abbiamo scoperto che, all'interno del midollo, le connessioni di peso elevato (ovvero un elevato numero di contatti sinaptici per connessione) catturano entrambe una grande parte del peso totale della connessione e può essere identificato con alta fedeltà. In effetti, la distribuzione del peso della connessione nel nostro connettoma è a coda pesante (Fig. 3b, inserto e Fig. 3 supplementare), come è stato trovato in altri organismi 21, 22 . Inoltre, supponendo che le sinapsi siano ugualmente difficili da correggere, abbiamo scoperto che qualsiasi connessione forte (con> 5 contatti sinaptici) verrà identificata con una probabilità> 95%. Pertanto, nel connettoma risultante, 8.637 contatti sinaptici sono identificati con precisione e sono rappresentate tutte le connessioni forti.

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a, matrice di connettività sinaptica per tipi di celle modulari assemblati da 2.495 sinapsi (Tabella supplementare 1). Tre percorsi, identificati tramite l'analisi di clustering di Louvain 46, sono etichettati da scatole colorate. Sono chiamati dai loro neuroni di input primari: i percorsi L1 (magenta), L2 (verde) e L3 / R7 / R8 (ciano). I percorsi sono ordinati in base al numero totale di connessioni all'interno di un percorso, in ordine decrescente, e i tipi di celle, all'interno di ciascun percorso, sono ordinati dalla somma delle loro connessioni pre e post-sinaptiche da e verso altri tipi di celle all'interno del loro percorso, anche in ordine decrescente. b, modulo Connome Medulla come grafico 3D. I tipi di celle con connessioni più forti vengono posizionati più vicini tra loro, utilizzando la visualizzazione dell'algoritmo di layout di somiglianze 47 . Si osservano tre gruppi spazialmente separati che corrispondono strettamente ai percorsi identificati attraverso il raggruppamento (colorazione delle sfere). La direzione dominante del flusso del segnale è orientata nella pagina 22 . L'inserto in b mostra la frazione delle connessioni sinaptiche all'interno dell'intero connettoma con un peso di connessione maggiore di quello indicato.

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Il modulo connectome e i suoi percorsi

Per identificare i percorsi che eseguono calcoli locali come il rilevamento del movimento, era necessario generare un'astrazione più conveniente dell'intero connettoma. Poiché ci aspettiamo che i circuiti di interesse si ripetano all'interno di ciascuna colonna, abbiamo estratto dal connome midollare un modulo periodico di connessioni tra i tipi di cellule identificati che si inseriscono in ogni colonna. Questi includono sia i cosiddetti tipi di cellule sinperiodiche con singoli neuroni in ogni colonna del midollo 23, sia i tipi di cellule con diversi membri all'interno di ciascuna colonna, che definiamo ultraperiodici. Non includiamo cellule tangenziali infraperiodiche o locali simili all'amacrina anche se presentano arborizzazioni in ogni colonna perché ciò non può essere determinato in modo inequivocabile dalla nostra ricostruzione al microscopio elettronico (Tabella supplementare 2). Abbiamo usato l'esistenza di più rappresentanti di colonne adiacenti nella nostra ricostruzione di microscopia elettronica (Figura 1 complementare) per identificare 25 tipi di cellule come sinperiodici, oltre a due tipi di cellule, Tm3 e T4, come ultraperiodici (con 1, 5 e 4 celle per colonna, rispettivamente) (Tabella supplementare 2). Abbiamo definito questi 27 tipi di celle modulari.

Supponendo che le connessioni tra celle modulari siano stereotipate tra le colonne, abbiamo costruito il modulo di circuito ripetuto trovando tutte le connessioni tra questi tipi di celle (metodi). A differenza delle ricostruzioni sparse, il modulo di connettoma risultante (Fig. 3a) cattura accuratamente non solo la presenza ma anche l'assenza di forti connessioni tra due tipi di celle.

Per determinare quali neuroni potrebbero essere coinvolti in diversi calcoli locali, abbiamo sezionato il modulo del connettoma in tre percorsi separati di elaborazione del segnale, usando sia un clustering che un algoritmo di layout (Fig. 3). Li abbiamo riconosciuti come percorsi precedentemente identificati, quelli di L1, L2 e L3 / R7 / R8. Gli obiettivi a valle di R7 e R8 sono stati precedentemente implicati nella visione dei colori. Poiché i percorsi dei colori sono separati in colonne diverse che ricevono input da ommatidia 24 pallido o giallo 24, ci aspettiamo che debbano fare affidamento sui tipi di celle a infrarossi omessi dal nostro modulo di connettoma. Pertanto, la struttura fine del percorso L3 / R7 / R8 verrà rivisitata altrove.

Le restanti vie L1 e L2 segnalano contrasto visivo e sono implicate nella rilevazione del movimento 7, 25, 26, 27, 28, 29 . Esperimenti comportamentali e registrazioni elettrofisiologiche confermano questo ruolo per L1 e L2: non solo sono necessari ciascuno per gli aspetti della rilevazione del movimento 29, 30, 31, ma, tra le cellule postsinaptiche ai fotorecettori R1 – R6, entrambi sono anche per lo più sufficienti 30, 31 per il calcolo. Tuttavia, L1 e L2 stessi mancano di risposte direzionalmente selettive 7, 25 . Pertanto, per cercare i circuiti di rilevamento del movimento all'interno del modulo del connettoma, abbiamo esaminato i neuroni a valle di L1 e L2 in modo più dettagliato.

