Il vaccino intero lievito ricombinante induce immunità antitumorale e migliora la sopravvivenza in un modello murino di melanoma geneticamente modificato | terapia genetica

Il vaccino intero lievito ricombinante induce immunità antitumorale e migliora la sopravvivenza in un modello murino di melanoma geneticamente modificato | terapia genetica

Anonim

Soggetti

  • Melanoma
  • Vaccino ricombinante

Astratto

Il melanoma maligno è una delle forme più mortali di cancro della pelle e si prevede che la sua incidenza aumenterà nei prossimi due decenni. Al momento, non esistono terapie efficaci per il melanoma avanzato. Abbiamo precedentemente dimostrato che la somministrazione di lievito ricombinante intero che esprime il MART-1 umano (hMART-IT) induce l'immunità antimelanoma protettiva in un modello murino trapiantabile B16F10. In questo studio, esaminiamo l'efficacia del vaccino hMART-IT in un ceppo congenito del modello murino di melanoma geneticamente modificato, che ricapitola sia la genetica sottostante sia il corretto microambiente tumorale del melanoma naturale. La somministrazione sottocutanea di hMART-IT ha indotto la citotossicità contro le cellule di melanoma e la produzione specifica di antigeni di citochine specifiche per Th1 da parte di splenociti. La somministrazione settimanale di hMART-IT ha ritardato significativamente lo sviluppo del melanoma e prolungato la sopravvivenza dei topi rispetto ai controlli. Sebbene l'analisi istologica abbia dimostrato un'infiltrazione diffusa di cellule T CD4 + e cellule T CD8 +, non è stata osservata alcuna riduzione delle cellule T regolatorie, suggerendo che hMART-IT non può prevenire l'immunotolleranza nel microambiente tumorale. Questo studio fornisce una prova del concetto che i modelli murini geneticamente modificati forniscono preziose informazioni sull'immunoterapica in fase di sperimentazione in ambito preclinico.

introduzione

Il melanoma maligno è una delle forme più mortali di cancro della pelle e si prevede che la sua incidenza continuerà a crescere nei prossimi due decenni. 1 I progressi in chirurgia, chemioterapia e radioterapia hanno ridotto la mortalità in una certa misura, ma l'efficacia complessiva di queste modalità terapeutiche è stata deludente. La riduzione della morbilità e della mortalità da melanoma si è quindi affidata alla prevenzione primaria e alla diagnosi precoce della malattia. Recentemente, sono stati studiati nuovi approcci terapeutici e offrono potenziali vantaggi terapeutici rispetto alle strategie attuali. 2, 3, 4

Abbiamo precedentemente dimostrato che l'immunizzazione di topi C57BL / 6 con lievito ricombinante intero trasfettato con hMART-1 protegge efficacemente i topi dalla sfida sottocutanea con una dose letale di cellule di melanoma di topo B16F10 inducendo una risposta e una produzione di cellule T citotossiche specifiche MART-1 fattore stimolante le colonie di granulociti / macrofagi e interferone (IFN) -γ in vitro. 5 Sebbene i modelli di tumore trapiantabili siano preziosi modelli animali per studi in vivo , hanno diversi limiti per renderli non ottimali per prevedere l'efficacia dell'immunoterapia nei pazienti. 6 In primo luogo, i tumori trapiantati sono tipicamente inoculati per via sottocutanea o endovenosa e quindi non crescono nel sito anatomicamente appropriato, causando un microambiente tumorale innaturale. In secondo luogo, i tumori trapiantabili generalmente progrediscono molto rapidamente dopo l'inoculazione, mentre i tumori spontanei di solito si sviluppano più lentamente attraverso una serie graduale di cambiamenti cellulari da patologie premaligne a patologie maligne. Di conseguenza, il sistema immunitario dei pazienti con tumori che si formano naturalmente si acclimata lentamente alla presenza di tumori, mentre il sistema immunitario di animali da esperimento con tumori trapiantati viene bruscamente esposto. In terzo luogo, l'eterogeneità delle cellule tumorali, come è presente nei tumori naturali, è difficile da simulare artificialmente nel modello di tumore trapiantabile. Di conseguenza, il microambiente tumorale nei tumori trapiantati è diverso dai tumori naturali, con conseguente alterazione dei modelli di angiogenesi e risposta immunitaria dell'ospite.

I modelli murini di cancro geneticamente modificati stanno diventando sistemi utili per comprendere la patogenesi molecolare e cellulare della tumorigenesi e per valutare gli agenti antitumorali in vivo . 7, 8 Questi modelli di topo richiedono manipolazioni genetiche che ricapitolano fedelmente gli eventi somatici nelle cellule tumorali umane. La melanomagenesi è associata a diverse alterazioni somatiche degli oncogeni e / o dei geni soppressori del tumore. 9, 10 Ink4a / Arf è una proteina soppressore del tumore codificata da CDKN2A , che agisce attraverso entrambe le vie di soppressione del tumore p53 e Rb. L'analisi genetica nei pazienti con melanoma familiare ha identificato le mutazioni germinali nel CDKN2A . 11 Inoltre, l'attivazione dell'oncogene associato al melanoma coinvolge più comunemente N-ras e le sue vie effettrici, Raf-MAPK / ERK chinasi (MEK) -ERK (RAF-MEK-ERK) e PI3K-Akt. L'attivazione di Akt3 promuove lo sviluppo del melanoma attraverso vari meccanismi, tra cui la stimolazione della proliferazione cellulare e una maggiore resistenza all'apoptosi. 12 studi transgenici (TG) su topi hanno dimostrato che le mutazioni attivate di H-ras o N-ras nei melanociti possono portare a una proliferazione aberrante e alla trasformazione maligna. 13, 14 Inoltre, i topi con espressione specifica di melanociti di H-ras o N-ras attivati ​​su uno sfondo carente di Ink4a sviluppano melanomi cutanei spontanei con elevata penetranza. 14, 15, 16 Più recentemente, sono stati sviluppati modelli di melanoma di topo geneticamente modificati con espressione inducibile di BRAF o KRAS . 17, 18 Questi topi non necessitano di trattamento cancerogeno e presentano le stesse alterazioni genetiche di quelle del melanoma umano, fungendo quindi da modello animale clinicamente rilevante per testare l'efficacia terapeutica.