Circuito di rilevazione del movimento dei candidati

Diverse linee di evidenza indicano che le informazioni di movimento calcolate a valle di L1 e L2 vengono trasmesse alla placca lobulare tramite i tipi di cellule T4 e T5 (rif. 25). In primo luogo, le registrazioni da LPTC in farfalle con T4 e T5 geneticamente silenziate dimostrano che almeno uno di questi tipi di cellule colonnari è necessario per rilevare la selettività della direzione 32 . In secondo luogo, le cellule T4 e T5 in Drosophila comprendono ciascuna quattro sottotipi differenziati dallo strato di piastra della lobula in cui i loro assoni sono 20 . Terzo, ciascuno di questi quattro strati all'interno della piastra della lobula mostra attività in risposta a stimoli ad ampio campo che si muovono in una direzione particolare: verso il basso, verso l'alto, all'indietro e in avanti (Fig. 4b, e), rivelati dalla loro assunzione di desossiglucosio 11, 27 . Infine, i dendriti di LPTC con diversa preferenza di movimento occupano gli strati della piastra della lobula corrispondenti alla loro preferenza direzionale 20 e, inoltre, ricevono connessioni sinaptiche dirette dai terminali T4 28 . Collettivamente, questi dati suggeriscono che ciascun sottotipo di T4 / T5 forma l'uscita di circuiti di rilevamento del movimento che segnalano una particolare direzione del movimento.

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a, Vista dal basso dei dendriti dei neuroni Mi1 (ciano) e Tm3 (magenta) presinaptici a T4-12, sovrapposti alla matrice dei terminali assonali L1 (giallo). La saturazione del colore per ciascun pergolato dendritico riflette il numero di contatti sinaptici effettuati su T4-12 (vedere b e d ). La freccia mostra lo spostamento dal centro di massa Tm3 al centro di massa Mi1 calcolato come illustrato in e . b, Vista laterale di T4-12 e delle sue cellule Mi1 e Tm3 presinaptiche. La preferenza di direzione per una cella T4 (colorata per corrispondere alle preferenze direzionali in e ) è determinata dallo strato di arborizzazione della placca lobula dei terminali degli assoni (barre a T in nero). c, Ingrandimento (rettangolo tratteggiato in a ) che mostra i neuriti ricostruiti delle cellule Mi1, Tm3 e L1 (senza i colori ponderati in a ) e i loro contatti sinaptici (L1 → Mi1: blu; L1 → Tm3: rosso). d, Arbor dendritico ricostruito di T4-12 con sinapsi di Mi1 (blu) e Tm3 (rosso). e, Cartoon di input per una singola cella T4 attraverso celle Mi1 e Tm3. I pesi sinaptici simulati illustrano come sono stati calcolati i campi ricettivi. Il centro di massa del componente Mi1 (o Tm3), cerchio blu (o rosso), viene calcolato posizionando la massa corrispondente al peso sinaptico composto da L1 a Mi1 (o Tm3) a T4 al centro della colonna corrispondente. Barre di scala, 8 μm ( a ), 8 μm ( b ), 1 μm ( c ) e 4 μm ( d ).

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Successivamente, sosteniamo che le uscite selettive in direzione di T5 e in particolare di T4 sono calcolate in gran parte indipendentemente l'una dall'altra. Coerentemente con l'analisi dello strato sovrapposto nella Drosophila 26 e le grandi mosche 25, il nostro connome (Fig. 3a, b) indica che T4 appartiene al percorso L1. Al contrario, anche se non abbiamo tracciato nella lobula, i dendriti delle cellule T5 occupano gli strati della lobula con i terminali degli assoni dei neuroni come Tm1 (rif 20, 25), Tm2 (rif. 20) e Tm4 (rif. 20), che appartengono al percorso L2 (Fig. 3b). 30 prove elettrofisiologiche e 29 comportamentali indicano che le vie L1 e L2 nel modulo del connettoma (Fig. 3a, b) sono computazionalmente indipendenti e corrispondono alle vie ON e OFF nei sistemi visivi dei vertebrati 30 . Inoltre, la maggior parte delle connessioni dalla via L2 alla via L1 arrivano via L5 (Fig. 3a), un tipo di cellula non implicato nella rilevazione del movimento 33 . Quindi, abbiamo deciso di cercare un circuito di rilevamento del movimento a valle di L1 convergente su celle T4. Questa decisione è stata presa nonostante l'evidenza elettrofisiologica che mostra una mancanza di selettività di direzione nelle cellule T4 34, ma dal completamento del nostro lavoro, è stata supportata dall'imaging del calcio delle cellule T4 35 .

Per identificare gli elementi candidati di un circuito di rilevazione del movimento che collega tra L1 e T4, abbiamo sfruttato il fatto che la rilevazione del movimento è sia veloce che robusta rispetto al rumore 16, 17 e, di conseguenza, dovrebbe essere implementata da connessioni feedforward e forti. La nostra densa ricostruzione al microscopio elettronico ha identificato cinque tipi di cellule con input significativi da L1: Mi1, Tm3, L5, C2 e C3 (Fig. 3a). I tipi di celle Mi1 e Tm3 sono i due più grandi destinatari dell'input L1, che insieme rappresentano oltre la metà dei contatti sinaptici di L1. A loro volta, Mi1 e Tm3 contribuiscono insieme> 80% degli input presinaptici a T4 (compresi tutti gli input da tipi di celle sia modulari che non modulari), formando così i due percorsi più forti da L1 a T4. Al contrario, il tipo di cella C3 contatta T4 con un ordine di grandezza in meno sinapsi rispetto a Mi1 e Tm3, suggerendo che il suo contributo è molto più debole. Infine, i tipi di celle L5 e C2 non hanno sinapsi direttamente con T4. Queste caratteristiche ci portano a suggerire che Mi1 e Tm3 sono i substrati primari per il rilevamento di movimento robusto e veloce all'interno del percorso L1.

Campi recettivi anatomici di cellule T4

Per esplorare ulteriormente se le celle Mi1 e Tm3 convergenti su cellule T4 potrebbero costituire i due bracci di un rilevatore di movimento basato sulla correlazione (Fig. 1a, b), abbiamo esaminato se l'asse di movimento definito da questi ingressi su un particolare T4 è coerente con il suo direzione preferita, misurata dalle sue uscite. Questa direzione preferita dall'uscita è stata determinata per 16 neuroni T4 tracciando i loro assoni nella piastra della lobula e identificando il loro strato di arborizzazione 11, 27 (Fig. 4b, e).

Per confrontare la preferenza dell'uscita T4 con l'asse di movimento derivante dai suoi input, abbiamo costruito l'asse di movimento di input analizzando il numero di contatti delle singole cellule Mi1 e Tm3 sul neurone T4 in questione. Abbiamo trovato che ogni T4 riceve input da diversi neuroni Mi1 e Tm3 suggerendo che, a differenza dei circuiti di Fig. 1a eb, diversi punti nel campo visivo forniscono input in ciascun braccio del rilevatore di movimento (Fig. 4a, b, e) . Questa osservazione è supportata dalla struttura delle unità di campionamento dedotte dalle registrazioni in blowfly H1 (rif. 36), che riceve input dagli LPTC 37 . Pertanto, dovevamo caratterizzare gli ingressi di ciascun T4 come componenti di campo ricettivo mediati da Mi1 e Tm3, mappati nel campo visivo. Per fare questo, abbiamo rintracciato le connessioni sinaptiche dai terminali L1 in 19 colonne (la colonna di riferimento e le 18 colonne circostanti) alle cellule Mi1 e Tm3 a valle e quindi dai neuroni Mi1 e Tm3 alle cellule T4 che ricevono input dalla colonna di riferimento (che capita anche al numero 19). I campi recettivi risultanti (Fig. 4a e Fig. 4 supplementare) mostrano gli ingressi T4 mappati come se sull'array L1 e quindi nel campo visivo.

Per tutte le cellule T4, i componenti mediati da Mi1 e Tm3 del campo ricettivo T4 si sovrappongono sostanzialmente l'uno con l'altro (Figura 4 aggiuntiva). In effetti, i centri di massa dei due componenti sono spostati a meno di una distanza intercomunale (Fig. 5a). Tuttavia, per 15 delle cellule T4, questo spostamento è ancora significativamente maggiore ( P <0, 05) di quanto sarebbe stato ottenuto per caso da errori di tracciamento. Una magnitudine di spostamento così piccola rispetto alle larghezze dei campi ricettivi concorda con le prove precedenti dedotte dalle registrazioni blowl H1 ed è stata teoricamente giustificata 36 .

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a, Vettori di spostamento per ciascun neurone T4 ( n = 19). I neuroni con spostamento significativo (nomi in grassetto) hanno intervalli di confidenza al 95% (ellissi) che escludono l'origine (Metodi). I vettori si trovano nel quadro di riferimento ufficiale (entro ∼ 30 ° dagli assi visivi). b, Alto, spostamento medio, calcolato da a, mediato sulle celle con la stessa direzione preferita del loro output. In basso, la differenza angolare tra lo spostamento spaziale per i singoli neuroni T4 e la direzione preferita del suo output (per gli strati della piastra della lobula 1–3 (LP1–3)) è correlata alla frazione degli input L1 mancanti (Metodi). Le celle T4 con> 15% degli ingressi L1 mancanti sono state omesse dagli spostamenti medi (in alto). Barre di scala, 0, 5 ( a ) e 0, 2 ( b ) della distanza da centro a centro tra sfaccettature adiacenti.

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La direzione di spostamento tra i componenti del campo ricettivo Tm3 e Mi1 per un neurone T4 è coerente con la preferenza direzionale del neurone, come definita dalla profondità della sua arborizzazione assonale terminale nella piastra della lobula? Supponendo che la direzione dello spostamento sia determinata dai centri di massa dei componenti da Tm3 a Mi1, la Fig. 5b (in alto) mostra che la direzione dello spostamento concorda con la preferenza direzionale per tre dei quattro strati della placca della lobula. La discrepanza nella direzione dello spostamento e la preferenza di movimento da davanti a dietro delle cellule T4 che terminano nel quarto strato (piastra della lobula più tardi 4, LP4) possono essere causate da circuiti trascurati che contribuiscono specificamente alle risposte di questi neuroni T4. Ad esempio, l'evidenza comportamentale coinvolge i neuroni C3 nella rilevazione del movimento da una parte all'altra 33 e, in effetti, i risultati della traccia preliminare indicano che, nonostante le cellule C3 forniscano un ordine di grandezza un numero inferiore di input alle cellule T4 rispetto alle cellule Mi1 o Tm3, i neuroni C3 target Preferibilmente cellule T4 LP4.

Parte della discrepanza tra l'offset del campo ricettivo e la preferenza direzionale delle singole cellule T4 (Fig. 5a) che innervano gli strati della piastra della lobula 1–3 è probabilmente causata da un errore sistematico nella nostra ricostruzione derivante dalle dimensioni finite della regione ricostruita. In effetti, la discrepanza tra lo spostamento di input misurato per un dato T4 e la sua preferenza di direzione prevista è correlata alla frazione ponderata degli input L1 mancanti sulle celle Tm3 a monte di quel T4 (Fig. 5b, in basso), supportando la vista che i campi periferici Le cellule T4 potrebbero non essere completamente ricostruite. Inoltre, alcune delle variazioni rimanenti nell'orientamento dell'offset possono anche essere reali, data la mezz'ampiezza osservata di 60 ° -90 ° delle curve di sintonia ottenute attraverso l'imaging del calcio dei singoli sottotipi T4 35 .