Poiché i modelli murini geneticamente modificati sono generalmente di origine genetica mista, abbiamo creato ceppi congenici per adattarsi meglio agli esperimenti immunoterapici. I ceppi congenici FVB / N di un topo TG che sovraesprimono H-ras G12V specifico per melanociti sono stati incrociati con un topo knockout Ink4a / Arf (KO) per generare un ceppo congenico FVB / N di topi TG / KO che è incline a sviluppare spontanea melanoma. I nostri topi TG / KO hanno sviluppato melanomi spontanei con elevata penetranza (74%) a circa 3-4 mesi di età, un arco di tempo che è suscettibile di terapia sperimentale. Utilizzando i topi TG / KO, abbiamo valutato l'efficacia dell'intero lievito ricombinante che esprime hMART-1 e abbiamo mostrato che la somministrazione del vaccino del lievito induce l'immunità antitumorale contro i tumori del melanoma e migliora la sopravvivenza globale dei topi portatori di tumore.

risultati

Creazione di topi TG / KO su sfondo FVB / N

Abbiamo generato un modello di melanoma di topo geneticamente modificato su uno sfondo congenico di FVB / N eseguendo il backcrossing di un topo TG e di un topo KO su ceppi di FVB / N e confermando che sono congeniti tramite genotipizzazione del marcatore del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP). I topi TG che sovraesprimono l'H-ras G12V specifico per melanociti sono stati originariamente generati su un background genetico misto (C57BL / 6J (50%); CBA / J (50%)), 15 e sono stati reincrociati su FVB / N presso il National Cancer Institute ( Frederick, MD, USA) MMHCC Repository da quattro a sei generazioni. Abbiamo ulteriormente incrociato il mouse TG su FVB / N per altre tre generazioni per stabilire un ceppo congenico FVB / N. Anche i topi KO Ink4a / Arf sono stati originariamente generati su un background genetico misto (C57BL / 6J (80%); 129 / Sv (18, 7%); SJL / J (1, 25%)). 15 Questi furono anche reincrociati su FVB / N dal MMHCC per 4-6 generazioni seguite da altre tre generazioni da noi per stabilire il ceppo congenico di FVB / N. Abbiamo quindi incrociato un topo TG (FVB / N) con un topo KO (FVB / N) per generare un topo TG / KO che era incline a sviluppare melanoma spontaneo.

I campioni di DNA di 19 topi TG / KO sono stati analizzati usando 210 marcatori SNP sul cromosoma 1–19 da JAX Genome Scanning Services (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Tutti e 19 i campioni erano simili al 100% di FVB / N per tutti i cromosomi, ad eccezione del cromosoma 4 vicino al gene CDKN2A . I marcatori SNP sul cromosoma 4 a 84.2, 88.9, 100.1, 101 e 117.6 Mb erano 129 / Sv-like. Quando questi cinque marcatori SNP sono stati inclusi nell'analisi, 210 marcatori SNP erano simili al 97-98% FVB / N, confermando che i nostri topi TG / KO erano congenici.

I topi TG / KO sviluppano spontaneamente melanomi MART-1 positivi

Lo sviluppo spontaneo di melanomi su orecchie, occhi, tronco e coda è stato osservato in 20 su 27 (74%) topi TG / KO intorno ai 3-4 mesi (100, 4 ± 4, 8 giorni; Figure 1a-d). Tra i restanti sette topi, due topi hanno sviluppato tumori dei tessuti molli (linfoma e fibrosarcoma) e cinque topi (18, 5%) sono morti improvvisamente per cause sconosciute, simili alle osservazioni precedentemente riportate. 15 Considerando il ruolo di CDKN2a come soppressore di tumori in buona fede , si sospettava che alcuni di questi topi sviluppassero tumori spontanei, come i tumori endocrini. 19, 20, 21 I melanomi dei topi TG / KO erano amelanotici e spesso ulcerati. La colorazione di ematossilina ed eosina dei tumori del melanoma ha mostrato un'infiltrazione cutanea di cellule epitelioidi e del fuso con citoplasma anfofilo e frequenti atipie cellulari (Figure 1e e f). Le cellule di melanoma erano raramente evidenti nell'epidermide. L'espressione di mRNA di MART-1, tirosinasi, TRP-1, TRP-2 e gp100 è stata dimostrata mediante trascrizione inversa (RT) -PCR nelle lesioni del melanoma (Figura 2a). L'espressione della proteina MART-1 nei melanomi di topo TG / KO è stata confermata mediante western blot (Figura 2b) e colorazione immunoistochimica (Figure 2c ed d).

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Topi TG / KO su sfondo FVB / N. Topi con espressione H-ras G12V specifica per melanociti su uno sfondo carente di Ink4a / Arf hanno sviluppato spontaneamente melanomi su orecchie ( a ), occhi ( b ), busto ( c ) e coda ( d ) a 3-4 mesi di età. ( e e) colorazione con ematossilina ed eosina di melanomi. La barra della scala rappresenta 200 μm ( e ) e 80 μm ( f ).

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Espressione MART-1 nei melanomi di topo TG / KO. ( a ) L'espressione di tirosinasi, TRP-1, TRP-2, MART-1 e gp100 mRNA in un tumore del melanoma di topo TG / KO è stata valutata mediante trascrizione inversa-PCR. La linea cellulare del melanoma B16F10 è servita da controllo positivo. M è un marcatore di peso molecolare. ( b ) L'espressione della proteina MART-1 è stata valutata mediante western blot usando linee cellulari di melanoma stabilite da melanomi di topo TG / KO (2837E17, 598E20 e 8B20). Le cellule EL4 servivano come controllo negativo. ( c ) d ) Espressione della proteina MART-1 su tumori melanoma TG / KO mediante colorazione immunoistochimica. Le barre di scala rappresentano 300 μm ( c ) e 30 μm ( d ).

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hMART-IT induce citotossicità contro il melanoma di topo nei topi TG / KO

Poiché molti tumori sottoregolano un'espressione di classe I del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) per sfuggire alla distruzione immunitaria, abbiamo prima analizzato l'espressione di classe I MHC delle cellule di melanoma bersaglio, cellule 8B20, mediante citometria a flusso. Sebbene l'espressione della classe I di MHC nelle cellule 8B20 fosse downregolata al basale, il pretrattamento IFN-γ ha indotto la sovraregolazione della classe MHC I per potenziare la lisi cellulare da parte dei linfociti (Figura 3a). Abbiamo quindi valutato la capacità degli splenociti di topi TG / KO vaccinati con hMART-IT di uccidere le cellule di melanoma pretrattate con IFN-γ in vitro . Topi TG / KO di sei settimane sono stati trattati con hMART-IT o soluzione salina tamponata con fosforo (PBS). Due settimane dopo, gli splenociti sono stati isolati, stimolati in vitro con hMART-IT e testati per la citotossicità contro le cellule 8B20 pretrattate con IFN-γ. Nessun topo presentava melanoma visibile al momento del raccolto. La coltura di splenociti da topi vaccinati con hMART-IT con cellule bersaglio per 4 ore ha determinato una lisi dose-dipendente di cellule di melanoma 8B20, mentre la citotossicità non è stata osservata da splenociti ingenui (Figura 3b).

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Gli splenociti di topi vaccinati con hMART-IT inducono citotossicità contro le cellule di melanoma in vitro . ( a ) L'espressione della classe MHC I è stata determinata mediante analisi della citometria a flusso superficiale da cellule 8B20 non trattate o trattate con IFN-γ. ( b ) Splenociti da topi trattati con PBS e hMART-IT sono stati stimolati in vitro con hMART-IT e utilizzati come cellule effettrici. Come cellule bersaglio sono state utilizzate cellule di melanoma murino 8B20 trattate con IFN-γ. L'attività citotossica è stata determinata utilizzando il rilascio di LDH. E / T, rapporto effettore-cellula bersaglio. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte utilizzando diversi set di topi. L'asterisco indica una differenza significativa ( P <0, 05 per i topi trattati con hMART-IT rispetto ai topi trattati con PBS).

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hMART-IT induce la produzione di IL-2, fattore di necrosi tumorale-α, IL-12 e IFN-γ in vitro

I supernatanti sono stati ottenuti da splenociti dopo stimolazione in vitro con hMART-IT e analizzati per la produzione di citochine. Gli splenociti da topi TG / KO immunizzati con hMART-IT hanno prodotto livelli significativamente più alti di interleuchina (IL) -2 (Figura 4a), fattore di necrosi tumorale-α (Figura 4b), IL-12 (Figura 4c) e IFN-γ (Figura 4d) rispetto agli splenociti di topi trattati con PBS. Questi risultati dimostrano che hMART-IT induce la secrezione di citochine Th1 da parte di splenociti.

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Gli splenociti da topi vaccinati con hMART-IT producono citochine Th1 quando stimolati con hMART-1 o MART-1. ( ad ) I splenociti di topi trattati con PBS e hMART-IT sono stati sottoposti a coltura congiunta con hMART-IT inattivato al calore con un rapporto splenociti / lievito di 2: 1 per 6 giorni. I supernatanti sono stati analizzati per la produzione di IL-2 ( a ), fattore di necrosi tumorale-α ( b ), IL-12 ( c ) e IFN-γ ( d ) utilizzando il pannello di citochina Th1 / Th2 del topo Bio-Plex. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte utilizzando diversi set di topi. I dati sono uno dei tre esperimenti rappresentativi. ( e e) f. splenociti da topi trattati con PBS e hMART-IT sono stati incubati con rHu-H-ras, rHu-MART-1, hMART-IT o YVEC per 24 ore. I supernatanti sono stati raccolti e misurati per IL-12 ( e ) e IFN-γ ( f ). I dati rappresentano la media ± se, n = 3. Le barre di errore provengono da un esperimento eseguito in triplicato e gli esperimenti sono stati replicati due volte. * P <0, 05; ** P <0, 01 rispetto agli splenociti di topi trattati con PBS.