La nostra scelta di misurare lo spostamento da Tm3 a Mi1 (e non nell'ordine inverso) sembra arbitraria senza includere informazioni su ritardi e polarità sinaptica (Fig. 1a, b). Per stimare un possibile ritardo di conduzione, abbiamo misurato sia la lunghezza del percorso che il calibro dei tronchi degli assoni principali che conducono segnali lungo le cellule Mi1 e Tm3 dalle sinapsi L1 alle sinapsi T4 e li abbiamo trovati simili, entro il 10% l'uno dall'altro. Inoltre, utilizzando una gamma di parametri elettrotonici misurati in altri neuroni volanti 38, i corrispondenti ritardi dei cavi erano ancora dell'ordine di un millisecondo, un ordine di grandezza inferiore a quello richiesto per la rilevazione del movimento 29 . Inoltre, sebbene alcuni neurotrasmettitori siano stati identificati per i tipi cellulari coinvolti, non conosciamo i loro recettori associati e quindi la risultante polarità sinaptica.

In assenza di prove sia per il ritardo relativo che per la polarità sinaptica, siamo liberi di scegliere la direzione di misurazione da Tm3 a Mi1, il che porta a spostamenti spaziali coerenti con la preferenza direzionale prevista dalla profondità del terminale T4 nella piastra della lobula. Supponendo che gli ingressi Mi1 e Tm3 a T4 siano combinati con lo stesso segno, come nel modello di rivelatore di movimento elementare Hassenstein-Reichardt (EMD) modello 4 (Fig. 1a), prevediamo che il braccio Tm3 del rilevatore di movimento dovrebbe introdurre un ritardo rispetto al braccio Mi1. Se, tuttavia, gli input fossero combinati con segni opposti, come nel modello 6 EMD simile a Barlow-Levick (Fig. 1b), la nostra previsione sarebbe l'opposto. Per quanto riguarda il meccanismo del ritardo, avere i due bracci del circuito implementati da diversi tipi di cellule consente la possibilità che il ritardo possa essere implementato biologicamente per mezzo di recettori metabotropici, come riportato nella retina vertebrata 39 .

Esplorando le cellule T4 ricostruite, abbiamo identificato una caratteristica finora non riconosciuta dei loro perni dendritici midollari (vedi, tuttavia, T4a, d in Fig. 14 di rif.20 e NJ Strausfeld, comunicazione personale): i rami dendritici di ciascun neurone T4 sono orientato principalmente in una direzione (Fig. 6a e Metodi). Inoltre, l'orientamento del ramo di ciascun T4, misurato dalle punte del dendrite alle loro basi, si raggruppa attorno a una delle quattro direzioni (Fig. 6b). Queste quattro direzioni, quando mappate dal riquadro delle coordinate del midollo nel campo visivo (Fig. 6c), si allineano con la preferenza della direzione di uscita per ogni strato della placca lobula (Fig. 6b). Questa osservazione ci ha permesso di validare in modo incrociato la classificazione di ciascuna delle 16 celle T4 in sottotipi di preferenza di direzione (Fig. 6a, b e Fig. 5 supplementare). Abbiamo quindi usato questa osservazione per inferire una preferenza di direzione per le restanti tre cellule T4, per le quali non è stato possibile completare la traccia nella placca lobula (Fig. 6c).

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a, quattro perni dendritici midollari rappresentativi delle cellule T4. I colori rappresentano l'orientamento del ramo dendritico locale. La mappa dei colori è stata costruita assegnando i colori da ogni strato della piastra della lobula (Fig. 4e) all'orientamento del ramo dominante medio su tutti i neuroni in ogni strato (frecce all'interno della mappa dei colori) e interpolando uniformemente. b, La profondità del pergolato assonale di un neurone T4 all'interno della placca lobulare è correlata all'orientamento del ramo dendritico dominante nel midollo (Metodi). Nell'asse della profondità, quattro strati sono etichettati e i neuroni all'interno di ogni strato sono colorati come in Fig. 4e. Gli orientamenti dominanti dei neuroni con assoni non tracciati sulla piastra della lobula sono tracciati sull'asse x (1: T4-5, 2: T4-4, 3: T4-14) e sono colorati con il colore del grappolo per a cui probabilmente appartengono (Figura 5 aggiuntiva). c, Trasformare l'orientamento dendritico dominante (± sem) dallo spazio definito dalla matrice di colonne midollari (nello strato M10) alle direzioni nello spazio visivo. Barra della scala, 5 micron.

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Discussione

Questo rapporto ha introdotto una nuova pipeline semi-automatizzata ad alto rendimento per la ricostruzione della microscopia elettronica e l'ha applicata per ricostruire un modulo di connettoma in modo completo all'interno del midollo, un neuropilo che ha resistito a lungo a tali tentativi. Inoltre, usando la connettomica, abbiamo identificato gli input Mi1 e Tm3 ai neuroni T4 come i due bracci di un rilevatore di movimento basato sulla correlazione candidato. Sebbene l'anatomia da sola non ci consenta di sondare l'operazione non lineare o il ritardo, e quindi di distinguere tra diversi modelli basati sulla correlazione 5, 6, 40, siamo stati in grado di prevedere quale tipo di cellula dovrebbe introdurre un ritardo più lungo, date le loro polarità sinaptiche (Fig. 1a, b).

Analogamente al nostro circuito proposto a valle di L1, le connessioni all'interno della nostra ricostruzione di microscopia elettronica ci consentono di suggerire tipi di cellule candidate - Tm1, Tm2 e Tm4 - che possono costituire il circuito di rilevamento del movimento a valle di L2. La conferma di questo suggerimento deve ovviamente attendere una densa ricostruzione delle connessioni sui neuroni T5 nella lobula.