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Abbiamo quindi verificato se la secrezione di citochine indotta da hMART-IT fosse specifica per l'antigene. Gli splenociti di topi trattati con PBS o hMART-IT sono stati stimolati con proteina H-ras umana ricombinante (rHu-H-ras), proteina MART-1 umana ricombinante (rHu-MART-1), hMART-IT o YVEC per 24 ore . Gli splenociti incubati con rHu-H-ras non hanno prodotto quantità significative di IL-12 o IFN-γ (Figure 4e e f). Al contrario, rHu-MART-1 ha indotto una secrezione dose-dipendente di IL-12 (14, 80 ± 1, 45 e 71, 09 ± 7, 46 pg ml −1 con 0, 05 e 0, 5 μg ml −1 rHu-MART-1, rispettivamente) da splenociti da hMART Topi trattati con IT, ma in misura minore negli splenociti di topi trattati con PBS. Gli splenociti di topi trattati con hMART-IT hanno dimostrato una maggiore secrezione di IL-12 dopo l'incubazione con hMART-IT (79, 42 ± 10, 30 pg ml −1 ) e in misura minore dopo l'incubazione con YVEC (22, 99 ± 4, 14 pg ml −1 ), mentre quelli di topi trattati con PBS secernono poco IL-12 dopo incubazione con hMART-IT (2, 81 ± 1, 26 pg ml −1 ) o YVEC (2, 13 ± 1, 23 pg ml −1 ). Allo stesso modo, rHu-MART-1 ha indotto una secrezione dose-dipendente di IFN-γ (4404 ± 199 e 21339 ± 2628 pg ml −1 con 0, 05 e 0, 5 μg ml −1 rHu-MART-1, rispettivamente) da splenociti da hMART- Topi trattati con IT, ma in misura minore in splenociti da topi trattati con PBS. Gli splenociti di topi trattati con hMART-IT hanno dimostrato una maggiore secrezione di IFN-γ dopo incubazione con hMART-IT (3290 ± 428 pg ml −1 ) e in misura minore dopo incubazione con YVEC (1050 ± 106 pg ml −1 ), mentre quelli di topi trattati con PBS secernono poco IFN-γ dopo incubazione con hMART-IT (2, 19 ± 2, 19 pg ml −1 ) o YVEC (1, 21 ± 1, 21 pg ml −1 ). Questi dati suggeriscono che la vaccinazione con hMART-IT provoca la secrezione specifica di MART-1 di citochine Th-1.

La vaccinazione con hMART-IT prolunga la sopravvivenza dei topi TG / KO

Per studiare se la vaccinazione di topi TG / KO con hMART-IT protegge dal melanoma in vivo , gli animali sono stati assegnati in modo casuale a coorti con vaccinazione hMART-IT, YVEC o PBS. Le coorti hanno ricevuto la vaccinazione sottocutanea settimanale a partire dall'età di 6 settimane (42 giorni). I topi sono stati monitorati per lo sviluppo del tumore, la dimensione del tumore e la sopravvivenza. I topi che hanno sviluppato melanoma oculare sono stati uccisi e non inclusi nello studio. I numeri degli animali finali esaminati nello studio erano n = 36, 30 e 35 per il trattamento con hMART-IT, YVEC o PBS, rispettivamente. Sebbene lo sviluppo di tumori del melanoma cutaneo sia stato ritardato nei topi trattati con hMART-IT (110, 56 ± 8, 60 giorni) rispetto ai topi trattati con PBS o trattati con YVEC (90, 08 ± 4, 93 giorni o 98, 93 ± 6, 12 giorni, rispettivamente), il log-rank la statistica non era significativa ( P = 0, 052). Tuttavia, il tempo dallo sviluppo del tumore alla morte è stato significativamente prolungato da 25, 74 ± 3, 18 giorni (topi trattati con PBS) o da 24, 09 ± 3, 10 giorni (topi trattati con YVEC) a 39, 41 ± 6, 13 giorni (topi trattati con hMART-IT; P = 0, 034 per test log-rank, Figura 5a). Allo stesso modo, la sopravvivenza globale dei topi è stata significativamente prolungata da 110, 11 ± 5, 90 giorni (topi trattati con PBS) o 117, 83 ± 5, 70 giorni (topi trattati con YVEC) a 140, 28 ± 8, 32 giorni (topi trattati con hMART-IT; P = 0, 001 per log- test di rango, Figura 5b). La regressione del tumore non è stata osservata in nessun gruppo. Questi risultati indicano che la somministrazione sottocutanea di hMART-1 ha prolungato significativamente la sopravvivenza dei topi TG / KO portatori di tumore rispetto ai topi ingenui e ai topi vaccinati con lievito trasfettato con un vettore vuoto.

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La vaccinazione hMART-IT prolunga la sopravvivenza dei topi TG / KO. Topi TG / KO sono stati inoculati per via sottocutanea nel fianco laterale con hMART-IT ( n = 36), YVEC ( n = 30) o PBS ( n = 35) settimanalmente da 6 settimane fino alla morte. I topi sono stati valutati per lo sviluppo del tumore, la dimensione del tumore e la sopravvivenza una volta alla settimana. Vengono mostrate le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier del tempo dal tumore alla morte ( a ) e del tempo alla morte ( b ). Il test log-rank è stato utilizzato per testare la differenza nelle curve di sopravvivenza. ( a ) Il test statistico log-rank ha mostrato una differenza significativa tra le curve tumore-morte ( P = 0, 042 per topi trattati con hMART-IT vs topi trattati con PBS e P = 0, 021 per topi trattati con hMART-IT vs trattati con YVEC topi). ( b ) Il test statistico log-rank ha mostrato una differenza significativa tra le curve di sopravvivenza ( P = 0, 0012 per topi trattati con hMART-IT vs topi trattati con PBS e P = 0, 0056 per topi trattati con hMART-IT vs topi trattati con YVEC).

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Gli splenociti di topi tumorali trattati con hMART-IT mantengono l'attività citototossica in vitro

Sebbene la crescita del tumore sia stata ritardata e i topi siano sopravvissuti più a lungo dopo la vaccinazione hMART-IT, i tumori del melanoma hanno continuato a crescere e la regressione non è stata osservata. Pertanto, abbiamo studiato i meccanismi di immunotolleranza nei topi TG / KO trattati con hMART-IT con tumore al melanoma. Abbiamo prima valutato la capacità degli splenociti di topi portatori di tumore di uccidere il melanoma in vitro . Gli splenociti di topi TG / KO trattati con hMART-IT con tumori melanoma sono stati isolati, stimolati in vitro con hMART-IT e testati per la citotossicità contro le cellule 8B20 trattate con IFN-γ. Le cellule di melanoma B16F10 trattate con IFN-γ che esprimono MART-1, ma esprimono la classe MHC I errata (cioè, esprimendo H-2 b ma non H-2 q ), sono state usate come bersaglio di controllo. Gli splenociti di topi TG / KO trattati con hMART-IT recanti tumori melanoma hanno mostrato citotossicità dose-dipendente contro le cellule di melanoma 8B20, ma non contro le cellule B16F10 (Figura 6a), suggerendo che l'attività citotossica dei linfociti è stata mantenuta nei topi portatori di tumore.

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Analisi di topi portatori di tumore. ( a ) Splenociti da topi portatori di tumore vaccinati con hMART-IT sono stati restimolati in vitro con hMART-IT e utilizzati come cellule effettrici. Come cellule bersaglio sono state utilizzate cellule di melanoma murino 8B20 trattate con IFN-γ (H-2 q ) e cellule di melanoma murino B16F10 (H-2 b ). L'attività citotossica è stata determinata utilizzando il rilascio di LDH. E / T, rapporto effettore-cellula bersaglio. Gli esperimenti sono stati ripetuti due volte utilizzando diversi set di topi. Asterisco Indica una differenza significativa ( P <0, 05 per la citotossicità contro le cellule 8B20 rispetto a quella contro le cellule B16F10). ( b ) Espressione di CD4, CD8 e Foxp3 nei tumori di topi trattati con PBS e quelli di topi vaccinati con hMART-IT mediante immunoistochimica. La barra della scala rappresenta 100 micron.

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I tumori trattati con hMART-IT mostrano un aumento delle cellule T CD4 + e CD8 + infiltranti il ​​tumore, ma nessuna riduzione delle cellule Foxp3 +

Poiché il microambiente tumorale può avere un effetto significativo nella difesa immunitaria locale, 22, 23 abbiamo esaminato la presenza di cellule CD3 +, CD4 +, CD8 + e Foxp3 + all'interno dei tumori del melanoma mediante immunoistochimica. I melanomi di topi vaccinati con hMART-IT hanno dimostrato un aumento significativo delle cellule CD3 +, CD4 + e CD8 + all'interno e attorno al tumore, rispetto al melanoma di topo trattato con PBS (Figura 6b). Tuttavia, il numero di cellule che esprimono Foxp3 era solo lievemente ridotto nei tumori di topi vaccinati con hMART-IT, rispetto ai tumori di topo trattati con PBS. Questa scoperta può offrire una spiegazione del perché la vaccinazione hMART-IT ha solo prolungato la sopravvivenza e alla fine non ha protetto gli animali dalla formazione o dalla morte del melanoma.

Discussione

Precedenti lavori hanno dimostrato che i topi con espressione specifica di melanociti di H-ras attivato su uno sfondo carente di Ink4a sviluppano melanomi cutanei spontanei dopo una latenza di 5, 5 mesi e con una penetranza del 42, 8% (15 topi su 35). 15, 16 In questo studio, il modello di topo congenito FVB / N dei topi geneticamente modificati ha sviluppato melanomi spontanei dopo un periodo di latenza di 3-4 mesi e una penetranza del 74%. La latenza più breve e la maggiore penetranza nei nostri topi TG / KO possono derivare da differenze fenotipiche nei ceppi di topo congeniti. Ad esempio, è noto che i topi C57BL / 6J sviluppano una risposta antitumorale Th1 e sono refrattari allo sviluppo di molti tumori, mentre i topi FVB / N sono altamente sensibili alla formazione di tumori indotti chimicamente con un alto tasso di conversione maligna. 24, 25

Sebbene i melanomi nei topi TG / KO fossero amelanotici, le cellule tumorali esprimevano antigeni di melanoma ben definiti, come MART-1, S-100 e TRP-1. Pertanto, abbiamo valutato l'efficacia dell'immunoterapia utilizzando lievito ricombinante intero che esprime hMART-1 utilizzando il modello di melanoma di topo spontaneo. Il lievito viene fagocitato avidamente dalle cellule dendritiche, fornendo così un vettore efficiente per fornire antigeni tumorali ricombinanti al sistema immunitario. 26 Gli antigeni proteici ricombinanti che sono naturalmente mannosilati dal lievito hanno dimostrato di migliorare la presentazione dell'antigene MHC classe I e II e la stimolazione delle cellule T rispetto alle proteine ​​non mannosilate. 27, 28, 29, 30 Inoltre, il lievito possiede naturalmente proprietà adiuvanti 31, 32 e può essere facilmente progettato per esprimere più antigeni. Inoltre, l'intero vaccino del lievito non richiede una conoscenza precisa della sequenza epitopica antigenica o della loro corrispondente classe MHC I o II, poiché le proteine ​​a lunghezza intera espresse nel lievito vengono elaborate e presentate naturalmente dalle cellule dendritiche. Infatti, nonostante il fatto che i peptidi MART-1 riconosciuti dalle cellule T da topi FVB / N non siano stati definiti, la produzione di citochine indotta da hMART-IT era specifica per la proteina hMART-1. Pertanto, l'uso dei sistemi di lievito fornirà una piattaforma immunostimolante unica per lo sviluppo di vaccini.