Questo rapporto presenta diversi interessanti parallelismi con i risultati delle retine dei vertebrati. In primo luogo, l'esistenza dei quattro sottotipi di cellule T4 che rispondono alle quattro direzioni cardinali del movimento ricorda i quattro sottotipi di cellule gangliari direzionali selettivamente ON-OFF (DSGC) nella retina di coniglio 41 . In secondo luogo, la nostra scoperta che la selettività direzionale delle cellule T4 è allineata con il loro orientamento dendritico ricorda le cellule gangliari JAM-B 42 e le cellule amacrine starburst (SAC) 43 nella retina del topo. Tuttavia, a differenza delle cellule JAM-B e SAC, la direzione preferita delle cellule T4 è lontana dalla punta dei dendriti e, a differenza delle cellule SAC ma come le cellule JAM-B, tutti i dendriti in un punto T4 nella stessa direzione. In terzo luogo, le connessioni altamente specifiche tra SAC e DSGC responsabili della selettività direzionale di quest'ultima sono state dimostrate in precedenza utilizzando la connettomica su larga scala 44 . Tuttavia, a differenza del circuito da SAC a DSGC, il circuito che riportiamo può calcolare risposte selettivamente direzionali da ingressi non direzionali.

La nostra identificazione del percorso di rilevamento del movimento candidato a valle di L1 è stata notevolmente aiutata dalla completezza della nostra ricostruzione al microscopio elettronico. Rispetto alle connessioni stimate dalla sovrapposizione del pergolato 26, avere i conteggi sinaptici precisi ci consente di stabilire connessioni inequivocabilmente (Figura 6 aggiuntiva). In questo modo, abbiamo identificato Tm3 come componente principale del circuito di rilevamento del movimento, un fatto che è sfuggito ai precedenti ricercatori a causa della sua minima arborizzazione in M10. Inoltre, rispetto alle ricostruzioni sparse in altri sistemi, ad esempio connessioni sinaptiche tra SAC e DSGC 44, la completezza ci consente di argomentare sia l'assenza di percorsi alternativi sia l'importanza numerica del percorso proposto.

Il significato del denso connoma midollare va ben oltre il rilevatore di movimento locale, applicandosi a molti altri calcoli visivi. Anche se resta ancora molto da fare, in particolare per incorporare completamente le cellule tangenziali e infraperiodiche, il nostro connettoma contiene i neuroni colonnari presenti in ogni colonna e quindi rimuove un blocco di vecchia data per comprendere la visione degli insetti. Più in generale, i nostri risultati dimostrano che, in combinazione con una ricca raccolta di risultati sperimentali e teorici, i connettomi possono, identificando i circuiti sottostanti, fornire informazioni chiave sul calcolo neuronale.

Riepilogo dei metodi

Il cervello di una mosca è stato preparato per la microscopia elettronica mediante sostituzione del congelamento / congelamento ad alta pressione, seguita da inclusione e sezionamento. Le sezioni sono state riprese mediante microscopia elettronica a trasmissione. Le micrografie elettroniche sono state assemblate in una pila tridimensionale che rappresenta correttamente le posizioni relative delle strutture immaginate mediante una registrazione non lineare. La pila allineata di immagini in scala di grigi è stata suddivisa dagli algoritmi di apprendimento automatico in sottoinsiemi di pixel, ciascuno appartenente a un solo neurone (vedi //bitbucket.org/shivnaga/sstem). Questa partizione sovra-segmentata è stata ispezionata manualmente e agglomerata in singoli neuroni ("correzione di bozze"). I terminali presinaptici e le densità post-sinaptiche sono stati quindi annotati a mano e assegnati ai neuroni (Dati supplementari 1). Questi passaggi manuali richiedevano, 4 14.400 ore-persona (incluse ∼ 2.500 ore di esperti). I tipi di neurone ricostruito sono stati determinati abbinando le loro forme agli esempi della microscopia ottica. L'intero connectome è stato condensato in un modulo connectome, che è stato suddiviso in percorsi utilizzando layout grafico e algoritmi di clustering. Contando il numero di contatti sinaptici tra le celle L1, Mi1, Tm3 e T4, abbiamo calcolato lo spostamento relativo dei componenti di input. Abbiamo convalidato questo spostamento rispetto alla preferenza di direzione delle celle T4 rilevate tracciando i loro assoni nella piastra della lobula.

Metodi online

Preparazione del tessuto, microscopia elettronica e imaging

La parte destra del cervello di una mosca femmina dell'Oregon R di tipo selvaggio era sezionata in serie in fette da 40 nm. Un totale di 1.769 sezioni, attraversando il midollo e le neuropille a valle (Fig. 1c), sono state riprese con un ingrandimento di × 5.000. Questo processo è dettagliato nei metodi supplementari.

Pipeline di ricostruzione semiautomatica

Per ottenere una densa ricostruzione al microscopio elettronico della colonna di riferimento, abbiamo usato una sequenza di passaggi di allineamento e segmentazione automatizzati, seguiti da una correzione di bozze e ricostruzione manuali, che abbiamo descritto come la pipeline di ricostruzione semi-automatizzata 19 .

Allineamento dell'immagine

Abbiamo prima trovato un allineamento approssimativo dell'intera pila di immagini, ignorando artefatti come pieghe, lacrime e occlusioni di sporcizia, usando la registrazione rigida TrakEM2 48 per allineare blocchi di immagini costituiti da 20 sezioni di mosaici 9 × 9, e quindi allineare i blocchi con un sistema automatico cerca tra le immagini al centro di ogni mosaico. Questo allineamento approssimativo serviva a determinare quali immagini si sovrapponevano, consentendo un'analisi più precisa dei tessuti con artefatti e, in particolare, grandi pieghe. Si presumeva che i pixel molto più scuri della media corrispondessero alle pieghe e venivano utilizzati per dividere ogni immagine in due o più componenti collegati, chiamati patch. Per ogni coppia di patch sovrapposte, sia all'interno di una sezione (lungo il confine) sia sezione-sezione, sono stati trovati punti di corrispondenza per correlazione (∼ 1 per 500.000 pixel sovrapposti). Un adattamento dei minimi quadrati di questi punti con la regolarizzazione per scala e inclinazione è stato quindi utilizzato per produrre un allineamento affine globale di tutte le patch. L'esame degli errori da questo adattamento ha identificato immagini per le quali la divisione automatica in patch era inaccurata e queste divisioni sono state corrette manualmente. Una volta ottenuto un adattamento soddisfacente, ogni patch di ciascuna immagine è stata quindi leggermente distorta per fornire la migliore corrispondenza ai suoi vicini pur rimanendo vicino all'affine globale. Maggiori dettagli sono disponibili nel rif. 49.

Segmentazione automatica dell'immagine

Nel passaggio successivo, abbiamo suddiviso la regione di interesse midollare all'interno della pila allineata di immagini in scala di grigi in sottoinsiemi di pixel appartenenti a singoli neuroni. Dato che la risoluzione del set di dati della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è anisotropica, abbiamo sviluppato un processo in due fasi comprendente la segmentazione 2D per identificare le sezioni trasversali dei neuroni seguite dal collegamento di questi segmenti in 3D. Nessun singolo algoritmo è stato utilizzato su tutti i dati, poiché molte tecniche di segmentazione diverse sono state provate in parallelo con gli sforzi di correzione delle bozze ed è stato controproducente ri-segmentare porzioni già corrette. Una tipica fase di segmentazione 2D ha comportato la creazione di mappe di probabilità al contorno utilizzando le caratteristiche morfologiche 50, 51, 52 seguite da apprendimento dei bordi potenziato 53, rilevazione dei mitocondri per ridurre i falsi confini 54, seguita dalla segmentazione spartiacque 55 e dal raggruppamento agglomerativo 56 utilizzando valori medi e mediani per creare limiti Segmenti 2D. La fase di collegamento 3D ha creato un grafico di collegamento di segmenti 2D consecutivi in ​​sezioni adiacenti. Ancora una volta, sono state utilizzate diverse tecniche, tra cui metriche semplici come la sovrapposizione e approcci di apprendimento automatico che calcolavano pesi appropriati delle funzionalità da dati precedentemente sottoposti a correzione di bozze. Ulteriori dettagli su alcuni dei nostri approcci di segmentazione automatica sono disponibili nelle precedenti pubblicazioni 19, 57 . Dato che tutti gli algoritmi di segmentazione commettono errori derivanti da artefatti di imaging e bassa risoluzione z , e poiché la correzione manuale delle sovra-segmentazioni è più facile delle sottosegmentazioni, abbiamo messo a punto i nostri algoritmi automatici per produrre un volume di immagine sovra-segmentato. Inoltre, abbiamo preservato le regioni spartiacque chiamate super-pixel per facilitare la correzione manuale della sovra-segmentazione nel passaggio successivo. Abbiamo rilasciato la versione più recente (e riteniamo migliore) del codice di segmentazione che abbiamo usato (//bitbucket.org/shivnaga/sstem), ma avvertiamo il lettore che anche la nostra migliore segmentazione automatica richiedeva una revisione, correzione e annotazione manuali estese (vedi sotto) per produrre i risultati che riportiamo in questo documento.

Correzione di bozze e ricostruzione

Successivamente abbiamo esaminato i risultati della segmentazione automatica, corretto gli errori rimanenti e assegnato sinapsi ai perni delle celle di correzione. Poiché ciò ha richiesto molto tempo, abbiamo formato un gruppo di redattori professionisti, chiamati correttori di bozze, il cui lavoro è stato supervisionato da tre microscopisti elettronici esperti (Sh.T., Sa.T. e PKR) (esperti). I correttori di bozze e gli esperti hanno svolto i loro compiti utilizzando uno strumento software personalizzato dedicato, Raveler (DJO et al. , Manoscritto in preparazione). In totale, questi passaggi di correzione hanno richiesto, 9 12.940 ore-persona (incluse 900 ore-persona fornite dai nostri esperti). Ci sono stati cinque passaggi chiave all'interno della procedura di ricostruzione: (1) correzione del volume, (2) annotazione sinapsi, (3) traccia postsinaptica, (4) perfezionamento del corpo di ancoraggio e (5) traccia sparsa selettiva, dettagliata nei Metodi Supplementari.

Affidabilità dello schema elettrico

Come introdotto sopra, abbiamo assegnato due correttori di bozze a ciascuna sinapsi, per aumentare l'affidabilità della correzione di bozze. Caratterizzando ciò, nel 48, 2% dei casi entrambi i correttori di bozze non sono stati in grado di identificare una cellula madre né perché non sono stati in grado di tracciare il processo in modo sicuro o perché ha lasciato la regione midollare di interesse. Nel 44, 0% dei casi, entrambi i correttori di bozze hanno rintracciato il PSD sullo stesso corpo di ancoraggio e nel 7, 5% dei casi un correttore di bozze non è stato in grado di completare la traccia, mentre l'altro ha rintracciato il PSD su un corpo di ancoraggio (numeri estratti dalla tabella supplementare 1). Tuttavia, solo in pochissimi casi (0, 23%) i due correttori di bozze hanno raggiunto corpi di ancoraggio diversi. Questi numeri suggeriscono che mancherà una grande parte delle connessioni, a seguito del processo di accordo di due correttori di bozze; tuttavia, tutte le connessioni identificate hanno una probabilità molto elevata di essere corrette.

Per valutare ulteriormente la qualità della nostra ricostruzione, abbiamo generato due connettomi dai risultati del doppio correttore di bozze: una versione inclusiva che includeva connessioni trovate da entrambi i correttori di bozze e una versione di consenso in cui le connessioni erano accettate solo quando entrambi i correttori di bozze concordavano. Il confronto tra questi due connomi è stato generalmente rassicurante. Sebbene il connectome inclusivo abbia ∼ il 16% in più di connessioni, tutte le connessioni aggiuntive avevano un solo contatto sinaptico. Tutte le connessioni con due o più sinapsi sono presenti in entrambi i connettomi (Tabella supplementare 1). Abbiamo usato il connettome di consenso per tutte le nostre analisi. Tuttavia, le conclusioni rimangono invariate quando si utilizza il connettoma inclusivo.