Inoltre, l'immunizzazione di topi TG / KO con hMART-IT ha ritardato lo sviluppo del tumore al melanoma e ha comportato un prolungamento della sopravvivenza da melanoma spontaneamente insorto rispetto ai topi trattati con PBS o YVEC. hMART-IT ha indotto citotossicità e una forte risposta di citochine Th1 da aumenti di IL-2, fattore di necrosi tumorale-α, IL-12 e IFN-γ in vitro , indicando un ambiente favorevole per l'immunità antitumorale. È stato dimostrato che IL-2 ad alte dosi somministrato per via endovenosa induce risposte tumorali nel 16% dei pazienti con melanoma non resecabile, con il 6% che raggiunge una risposta completa. Allo stesso modo, la somministrazione di IL-12 stimola la produzione di IFN-γ e ha prodotto risposte tumorali in uno studio iniziale di fase 1. 34 È stato anche dimostrato che la combinazione di IL-2 a basso dosaggio con IL-12 somministrato per via endovenosa produce modesti effetti antitumorali in alcuni pazienti attraverso un aumento prolungato di IFN-γ. 35

Nonostante l'induzione della citotossicità e la produzione di citochine Th1 in vitro e una crescita più lenta del tumore in vivo , i tumori del melanoma non sono regrediti nei topi trattati con hMART-IT. La presenza di infiltrazione diffusa di cellule CD4 + e CD8 + nei tumori, così come attività citotossica positiva da splenociti in vitro , suggerisce l'induzione di una risposta immunitaria mediata da cellule T da parte di hMART-IT in topi portatori di tumore e sostiene la conclusione secondo cui gli animali trattati con hMART-IT hanno mostrato una crescita tumorale più lenta. Tuttavia, l'analisi immunoistochimica ha dimostrato la presenza di cellule Foxp3 + nei tumori trattati con hMART-IT. Le cellule T regolatorie CD4 + CD25 + Foxp3 + (cellule Treg) temperano la tolleranza immunologica agli autoantigeni sopprimendo le risposte immunitarie antitumorali. È stato osservato un aumento del numero di cellule CD4 + CD25 + funzionalmente soppressive in pazienti con melanoma metastatico 36 e melanoma nodale, 37 indicando che le cellule Treg possono avere un ruolo nel modificare l'entità della risposta delle cellule T nel paziente. Sutmuller et al. 38 hanno dimostrato che l'esaurimento del CD25 + ha comportato un aumento del rigetto del tumore. Hanno anche dimostrato che il trattamento antitumorale è fortemente migliorato se la vaccinazione è preceduta da una deplezione di cellule Treg CD25 + in vitro .

Utilizzando un modello di topo melanoma Hgf-Cdk4 R24C geneticamente modificato, Tormo et al. 39 hanno dimostrato che l'immunoterapia combinata con la vaccinazione e l'iniezione di adiuvante ritarda la crescita del melanoma, in accordo con i nostri dati. Aggiungendo ulteriormente ciclofosfamide e trasferimento adottivo di linfociti T specifici al tumore in questi regimi, Kohlmeyer et al. 40 hanno dimostrato che una combinazione di chemioimmunoterapia determina una regressione completa del melanoma sia primario che metastatico nel modello di topo melanoma Hgf-Cdk4 R24C . La ciclofosfamide induce la proliferazione omeostatica delle cellule T, abroga le cellule Treg e ripristina l'omeostasi delle cellule dendritiche. 41, 42, 43, 44 L'aggiunta di chemioterapici per aumentare l'immunità dell'ospite nel nostro modello può servire a migliorare la risposta immunologica, con possibili miglioramenti nella sopravvivenza dei topi. Inoltre, è stato dimostrato che il miglioramento della risposta delle cellule T mediante l'inibizione dell'antigene 4 citotossico associato ai linfociti T con ipilimumab migliora la sopravvivenza globale dei pazienti con melanoma in stadio III o IV in uno studio di fase III. 4 L' antigene-4 associato ai linfociti T citotossici è espresso sulle cellule T attivate e trasmette un segnale inibitorio alle cellule T effettrici. 45 L' antigene-4 associato ai linfociti T citotossici è anche espresso sulle cellule Treg ed è essenziale per la funzione di Treg. 46 Pertanto, l'aggiunta di ipilimumab o di altri modulatori delle cellule T può servire a migliorare l'efficacia del vaccino hMART-IT nel trattamento del melanoma.

Materiali e metodi

Topi

I topi Tyr-H-ras G12V TG (sfondo FVB / N) e topi Ink4a / Arf KO (ceppo FVB / N) sono stati ottenuti dal National Cancer Institute. 15, 47 Sono stati ulteriormente incrociati su FVB / N per stabilire ceppi congenici di FVB / N. La presenza degli alleli transgenici e KO è stata valutata mediante PCR genomica. 15, 47 I topi sono stati incrociati due volte per generare topi TG con espressione H-ras G12V specifica per melanociti su uno sfondo carente di Ink4a / Arf (TG / KO). Gli animali sono stati tenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni, secondo le linee guida di cura degli animali del National Institutes of Health. I protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Institute Animal Care and Use Committee dell'Università del Colorado a Denver.