In generale, gli alti tassi di contatti sinaptici persi nel nostro correttore di bozze erano tollerabili per il nostro progetto perché il nostro intento era studiare connessioni con diversi contatti sinaptici paralleli. Potremmo confermare che il connectome contiene una grande frazione di connessioni così forti tracciare la distribuzione del numero di contatti tra coppie di celle connesse.

Abbiamo trovato una distribuzione dalla coda fortemente pesante del numero totale di contatti per ciascuna coppia connessa sia nell'intero connettoma (inserto in Fig. 3b), sia all'interno del sottoinsieme di tipi di cellule scarsamente tracciati coinvolti nella rilevazione del movimento (Fig. Supplementare 3). Dato che le dimensioni delle barre a T all'interno del midollo sono relativamente uniformi (A. McGregor et al. , Osservazioni non pubblicate) e si ritiene che le dimensioni delle strutture sinaptiche siano correlate alla loro forza fisiologica 58, abbiamo visto il numero di contatti sinaptici paralleli tra due neuroni come proxy del peso sinaptico. Inoltre, supponendo che la probabilità di perdere un contatto sinaptico durante la correzione di bozze sia uniforme in tutti i siti postsinaptici, possiamo stimare che il connettoma di consenso contenga tutte le connessioni con> 5 sinapsi con un livello di confidenza> 95% (metodi supplementari). Pertanto, riteniamo che il nostro consenso comune sia preciso e completo per connessioni forti.

Costruzione di un modulo connectome

Nel costruire un modulo ripetitivo all'interno del connoma midollare, sono stati identificati tutti i membri di ciascuna classe di neuroni all'interno della colonna di riferimento e il numero di sinapsi da quei neuroni a tutti gli altri neuroni della classe postsinaptica è stato mediato sulle cellule presinaptiche. Per i tipi di cellule ultraperiodiche, ad esempio Tm3, ciò potrebbe comportare un peso frazionario. Inoltre, poiché ci sono 1, 5 cellule Tm3 per colonna in media, abbiamo calcolato il peso sinaptico moltiplicandolo per 1, 5. Questi pesi frazionari forniscono la forza media di connessione su colonne diverse, poiché alcune colonne hanno solo un singolo Tm3, mentre altre ne hanno due.

La sommatoria direzionale che è stata usata qui è stata scelta perché, nella nostra ricostruzione, abbiamo tentato di correggere ogni elemento postsinaptico al neurone associato. Tuttavia, non abbiamo tentato di rileggere ogni sito presinaptico al neurone genitore (poiché alcuni di questi elementi potrebbero derivare da colonne non di riferimento, che non sono state densamente ricostruite).

Questo metodo è stato modificato per le quattro connessioni nel circuito di rilevamento del movimento: da L1 a Mi1, da L1 a Tm3, da Mi1 a T4 e da Tm3 a T4. In questi casi, il numero di contatti sinaptici dal connettoma midollare densamente ricostruito è stato sostituito dal numero di contatti sinaptici identificati durante la traccia sparsa di queste connessioni specifiche (Tabella Supplementare 3).

Calcolo dei componenti del campo ricettivo Mi1 e Tm3

Abbiamo calcolato i componenti Mi1 e Tm3 del campo ricettivo per ogni T4, moltiplicando il numero di contatti sinaptici da ciascun neurone L1 a un singolo neurone Mi1 o Tm3 intermedio per il numero di contatti da quella cellula intermedia a T4, e quindi sommando su tutti i neuroni Mi1 e Tm3 che ricevono input dallo stesso L1 (Fig. 4e). Questa moltiplicazione equivale al conteggio del numero di rotte sinaptiche indipendenti da ciascuna L1 a ciascuna T4, in cui ciascuna rotta deve utilizzare una coppia diversa dei contatti sinaptici tra la L1 e le cellule bersaglio intermedie, i bersagli intermedi e il T4.

Stima dell'errore di Monte Carlo

La nostra metodologia di correzione di bozze provoca pochissimi errori falsi positivi, ma molti errori falsi negativi tra coppie di neuroni (vedi sopra). Pertanto, è altamente probabile che il numero osservato di contatti sinaptici ( m ) sia un sottoinsieme di un numero reale più elevato di contatti sinaptici tra due neuroni ( n ). Supponendo che, per ogni coppia di neuroni connessa ogni contatto sinaptico avesse una uguale probabilità falsa negativa, e usando quella probabilità in una distribuzione binomiale, il nostro obiettivo era stimare la probabilità posteriore, P ( n | m ) (cioè la probabilità di la vera n data la m osservata, per valori diversi di n . Per fare ciò, poiché la precedente distribuzione su n è sconosciuta, abbiamo approssimato questa probabilità posteriore con la probabilità, P ( m | n ) (cioè, probabilità di osservare m dato un valore del vero n ), per diversi valori di n . Abbiamo generato 1.000 diverse stime del peso di connessione reale, per ogni coppia di neuroni connessi, campionando dall'insieme dei possibili n valori con la probabilità calcolata dato ogni valore di n . Le coppie di neuroni che erano state disconnesse a causa di alti tassi di errore falsi negativi potevano anche connettersi se i loro profili dei neuriti si sovrapponevano in 3D. Il numero di contatti è stato stimato utilizzando lo stesso metodo di campionamento di prima (ma con m uguale a zero). In questo modo, abbiamo generato 1.000 matrici di connettività diverse. Lo spostamento è stato quindi calcolato per ciascuna matrice. Gli autovalori e gli autovettori della matrice di covarianza su tutti i vettori di spostamento sono stati calcolati e utilizzati per tracciare un'ellisse lungo gli assi degli autovettori con intervalli di confidenza di 2 σ (Fig. 5a). Per estendere questa costruzione allo spostamento medio su un gruppo di neuroni, sono state calcolate 1.000 variazioni della media, campionando prima gli spostamenti generati per ciascun neurone, e quindi calcolando la media per ogni serie di campioni. Le ellissi sono state quindi calcolate, allo stesso modo di prima, su questo insieme di 1.000 valori medi (Fig. 5b, in alto).