Scansione del genoma

Il DNA è stato estratto da campioni di coda usando il kit per PCR per tessuto REDExtract-N-Amp (Sigma, St Louis, MO, USA). I marcatori SNP sono stati selezionati tra i cromosomi 1–19 per distinguere FVB / N da C57BL / 6; CBA / J; 129 / Sv dal Jackson Laboratory. La genotipizzazione di 19 topi TG / KO è stata eseguita da ciascun campione di DNA dal JAX Genome Scanning Service (Jackson Laboratory).

Ingegneria del lievito

Le cellule di lievito sono state progettate per esprimere il MART-1 umano, come precedentemente descritto. 5, 48, 27 È stato generato un vettore di espressione inserendo il DNA complementare MART-1 umano nel vettore di lievito pYEX-BX (Amrad Biotech, Baronia, Australia). Il vettore è stato trasfettato in Saccharomyces cervisiae , W303α (ATCC, Manassas, VA, USA). L'espressione della proteina MART-1 è sotto il controllo del promotore rame-inducibile-CUP1. Il solfato di rame (0, 5 m M, Sigma) è stato aggiunto alle colture di lievito durante la crescita della fase log e l'espressione del MART-1 umano è stata confermata dalla macchia occidentale. Il lievito che esprime il MART-1 umano è stato designato hMART-IT. Il lievito trasfettato con pYEX-BX senza MART-1 è stato designato YVEC e utilizzato come controllo vettoriale. Il lievito è stato inattivato al calore (56 ° C, 1 h) e conservato a -70 ° C fino al momento dell'uso.

Coltura cellulare

Le linee cellulari di melanoma murino B16F10 e timoma murino EL-4 sono state acquistate da ATCC. Le cellule 8B20, 598E20 e 2837E17 sono state stabilite da tumori del melanoma che si sono manifestati spontaneamente nei topi TG / KO dissociando tumori con collagenasi I e ialuronidasi (Sigma) per 2 ore e coltivando cellule dissociate. Tutte le cellule sono state coltivate in RPMI 1640 (Sigma) integrato con il 10% di siero di vitello fetale (Summit Biotech, Ft Collins, CO, USA), L -glutamina (Sigma) e penicillina / streptomicina (Mediatech, Herndon, VA, USA).

Trascrizione inversa-PCR

L'RNA intero è stato isolato da tumori, cute e milza di topi TG / KO e cellule B16F10 con reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando il kit Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA). La PCR è stata eseguita con 30 cicli usando le seguenti sequenze di primer: Tirosinasi-F: 5′-GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGT-3 ′; Tirosinasi-R: 5′- TGGTGCTTCATGGGCAAAATC-3 ′; TRP-1-F: 5′-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC-3 ′; TRP-1-R: 5′-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-3 ′; TRP-2-F: 5′-GGATGACCGTGAGCAATGGCC-3 ′; TRP-2-R: 5′-CGGTTGTGACCAATGGGTGCC-3 ′; MART-1-F: 5′-CGCTCCTATGTCACTGCTGA-3 ′; MART-1-R: 5′-GGTGATCAGGGCTCTCACAT-3 ′; gp100-F: 5′-CGGATGGTCAGGTTATCTGGA-3 ′; gp100-R: 5′-TGGTGAAGGTTGAACTGGC-3 ′; gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi-F: 5′-CCATGACAACTTTGGCATTG-3 ′; gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi-R: 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 ′.

Macchia occidentale

Le cellule EL4, 8B20, 598E20 e 2837E17 sono state sospese in tampone RIPA (25 m M Tris – HCl, pH 7, 6, 150 m M NaCl, 1% NP-40, 1% di desossicolato di sodio, 0, 1% SDS, da Pierce, Rockford, IL, USA) e omogeneizzato con un omogeneizzatore elettronico (VirSonic50, VirTis, Gardiner, NY, USA). I lisati cellulari sono stati separati con elettroforesi Tris-HCl SDS / poliacrilammide al 12% (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad) a 200 mA per 90 min. Il legame non specifico è stato inibito dall'incubazione della membrana di nitrocellulosa in soluzione salina tamponata con Tris allo 0, 2% con Tween-20 con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente. Le membrane sono state incubate con l'antumano di topo Melan-A / MART-1 (BioGenex, San Ramon, CA, USA) come anticorpo primario e coniugato di perossidasi di rafano antimouso di rafano (Pierce) come anticorpo secondario, seguito dal rilevamento mediante SuperSignal West Femto Maximum Substrato di sensibilità (Pierce), secondo le istruzioni del produttore.

Citometria a flusso

Le cellule sono state incubate con antimouso coniugato con isotiocianato di fluoresceina H2K q da BD Biosciences (San Diego, California, USA) per 30 minuti. L'anticorpo abbinato all'isotipo è stato usato come controllo. L'espressione del marcatore della superficie cellulare è stata analizzata mediante citometria a flusso standard a due colori con un citometro a flusso Beckman Coulter FC500 (Beckman Coulter, Hialeah, FL, USA) e il software Summit (Dako Cytomation, Ft Collins, CO, USA).

Test di citotossicità

Topi TG / KO di sei settimane sono stati inoculati per via sottocutanea nel fianco laterale con hMART-IT (5 × 10 7 cellule di lievito in 100 μl di PBS) o PBS (100 μl, topi ingenui) settimanalmente per 3 settimane. Due settimane dopo l'ultima iniezione, sono state raccolte le milze e sono state preparate sospensioni a singola cellula. Gli splenociti sono stati co-coltivati ​​con hMART-IT con un rapporto splenociti / lievito di 2: 1 per 6 giorni in RPMI 1640 integrato con siero di vitello fetale al 10%, L -glutamina, penicillina / streptomicina e 50 μ M-mercaptoetanolo M e usati come cellule effettrici. Le cellule 8B20 sono state trattate per 48 ore con IFN-γ (50 U ml −1, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) e utilizzate come cellule bersaglio per i test di citotossicità sulle cellule T. Le cellule effettrici sono state risospese ad una concentrazione finale di 6, 75 × 10 6 cellule ml −1, e 50 microlitri sono stati quindi miscelati con cellule bersaglio (rapporti effettore-bersaglio compresi tra 1, 7: 1 a 45: 1) e incubati a 37 ° C in un incubatrice umidificata al 5% di CO 2 per 4 ore. Le cellule bersaglio e le cellule effettrici da sole sono state usate come controlli. L'attività citotossica delle cellule effettrici è stata determinata utilizzando il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) (kit per il dosaggio della citotossicità non radioattiva Cyto-Tox 96, Promega) seguendo le istruzioni del produttore. La percentuale di citotossicità è stata calcolata utilizzando la seguente equazione: Lisi specifica percentuale = ((rilascio di LDH sperimentale) - (rilascio di LDH spontaneo target) - (rilascio di LDH spontaneo effettore)) / ((rilascio di LDH totale target) - (rilascio di LDH spontaneo target) ) × 100.

Analisi di citochine

I topi sono stati iniettati per via sottocutanea con hMART-IT o PBS settimanalmente per 3 settimane. Due settimane dopo l'ultima iniezione, sono state preparate sospensioni a singola cellula dalla milza. Gli splenociti sono stati co-coltivati ​​con hMART-IT inattivato al calore con un rapporto splenociti / lievito di 2: 1. Supernatant è stato raccolto ogni 24 ore per 6 giorni per i profili di citochine. Misurazioni simultanee multiple di citochine sono state eseguite utilizzando il pannello di citochine mouse Th1 / Th2 Bio-Plex (Bio-Rad), secondo le istruzioni del produttore. In breve, il surnatante di splenociti è stato incubato con microsfere di polistirene indirizzate spettralmente e rivestite con anticorpi specifici per citochine, seguite da incubazione con anticorpo di rilevazione biotinilato e rilevazione da streptavidina-ficoeritrina. L'entità della reazione è stata misurata utilizzando un lettore di microsfere Luminex (Luminex, Austin, TX, USA) e le concentrazioni di citochine sono state calcolate dal software Bio-Plex Manager (Bio-Rad). In alcuni esperimenti, gli splenociti sono stati co-coltivati ​​con rHu-MART-1 (Prospec-Tany TechonoGene, Rehovot, Israele), rHu-H-ras (Oxford Biomedical Research, Oxford, MI, USA), YVEC o hMART-IT per 24 h e surnatanti sono stati analizzati per i profili di citochine.

Protocollo di vaccinazione

Da 6 settimane fino alla morte, i topi TG / KO sono stati inoculati per via sottocutanea nel fianco con hMART-IT (5 × 10 7 cellule di lievito in 100 μl di PBS), YVEC (5 × 10 7 cellule di lievito in 100 μl di PBS) o PBS (100 μl, topi ingenui) settimanalmente. La pelle del topo è stata ispezionata settimanalmente. I tumori cutanei eritematosi con diametro> 2 mm sono stati considerati melanoma primario. I volumi di tumore sono stati misurati settimanalmente e i topi sono stati eutanizzati quando i volumi di tumore hanno superato 2 cm 3 o quando i topi hanno sviluppato melanoma oculare.

L'immunoistochimica

I campioni di tumore sono stati ottenuti da topi TG / KO vaccinati con hMART-IT o PBS. Furono fissati in formalina al 10% e incorporati in paraffina, oppure incorporati nel mezzo di congelamento dei tessuti OCT (Triangle Biomedical Science, Durham, NC, USA) e congelati. I campioni inclusi in paraffina sono stati sezionati, deparaffinati, preriscaldati con tampone calore / citrato (soluzione di recupero dell'antigene, BioGenex) e incubati con anti-Melan-A / MART-1 (BioGenex), anti-CD3 (clone Cd3-12; Serotec, Raleigh, NC, USA) o anti-Foxp3 (Clone FJK-16 s, eBioscience, San Diego, CA, USA) a 4 ° C durante la notte. I campioni di tessuto congelato sono stati criosettati, fissati in acetone ghiacciato per 10 minuti e incubati con anticorpi anti-CD4 (clone GK1.5, BD Bioscience) o anti-CD8 (clone XMG1.2, BD Biosciences). Le immunoreazioni sono state visualizzate usando metodi complessi avidina-biotina-perossidasi. L'ematossilina (Sigma) è stata utilizzata come colorante di contrasto. I controlli negativi sono stati incubati con anticorpi corrispondenti all'isotipo.

analisi statistica

Gli studi in vivo sulla sopravvivenza sono stati analizzati utilizzando il software SigmaStat (Aspire Software International, Ashburn, VA, USA). È stata eseguita l'analisi di regressione non parametrica di Kaplan-Meier e la significatività è stata determinata utilizzando il test log-rank. Gli studi in vitro sono stati analizzati dai test t non accoppiati di Student . Le differenze sono state considerate significative se P <0, 05.