Effetto di dimensioni di ricostruzione limitate

Poiché la diffusione dei perni dendritici delle cellule Tm3 collegate a un dato T4 è maggiore di quella delle celle Mi1, è più probabile che le cellule Tm3 vengano parzialmente ricostruite e, quindi, mancano input di L1 vicino ai bordi della nostra ricostruzione a 19 colonne . Per fornire una misura dell'effetto di questo cut-off su ciascun T4, abbiamo prima ispezionato visivamente ogni neurone Tm3 e classificato in una delle quattro classi, a seconda della percentuale di pergolato mancante dalla ricostruzione a 19 colonne. Le cellule Tm3 che sono state ricostruite hanno ricevuto completamente input da una media di sei neuroni L1. Al contrario, le cellule Tm3 nella quarta classe, che avevano la maggior parte del loro pergolato al di fuori della nostra regione di interesse, hanno ricevuto input da una media di soli due neuroni L1. Sommando la frazione di ingressi L1 mancante, ponderata dalla frazione di ingressi fornita da ciascuna classe Tm3 al dato T4, abbiamo ottenuto una stima della frazione ponderata degli ingressi L1 mancanti (attraverso il canale Tm3) per ogni T4 (la x asse in Fig. 5b, in basso). Abbiamo anche usato questa metrica per giustificare la rimozione delle cellule T4 mancanti> 15% dei loro ingressi L1 ponderati (attraverso il canale Tm3), nel costruire le risposte medie per le celle T4 con le stesse preferenze di direzione di uscita (Fig. 5b, in alto).

Orientamento di Dendrite

Dopo la correzione di bozze, le arborizzazioni T4 all'interno di M10 sono state scheletrate, a partire dal centro del ramo più spesso, adattando il metodo di rif. 59 con una funzione di ponderazione modificata. Il punto di diramazione assonale è stato determinato da Sh.T. in modo da identificare con precisione la parte dendritica dell'arborizzazione del midollo. È stato calcolato l'orientamento locale attorno a ciascun nodo dendritico (utilizzando tre nodi in entrambe le direzioni attorno a ciascun nodo e ignorando tutti i nodi con meno di tre nodi adiacenti in entrambe le direzioni). L'orientamento del ramo dendritico dominante, per ogni T4 (Fig. 6b), è stato calcolato prendendo la trasformata di Fourier veloce (MATLAB e Statistics Toolbox, versione R2012b) della distribuzione degli orientamenti tra i nodi e definito come la fase della modalità fondamentale componente della trasformazione. Supponendo una distribuzione normale per l'orientamento dominante delle cellule assegnate a uno strato (tramite la profondità del loro pergolato di assoni), abbiamo calcolato la probabilità di ogni T4 non rintracciato che giace all'interno di ciascun gruppo di cellule, dato il suo orientamento dominante misurato. L'assegnazione della cella T4-4 allo strato 1 era significativa ( P <0, 05), ma l'assegnazione delle altre due celle non lo era. La mappa dei colori per i pergolati dendritici (Fig. 6a e Fig. 5 supplementare) è stata scelta centrando i colori sulla media dell'orientamento del ramo dendritico per ciascun cluster (Fig. 6b) e variando continuamente il colore tra i cluster.

Accesso ai dati

Alla pubblicazione gli scheletri di tutte le celle saranno caricati su //neuromorpho.org. Ospiteremo un sito Web (//openwiki.janelia.org/wiki/display/flyem/Medulla+TEM+Reconstruction) che consentirà allo spettatore di cercare nel connome di consenso coppie di neuroni collegati. Forniremo inoltre l'intera segmentazione con annotazioni di sinapsi, insieme a Raveler per aprire il set di dati, su richiesta. La parte richiedente dovrà fornire un disco rigido.

Informazione supplementare

File PDF

  1. 1.

    Informazione supplementare

    Questo file contiene le figure complementari 1-6, i metodi supplementari, le tabelle supplementari 1-3, una legenda completa che accompagna il file di dati supplementari, la legenda video completa e i riferimenti supplementari.

  2. 2.

    Figura supplementare

    Questo file contiene la versione completa della Figura 1 supplementare (per la legenda completa, consultare il file Informazioni supplementari p.1).

File Excel

  1. 1.

    Tabella supplementare 1

    Questo file contiene la versione completa della Tabella supplementare 1 (consultare il file Informazioni supplementari p.16 per la legenda).

File zip

  1. 1.

    Dati Supplementari

    Questo file zippato contiene dati supplementari 1 - per la legenda vedere il file di informazioni supplementari p.23).

video

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    Ricostruzioni di neuroni

    Questo video mostra la pila di immagini EM della regione di interesse midollare (Fig. 1c). Le immagini dalla pila vengono progressivamente rimosse (dirette verso gli strati più profondi) e le ricostruzioni di 379 neuroni vengono aggiunte in successione, in colori selezionati casualmente. I neuroni sono raggruppati in sei classi, con il testo che descrive la classe aggiunta simultaneamente ai neuroni di ogni classe: (1) terminali fotorecettori, dalla retina, e neuroni dalla lamina che innervano la colonna di riferimento all'interno del midollo. (2) Neuroni che ricevono input diretti dai neuroni della retina e della lamina. (3) Neuroni che ricevono input diretti dai neuroni in classe (2). (4) Neuroni che si arborano nella colonna di riferimento, ma si diffondono su più colonne. (5) Neuroni tangenziali, di cui spesso è stato ricostruito solo un frammento che attraversa la regione di interesse. (6) Neuroni aggiuntivi, spesso della stessa classe dei neuroni nelle classi (1) - (5), ma da colonne adiacenti.

Commenti

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